本發(fā)明涉及能夠增強(qiáng)植物細(xì)胞中水楊酸誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，并且有助于對(duì)真菌毒力因子脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的抗性、對(duì)鐮刀菌屬真菌和鐮刀菌赤霉病的抗性的基因，以及包含該基因的重組構(gòu)建體。本發(fā)明還涉及用該基因轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，以及植物材料，該植物材料包括含有所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞的植物細(xì)胞培養(yǎng)物、種子和植物。

酚類化合物水楊酸是植物抗病性的關(guān)鍵信號(hào)分子。水楊酸積累是由病原體攻擊和其它應(yīng)激條件誘導(dǎo)的(Delaney等人，1994)。水楊酸或其類似物例如苯并(1,2,3)噻二唑-7-硫代羧酸的外源施用在植物中誘導(dǎo)抗病性(White，1979；等人，1996；Lawton等人，1996)。水楊酸正調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡(Vlot等人，2009)，并且在這樣做時(shí)其抑制活體營(yíng)養(yǎng)型(biotrophic)病原體的擴(kuò)散。它是對(duì)活體營(yíng)養(yǎng)和半活體營(yíng)養(yǎng)型病原體如禾谷鐮刀菌(F.graminearum)的防御反應(yīng)的重要組成部分(Makandar等人，2012)。禾谷鐮刀菌是造成經(jīng)濟(jì)破壞性的谷物的鐮刀菌赤霉病(FHB)的致病劑；這種病原體是半活體營(yíng)養(yǎng)型的，在死體營(yíng)養(yǎng)階段(其中它們以死亡的植物組織飼喂)之前有一短的活體營(yíng)養(yǎng)階段。這種疾病是重要的，因?yàn)樗鼘?dǎo)致小粒谷物如小麥和大麥的產(chǎn)量損失和毒素污染。已知增強(qiáng)對(duì)毒素脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)的抗性可以提高對(duì)疾病的抗性。鑒于FHB的經(jīng)濟(jì)重要性，已經(jīng)制定了幾種控制策略來(lái)預(yù)防FHB流行病。然而，宿主抗性的使用被認(rèn)為是控制小麥中FHB和單端孢霉烯累積的最有效的手段。DON是植物毒性的，并且對(duì)DON的抗性增強(qiáng)對(duì)鐮刀菌和FHB疾病的抗性。US2007/0044171公開了數(shù)千種被描述為可用于改善植物的重組多核苷酸。

本發(fā)明的目的是發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)水楊酸誘導(dǎo)的免疫并且有助于對(duì)DON和FHB的抗性的新基因。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

申請(qǐng)人已經(jīng)鑒定了新的DON應(yīng)答性孤兒基因(ENST1-SEQ ID NO：1)及其啟動(dòng)子，其特征在于DON應(yīng)答元件，其可以用于驅(qū)動(dòng)FHB抗性基因的表達(dá)。該基因的同義詞是FROG(鐮刀菌抗性孤兒基因)。申請(qǐng)人已經(jīng)從小麥中分離了與ENST1具有約94％同源性的基因的兩個(gè)變體(圖1-SEQ ID NO：26和27)。申請(qǐng)人已經(jīng)表明該基因具有大于62％核苷酸序列同一性的同源物，該基因存在于山羊草(Aegilops tauschii)、二穗短柄草、草甸羊茅(Festuca pratensis)、大麥(Hordeum vulgare)和小麥(Triticum aestivum)中(圖2)。申請(qǐng)人已經(jīng)表明在三種轉(zhuǎn)基因小麥品系中ENST1的過(guò)表達(dá)(a)增強(qiáng)了小麥對(duì)禾谷鐮刀菌定殖的抗性(圖8)以及(b)延緩了FHB疾病癥狀的擴(kuò)散(圖9)。申請(qǐng)人已經(jīng)表明在擬南芥植物中ENST1的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了水楊酸誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(圖4)(對(duì)活體營(yíng)養(yǎng)型病原體的抗性的重要組成部分)，因此可用于抗病育種。此外，該基因?qū)ON和產(chǎn)生DON的鐮刀菌有應(yīng)答性，并且與二穗短柄草ENST1同源物的啟動(dòng)子具有42％的同一性的啟動(dòng)子已經(jīng)被克隆和測(cè)序，可用于控制DON應(yīng)答基因(圖5和6)。申請(qǐng)人已經(jīng)表明，與非沉默的對(duì)照植物相比，在栽培品種CM82036的小麥頭部中病毒誘導(dǎo)的ENST1基因沉默顯著增加了DON漂白(bleached)的小穗的數(shù)量(圖7)。

本發(fā)明提供分離的多核苷酸，該分離的多核苷酸包括SEQ ID NO：1，或與SEQ ID NO：1具有至少60％序列同一性的其功能變體(下文稱為“本發(fā)明的多核苷酸”)。

本發(fā)明還提供由本發(fā)明的分離的多核苷酸編碼的分離的蛋白質(zhì)(下文稱為“本發(fā)明的蛋白質(zhì)”)。

本發(fā)明還提供包括在植物細(xì)胞中發(fā)揮作用的可操作連接到轉(zhuǎn)基因的啟動(dòng)子區(qū)的重組構(gòu)建體，其中該轉(zhuǎn)基因包括本發(fā)明的多核苷酸。優(yōu)選地，該啟動(dòng)子區(qū)包括DON應(yīng)答啟動(dòng)子，優(yōu)選SEQ ID NO：2的序列，或其與SEQ ID NO：2具有至少40％序列同一性的功能變體。

本發(fā)明還提供包括本發(fā)明的重組構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化平臺(tái)。優(yōu)選地，啟動(dòng)子區(qū)包括DON應(yīng)答啟動(dòng)子。優(yōu)選地，所述啟動(dòng)子區(qū)包括SEQ ID NO：2的序列。優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)基因包括SEQ ID NO：1的重組多核苷酸。最優(yōu)選地，所述啟動(dòng)子區(qū)包括SEQ ID NO：2的序列，并且所述轉(zhuǎn)基因包括SEQ ID NO：1的重組多核苷酸。

典型地，所述轉(zhuǎn)化平臺(tái)包括能夠介導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化或基因槍轉(zhuǎn)化的細(xì)菌。

本發(fā)明還提供用本發(fā)明的多核苷酸、重組構(gòu)建體或轉(zhuǎn)化平臺(tái)遺傳轉(zhuǎn)化的植物材料。典型地，所述植物材料選自于植物細(xì)胞、植物細(xì)胞培養(yǎng)物、植物組織、植物或植物種子。典型地，所述轉(zhuǎn)化的植物材料包括能夠過(guò)表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。

本發(fā)明還提供包括攜帶轉(zhuǎn)基因的植物細(xì)胞的植物材料，其中所述轉(zhuǎn)基因包括本發(fā)明的多核苷酸。

本發(fā)明還提供遺傳轉(zhuǎn)化植物材料的方法，該方法包括用本發(fā)明的多核苷酸、重組構(gòu)建體或轉(zhuǎn)化平臺(tái)轉(zhuǎn)化植物材料的細(xì)胞或多個(gè)細(xì)胞的步驟，其中轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或多個(gè)細(xì)胞通常能夠過(guò)表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸。典型地，所述植物材料選自于植物細(xì)胞、植物細(xì)胞培養(yǎng)物、植物組織、植物或植物種子。

本發(fā)明還提供產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的方法，該方法包括以下步驟：用包括本發(fā)明的重組構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化平臺(tái)接種細(xì)胞，在使得轉(zhuǎn)化平臺(tái)能夠轉(zhuǎn)化細(xì)胞的條件下培養(yǎng)該細(xì)胞，選擇性地篩選接種細(xì)胞用于轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，并且通常分離該轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或每個(gè)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。優(yōu)選地，所述重組構(gòu)建體包括DON應(yīng)答啟動(dòng)子。最優(yōu)選地，所述重組構(gòu)建體包括啟動(dòng)子區(qū)和轉(zhuǎn)基因，該啟動(dòng)子區(qū)包括SEQ ID NO：2的序列，轉(zhuǎn)基因包括SEQ ID NO：1的重組多核苷酸。

本發(fā)明還提供產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，該方法包括根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，并從轉(zhuǎn)化的細(xì)胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植物的步驟。

