本發(fā)明一般地涉及主-客金屬有機(jī)骨架(MOF)系統(tǒng)。具體地，本發(fā)明涉及含有生物分子的MOF及其生產(chǎn)方法。

背景技術(shù)：

MOF是通過由多官能有機(jī)配體配位的包含金屬離子，例如金屬離子或金屬氧化物的金屬簇所形成的雜化配位結(jié)構(gòu)。這導(dǎo)致了可以是高度多孔的1、2或3維結(jié)構(gòu)的形成。

MOF的孔隙度可以看作是處于通道連接的籠的形式的腔的空間布置?；诮饘匐x子和有機(jī)配體的具體選擇，具有處于開放的微孔和間隙孔形式的腔的MOF是可用的。

腔的獨(dú)特尺寸特征和空間分布提供了每個(gè)顆粒具有約為數(shù)千平方米表面積的MOF。有利地，還可以使用應(yīng)用于MOF結(jié)構(gòu)的有機(jī)配對物的常規(guī)有機(jī)化學(xué)試劑來調(diào)整腔的表面的化學(xué)性質(zhì)。

由于它們獨(dú)特的多孔特性，MOF代表了理想的多孔基質(zhì)，其內(nèi)包封了所需的成分以形成主-客MOF系統(tǒng)?；诳腕w物質(zhì)的性質(zhì)，這類系統(tǒng)對于氣體儲存/分離裝置、催化、藥物遞送、光電子學(xué)和傳感中的應(yīng)用是極其有吸引力的。例如，MOF基質(zhì)可以作為尺寸-選擇性過濾器，其允許某些化學(xué)物質(zhì)擴(kuò)散穿過MOF骨架以接觸包封在其中的化學(xué)活性物質(zhì)并促進(jìn)特定化學(xué)反應(yīng)。

對于主-客MOF系統(tǒng)的產(chǎn)生，生物分子是特別有吸引力的一類客體，這是因?yàn)檫@種系統(tǒng)將高度適用于例如工業(yè)規(guī)模的酶催化、藥物遞送系統(tǒng)、高靈敏度生物測定和生物傳感器。通常，那些應(yīng)用需要位于載體上的生物活性物質(zhì)的穩(wěn)定，而不損害它們的生物活性。

然而，這種系統(tǒng)的開發(fā)仍處于其初期。獲得包封生物分子的MOF的可用路徑主要基于用所關(guān)心的生物分子滲透預(yù)形成的MOF(合成后滲透)。

合成后滲透的實(shí)例可見于Vasiliki Lykourinou,Yao Chen,Xi-Sen Wang,Le Meng,Tran Hoang,Li-June Ming,Ronald L.Musselman,和Shengqian Ma,'I mMobilization of MP-11 into a Mesoporous Metal-Organic Framework,MP-11@mesoMOF:A New Platform for Enzymatic Catalysis',Journal of the American Chemical Society,133(2011),10382；Yao Chen,Vasiliki Lykourinou,Carissa Vetromile.Tran Hoang,Li-June Ming,Randy W.Larsen,and Shengqian Ma,'How Can Proteins Enter the Interior of a MOF？Investigation of Cytochrome c Translocation into a MOF Consisting of Mesoporous Cages with Microporous Windows',Journal of the American Chemical Society,134(2012),13188；Yao Chen,Vasiliki Lykourinou,Tran Hoang,Li-June Ming,Shengqian Ma,'Size-selective biocatalysis of myoglobin i mMobilized into a mesoporous metal-organic framework with hierarchical pore sizes',Inorganic Chemistry,51(2012),9156。

然而，那些方法對于例如可以滲透至MOF骨架的生物分子的量、尺寸和類型具有一些限制。同時(shí)，滲透的MOF內(nèi)的生物分子的分布在整個(gè)主體骨架內(nèi)是不均勻的。另外，合成后滲透可以導(dǎo)致客體生物分子的特定生物活性的喪失。

因此，仍有機(jī)會(huì)來開發(fā)提供用于解決這些限制中的一個(gè)或多個(gè)的將生物分子包封在MOF骨架內(nèi)的替代方案。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明因此提供了用于生產(chǎn)具有包封生物分子的骨架的MOF的方法，該方法包括在溶液中使生物分子與MOF前體結(jié)合(合并)，其中生物分子促進(jìn)包封骨架的形成。

本發(fā)明源于以下意外效果：當(dāng)在溶液中與MOF前體結(jié)合在一起時(shí)，生物分子可以促進(jìn)或引起MOF的形成。也就是說，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)生物分子可以有效地起到種子的作用，在種子周圍形成骨架，所得骨架包封生物分子。不希望受理論限制，據(jù)信該生物分子對于骨架形成起到非均相成核中心的作用。

在不存在生物分子時(shí)不會(huì)形成MOF的條件下，在溶液內(nèi)生物分子有利地促進(jìn)MOF的形成。例如，可以在室溫下有利地促進(jìn)MOF的形成。

另外，通過生物分子促進(jìn)的MOF形成可以是快速的，通常在幾分鐘內(nèi)導(dǎo)致MOF的形成以及生物分子的包封。這在商業(yè)規(guī)模上對本發(fā)明的應(yīng)用是特別有利的。

本發(fā)明可以有利地提供生物分子在骨架內(nèi)的均勻分布，與使用傳統(tǒng)合成后浸滲法制備的MOF/生物分子系統(tǒng)相比，反過來這可以使得單位質(zhì)量或單位體積所形成的MOF包含更大量的包封生物分子。

根據(jù)本發(fā)明，可以使用不同范圍的生物分子。

在一個(gè)實(shí)施方式中，生物分子為氨基酸、肽、蛋白質(zhì)或核酸。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解生物分子如蛋白質(zhì)和核酸的生物活性與它們的空間構(gòu)象密切相關(guān)。

有利地，根據(jù)本發(fā)明的生物分子的包封可以保留生物分子的天然構(gòu)象。因此，包封的生物分子可以維持它們的生物活性。也就是說，包封骨架有利地為生物分子提供了保護(hù)載體。據(jù)信骨架的保護(hù)能力來源于骨架和客體生物分子之間的基于電荷相互作用，從而導(dǎo)致生物分子穩(wěn)定性的顯著提高。