本發(fā)明還提供產(chǎn)生具有改善性質(zhì)的植物的方法，該方法包括以下步驟：用根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化平臺(tái)或包括本發(fā)明的重組構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化平臺(tái)轉(zhuǎn)化植物，并種植所述植物。優(yōu)選地，所述重組構(gòu)建體包括DON應(yīng)答啟動(dòng)子。最優(yōu)選地，所述重組構(gòu)建體包括啟動(dòng)子區(qū)和轉(zhuǎn)基因，該啟動(dòng)子區(qū)包括SEQ ID NO：2的序列，轉(zhuǎn)基因包括SEQ ID NO：1的重組多核苷酸。典型地，所述改善性質(zhì)選自于：對(duì)FHB疾病的抗性、對(duì)DON的抗性、提高產(chǎn)量、提高種子數(shù)量、提高種子重量、改善的抗病性。

優(yōu)選地，所述植物是谷物植物，優(yōu)選小粒谷物植物。理想地，所述植物選自于小麥、大麥、燕麥、玉米或擬南芥植物。

本發(fā)明還提供根據(jù)本發(fā)明的方法遺傳轉(zhuǎn)化的植物材料，其中該植物材料的至少一個(gè)細(xì)胞過(guò)表達(dá)本發(fā)明的重組多核苷酸。典型地，所述植物材料選自于植物細(xì)胞、植物細(xì)胞培養(yǎng)物、植物組織、植物或植物種子。

本發(fā)明還涉及能夠介導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化并含有根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化平臺(tái)的細(xì)菌。

本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的種子、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞、植物細(xì)胞培養(yǎng)物或植物細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因植物組織、轉(zhuǎn)基因植物材料或穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因植物。

本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明的轉(zhuǎn)化平臺(tái)或重組構(gòu)建體或重組多核苷酸的種子、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞、植物細(xì)胞培養(yǎng)物或植物細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因植物組織、轉(zhuǎn)基因植物材料或穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因植物。

本發(fā)明還涉及能夠遺傳轉(zhuǎn)化細(xì)胞(理想地，植物細(xì)胞)的試劑盒，其包括(a)能夠介導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的細(xì)菌，(b)重組構(gòu)建體，和(c)轉(zhuǎn)基因。所述轉(zhuǎn)基因可以位于單一轉(zhuǎn)化載體上或可以位于不同的載體上。

本發(fā)明還提供分離的多核苷酸，該分離的多核苷酸包括SEQ ID NO：2的序列或其與SEQ ID NO：2具有至少40％序列同一性的功能變體。

附圖說(shuō)明

圖1.ENST1小麥變體的多重比對(duì)。從cDNA庫(kù)中分離來(lái)自小麥變體TaENST1cm-4A和TaENST1cm-4B(栽培品種CM82036)的編碼序列，并用于從參考小麥基因組(栽培品種中國(guó)春(Chinese spring))的分析中檢索不同的變體。使用MULTALIN將得到的序列TaENST1cs-4A、TaENST1cs-4B和TaENST1cs-4D與來(lái)自CM82036栽培品種的序列進(jìn)行比對(duì)和比較。

圖2.不同ENST1同源物的多重比對(duì)。ENST1同源物的編碼序列(A)或相應(yīng)的蛋白質(zhì)序列(B)的比對(duì)。通過(guò)針對(duì)NCBI核苷酸集合、大麥(栽培品種Morex)和二穗短柄草基因組的BLASTn分析鑒定序列?？s寫詞：山羊草(At)、二穗短柄草(Bd)、草甸羊茅(Fp)、大麥(Hv)和小麥(Ta)

圖3.在擬南芥中過(guò)表達(dá)ENST1的轉(zhuǎn)基因系的分子表征。將ENST1的編碼序列引入在組成型雙35S啟動(dòng)子控制下的二元gateway載體pAM-PAT-GWY中，之后使用該構(gòu)建體通過(guò)浸漬花轉(zhuǎn)化擬南芥。(A)通過(guò)PCR驗(yàn)證攜帶ENST1的T-DNA構(gòu)建體在具有與35S啟動(dòng)子和T-DNA構(gòu)建體的終止子匹配的引物的不同擬南芥轉(zhuǎn)基因系(OE-1、OE-2、OE-20)中的插入。將野生型植物(Col-0)和用于轉(zhuǎn)化的載體分別用作PCR陽(yáng)性或陰性對(duì)照。(B)通過(guò)RT-PCR分析確定ENST1在正常植物生長(zhǎng)條件下與野生型植物(Col-0)相比在不同轉(zhuǎn)基因系中的基因表達(dá)。

圖4.在擬南芥中ENST1過(guò)表達(dá)對(duì)水楊酸誘導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡的影響。測(cè)試了野生型植物Col-0(WT)和過(guò)表達(dá)TaENST1-4A(OE-1，OE-2和OE-20)的三個(gè)獨(dú)立系對(duì)水楊酸(SA)的應(yīng)答。幼苗用65μM SA處理或在49℃(10分鐘)處理。處理后24小時(shí)，進(jìn)行根毛測(cè)定，評(píng)估顯示細(xì)胞質(zhì)的回縮和濃縮的根毛的百分比，并且沒(méi)有FDA染色被認(rèn)為其已經(jīng)經(jīng)歷了凋亡型程序性細(xì)胞死亡(AL-PCD)。呈現(xiàn)的值是平均值(n＝3)±SEM。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

圖5.(A)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)和(B)禾谷鐮刀菌對(duì)ENST1的轉(zhuǎn)錄的影響。(A)用DON或吐溫-20(模擬處理)處理栽培品種CM82036小麥的幼苗根、葉和開花的頭部。在處理后24小時(shí)收取組織并用于分析。(B)用野生型禾谷鐮刀菌GZ3639、其DON-負(fù)突變衍生物GZT40或吐溫-20處理小麥頭部。如所指示，在接種后不同時(shí)間點(diǎn)收取組織。數(shù)據(jù)表示相對(duì)于參考基因α-微管蛋白的TaENST1-4A表達(dá)，在實(shí)時(shí)PCR分析后使用2^-ΔCt方法。結(jié)果是三個(gè)(A)或兩個(gè)(B)生物學(xué)重復(fù)的平均值，誤差線表示SEM。

圖6.ENST1的啟動(dòng)子區(qū)驅(qū)動(dòng)β-D-葡糖醛酸糖苷酶活性，如在擬南芥中所證明的。通過(guò)卡那霉素選擇和基于PCR的啟動(dòng)子區(qū)擴(kuò)增，確認(rèn)T2幼苗是純合轉(zhuǎn)化體。將幼苗在DON或模擬處理中孵育并染色用于GUS活性，如圖所示，該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)DON和組織特異性GUS活性。

圖7.在小麥小穗中ENST1的病毒誘導(dǎo)的基因沉默(VIGS)。使用大麥條紋花葉病毒(BSMV)構(gòu)建體BSMV：00(空載體)或BSMV：ENST1(靶向TaENST1-4A的構(gòu)建體)對(duì)小麥栽培品種CM82036的植物進(jìn)行病毒誘導(dǎo)的基因沉默。在第一個(gè)頭部出現(xiàn)之前用三重(tripartite)BSMV質(zhì)粒處理旗葉，隨后在開花中期用DON或吐溫-20(模擬處理)接種。所呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)是接種后14天(dpi)獲得的結(jié)果。(A)通過(guò)實(shí)時(shí)PCR分析對(duì)小麥小穗中的基因沉默進(jìn)行定量，使用2^-ΔCt方法相對(duì)于參照基因α-微管蛋白計(jì)算TaENST1-4A表達(dá)。(B)圖像顯示典型的疾病癥狀。(C)每個(gè)頭部的病害小穗數(shù)目的量化。結(jié)果(A)和(C)是每次處理每個(gè)構(gòu)建體具有約16個(gè)頭部的兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)的平均值。誤差線表示SEM。使用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)確定統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。具有不同字母的列顯著不同(P＜0.05)。

圖8.TaENST過(guò)表達(dá)對(duì)小麥葉片抗禾谷鐮刀菌A、B和C的影響，TaENST過(guò)表達(dá)系(OE-1、OE-2和OE-3)和對(duì)照植物(WT)被用于表型分析。用禾谷鐮刀菌加DON(75μM)處理分離的小麥葉片后4天測(cè)定：A：代表性葉片癥狀、B：病葉面積和C：分生孢子的產(chǎn)生。誤差線表示±SEM。星號(hào)表示與WT相比的顯著差異((B)Tukey′s HSD測(cè)試；(C)Mann-Whitney U測(cè)試；*，P＜0.05；**，P＜0.01；***，P＜0.001)。

圖9.TaENST過(guò)表達(dá)對(duì)小麥FHB疾病易感性的影響。A和B，在開花中期，來(lái)自過(guò)表達(dá)系(OE-1、OE-2和OE-3)或?qū)φ罩参?WT)的中心開花小穗用禾谷鐮刀菌點(diǎn)接種。在接種后7、14和21天評(píng)估疾病，并且所呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)對(duì)應(yīng)于在(A)21天或(B)對(duì)AUDPC的得分。誤差線表示±SEM。星號(hào)表示與WT相比的顯著差異(Mann-Whitney U檢驗(yàn)；*，P＜0.05；**，P＜0.01)。

發(fā)明詳述

本發(fā)明涉及限于草的早熟禾亞科的DON應(yīng)答孤兒基因ENST1，其能夠增強(qiáng)水楊酸誘導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡，抵抗鐮刀菌赤霉病(FHB)毒力因子DON，抵抗鐮刀菌屬真菌和鐮刀菌赤霉病。該基因稱為ENST1(該基因的同義詞是FROG-鐮刀菌抗性孤兒基因)，并且該基因序列提供如下。

ATGGTGTGGTCTACCAGCAAGCAACAAGGAGGAGAGCGAGAAGAATCGAAGCAGCACAAAATGGTAAAAGAGGTGAAGACACCTATCTTCACGCATCAGCTCTCCTTCCATTCTCTTCCCCTTAACAAAGTCAAGAACATCGAGGTCGACCGCTTGAGGCTGTCTTTCACGACGCCGAAAAATTCTACGCTGGTCCCCGTTGATTCCGGTTCTGATGAAGAGAGTGACGAAGATCGAGGCTGTTCGGACATCGATTCTAACAAGCCTATGGACGAAGGGTTAGATCACATCTGTAGTGGTCTGCATGCTATTCCCCGGAAAAACAAAGCAAGATCGGCCAAGAAAAGATCCCATAAGATCAGCTCTAGGAAATTCTACAAAATATTCAGTTGA[SEQ ID NO：1].

該基因編碼核蛋白ENST1，并且已被表征為與應(yīng)激調(diào)節(jié)物SNRK1a和新型NAC轉(zhuǎn)錄因子相互作用的核蛋白，如通過(guò)酵母雙雜交分析所確定的。所述ENST1的序列提供如下。

MVWSTSKQQGGEREESKQHKMVKEVKTPIFTHQLSFHSLPLNKVKNIEVDRLRLSFTTPKNSTLVPVDSGSDEESDEDRGCSDIDSNKPMDEGLDHICSGLHAIPRKNKARSAKKRSHKISSRKFYKIFS[SEQ ID NO：3]

申請(qǐng)人還發(fā)現(xiàn)了應(yīng)答于DON處理而活化的DON應(yīng)答啟動(dòng)子，如通過(guò)基因表達(dá)研究(見圖5)和在攜帶啟動(dòng)子-GUS融合體的擬南芥轉(zhuǎn)化體中的GUS活性的分析(見圖7)所證明的。所述啟動(dòng)子的序列提供如下：

CTGCCTCTTGCGAGCGGGAAGCCAGTGCCACCGCTCGGCATTTCCCGTACATCCGGATCTAAGCTCACCCGTAGCGCGACAATTAGTGGATAGGAGTTGGGGCCTCACCGAGAAGCACTGCCCTTCCTGGTCCTCCTACCTGCAAAGAGGTGAAGATGCGGTCGGCCGCACCGCGGTAGCTCGACGGCTCCGTGAATGGTGGGGCAGATGCCACGTTGCTGCATGGCTCCGCGCGACTGSCMACATGAATGGTGGCGACGGGTACGAAAGTGGCGGCAGCTACAACTTCGCGCCGACATGAGTATCCCGAGCCTCCTTCGCCGTCTCGTGCACCTTTTTTTAACAAATTAAGAAGCTTTTTGCCCTTCTGGGATACTGCTGGGCCCGAGGCGGAGTGAATCTGGGCGGGTTGGGTACAACCATACAAGGAGGAAGAATGTGGGAGTAGTGGGGTGGTTGACCTGCTTTTCTTCGGTTCAGTTCGCTCCTGTTCAAAAGAATGACCAACTAGGAGAAAAAACCAAAAGCAAAAATAAACTGTCAACGTGGCAAGCGCTAAAATTGAGAGAAGAAAAACCAAGTTAAAATGTAAACACGAGGGTAAAATGTGGCACAAAGTGCAAAAGTGAAGGTACTCACCTGCCAAAATGAAAGTGAAGGTGCTCCCTCCTTCCCAAAATATAAGGCGCGGATTGACTTTTCTGGTCTTTATTGTGCAACTTTGACTATAATTTTCATGTATTCGTTACAAGACAAATACGATGATGCCATTTATACATATTCAATCAATATACTTTGATATATATTAATGGTCAAAGTCGTGCATAAAAAACCGCCTTATATTTTAGGAAAGAGGAAGTATAAATTAAGGATTTTCTCCGGGTTAAATGAAATTAACTCTTATTTTATTAATGTCCACACCGGAGGCCTCCCCCTTGTTAGAATCCTGACTCCATCCCTGATCACGGCTGTCCGGTTGGATGCCCACCAAGGCATTTTTCCTCTCCCCGTACATGTGCAAATGGATAGCGACCTTGGCAACCAAGAAAATGGATATCGACAAGATTCGTCAGACGAGTCAGCGACGAAGAACCTTGGCAACCAAGGCGCGCGGCAGCCACCGTGACGATCAAGTCAAATAATCATCTGACCTCGTGCTTCCGCTCACATCCGTCGTTTTCGTCCTGGACGAACCTTCACGCAGCTTTCTCCCCTCAGCTTCTCTCTCTTCGCCCCTCACAACTTATATATAAGTGTCGCACTACTAGATCCTCAAC

[SEQ ID NO：2]

如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“分離的”應(yīng)該理解為從其天然環(huán)境中分離或通過(guò)技術(shù)方法(例如重組DNA技術(shù))產(chǎn)生。

如本文中所用，應(yīng)用于SEQ ID NO：1(enst1基因)的術(shù)語(yǔ)“其功能變體”應(yīng)該理解為與SEQ ID NO：1具有至少60％、62％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性的多核苷酸，并且當(dāng)使用下述方法在擬南芥植物中過(guò)表達(dá)時(shí)，其通常能夠增強(qiáng)水楊酸誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。因此，所述功能變體是指當(dāng)與第一多核苷酸的功能相比時(shí)，以不顯著影響功能的方式從第一多核苷酸序列變化的任何第二多核苷酸，并且這樣的功能變體可以是天然存在的，或者可以是非天然功能變體。圖1中提供了與ENST1具有約94％的序列同源性的SEQ ID NO：1的功能性小麥變體-TaENST 1cs-4A(SEQ ID 26)、TaENST 1cs-4B(SEQ ID 27)和TaENST 1cs-4D(SEQ ID 28)。

如本文中所用，應(yīng)用于SEQ ID NO：2(DON應(yīng)答啟動(dòng)子)的術(shù)語(yǔ)“其功能變體”應(yīng)該理解為與SEQ ID NO：2具有至少40％、42％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性的多核苷酸，該多核苷酸是DON應(yīng)答性的，并且能夠使用下述方法促進(jìn)擬南芥植物中ENST1基因的過(guò)表達(dá)。因此，所述功能變體是指當(dāng)與第一多核苷酸的功能相比時(shí)，以不顯著影響功能的方式從第一多核苷酸序列變化到的任何第二多核苷酸，并且這樣的功能變體可以是天然存在的，或者可以是非天然功能變體。

在本說(shuō)明書中，術(shù)語(yǔ)“序列同一性”應(yīng)該認(rèn)為是包含序列同一性和相似性，即與參考序列具有至少98％序列同一性的基因序列是其中任何98％的比對(duì)核苷酸至少是與參考序列中的相應(yīng)殘基相同或保守取代的基因序列。

在本說(shuō)明書中，術(shù)語(yǔ)“植物材料”應(yīng)該理解為包括植物細(xì)胞的植物的任何組成，包括植物細(xì)胞、植物細(xì)胞培養(yǎng)物、植物組織、植物或來(lái)自植物的種子?！稗D(zhuǎn)基因種子”是指含有引入(理想地，穩(wěn)定引入)其基因組中的轉(zhuǎn)基因的種子。