本發(fā)明適用于多種不同的MOF。例如，MOF可以是無定形的或晶體的。MOF還可以是中-或微-MOF。

在一個(gè)實(shí)施方式中，MOF為晶體MOF。MOF的晶體性來源于骨架內(nèi)內(nèi)腔(intrinsic cavities)的規(guī)則且空間有序的分布。內(nèi)腔尺寸的特征在于每個(gè)具體的晶體MOF，并且尺寸可以在幾埃至數(shù)十埃的范圍內(nèi)。內(nèi)腔的尺寸分布可以是極窄的，其將這類材料提供給需要例如過濾或吸收物質(zhì)的精確尺寸選擇的應(yīng)用。

本發(fā)明還有利地允許：生物分子包封在晶體MOF內(nèi)，而不考慮內(nèi)腔和生物分子之間的相對尺寸。例如，本發(fā)明的方法允許在晶體MOF內(nèi)包封顯著大于骨架內(nèi)腔的生物分子如蛋白質(zhì)或核酸。該方法可以提供獨(dú)特的MOF，常規(guī)合成后滲透法排除了它們的可能性。

因此，本發(fā)明還提供了產(chǎn)生具有骨架的晶體MOF的方法，骨架(i)限定了內(nèi)腔，并且(ii)包封了生物分子，所述方法包括在溶液中使MOF前體和生物分子結(jié)合，生物分子促進(jìn)包封骨架的形成，其中生物分子具有大于骨架任何內(nèi)腔的最大腔直徑的最小尺寸。

本發(fā)明還提供了具有骨架的晶體MOF，骨架(i)限定了內(nèi)腔并且(ii)包封了生物分子，其中生物分子具有大于骨架任何內(nèi)腔的最大腔直徑的最小尺寸。

可以將根據(jù)本發(fā)明形成的MOF視為獨(dú)特的生物復(fù)合物，其中MOF形成連續(xù)的主體基質(zhì)相，在其內(nèi)部均勻地分散客體生物分子。

在一個(gè)實(shí)施方式中，生物分子是蛋白質(zhì)或核酸。

還意外地發(fā)現(xiàn)生物分子可以影響這樣形成的MOF的動(dòng)力學(xué)、形狀和結(jié)晶性。

由于可以有利地保持包封的生物分子的生物化學(xué)特性，因此本發(fā)明的MOF生物分子系統(tǒng)可以有利地具有高生物活性、優(yōu)越的保護(hù)能力和引發(fā)-釋放的性質(zhì)，并且在工業(yè)規(guī)模的酶促催化、酶工業(yè)修復(fù)、藥物遞送系統(tǒng)、高靈敏度生物測定和生物傳感器中提供潛在可應(yīng)用性。一般地，本發(fā)明的MOF/生物分子系統(tǒng)還可以在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域和研究中獲得應(yīng)用。

以下將更詳細(xì)地討論本發(fā)明的其它方面和/或?qū)嵤┓绞健?/p>

附圖說明

現(xiàn)將參考以下非限制性附圖描述本發(fā)明的實(shí)施方式，其中：

圖1示出了(a)ZIF-8和(b)ZIF-65的內(nèi)腔示意圖；

圖2示出了具有包封在其骨架內(nèi)的生物分子的MOF的合成的實(shí)施方式的示意圖；

圖3示出了使用多種氨基酸接種的ZIF-8的形成效率。通過如實(shí)施例1描述的光散射測量確定效率；

圖4示出了(a-k)根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式方法合成的包封(a)牛血清白蛋白(BSA)、(b)卵清蛋白(OVA)、(c)核糖核酸酶A、(d)人血清白蛋白(HSA)、(e)吡咯喹啉醌依賴型葡萄糖脫氫酶((PQQ)GDH)、(f)脂肪酶、(g)血紅蛋白、(h)溶菌酶、(i)胰島素、(j)辣根過氧化物酶(HRP)、(k)胰蛋白酶的ZIF-8、(m)脲酶和(n)寡核苷酸的掃描電子顯微鏡(SEM)圖像。圖(4)(l)示出了包封異硫氰酸熒光素(FITC)-標(biāo)記的牛血清白蛋白(BSA)生物分子的ZIF-8的晶體的光發(fā)射。使用共聚焦掃描激光顯微鏡(CLSM，主圖)記錄的圖像。圖4中的比例尺為1μM；

圖5示出了包封生物分子的ZIF-8的X射線衍射(XRD)圖。如實(shí)施例中的描述，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式獲得了樣品，并將XRD圖與純ZIF-8的模擬衍射相比較。

圖6示出了對(a)BSA@ZIF-8、(b)HRP@ZIF-8和(c)脲酶@ZIF-8樣品測量的小角度X射線散射(SAXS)數(shù)據(jù)；

圖7示出了發(fā)光FITC-標(biāo)記的BSA@ZIF-8晶體的一系列共聚焦掃描激光顯微鏡圖。一系列圖像與通過以126nm的增量沿z軸移動(dòng)焦平面獲得的連續(xù)圖像有關(guān)；

圖8示出了(a)圖7的FITC-標(biāo)記的BSA@ZIF-8晶體的微分干涉差(DIC)圖；(b)相同樣品的3D俯視圖的CLSM圖；(c，d)通過將圖7圖像沿z軸堆疊，并分別沿x和y方向觀察獲得的圖7的連續(xù)圖像的3D重構(gòu)；

圖9示出了在存在蛋白水解試劑的情況下和在沸水中處理后(PQQ)GDH@ZIF-8相對于無(PQQ)GDH的歸一化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化；

圖10示出了在80℃水中熱處理1小時(shí)前后脲酶@ZIF-8相對于無脲酶的歸一化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化；

圖11示出了(a-d)pH-引發(fā)的初始包封在根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式的MOF晶體中的蛋白質(zhì)的釋放的示意圖。圖11(e)示出了在不同的pH下，作為時(shí)間的函數(shù)的BSA釋放的相應(yīng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，圖11(f-i)示出了對含有酶的MOF和含有另一種蛋白質(zhì)的MOF的混合物進(jìn)行的類似pH-下降測試的圖示。圖11(j)示出了對包封胰蛋白酶的ZIF-8和包封DQ-卵清蛋白(DQ-OVA)的ZIF-8的混合物測量的相應(yīng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)；

圖12示出了在pH 6.0下，BSA@ZIF-8晶體隨時(shí)間逐漸分解的SEM圖；

圖13示出了使用相對于MOF前體(80mM HmIm和醋酸鋅20mM)提高BSA的量，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式形成的含有生物分子的ZIF-8的SEM圖。圖像表示在室溫下使用(a)1mg、(b)5mg、(c)10mg和(d)20mg BSA獲得的樣品；