在本說(shuō)明書中，術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞”應(yīng)該理解為來(lái)自植物或真菌的細(xì)胞。典型地，所述細(xì)胞獲自于單子葉植物或雙子葉植物。在特別優(yōu)選的實(shí)施例中，所述細(xì)胞是植物細(xì)胞，該植物細(xì)胞選自于由以下組成的組：擬南芥；馬鈴薯(即Solanum tuberosum)；煙草(Nicotiana tabaccum)；小麥；大麥；玉米和稻米；大豆；甘藍(lán)型油菜。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因細(xì)胞”應(yīng)該理解為包括引入(理想地穩(wěn)定引入)轉(zhuǎn)基因到其基因組中的細(xì)胞。通常，所述轉(zhuǎn)基因是相對(duì)于細(xì)胞的外源性材料，或者其相對(duì)于細(xì)胞是內(nèi)源性的，但是該細(xì)胞被改造以引入該轉(zhuǎn)基因額外的拷貝。

在本說(shuō)明書中，術(shù)語(yǔ)“植物”應(yīng)該理解為單子葉植物或雙子葉植物。優(yōu)選地，所述植物是單子葉植物。在一個(gè)實(shí)施例中，所述植物來(lái)自禾本科或擬南芥屬。在一個(gè)實(shí)施例中，所述植物是來(lái)自草的早熟禾亞科。在特別優(yōu)選的實(shí)施例中，所述植物是谷類植物，通常是小粒谷物植物，優(yōu)選地選自于由小麥；大麥；玉米；稻；馬鈴薯(即Solanum tuberosum)；煙草(Nicotiana tabaccum)；大豆；甘藍(lán)型油菜(Brassica napus)組成的組。

在本說(shuō)明書中，術(shù)語(yǔ)“重組構(gòu)建體”應(yīng)該理解為旨在用于將外源遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞中的多核苷酸構(gòu)建體。它們有時(shí)被稱為載體。所述構(gòu)建體包括在植物細(xì)胞中作用的啟動(dòng)子區(qū)，其可操作地連接到本發(fā)明分離的多核苷酸。優(yōu)選地，所述啟動(dòng)子是DON應(yīng)答啟動(dòng)子。DON應(yīng)答啟動(dòng)子的實(shí)例是SEQ ID NO：2的多核苷酸及其功能變體。所述構(gòu)建體可以包括多個(gè)序列元件，包含多于一個(gè)的編碼序列、啟動(dòng)子和選擇性標(biāo)記。通常，所述構(gòu)建體或載體包括Ti質(zhì)粒(或其片段)，其適當(dāng)?shù)睾蠺-DNA區(qū)，理想地含有至少一個(gè)或多個(gè)毒力基因。優(yōu)選地，所述Ti質(zhì)?；蚱淦潍@得于農(nóng)桿菌。合適地，將所述轉(zhuǎn)基因引入Ti質(zhì)粒的T-DNA區(qū)。更優(yōu)選地，將所述轉(zhuǎn)基因引入T-DNA區(qū)的左邊界和右邊界之間。所述Ti質(zhì)粒可以包括選擇性標(biāo)記基因，盡管這不是必需的，因?yàn)槔缈梢酝ㄟ^(guò)高通量PCR快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因的成功轉(zhuǎn)化。當(dāng)使用時(shí)，所述選擇性標(biāo)記基因適當(dāng)?shù)匕赥-DNA區(qū)內(nèi)部，并理想地可操作地連接到該轉(zhuǎn)基因。

術(shù)語(yǔ)“在植物細(xì)胞中作用的啟動(dòng)子區(qū)”是指能夠在用包括可操作連接到轉(zhuǎn)基因的啟動(dòng)子的重組構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物中驅(qū)動(dòng)可操作連接的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的多核苷酸序列。通常，所述啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)該轉(zhuǎn)基因的過(guò)表達(dá)。啟動(dòng)子的實(shí)例包含玉米泛素啟動(dòng)子和35S花椰菜花葉病毒啟動(dòng)子。優(yōu)選地，所述啟動(dòng)子是DON應(yīng)答啟動(dòng)子。理想地，所述DON應(yīng)答啟動(dòng)子包括SEQ ID NO：2的多核苷酸。

術(shù)語(yǔ)“DON應(yīng)答啟動(dòng)子”是指在植物細(xì)胞中有功能并且應(yīng)答霉菌毒素脫氧雪腐鐮刀菌烯醇或DON類似物/衍生物而被活化的啟動(dòng)子區(qū)。DON應(yīng)答啟動(dòng)子的實(shí)例是包括所述SEQ ID NO：2的多核苷酸的啟動(dòng)子區(qū)。由DON應(yīng)答啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的基因的其它實(shí)例包括葡糖基轉(zhuǎn)移酶和多重耐藥性蛋白(Poppenberger等人，2003；Walter等人，2015)。

在本說(shuō)明書中，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化平臺(tái)”應(yīng)該理解為將轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中所需的遺傳機(jī)構(gòu)，并且通常包括能夠介導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化并含有本發(fā)明重組構(gòu)建體的生物體，例如細(xì)菌。轉(zhuǎn)化平臺(tái)的實(shí)例包括大腸桿菌、根癌土壤桿菌、粘著劍菌(E.adhaerens)和某些細(xì)菌“轉(zhuǎn)座子(transbacter)”菌株。其它實(shí)例包括：基因槍轉(zhuǎn)化和花浸漬。

在本說(shuō)明書中，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因”應(yīng)該理解為本發(fā)明的分離的多核苷酸及其功能變體。

在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，所述轉(zhuǎn)基因可以促進(jìn)非農(nóng)藝性狀的轉(zhuǎn)移。

術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”應(yīng)該理解為在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中所述啟動(dòng)子將與轉(zhuǎn)基因一起轉(zhuǎn)移，并且該轉(zhuǎn)基因?qū)⒃趩?dòng)子的控制下。

在本說(shuō)明書中，術(shù)語(yǔ)“選擇性標(biāo)記”被認(rèn)為是指當(dāng)引入宿主DNA中時(shí)將給予有效轉(zhuǎn)化的可檢測(cè)信號(hào)的外源遺傳物質(zhì)片段。在優(yōu)選的實(shí)施例中，所述選擇性標(biāo)記基因選自于包括：hph、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II[NPT II/Neo])、aadA和tetR的組。適當(dāng)?shù)膱?bào)告轉(zhuǎn)基因可以包括GUS或GFP。

在另一個(gè)實(shí)施例中，所述轉(zhuǎn)基因基因還用作選擇性標(biāo)記基因，其中由轉(zhuǎn)化細(xì)胞展示的性狀用作成功引入轉(zhuǎn)基因的選擇性標(biāo)記。例如，所述轉(zhuǎn)基因可給予對(duì)特定疾病或抗生素的抗性，其中所述轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可通過(guò)其能夠在先前不可存活的條件下生長(zhǎng)而被鑒定。典型地，抗生素抗性選自于對(duì)抗生素如潮霉素、卡那霉素、壯觀霉素、四環(huán)素和氨芐青霉素的抗性。合適地，所述轉(zhuǎn)基因給予對(duì)包含馬鈴薯枯萎病在內(nèi)的疾病的抗性。

在優(yōu)選的實(shí)施例中，所述轉(zhuǎn)基因不與選擇性標(biāo)記基因連接，并且通過(guò)PCR/高通量基因測(cè)序檢測(cè)所述轉(zhuǎn)基因在轉(zhuǎn)化植物中的成功引入。

優(yōu)選地，所述Ti質(zhì)粒含有一個(gè)或多個(gè)毒力基因，其中至少一個(gè)毒力基因通常選自于由virA、virB、virC、virD、virE、virG、virK和virJ或其功能變體組成的組。理想地，至少6、7或8種上述毒力基因包含在所述轉(zhuǎn)化載體上。優(yōu)選地，至少6、7或8種上述毒力基因形成所述Ti質(zhì)粒的一部分。毒力基因的功能性變體是已經(jīng)通過(guò)例如一個(gè)或多個(gè)核苷酸的修飾而被遺傳修飾的毒力基因，例如在本領(lǐng)域中稱為“定向進(jìn)化”的過(guò)程中。

材料和方法

DNA、RNA提取和cDNA合成

按照廠商的說(shuō)明書用試劑盒HP plant DNA迷你試劑盒(OMEGA)提取DNA。對(duì)小麥頭部如先前所述(Ansari等人，2007)或?qū)ζ渌参锝M織根據(jù)廠商的說(shuō)明書使用RNeasy植物試劑盒(Qiagen)提取RNA。根據(jù)廠商的說(shuō)明書使用TURBO DNA-free^TM試劑盒(Ambion Inc.，USA)對(duì)提取的總RNA進(jìn)行DNA酶處理。通過(guò)用Nanodrop測(cè)量UV吸光度并在瓊脂糖凝膠上電泳后分析RNA的質(zhì)量、產(chǎn)量和完整性。通過(guò)PCR證實(shí)不存在DNA污染。如前所述(Walter等人，2008)進(jìn)行總RNA的逆轉(zhuǎn)錄。

ENST1 mRNA的擴(kuò)增和測(cè)序

ENST1的mRNA序列是使用從DON處理的小麥栽培品種CM82036的頭部提取的RNA和GeneRacer TM試劑盒(Invitrogen)通過(guò)三次連續(xù)的RACE(cDNA末端的快速擴(kuò)增)獲得的。根據(jù)廠商的說(shuō)明書，使用SuperScript^TM III RT(Invitrogen)將RNA去磷酸化、脫帽和逆轉(zhuǎn)錄?；蛱禺愋砸镌斠娧a(bǔ)充表1。初始降落PCR反應(yīng)(50μl終體積)含有200nM正向或反向基因特異性引物(GSP1引物)、600nM 5'或3'GeneRacer引物、1×高保真緩沖液、2.5U高保真度鉑taq聚合酶(Invitrogen)、2mM MgSO₄、200μM的每種dNTP、1μl cDNA。PCR反應(yīng)條件包括在94℃2分鐘的初始變性步驟，然后是94℃30秒、72℃1分鐘的5個(gè)循環(huán)；94℃30秒、70℃1分鐘的5個(gè)循環(huán)；在94℃30秒的25個(gè)循環(huán)，最后在68℃30秒退火，72℃1分鐘一個(gè)循環(huán)。隨后兩輪嵌套PCR(50μl體積)含有1μl的1:300稀釋的嵌套PCR(50μl體積)，其含有1μl的1:300稀釋的預(yù)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物、2.5U LA Taq和1×TaKaRa LA Taq^TM Mg²⁺加緩沖液(Takara，Japan)、200μM dNTP(Gibco，UK)、200nM的5'或3'嵌套的GeneRacer引物和200nM的正向或反向嵌套基因特異性引物(GSP2)。PCR反應(yīng)條件包括在94℃初始變性1分鐘，然后是94℃30秒、65℃30秒和68℃2分鐘的25個(gè)循環(huán)。最終延伸設(shè)定為68℃10分鐘。將擴(kuò)增的片段克隆到TOPO TA試劑盒(Invitrogen，UK)中并測(cè)序。

生物信息學(xué)分析

基于從RACE-PCR獲得的序列，使用NCBI的ORF查找器(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)推導(dǎo)開放閱讀框(ORF)和編碼序列(CDS)。結(jié)果通過(guò)BLASTn查詢來(lái)自NCBI的GenBank中可用的cDNA序列、數(shù)據(jù)庫(kù)KOMUGi(http://www.shigen.nig.ac.jp/wheat/komugi/)、來(lái)自國(guó)際小麥基因組測(cè)序聯(lián)盟的基因組序列(http://wheat-urgi.versailles.inra.fr/Seq-Repository)和草圖基因組集合(http://www.cerealsdb.uk.net/cerealgenomics/CerealsDB)獲得的結(jié)果分析確認(rèn)。所有的序列比對(duì)和序列分析用Multalin軟件(http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html)和Bioedit(http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html)進(jìn)行。從該分析中，在本研究中克隆的ORF位于小麥染色體4A上，并且該變體命名為TaENST1-4A。同源基因和兩個(gè)其它小麥變體(TaENST1-4B和TaENST1-4D)是從上述相同數(shù)據(jù)庫(kù)加上國(guó)際大麥測(cè)序聯(lián)盟(http://webblast.ipk-gatersleben.de/barley/viroblast.php)和MIPS短柄草位點(diǎn)(http://mips.helmholtz-muenchen.de/proj/plant/jsf/brachypodium/index.jsp)的分析推導(dǎo)的。

克隆ENST1啟動(dòng)子區(qū)和產(chǎn)生啟動(dòng)子：GUS融合。

使用Universal Genome Walker試劑盒(Clontech Laboratories，Inc.，Palo Alto，CA，USA)獲得ENST1基因的啟動(dòng)子區(qū)(小麥栽培品種CM82036)的片段。使用Genome walker文庫(kù)，我們用ENST1基因特異性引物和Advantage基因組聚合酶混合物(Clontech，Palo Alto，CA，USA)來(lái)準(zhǔn)備初級(jí)和嵌套式PCR?；赥aENST1 cDNA序列設(shè)計(jì)所述基因特異性引物。嵌套的PCR產(chǎn)物用1.5％的瓊脂糖凝膠純化，并亞克隆到pCRR2.1-TOPO載體(Invitrogen，Carlsbad，USA)中。然后將所述克隆的載體在Macrogen中測(cè)序。為了構(gòu)建所述ENST1啟動(dòng)子::GUS質(zhì)粒，我們使用正向引物5'GCTCTAGACTGCCTCTTGCGAGCGGGAAG-3'(SEQ ID 4)和反向引物：5'CAGGATCCCACTTCAGGCACTCTCTCTTTCTGTG-3'(SEQ ID 5)擴(kuò)增啟動(dòng)子區(qū)。將所有擴(kuò)增的DNA測(cè)序并確認(rèn)其是正確的，然后使用Xba I-BamHI消化，并克隆到pBI101.1載體(Jefferson R A，1987)。

植物材料和生長(zhǎng)條件

擬南芥登錄Columbia Col-0用于本研究。使用gateway克隆策略(在補(bǔ)充表1中列出的引物組)，使用pDONR207(Invitrogen)以及隨后pAM-PATgateway載體作為最終載體，產(chǎn)生在CaMV 35S啟動(dòng)子控制下表達(dá)ENST1(TaENST1-4A變體)編碼序列的轉(zhuǎn)基因植物(Col-0)(Bernoux等人，2008)。通過(guò)花浸漬方法(Logemann等人，2006)，進(jìn)行在所述ENST1啟動(dòng)子控制下的ENST1表達(dá)或GUS表達(dá)的擬南芥的轉(zhuǎn)化，并且在研究對(duì)BASTA的抗性(基因表達(dá)研究)或卡那霉素抗性(啟動(dòng)子研究)之后獲得純合系的選擇。三個(gè)獨(dú)立的純合轉(zhuǎn)基因系用于所述啟動(dòng)子融合和基因表達(dá)的研究。植物在土壤混合物2：2：1(多用途三葉草、John Innes Compost No 2和蛭石)上生長(zhǎng)用于種子生產(chǎn)。在黑暗處4℃下分層三天后，將該植物在16h光照/8h黑暗的光周期、70％相對(duì)濕度、20-22℃的生長(zhǎng)室中生長(zhǎng)。

小麥栽培品種CM82036對(duì)FHB疾病和DON處理都是抗性的，由Hermann Buerstmayr博士(IFA Tulln，奧地利)友好地提供。如前所述(Ansari等人，2007)，成株在封閉環(huán)境條件下生長(zhǎng)。在開花中期(生長(zhǎng)期Zadoks 65)，用15μl的5mg/ml(即16.9mM)DON(Santa Cruz)0.02％吐溫-20、20μl 10⁶分生孢子/ml的禾谷鐮刀菌GZ3639(WT)或GTZ40(非DON生產(chǎn)者)0.02％吐溫-20或?qū)φ仗幚?0.02％吐溫-20)將所述頭部接種到兩個(gè)中央小花中。接種后，頭部用塑料袋覆蓋2天。在附圖圖例中所示的處理后不同時(shí)間收取處理的小穗。對(duì)于該時(shí)間過(guò)程實(shí)驗(yàn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)應(yīng)于來(lái)自各個(gè)植物的4個(gè)頭部的庫(kù)。對(duì)于葉子處理，收集第二葉(生長(zhǎng)期Zadoks 10)，放置在正方形培養(yǎng)皿中用10ml 0.67mM苯并咪唑浸濕的潮濕Whatman No.1濾紙(Whatman,UK)上，并用兩片含0.67mM苯并咪唑的1％瓊脂保持在它們的末端。用10μl 100μg/ml DON 0.02％吐溫-20處理輕傷葉，并在生長(zhǎng)室中在70％相對(duì)濕度、20-22℃下用16h光照/8h黑暗的光周期孵育。對(duì)于根處理，將幼苗植物在潮濕的Whatman濾紙上在20℃下發(fā)芽3天，然后放置在有Whatman濾紙的新培養(yǎng)皿中，該濾紙用6ml的20μg/ml DON 0.02％吐溫-20(即67.5μM)或0.02％吐溫-20(對(duì)照)浸濕。發(fā)芽幼苗在黑暗中20℃下孵育。對(duì)于收取，將所有不同的樣品在液氮中快速冷凍，并在RNA提取之前在-70℃儲(chǔ)存。