圖14示出了由在室溫下使用提高量的BSA獲得的包封BSA的樣品測量的XRD衍射圖；

圖15示出了使用提高量的BSA獲得的BSA@ZIF-8的孔徑分布；

圖16示出了根據(jù)對比例1使用合成后用FITC-標(biāo)記的BSA滲透的傳統(tǒng)方法合成的純ZIF-8的(a)DIG和(b)CLSM圖；

圖17示出了BSA(紅色)、BSA@ZIF-8(橙色)、在70℃下用SDS(10％)溶液清洗1h后的BSA@ZIF-8MOF(黃色)、ZIF-8(綠色)、在BSA水溶液(1mg mL^-1)中暴露后的ZIF-8(藍(lán)色)和與BSA溶液培育，然后在70℃用SDS(10％)溶液清洗1h后的ZIF-8(紫色)的傅里葉變換紅外(FTIR)光譜；和

圖18示出了與相同熱處理之前和之后無HRP酶的酶活性相比，熱處理之前和之后測量的包封在ZIF-8中的辣根酶(HRP)的酶促效率的圖。

一些附圖包含彩色圖示或?qū)嶓w。附圖的彩色版本根據(jù)需要可得。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供了產(chǎn)生具有包封生物分子的骨架的MOF的方法。

只要可以通過生物分子促進(jìn)MOF骨架的形成，那么對用于本發(fā)明的MOF的組成沒有具體限制。

本發(fā)明適用于多種不同的MOF。例如，MOF可以是無定形或晶體的。MOF還可以是中-或微-MOF。

根據(jù)本發(fā)明的MOF包括具有通過至少一個(gè)有機(jī)配體配位的至少兩個(gè)金屬簇的那些。

如本文所使用的，“金屬簇”的表達(dá)旨在表示含有至少一種金屬或類金屬的至少一個(gè)原子或離子的化學(xué)部分。該定義涵蓋了任選地包含有機(jī)配體或共價(jià)鍵合基團(tuán)的單個(gè)原子或離子以及原子或離子基團(tuán)。因此，“金屬離子”的表達(dá)包括例如金屬離子、類金屬離子和金屬氧化物。

形成MOF結(jié)構(gòu)一部分的適合的金屬離子可以選自包括錒系元素和鑭系元素及它們的組合的IUPAC元素周期表的1-16族金屬。金屬離子可以選自Li⁺、Na⁺、K⁺、Rb⁺、Be²⁺、mg²⁺、Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺、Se³⁺、Y³⁺、Ti⁴⁺、Zr⁴⁺、Hf⁴⁺、V⁵⁺、V⁴⁺、V³⁺、V²⁺、Nb³⁺、Nb⁵⁺、Ta⁵⁺、Cr⁶⁺、Cr³⁺、Mo⁶⁺、Mo³⁺、W⁶⁺、W³⁺、Mn⁴⁺、Mn³⁺、Mn²⁺、Re⁷⁺、Re²⁺、Fe³⁺、Fe²⁺、Ru⁴⁺、Ru³⁺、Ru²⁺、Os3⁺、Qs²⁺、Co³⁺、Co²⁺、Rh³⁺、Rh²⁺、Rh⁺、Ir⁴⁺、Ir²⁺、Ir⁺、Ni²⁺、Pd⁴⁺、Pd²⁺、Pt⁴⁺、Pr²⁺、Cu²⁺、Cu⁺、Ag⁺、Au⁺、Zn²⁺、Cd²⁺、Hg²⁺、B³⁺、Al³⁺、Ga³⁺、In³⁺、Ti³⁺、Si⁴⁺、Si²⁺、Ge⁴⁺、Ge²⁺、Sn⁴⁺、Sn²⁺、Pb⁴⁺、Pb²⁺、As⁵⁺、As³⁺、Sb⁵⁺、Sb³⁺、Bi⁵⁺、Bi³⁺、La³⁺、Ce³⁺、Ce⁴⁺、Pr³⁺、Pr⁴⁺、Nd³⁺、Sm³⁺、Sm²⁺、Eu³⁺、Eu²⁺、Gd³⁺、Tb³⁺、Tb⁴⁺、Dy³⁺、Ho³⁺、Er³⁺、Tm³⁺、Tm²⁺、Yb³⁺、Yb²⁺、Lu³⁺、Th⁴⁺、U⁶⁺、U⁵⁺、U⁴⁺、U³⁺及它們的組合。

適合的金屬離子配位有機(jī)配體可以來源于草酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、鄰苯二甲酸、間苯二甲酸、對苯二甲酸、檸檬酸、苯均三酸、1,2,3-三唑、三唑或方形酸。

適合于本發(fā)明目的的有機(jī)配體包括WO 2010/075610和Filipe A.Almeida Paz,Jacek Klinowski,Sergio M,F.Vilela,P.C.Tomé,José A.S.Cavaleiro,Rocha,‘Ligand design for functional metal-organic frameworks',Chemical Society Reviews,2012,41卷,1088-1110頁中所列的有機(jī)配體，以上文獻(xiàn)的內(nèi)容以其全部內(nèi)容包括在本文中。

在一些實(shí)施方式中，MOF為鑭系元素(Ln)MOF，例如，Er(bdc)、Dy(bdc)、Tb(bpdc)、Gd(bpdc)和Tb(bpydc)、Tb(bdc)、Eu(bdc)、Gd(bdc)或者Ln(bpedc)，其中bdc＝1,4-苯二羧酸、bpdc＝4,4'-聯(lián)苯二羧酸和bpydc＝2,2'-二吡啶-5,5'-二羧酸并且bpedc＝聯(lián)苯乙烯-4,4'-二羧酸。

在一些實(shí)施方式中，MOF選自混合組分MOF，其被稱為MC-MOF。MC-MOF具有以多于一類有機(jī)配體和/或金屬為特征的結(jié)構(gòu)?？梢酝ㄟ^在其中結(jié)合了MOF前體和生物分子的溶液中直接使用不同的有機(jī)配體和/或金屬，或者通過所形成的MOF的有機(jī)配體和/或金屬物質(zhì)的合成后取代來獲得MC-MOF。MC-MOF的具體實(shí)例可見于A.D.,Burrows,CrystEngCo mM 2011,13卷,3623-3642頁，該文獻(xiàn)的內(nèi)容以其全部內(nèi)容包括在本文中。

在一些實(shí)施方式中，MOF為咪唑鋅骨架(ZIF)。由于(i)它們在生理?xiàng)l件下延長的穩(wěn)定性，(ii)它們的金屬-有機(jī)配體鍵的pH響應(yīng)性，其可以用作pH-誘導(dǎo)的藥物遞送應(yīng)用的引發(fā)劑和(iii)可忽略的細(xì)胞毒性，因此ZIF是特別適合于生物應(yīng)用的MOF亞類。另外，可以在水中合成ZIF，并且即使在高溫下(例如，在沸點(diǎn))持續(xù)延長的一段時(shí)間(例如，幾個(gè)星期)，它在水中仍是化學(xué)穩(wěn)定的。ZIF在水中的穩(wěn)定性使它們成為容納用于在生物環(huán)境中使用的生物分子的優(yōu)選基質(zhì)。

ZIF骨架的特征在于通過有機(jī)咪唑有機(jī)配體連接的四面體-配位的過渡金屬離子(例如，F(xiàn)e、Co、Cu、Zn)，產(chǎn)生了三維多孔固體。與沸石類似，ZIF具有高熱和化學(xué)穩(wěn)定性。根據(jù)前體的選擇，并且現(xiàn)在根據(jù)本發(fā)明，取決于生物分子的選擇，可以合成多種ZIF拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。

因此，根據(jù)本發(fā)明可以制備的MOF可以是羧酸鹽-基MOF、雜環(huán)多氮唑-基MOF、金屬-氰化物MOF。根據(jù)本發(fā)明可以制備的MOF的具體實(shí)例包括通常在本領(lǐng)域中作為CD-MOF-1、CD-MOF-2、CD-MOF-3、CPM-13、FJI-1、FMOF-1、HKUST-1、IRMOP-1、IRMOF-2、IRMOP-3、IRMOF-6、IRMOP-8、IRMOF-9、IRMOF-13、IRMOF-20、JUC-48、JUC-62、MIL-101、MIL-100、MIL-125、MIL-53、MIL-88(包括MIL-88A、MIL-88B、MIL-88C、MIL-88D系列)、MOF-5、MOF-74、MOF-177、MOF-210、MOF-200、MOP-205、MOF-505、MOROF-2、MOROF-1、NOTT-100、NOTT-101、HOTT-102、NOTT-103、NOTT-105、NOTT-106、NOTT-107、NOTT-109、NOTT-110、NOTT-111、NOTT-112、NOTT-113、NOTT-114、NOTT-140、NU-100、rho-ZMOF、PCN-6、PCN-6'、PCN9、PCN10、PCN12、PCN12’、PCN14、PCN16、PCN-17、PCN-21、PCN46、PCN66、PCN68、PMOF-2(Cu)、PMOF-3、SNU-5、SNU-15'、SNU-21S、SNU-21H、SNU-50、SNU-77H、UiO-66、UiO-67、soc-MOF、sod-ZMOF、TUDMOF-1、UMCM-2、UMCM-150、UTSA-20、ZIF-2、ZIF-3、ZIF-4、ZIF-8、ZIF-9、ZIF-10、ZIF-11、ZIF-12、ZIF-14、ZIF-20、ZIF-21、ZIF-23、ZIF-60、ZIF-61、ZIF-62、ZIF-64、ZIF-65、ZIF-67、ZIF-68、ZIF-69、ZIF-70、ZIF-71、ZIF-72、ZIF-73、ZIF-74、ZIF-75、ZIF-76、ZIF-77或ZIF-90已知的那些。

在一個(gè)實(shí)施方式中，MOF為無定形的。

在無定形MOF(αMOF)中，金屬簇和有機(jī)配體形成不具有可檢測的空間順序的骨架。αMOF的腔由原子的非周期性空間分布造成，并且在MOF骨架內(nèi)以隨機(jī)方式空間分布。原子的非周期性布置產(chǎn)生了αMOF，αMOF產(chǎn)生了以漫散射引起的寬“駝峰(hump)”為主的X射線衍射圖，并因此通常難以通過XRD衍射測量將它們彼此區(qū)分。

本文所列的任何MOF可以是αMOF，例如，在Thomas D.Bennett,Anthony K Cheetham,'Amorphous Metal-Organic Frameworks',Accounts of Chemical Research 2014,47,1555中描述了αMOF的特性和性質(zhì)，其內(nèi)容以其全部內(nèi)容結(jié)合到本文中。

可以通過技術(shù)人員已知的技術(shù)確定αMOF的腔的尺寸分布。例如，在Brunauer,S.,Emmett P.,and Teller,E,'Adsorption of gases in multimolecular layers’Journal of the American Chemical Society(1938),60,309-319中提議的基于使用Brunauer E mMet and Teller法(BET)的測量。盡管可以將不同的氣體用作探針(如氮?dú)狻錃?、氬氣、氦、二氧化碳、H₂O和甲烷)，但是以氮?dú)庾鳛闅怏w探針是最常見的。

根據(jù)αMOF的種類，產(chǎn)生的包封生物分子的骨架的腔可以例如具有高達(dá)的尺寸(使用BET測量)。

在一個(gè)實(shí)施方式中，MOF為晶體。

在晶體MOF中，通過有機(jī)配體配位金屬簇以形成由簇/有機(jī)配體布置的重復(fù)單元制成的幾何規(guī)則網(wǎng)絡(luò)。

當(dāng)通過通常已知的結(jié)晶學(xué)表征技術(shù)表征時(shí)，晶體MOF產(chǎn)生了衍射圖。這些包括例如X射線粉末衍射(XPD)、掠入式射X射線衍射、小角度X射線散射(SAXS)、單晶X射線衍射、電子衍射、中子衍射以及材料結(jié)晶學(xué)領(lǐng)域中技術(shù)人員已知的其它技術(shù)。

MOF的晶體性來源于形成骨架的內(nèi)腔的規(guī)則且空間有序的分布。

如本文所使用的，“內(nèi)腔”的表達(dá)旨在表示相互連通的孔隙的有序網(wǎng)絡(luò)，其通過MOF的基本性質(zhì)對晶體MOF特異。如本領(lǐng)域中已知的，MOF的內(nèi)腔網(wǎng)絡(luò)由MOF的金屬簇和有機(jī)配體的具體空間布置造成，并且對任何原始晶體MOF是唯一的。

可以將晶體MO的內(nèi)腔視為由通過窗或通道互相連接的規(guī)則分布的籠所形成的。通過形成MOF骨架的化學(xué)物質(zhì)的空間排列決定晶體MOF中籠和窗/通道的具體形狀。因此，“內(nèi)腔”的表達(dá)具體地確定了天然MOF骨架的籠和窗/通道的整體有序網(wǎng)絡(luò)。