所述小麥栽培品種Fielder及其轉(zhuǎn)基因衍生物用于疾病評(píng)估研究。過(guò)表達(dá)ENST的轉(zhuǎn)基因小麥栽培品種Fielder如下產(chǎn)生。使用所述gateway克隆策略和pDONR207載體(Invitrogen)克隆ENST CDS；隨后將該基因克隆入二元載體pSc4ActR1R2(在水稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的控制下)(McElroy等人，1990)。然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株AGL-1中，并與未成熟小麥胚在23℃在黑暗中共培養(yǎng)2天(Ishida等人，2015)。除去胚軸后，基本上如前所述進(jìn)行該植物材料的后續(xù)組織培養(yǎng)(Risacher等人，2009)。通過(guò)qPCR分析從再生的植株(plantlet)中分離的DNA，以確定相對(duì)于內(nèi)部對(duì)照(Craze等人，在制備中)的nptII選擇性標(biāo)記基因的拷貝數(shù)。攜帶T-DNA(在OE-1和OE-2系中有1個(gè)拷貝；在OE-3系中有1-2個(gè)拷貝)和過(guò)表達(dá)ENST的T0轉(zhuǎn)基因植物繁殖到T3代：植物生長(zhǎng)在用16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗的光周期在20-22℃、300μmol m^-2s^-1、70％相對(duì)濕度的封閉環(huán)境條件下，如前所述(Ansari等人，2007)。通過(guò)測(cè)試所述構(gòu)建體的存在-不存在并計(jì)算每代中的分離比來(lái)分析純合性。選擇轉(zhuǎn)基因系OE-1、OE-2和OE-3用于禾谷鐮刀菌研究，基于與野生型植物相比，它們分別表現(xiàn)出ENST基因表達(dá)的218、445和80倍增加。

真菌培養(yǎng)接種物

在綠豆肉湯中(Bai和Shaner，1996)產(chǎn)生禾谷鐮刀菌野生型GZ3639和單端孢霉烯-負(fù)性突變體衍生物GZT40的無(wú)性分生孢子接種物(大分生孢子)(Proctor等人，1995)，并收取、洗滌并調(diào)節(jié)至10⁶分生孢子/ml，全部如前所述(Brennan等人，2005)。

實(shí)時(shí)和半定量RT-PCR分析

使用Stratagene Mx3000TM實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行實(shí)時(shí)RT-PCR(qRT-PCR)分析。每個(gè)反應(yīng)用1.25μl的1：5(v/v)稀釋的第一cDNA鏈0.2μM每種引物1XPremix Ex Taq^TM(Tli RNase H plus，RR420A，Takara)進(jìn)行，其總反應(yīng)體積為12.5μl，具有以下條件：在95℃1分鐘的1個(gè)循環(huán)；在95℃5秒和在60℃20秒的40個(gè)循環(huán)；以及在95℃1分鐘、55℃30秒和95℃30秒的最終循環(huán)，用于解離曲線。通過(guò)解離曲線的分析和通過(guò)擴(kuò)增產(chǎn)物大小的可視化來(lái)驗(yàn)證擴(kuò)增特異性。小麥α-微管蛋白(gb：U76558.1)(Xiang等人，2011)用作管家基因并且經(jīng)驗(yàn)證不受用于我們的分析和可用的微陣列表達(dá)數(shù)據(jù)(PLEXdb)的處理的影響。所有實(shí)時(shí)RT-PCR分析進(jìn)行兩次重復(fù)(從獨(dú)立逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的兩個(gè)cDNA)。如先前所述(Livak和Schmittgen，2001)，使用通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR獲得的閾值循環(huán)(C_T)值來(lái)使用公式2^{-(CT靶基因-CT管家基因)}計(jì)算相對(duì)基因表達(dá)。

對(duì)于半定量RT-PCR(sqRT-PCR)，通過(guò)用擬南芥屬肌動(dòng)蛋白8基因的PCR擴(kuò)增來(lái)校準(zhǔn)模板，然后用與TaENST1-4A的CDS匹配的引物組測(cè)定轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。熱循環(huán)參數(shù)為5分鐘95℃；在45秒95℃、45秒60℃、45秒72℃的30或35個(gè)循環(huán)；以及5分鐘72℃的最終延伸。用safeView核酸染色(NBS-SV)染色后，在UV光下在1.5％瓊脂糖凝膠上電泳遷移后顯現(xiàn)PCR產(chǎn)物。使用的引物組列于補(bǔ)充表1中。用于TaENST1-4A的引物組被設(shè)計(jì)為對(duì)染色體4A ENST1變體是特異性的，并且不與用于所述VIGS的基因片段重疊。通過(guò)對(duì)相應(yīng)產(chǎn)物測(cè)序來(lái)驗(yàn)證特異性。

病毒誘導(dǎo)基因沉默(VIGS)

本研究中使用的大麥條紋花葉病毒(BSMV)衍生的VIGS載體由野生型BSMV ND18α、β、γ三聯(lián)基因組(Scofield等人，2005；Holzberg等人，2002)組成。VIGS分析用于沉默ENST1，其與TaENST1-4A具有100％同源性，但是我們不能排除潛在地影響兩個(gè)其它變體TaENST1-4B和TaENST1-4D(每個(gè)91％的同源性)。使用引物組VIGS Pac1用于/VIGS Not1rev(表1)從TaENST1-4A的保守結(jié)構(gòu)域擴(kuò)增用于VIGS的片段，并克隆到pGEM-T載體(pGEM-T Easy克隆試劑盒；Promega)中。通過(guò)用NotI和PacI消化來(lái)釋放片段，通過(guò)凝膠提取純化并以反義方向連接到NotI/Pac1-消化的BSMVγ載體pSL038-1中(Scofield等人，2005)。通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證帶有沉默片段(BSMV：TaENST1)的pSL038-1質(zhì)粒。含有大麥八氫番茄紅素去飽和酶基因(BSMV：PDS)的185bp片段的BSMVγ載體構(gòu)建體用作VIGS的陽(yáng)性對(duì)照，并且之前已經(jīng)描述過(guò)(Scofield等人，2005)，沉默導(dǎo)致植物過(guò)早漂白(結(jié)果未顯示)。含有不具有植物片段(BSMV：00)或具有BSMV：ENST1和BSMV：PDS的BSMVα、γ基因組的載體用MluI線性化。具有BSMVβ基因組的載體用SpeI線性化。使用mMessage mMachine T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(AM1344，Ambion)根據(jù)廠商的方案從線性化質(zhì)粒制備加帽的體外轉(zhuǎn)錄物。在第一個(gè)小麥頭部出現(xiàn)之前，將小麥栽培品種CM82036的植物旗葉按照描述的方案(Scofield等人，2005)用BSMV構(gòu)建體摩擦接種。用BSMVα、β和γRNA(BSMV：00)的體外轉(zhuǎn)錄物或含有植物片段(BSMV：PDS或BSMV：TaENST1)的衍生物γRNA的1:1:1混合物進(jìn)行摩擦接種。在開花中期，如上所述用DON或?qū)φ?模擬處理)處理BSMV感染植物的頭部的兩個(gè)中央小穗。在處理的小穗上方的第三小穗在DON處理后24小時(shí)取樣，在液氮中快速冷凍，并在通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR分析進(jìn)行沉默確認(rèn)之前儲(chǔ)存在-70℃。在DON接種后14天評(píng)估受損(褪色和壞死)小穗(包含處理的小穗)的數(shù)量。在兩次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的每一次中對(duì)16個(gè)小穗(8株植物)進(jìn)行每種處理組合。