為了幫助進(jìn)一步定義晶體MOF“內(nèi)腔”的含義，參考了圖1。圖1示出了實(shí)例咪唑鹽骨架ZIF-8和ZIF-65的超晶胞的內(nèi)腔的示意圖。每個(gè)超晶胞表示為通過窗(就ZIF-8來說)或通道(就ZIF-65來說)連接的9個(gè)籠組成。圖1的超晶胞的實(shí)際化學(xué)結(jié)構(gòu)可以成像為在超晶胞角落處具有鋅離子并且有機(jī)配體為連接邊緣。

根據(jù)本發(fā)明，通過數(shù)學(xué)模型定量晶體MOF的內(nèi)腔尺寸。如本領(lǐng)域已知的，基于構(gòu)成MOF骨架的原子的具體空間分布，可以通過數(shù)學(xué)模型復(fù)制出晶體MOF的三維化學(xué)結(jié)構(gòu)。模型允許推斷(外推，extrapolating)指示內(nèi)腔尺寸的參數(shù)，即“最大腔直徑”(LCD)，其表示可以在MOF內(nèi)腔內(nèi)空間的一些點(diǎn)插入但不會(huì)與任何骨架原子重疊的最大球形探針的直徑。

在本文中，晶體MOF的內(nèi)腔的LCD值旨在表示為根據(jù)E.Haldoupis,S,Nair and D.S.Sholl,Journal of the American Chemical Society,132(2010),7528中描述的程序計(jì)算的那些，其以其全部內(nèi)容作為參考結(jié)合到本文中。

根據(jù)晶體MOF的種類，內(nèi)腔可以表征為以下范圍內(nèi)的LCD值：約至約之間、約至約之間、約至約之間、約至約之間、約至約之間、約至約之間、約至約之間、約至約之間、約至約之間、約至約之間、約至約之間、約至約之間、約至約之間。

本發(fā)明適用于微-MOF和中-MOF。這與現(xiàn)有后滲透法相反，現(xiàn)有后滲透法通常限于生物分子向中-MOF內(nèi)腔的滲透。

如本文所使用的，術(shù)語“微-MOF”是指通過BET測量的腔尺寸(對于αMOF)或者內(nèi)腔的LCD(對于晶體MOF)小于2nm的MOF。術(shù)語“中-MOF”包括測量的腔尺寸(對于αMOF)或者內(nèi)腔的LCD(對于晶體MOF)在2nm至50nm之間的那些MOF。

只要其包封生物分子，則對MOF尺寸無具體限制。在一些實(shí)施方式中，以顆粒形式提供MOF，其最大尺寸在以下范圍：約10nm至約500μM、約25nm至約250μM、約50nm至約100μM、50nm至約50μM、約50nm至約25μM、約50nm至約10μM、約50nm至約5μM、約50nm至約2.5μM、約50nm至約1μM或約50nm至約0.5μM。

如本文所使用的，術(shù)語“生物分子”及其變體包括分離自生物有機(jī)體的任何化合物，以及合成或重組類的似物或模擬物、衍生物、突變體或變體和/或其生物活性片段。

例如，生物分子可以是蛋白質(zhì)、肽、核酸、核苷酸或氨基酸。

如本文所使用的，用于表示生物分子的術(shù)語“生物活性的”及其變體，如"生物活性"是指任何體內(nèi)或體外活性，其是生物分子本身的特征，包括生物分子與一個(gè)或多個(gè)靶標(biāo)的相互作用。

例如，生物活性可以包括抗體與抗原的選擇性結(jié)合，酶的酶活性等。這種活性可以無限制地包括任選地與另一種生物分子或與靶標(biāo)分子的結(jié)合、融合、鍵形成、結(jié)合、接近、催化或化學(xué)反應(yīng)。

本發(fā)明的方法包括在溶液中使生物分子和MOF前體結(jié)合，例如，如圖2的示意圖所示。

MOF前體包括在適合溶劑內(nèi)的溶液中提供本文所列的金屬離子的本領(lǐng)域中已知的那些化合物。那些化合物可以是相關(guān)金屬離子的鹽，包括金屬-氯化物、-硝酸鹽、-乙鹽酸、-硫酸鹽、-硫酸氫鹽、-溴化物、-碳酸鹽、-磷酸鹽及它們的衍生物，包括單或多水合物衍生物。

適合的金屬鹽前體的實(shí)例包括(但不限于)硝酸鈷(Co(NO₃)₂·xH₂O)、硝酸鋅(Zn(NO₃)₂·xH₂O)、硝酸鐵(III)(Fe(NO₃)₃·xH₂O)、硝酸鋁(Al(NO₃)₃·xH₂O)、硝酸鎂(mg(NO₃)₂·xH₂O)、硝酸鈣(Ca(NO₃)₂·xH₂O)、硝酸鈹(Be(NO₃)₂·xH₂O)、硝酸銪(Eu(NO₃)₃·xH₂O)、硝酸鋱(Tb(NO₃)₃·xH₂O)、硝酸鐿(Yb(NO₃)₃·xH₂O)、硝酸鏑(Dy(NO₃)₃·xH₂O)、硝酸鉺(Er(NO₃)₃·xH₂O)、硝酸鎵(Ga(NO₃)₃·xH₂O)、硝酸釓(Gd(NO₃)₃·xH₂O)、硝酸鎳(Ni(NO₃)₂·xH₂O)、硝酸鉛(Pb(NO₃)₂·xH₂O)、硝酸鎘(Cd(NO₃)₂·xH₂O)、硝酸錳(II)(Mn(NO₃)₂·xH₂O)、氯化鈷(CoCl₂·xH₂O)、氯化鋅(ZnCl₂·xH₂O)、氯化鐵(III)(FeCl₃·xH₂O)、氯化亞鐵(II)(FeCl₂·xH₂O)、氯化鋁(AlCl₃·xH₂O)、氯化鎂(mgCl₂·xH₂O)、氯化鈣(CaCl₂·xH₂O)、氯化鈹(BeCl₂·xH₂O)、氯化銪(EuCl₃·xH₂O)、氯化鋱(TbCl₃·xH₂O)、氯化鐿(YbCl₃·xH₂O)、氯化鏑(DyCl₃·xH₂O)、氯化鉺(ErCl₃·xH₂O)、氯化鎵(GaCl₃·xH₂O)、氯化釓(GdCl₃·xH₂O)、氯化鎳(NiCl₂·xH₂O)、氯化鉛(II)(PbCl₂·xH₂O)、氯化鎘(CdCl₂·xH₂O)、氯化錳(II)(MnCl₂·xH₂O)、醋酸鈷(Co(CH₃COO)₂·xH₂O)、醋酸鋅(Zn(CH₃COO)₂·xH₂O)、醋酸鐵(III)(Fe(CH₃COO)₃·xH₂O)、醋酸亞鐵(II)(Fe(CH₃COO)₂·xH₂O)、醋酸鋁(Al(CH₃COO)₃·xH₂O)、醋酸鎂(mg(CH₃COO)₂·xH₂O)、醋酸鈣(Ca(CH₃COO)₂·xH₂O)、醋酸鈹(Be(CH₃COO)₂·xH₂O)、醋酸銪(Eu(CH₃COO)₃·xH₂O)、醋酸鋱(Tb(CH₃COO)₃·xH₂O)、醋酸鐿(Yb(CH₃COO)₃·xH₂O)、醋酸鏑(Dy(CH₃COO)₃·xH₂O)、醋酸鉺(Er(CH₃COO)₃·xH₂O)、醋酸鎵(Ga(CH₃COO)₃·xH₂O)、醋酸釓(Gd(CH₃COO)₃·xH₂O)、醋酸鎳(Ni(CH₃COO)₂·xH₂O)、醋酸鉛(II)(Pb(CH₃COO)₂·xH₂O)、醋酸鎘(Cd(CH₃COO)₂·xH₂O)、醋酸錳(II)(Mn(CH₃COO)₂·xH₂O)、硫酸鈷(CoSO4·xH₂O)、硫酸鋅(ZnSO4·xH₂O)、硫酸鐵(III)(Fe2(SO4)3·xH₂O)、硫酸亞鐵(II)(FeSO4·xH₂O)、硫酸鋁(Al2(SO4)3·xH₂O)、硫酸鎂(mgSO4·xH₂O)、硫酸鈣(CaSO4·xH₂O)、硫酸鈹(BeSO4·xH₂O)、硫酸銪(Eu2(SO4)3·xH₂O)、硫酸鋱(Tb2(SO4)3·xH₂O)、硫酸鐿(Yb2(SO4)3·xH₂O)、硫酸鏑(Dy2(SO4)3·xH₂O)、硫酸鉺(Er2(SO4)3·xH₂O)、硫酸鎵(Ga2(SO4)3·xH₂O)、硫酸釓(Gd2(SO4)3·xH₂O)、硫酸鎳(NiSO4·xH₂O)、硫酸鉛(II)(PbSO4·xH₂O)、硫酸鎘(CdSO4·xH₂O)、硫酸錳(II)(MnSO₄·xH₂O)、氫氧化鈷(Co(OH)₂·xH₂O)、氫氧化鋅(Zn(OH)₂·xH₂O)、氫氧化鐵(III)(Fe(OH)₃·xH₂O)、氫氧化氧化鐵(III)(FeO(OH)·xH₂O)、氫氧化亞鐵(II)(Fe(OH)₂·xH₂O)、氫氧化鋁(Al(OH)₃·xH₂O)、氫氧化鎂(mg(OH)₂·xH₂O)、氫氧化鈣(Ca(OH)₂·xH₂O)、氫氧化鈹(Be(OH)₂·xH₂O)、氫氧化銪(Eu(OH)₃·xH₂O)、氫氧化鋱(Tb(OH)₃·xH₂O)、氫氧化鐿(Yb(OH)₃·xH₂O)、氫氧化鏑(Dy(OH)₃·xH₂O)、氫氧化鉺(Er(OH)₃·xH₂O)、氫氧化鎵(Ga(OH)₃·xH₂O)、氫氧化釓(Gd(OH)₃·xH₂O)、氫氧化鎳(Ni(OH)₂·xH₂O)、氫氧化鉛(Pb(OH)₂·xH₂O)、氫氧化鎘(Cd(OH)₂·xH₂O)、氫氧化錳(II)(Mn(OH)₂·xH₂O)、溴化鈷(CoBr₂·xH₂O)、溴化鋅(ZnBr₂·xH₂O)、溴化鐵(III)(FeBr₃·xH₂O)、溴化亞鐵(II)(FeBr₂·xH₂O)、溴化鋁(AlBr₃·xH₂O)、溴化鎂(mgBr₂·xH₂O)、溴化鈣(CaBr₂·xH₂O)、溴化鈹(BeBr₂·xH₂O)、溴化銪(EuBr₃·xH₂O)、溴化鋱(TbBr₃·xH₂O)、溴化鐿(YbBr₃·xH₂O)、溴化鏑(DyBr₃·xH₂O)、溴化鉺(ErBr₃·xH₂O)、溴化鎵(GaBr₃·xH₂O)、溴化釓(GdBr₃·xH₂O)、溴化鎳(NiBr₂·xH₂O)、溴化鉛(PbBr₂·xH₂O)、溴化鎘(CdBr₂·xH₂O)、溴化錳(II)(MnBr₂·xH₂O)、碳酸鈷(CoCO₃·xH₂O)、碳酸鋅(ZnCO₃·xH₂O)、碳酸鐵(III)(Fe₂(CO₃)₃·xH₂O)、碳酸鋁(Al₂(CO₃)₃·xH₂O)、碳酸鎂(mgCO₃·xH₂O)、碳酸鈣(CaCO3·xH₂O)、碳酸鈹(BeCO₃·xH₂O)、碳酸銪(Eu₂(CO₃)₃·xH₂O)、碳酸鋱(Tb₂(CO₃)₃·xH₂O)、碳酸鐿(Yb₂(CO₃)₃·xH₂O)、碳酸鏑(Dy₂(CO₃)₃·xH₂O)、碳酸鉺(Er₂(CO₃)₃·xH₂O)、碳酸鎵(Ga₂(CO₃)₃·xH₂O)、碳酸釓(Gd₂(CO₃)₃·xH₂O)、碳酸鎳(NiCO₃·xH₂O)、碳酸鉛(PbCO₃·xH₂O)、碳酸鎘(CdCO₃·xH₂O)、碳酸錳(II)(MnCO₃·xH₂O)及它們的混合物，其中x在0-12的范圍內(nèi)。

MOF前體還包括本文描述的種類的有機(jī)配體，其在MOF骨架中配位金屬離子簇。有機(jī)配體包括具有至少兩個(gè)能夠配位金屬離子的化學(xué)部分的分子。在一些實(shí)施方式中，這些基團(tuán)包括羧酸鹽、膦酸鹽、磺酸鹽，N-雜環(huán)基及它們的組合。