分離葉病評(píng)估研究

如前所述(Browne和Cooke，2004)，使用小麥栽培品種Fielder和過(guò)表達(dá)TaENST的轉(zhuǎn)基因系進(jìn)行分離葉病試驗(yàn)。從3葉期植物的第二葉(生長(zhǎng)期13；(Zadoks等人，1974))切下8cm切片。將葉切片放置在培養(yǎng)皿(90mm直徑)的表面上且其近軸側(cè)面向上。將切割的末端放置在含有0.5mM苯并咪唑的1％植物瓊脂pH5.7(Duchefa)的夾層之間(從該板的中心移除瓊脂，以防止在葉接種點(diǎn)過(guò)量的真菌生長(zhǎng))。將每個(gè)葉切片的中心穿孔，并用4μl的0.02％吐溫-20(模擬)小滴處理或用增加10⁶分生孢子/ml的禾谷鐮刀菌菌株GZ3639或10⁶分生孢子/ml菌株GZ3639加75μM DON的這種溶液處理。將板在20℃下在16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗的循環(huán)下孵育。接種后4天分析葉切片。使用FIJI軟件拍照葉切片并估算病害葉面積(Schindelin等人，2012)。將葉切片浸入水中并劇烈渦旋，并使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器(Hycor Biomedical)對(duì)產(chǎn)生的大分生孢子進(jìn)行計(jì)數(shù)。有三個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)包含6個(gè)板每種處理，每個(gè)板包含兩個(gè)葉片段每種小麥基因型。

對(duì)t的FHB評(píng)估和DON研究

培養(yǎng)小麥栽培品種Fielder和過(guò)表達(dá)TaENST的轉(zhuǎn)基因系，并用20μl的10⁶分生孢子/ml禾谷鐮刀菌菌株GZ3639或吐溫-20(模擬)(FHB實(shí)驗(yàn))如上所述處理頭部(VIGS)。通過(guò)在接種后7、14和21天對(duì)受感染的小穗的數(shù)目進(jìn)行視覺(jué)評(píng)分來(lái)計(jì)算感染水平，并且將數(shù)據(jù)用于計(jì)算疾病進(jìn)展曲線下的面積(AUDPC)(Shaner，1977)。有三個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)包含至少20個(gè)頭部(10株植物)每種處理。

根毛測(cè)定

根毛測(cè)定如前所述進(jìn)行(Kacprzyk等人，2014)。簡(jiǎn)言之，將5天齡的幼苗用65μM SA溶液處理，并在22℃下在恒定光照下孵育直到得分。通過(guò)用熒光素二乙酸酯(FDA)染色和在波長(zhǎng)485nm激發(fā)熒光素發(fā)射的顯微鏡下檢查根毛活力來(lái)評(píng)估凋亡型程序細(xì)胞死亡(AL-PCD)。當(dāng)具有濃縮的細(xì)胞內(nèi)容物并且原生質(zhì)體從細(xì)胞壁縮回時(shí)，進(jìn)一步檢查FDA染色陰性的根毛并記分為程序性細(xì)胞死亡(PCD)(與沒(méi)有縮回的細(xì)胞質(zhì)的壞死細(xì)胞相反，因此在光學(xué)顯微鏡下與活細(xì)胞相比沒(méi)有可區(qū)分的形態(tài))。每個(gè)類別的百分比計(jì)算為對(duì)至少三次重復(fù)平均的得分的根毛總數(shù)(約100)的百分比。

GUS分析

將幼苗如上所述(Poppenberger等人，2003)在DON或模擬處理中孵育，并且在模擬或DON處理中孵育后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行GUS染色。根據(jù)公開的方法(Jefferson R A，1987)進(jìn)行組織化學(xué)染色。

統(tǒng)計(jì)分析

所有的統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS統(tǒng)計(jì)版本20軟件(SPSS)進(jìn)行。用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)分布的正態(tài)性。在基因表達(dá)、分生孢子產(chǎn)生、DON和鐮刀菌赤霉病數(shù)據(jù)集的情況下，使用Mann-Whitney U或Kruskal-Wallis檢驗(yàn)比較各個(gè)處理。來(lái)自分離葉實(shí)驗(yàn)的正態(tài)分布的感染葉面積數(shù)據(jù)通過(guò)結(jié)合Tukey's HSD檢驗(yàn)的ANOVA以0.05的顯著性水平進(jìn)行評(píng)估。

結(jié)果

ENST1分析

使用RACE-PCR方法，我們克隆了來(lái)自于小麥栽培品種CM82036的ENST1 ORF。生物信息學(xué)分析顯示推導(dǎo)的CDS與所述中國(guó)春染色體4A中的序列具有100％的核苷酸同源性。于是，我們將該基因命名為TaENST1-4A。位于中國(guó)春染色體4B(TaENST1cs-4B)和4D(TaENST1cs-4D)上的存在于小麥基因組中的兩個(gè)其它變體被鑒定為與TaENST1-4A具有高同源性(圖1)。進(jìn)一步的分析顯示TaENST1-4A序列與任何特征基因或蛋白質(zhì)沒(méi)有顯著的同源性。TaENST1-4A的同源物僅在禾本科(小麥、大麥、羊茅屬植物(Festuca)、山羊草(Aegilops)和短柄草)中發(fā)現(xiàn)(圖2A)。在蛋白質(zhì)水平上，TaENST1-4A與兩種其它小麥變體和節(jié)節(jié)麥具有≥90％、與大麥具有87％、與羊茅屬植物具有67％以及與短柄草具有45％的同一性(圖2B)。

ENST1對(duì)程序性細(xì)胞死亡的影響

為了理解ENST1如何參與DON抗性，使用所述pAM-PAT載體(注意在擬南芥中沒(méi)有內(nèi)源ENST1同源物)產(chǎn)生在所述CaMV 35S啟動(dòng)子控制下表達(dá)ENST1保守結(jié)構(gòu)域的擬南芥轉(zhuǎn)基因系。在本研究中使用三個(gè)獨(dú)立的純合系OE-1、OE-2和OE-20。首先通過(guò)PCR對(duì)所述T-DNA的存在進(jìn)行特征驗(yàn)證(圖3A)，然后通過(guò)RT-PCR確認(rèn)轉(zhuǎn)基因系的正確ENST1過(guò)表達(dá)(圖3B)。這些ENST1表達(dá)系在正常植物生長(zhǎng)條件下沒(méi)有表現(xiàn)出形態(tài)或發(fā)育改變(數(shù)據(jù)未顯示)。

SA的外源性應(yīng)用誘導(dǎo)不同植物和組織中的程序性細(xì)胞死亡(PCD)，如擬南芥中的根毛。使用根毛測(cè)定法測(cè)試SA誘導(dǎo)的PCD是否在ENST1表達(dá)者中改變。在條件對(duì)照(水處理)中，在處理一天后測(cè)量根毛中的細(xì)胞死亡，并顯示在不同植物之間沒(méi)有差異的PCD的基礎(chǔ)水平(圖4)。在SA處理后，在WT植物中觀察到PCD的顯著誘導(dǎo)。但SA在表達(dá)ENST1的植物中誘導(dǎo)顯著更高的PCD(圖4)。ENST1表達(dá)不增強(qiáng)由熱誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(圖4)，表明其不是對(duì)細(xì)胞死亡的一般效應(yīng)，而是對(duì)包含至少水楊酸的特定處理是特異性的。

ENST1啟動(dòng)子和基因表達(dá)的表征

為了證實(shí)ENST1對(duì)毒素DON有應(yīng)答，使用實(shí)時(shí)RT-PCR測(cè)定(對(duì)TaENST1-4A特異性)測(cè)量用所述毒素處理的不同小麥組織中的基因表達(dá)水平。在模擬處理的樣品中ENST1的基礎(chǔ)表達(dá)非常低或者幾乎不可檢測(cè)，相反在用所述毒素處理的所有組織中觀察到高表達(dá)(圖5A)。為了確定ENST1基因表達(dá)是否由脫氧雪腐鐮刀菌烯醇產(chǎn)生者禾谷鐮刀菌(菌株GZ3639)誘導(dǎo)，在真菌接種后的最初幾天內(nèi)測(cè)量用真菌感染的小穗中的表達(dá)水平。結(jié)果表明ENST1在接種后1天(接種后天數(shù)(dpi))被早期誘導(dǎo)；在2dpi具有誘導(dǎo)峰值，隨后返回到基本水平(圖5B)。在相同的實(shí)驗(yàn)中，我們分析了GZ3639的DON非產(chǎn)生突變體衍生物(即GZT40)對(duì)ENST1表達(dá)的影響。在接種后的所有天，GZT40對(duì)ENST1表達(dá)的誘導(dǎo)非常低(圖3B)。因此，我們推斷ENST1是早期宿主對(duì)鐮刀菌屬真菌產(chǎn)生毒素的應(yīng)答的一個(gè)組成部分。在DON或模擬處理中孵育后，在所述ENST1啟動(dòng)子(上游序列)的控制下表達(dá)GUS基因的轉(zhuǎn)基因植物對(duì)GUS活性染色。如圖6所示，活性是DON和組織依賴性。