適合的有機(jī)配體包括在WO 2010/075610和Filipe A.Almeida Paz,Jacek Klinowski,Sergio M,F.Vilela,P.C.Tomé,José A.S.Cavaleiro,Rocha,Ligand design for functional metal-organic frameworks,Chemical Society Reviews,2012,41卷,1088-1110頁中所列的那些配體，以上文獻(xiàn)的內(nèi)容以其全部內(nèi)容包括在本文中。

有機(jī)配體前體的實(shí)例包括(但不限于)4,4’,4”-[苯-1,3,5-三基-三(乙炔-2,1-二基)]三苯甲酸酯、聯(lián)苯基-4,4’-二羧酸酯、4,4’,4”-[苯-1,3,5-三基-三(苯-4,1-二基)]三苯甲酸酯、1,3,5-苯三苯甲酸酯、1,4-苯二羧酸酯、苯-1,3,5-三(1H-四唑)、1,3,5-苯三羧酸、對苯二甲酸、咪唑、苯并咪唑、2-硝基咪唑、2-甲基咪唑(HmIm)、2-乙基咪唑、5-氯代苯并咪唑、嘌呤、富馬酸、α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、γ-環(huán)糊精、1,4-二(1-咪唑基)苯)、4,4’-二吡啶基、1,4-二氮雜雙環(huán)[2.2.2]辛烷、2-氨基-1,4-苯二羧酸酯、2-氨基-1,4-苯二羧酸、4,4’-偶氮苯二羧酸酯、4,4’-偶氮苯二羧酸、苯胺-2,4,6-三苯甲酸酯、苯胺-2,4,6-三苯甲酸、聯(lián)苯基-4,4’-二羧酸、1,1’-聯(lián)苯基-2,2’,6,6’-四羧酸酯、1,1’-聯(lián)苯基-2,2’,6,6’-四羧酸、2,2’-二吡啶基-5,5’-二羧酸酯、2,2’-二吡啶基-5,5’-二羧酸、1,3,5-三(4-羧苯基)苯、1,3,5-三(4-羧酸酯苯基)苯、1,3,5-苯三羧酸酯、2,5-二羥基-1,4-苯二羧酸酯、2,5-二羥基-1,4-苯二羧酸、2,5-二甲氧基-1,4-苯二羧酸酯、2,5-二甲氧基-1,4-苯二羧酸、1,4-萘二羧酸酯、1,4-萘二羧酸、1,3-萘二羧酸酯、1,3-萘二羧酸、1,7-萘二羧酸酯、1,7-萘二羧酸、2,6-萘二羧酸酯、2,6-萘二羧酸、1,5-萘二羧酸酯、1,5-萘二羧酸、2,7-萘二羧酸酯、2,7-萘二羧酸、4,4’,4”-次氮基三苯甲酸酯、4,4’,4”-次氮基三苯甲酸、2,4,6-三(2,5-二羧基苯基氨基)-1,3,5-三嗪、2,4,6-三(2,5-二羧酸酯苯基氨基)-1,3,5-三嗪、1,3,6,8-四(4-羧苯基)芘、1,3,6,8-四(4-羧酸酯苯基)芘、1,2,4,5-四(4-羧苯基)苯、1,2,4,5-四(4-羧酸酯苯基)苯、5,10,15,20-四(4-羧苯基)卟啉、5,10,15,20-四(4-羧酸酯苯基)卟啉、腺嘌呤、腺嘌呤酯、富馬酸酯、1,2,4,5-苯四羧酸酯、1,2,4,5-苯四羧酸、1,3,5-苯三苯甲酸、3-氨基-1,5-苯二羧酸、3-氨基-1,5-苯二羧酸酯、1,3-苯二羧酸、1,3-苯二羧酸酯、4,4’,4”-[苯-1,3,5-三基-三(乙炔-2,1-二基)]三苯甲酸、4,4’,4”-[苯-1,3,5-三基-三(苯-4,1-二基)]三苯甲酸、草酸、草酸酯、富馬酸、富馬酸酯、馬來酸、馬來酸酯、反,反-粘康酸、反,反-粘康酸酯、順,反-粘康酸、順,反-粘康酸酯、順,順-粘康酸、順,順-粘康酸酯、吡唑、2,5-二甲基吡唑、1,2,4-三唑、3,5-二甲基-1,2,4-三唑、吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、六甲叉基四胺、煙酸、煙酸酯、異煙酸、異煙酸酯、4-(3,5-二甲基-1H-吡唑)苯甲酸、2,5-呋喃二羧酸、2,5-呋喃二羧酸酯、3,5-二甲基-4-羧基吡唑、3,5-二甲基-4-羧酸酯吡唑、4-(3,5-二甲基-1H-吡唑-4-基)苯甲酸、4-(3,5-二甲基-1H-吡唑-4-基)-苯甲酸酯及它們的混合物。

將理解有機(jī)配體還可以是官能化的有機(jī)配體。例如，另外可以通過氨基-，如2-氨基對苯二甲酸、氨基甲酸酯-、乙酰胺-或酰胺-官能化本文所列的有機(jī)配體中的任一個(gè)。在用作MOF形成的前體之前，可以對有機(jī)配體官能化，或者可選擇的可以對裝配的MOF本身化學(xué)處理以官能化其橋連的有機(jī)配體。

技術(shù)人員將知道通過用于合成MOF的預(yù)官能化有機(jī)配體或通過官能化后預(yù)形成的MOF允許通過官能團(tuán)官能化MOF的適合化學(xué)規(guī)程。

可以在MOF上提供的適合的官能團(tuán)包括-NHR、-N(R)₂、-NH₂、-NO₂、-NH(芳基)、鹵化物、芳基、芳烷基、烯基、炔基、吡啶基、雙吡啶基、三聯(lián)吡啶基、苯胺基、-O(烷基)、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、磺酰氨基、羥基、氰基、-(CO)R、-(SO₂)R、-(CO₂)R、-SH、-S(烷基)、-SO₃H、-SO₃^-M⁺、-COOH、COO^-M⁺、-PO₃H₂、-PO₃H^-M⁺、-PO₃^2-M²⁺、-CO₂H、甲硅烷基衍生物、硼烷衍生物、二茂鐵及其它茂金屬，其中M為金屬原子，并且R為C_1-10烷基。

對于可以用于制備其中MOF前體和生物分子結(jié)合的溶液的溶劑沒有具體限制，只要(i)MOF前體在溶劑中可溶，和(ii)生物分子與溶劑相容。也就是說，溶劑通常將是不會(huì)不利地影響生物分子的生物活性的溶劑。