TaENST增強(qiáng)小麥葉對(duì)禾谷鐮刀菌的抗性

使用分離葉測(cè)定，相對(duì)于野生型植物，評(píng)價(jià)禾谷鐮刀菌(菌株GZ3639)在過(guò)表達(dá)TaENST的轉(zhuǎn)基因系OE-1、OE-2和OE-3上的傳播和孢子形成。與野生型植物相比，過(guò)表達(dá)者中的疾病和孢子形成減少。因此，TaENST的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了小麥對(duì)禾谷鐮刀菌定殖的抗性(圖8)。TaENST的過(guò)表達(dá)延緩了FHB疾病癥狀的傳播

評(píng)價(jià)了TaENST過(guò)表達(dá)對(duì)來(lái)自接種的小麥頭部的中央小穗的FHB癥狀的傳播的影響。結(jié)果表明，野生型栽培品種Fielder在處理后21天有平均5.1個(gè)病斑的小穗。所有三個(gè)轉(zhuǎn)基因系顯示較少的疾病傳播；相對(duì)于野生型植物，OE-1和OE-2分別觀察到顯著減少23％和17％。在處理后21天觀察到的OE-3的減少不顯著，但是，如OE1，OE3系的疾病進(jìn)展(用7、14和21dpi的疾病評(píng)分計(jì)算AUDPC評(píng)估)顯著低于野生型植物(WT)?？傮w上，結(jié)果表明TaENST的過(guò)表達(dá)提供了對(duì)FHB的定量抗性。(圖9)

ENST1在DON抗性中的作用

我們使用病毒誘導(dǎo)基因沉默(VIGS)來(lái)測(cè)試ENST1在小麥抗DON中起作用的假說(shuō)。我們用靶向ENST1或PDS(陽(yáng)性對(duì)照)或無(wú)基因(陰性對(duì)照)的VIGS構(gòu)建體處理植物用于沉默。在主要頭部出現(xiàn)之前，將構(gòu)建體施用于抗毒性小麥栽培品種CM82036的旗葉。大約兩個(gè)星期后，在中間開花期用DON(16.9mM)或模擬0.2％吐溫20處理兩個(gè)中央小穗。在1dpi，除去已經(jīng)處理的一個(gè)小穗上面的一個(gè)，并用于使用實(shí)時(shí)RT-PCR測(cè)量ENST1(TaENST1-4A變體)的表達(dá)水平。如前所示，在非毒素處理的植物(模擬)中觀察到非常低的ENST表達(dá)，無(wú)論是在對(duì)照(BSMV：00)還是沉默植物(BSMV：ENST1)(圖7A)中。在所述模擬BSMV：00-處理的植物中，通過(guò)DON將ENST1誘導(dǎo)43倍。但是，由于BSMV：TaENST1植物處理導(dǎo)致的ENST1沉默將DON誘導(dǎo)降低了77％(與Don處理的、BSMV：00處理的植物相比)(圖7A)。這些表明ENST1的基因沉默在DON處理的小麥頭部中是有效的。我們測(cè)量了毒素處理后14天DON對(duì)植物的表型效應(yīng)。用BSMV：TaENST1處理的植物對(duì)于DON誘導(dǎo)的小穗損傷比非沉默植物BSMV：00更敏感(圖7B和7C)。ENST1沉默小穗的數(shù)目顯示DON誘導(dǎo)的損傷顯著大于BSMV：00處理的(2.5倍增加)。因此表明ENST1在DON抗性中的直接作用。

表1.本研究中使用的引物。

參考文獻(xiàn)

Ansari KI，Walter S，Brennan JM，Lemmens M，Kessans S，McGahern A，Egan D，Doohan FM(2007)Retrotransposon and gene activation in wheat in response to mycotoxigenic and non-mycotoxigenic-associated Fusarium stress.Theoretical and Applied Genetics 114(5)：927-937

Bai G-H，Shaner G(1996)Variation in Fusarium graminearum and cultivar resistance to wheat scab.Plant Disease 80(9)：975-979

Bemoux M，Timmers T，Jauneau A，Brière C，de Wit PJ，Marco Y，Deslandes L(2008)RD19，an Arabidopsis cysteine protease required for RRS1-R-mediated resistance，is relocalized to the nucleus by the Ralstonia solanacearum PopP2 effector.The Plant Cell Online 20(8)：2252-2264

Brennan J，Egan D，Cooke B，Doohan F(2005)Effect of temperature on head blight of wheat caused by Fusarium culmorum and F.graminearum.Plant pathology 54(2)：156-160

Delaney TP，Uknes S，Vernooij B，F(xiàn)riedrich L，Weymann K，Negrotto D，Gaffney T，Gut-Rella M，Kessmann H，Ward E(1994)A central role of salicylic acid in plant disease resistance.Science 266(5188)：1247-1250

J，Volrath S，Knauf-Beiter G，Hengy G，Beckhove U，Kogel K-H，Oostendorp M，Staub T，Ward E，Kessmann H(1996)Benzothiadiazole，a novel class of inducers of systemic acquired resistance，activates gene expression and disease resistance in wheat.The Plant Cell Online 8(4)：629-643

Holzberg S，Brosio P，Gross C，Pogue GP(2002)Barley stripe mosaic virus-induced gene silencing in a monocot plant.The Plant Journal 30(3)：315-327

Jefferson R A KTAaBM W(1987)GUS fusions：beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants.The Embo Journal 6：7

Kacprzyk J，Devine A，McCabe PF(2014)The Root Hair Assay Facilitates the Use of Genetic and Pharmacological Tools in Order to Dissect Multiple Signalling Pathways That Lead to Programmed Cell Death.PloS one 9(4)：e94898

Lawton KA，F(xiàn)riedrich L，Hunt M，Weymann K，Delaney T，Kessmann H，Staub T，Ryals J (1996)Benzothiadiazole induces disease resistance in Arabidopsis by activation of the systemic acquired resistance signal transduction pathway.The Plant Journal 10(1)：71-82

Livak KJ，Schmittgen TD(2001)Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2^-ΔΔCTMethod.methods 25(4)：402-408

Logemann E，Birkenbihl RP，B，Somssich IE(2006)An improved method for preparing Agrobacterium cells that simplifies the Arabidopsis transformation protocol.Plant Methods 2(1)：16

Makandar R，Nalam VJ，Lee H，Trick HN，Dong Y，Shah J(2012)Salicylic acid regulates basal resistance to Fusarium head blight in wheat.Molecular Plant-Microbe Interactions 25(3)：431-439

Poppenberger B，Berthiller F，Lucyshyn D，Sieberer T，Schuhmacher R，Krska R，Kuchler K，J，Luschnig C，Adam G(2003)Detoxification of the Fusarium mycotoxin deoxynivalenol by a UDP-glucosyltransferase from Arabidopsis thaliana.Journal of Biological Chemistry 278(48)：47905-47914

Proctor RH，Hohn TM，McCormick SP(1995)Reduced virulence of Gibberella zeae caused by disruption of a trichthecine toxin biosynthetic gene.MPMI-Molecular Plant Microbe Interactions 8(4)：593-601

Scofield SR，Huang L，Brandt AS，Gill BS(2005)Development of a virus-induced gene-silencing system for hexaploid wheat and its use in functional analysis of the Lr21-mediated leaf rust resistance pathway.Plant Physiology 138(4)：2165-2173

Vlot AC，Dempsey DMA，Klessig DF(2009)Salicylic acid，a multifaceted hormone to combat disease.Annual review of phytopathology 47：177-206

Walter S，Brennan JM，Arunachalam C，Ansari KI，Hu X，Khan MR，Trognitz F，Trognitz B，Leonard G，Egan D(2008)Components of the gene network associated with genotype-dependent response of wheat to the Fusarium mycotoxin deoxynivalenol.Functional&integrative genomics 8(4)：421-427

Walter S，et al.(2015)A wheat ABC transporter contributes to both grain formation and mycotoxin tolerance.Journal of Experimental Botany.

White R(1979)Acetylsalicylic acid(aspirin)induces resistance to tobacco mosaic virus in tobacco.Virology 99(2)：410-412

Xiang Y，Song M，Wei Z，Tong J，Zhang L，Xiao L，Ma Z，Wang Y(2011)A jacalin-related lectin-like gene in wheat is a component of the plant defence system.Journal of experimental botany 62(15)：5471-5483