可以使用的溶劑的實(shí)例包括甲醇、乙醇、二甲基亞砜(DMSO)、丙酮、水及它們的混合物

在一些實(shí)施方式中，其中生物分子和MOF前體結(jié)合的溶液為水溶液，例如，去離子水或生理緩沖溶液(包含一種或多種鹽如KH₂PO₄、NaH₂PO₄、K₂HPO₄、Na₂HPO₄、Na₃PO₄、K₃PO₄、NaCl、KCl、mgCl₂、CaCl₂等的水)。

只要形成MOF，對存在于溶液中的MOF前體的濃度沒有具體限制。

溶液中MOF前體的濃度可以包括以下范圍：約0.001M和1M之間、約0.01M和0.5M之間、約0.01M和0.2M之間、約0.02M和0.2M之間、約0.02M和0.15M之間、約0.05M和0.15M之間、約0.08M和0.16M之間。這些值表示相對于含有MOF前體和生物分子的溶液的總體積，有機(jī)配體的濃度以及金屬鹽的濃度。

未限制有機(jī)配體濃度和金屬鹽濃度之間的比值，只要該比值適合于通過根據(jù)本發(fā)明與生物分子的結(jié)合促進(jìn)的MOF形成。在一些實(shí)施方式中，有機(jī)配體與金屬鹽的比值可以在以下范圍：60:1至1:60(mol:mol)、30:1至1:30、10:1至1:10、5:1至1:5、2.5:1至1:2.5、2:1至1:2或1.5:1至1:1.5。

根據(jù)本發(fā)明的方法，生物分子促進(jìn)包封骨架的形成。

生物分子“促進(jìn)”包封骨架形成表示一旦與MOF前體在溶液中結(jié)合，生物分子本身導(dǎo)致、誘導(dǎo)或引發(fā)MOF骨架的形成。由于生物分子促進(jìn)骨架形成，因此MOF骨架圍繞生物分子生長直至最終將其包封。

不受理論限制，據(jù)信生物分子誘導(dǎo)的MOF形成可以與特定生物分子的電荷、親水性/疏水性以及螯合能力有關(guān)。據(jù)信生物分子對MOF前體的親合力有利于包封MOF的形成，親合力來源于例如分子間氫鍵和疏水性相互作用。NMR光譜和元素分析確認(rèn)當(dāng)在溶液中與那些前體結(jié)合時(shí)，每個(gè)生物分子可以配位MOF前體。

導(dǎo)致的金屬陽離子(來源于金屬鹽前體的溶解)和有機(jī)配體兩者局部濃度的升高(即在生物分子最接近的周圍)將有利于MOF骨架的預(yù)成核簇。已發(fā)現(xiàn)與具有更強(qiáng)疏水性特征和具有帶正電荷的部分的分子相比，親水分子和具有帶負(fù)電荷的域或部分(例如，羧基、羥基、氨基等)的分子顯示出改善的使MOF成核的能力。因此，可以假設(shè)生物分子中帶負(fù)電荷的域吸引在溶液中MOF金屬前體所提供的金屬陽離子并且在MOF形成早期，有助于穩(wěn)定金屬-有機(jī)配體簇。

意外地，MOF前體在溶液中與生物分子的結(jié)合足以導(dǎo)致MOF骨架的形成。不需要應(yīng)用其它因子或試劑來引發(fā)MOF的形成。例如，不需要像常規(guī)溶劑熱MOF合成法(其通常需要使用熱源，如烘箱，例如，微波爐、加熱板或加熱罩)中通常所進(jìn)行的將熱應(yīng)用于溶液。

因此，在一些實(shí)施方式中，在低于100℃、90℃、75℃、50℃或35℃的溶液溫度下，引起包封骨架的形成。因此，溶液溫度可以在-50℃和75℃之間、-50℃和50℃之間或-50℃和30℃之間。

在一些實(shí)施方式中，在室溫下進(jìn)行該方法。如本文所使用的，“室溫”的表達(dá)將被理解為涵蓋了約20℃和25℃之間的溫度范圍，其平均為約23℃。在這些較低的溫度下實(shí)施方法對于熱敏性蛋白如抗體、纖連蛋白、糖蛋白、蛋白水解酶和膠原蛋白將是有利的。

對于MOF前體和生物分子可以在溶液內(nèi)結(jié)合的順序沒有具體限制。

例如，含有金屬前體的溶液可以首先與含有有機(jī)配體的溶液混合，隨后將含有生物分子的單獨(dú)溶液引入含有金屬鹽和有機(jī)配體的溶液。可選地，可以首先制備含有生物分子和有機(jī)配體的溶液，并且隨后將其引入到含有金屬前體的單獨(dú)溶液。

另外，可以首先制備含有生物分子和金屬前體的溶液，隨后將其引入到含有有機(jī)配體的單獨(dú)溶液。

此外，可以同時(shí)將分別單獨(dú)含有金屬前體、有機(jī)配體和生物分子的單獨(dú)溶液混合在一起。

在一個(gè)實(shí)施方式中，將生物分子引入包含MOF前體的溶液中。

有利地，根據(jù)本發(fā)明的方法的MOF的形成是快速的。根據(jù)所使用的生物分子的類型以及所使用的MOF前體的類型，已發(fā)現(xiàn)一旦將生物分子和MOF前體一起引入到溶液中，MOF可以在約1秒、10秒、1分鐘、10分鐘、30分鐘、60分鐘或2小時(shí)內(nèi)形成。在相同的時(shí)間、溫度和MOF前體濃度的條件下，已發(fā)現(xiàn)在僅含MOF前體(即無生物分子)的溶液中，MOF不會(huì)形成。換言之，已發(fā)現(xiàn)生物分子本身促進(jìn)MOF的形成。

包封在MOF骨架內(nèi)的生物分子可以有利地在骨架整個(gè)體積內(nèi)均勻分布?？梢酝ㄟ^共聚焦顯微鏡發(fā)射測量確定骨架內(nèi)生物分子的分布情況。如果當(dāng)在染料的最佳發(fā)射波長測量，當(dāng)在染料的最佳激發(fā)波長使用0.12微米線性增量掃描時(shí)，通過使用共聚焦掃描激光顯微鏡(CLSM)掃描具有用熒光染料標(biāo)記的包封生物分子的MOF的任何平面所記錄的發(fā)射信號的強(qiáng)度不改變超過10％時(shí)，將認(rèn)為在整個(gè)骨架體積中生物分子的分布是“均勻的”。

與本發(fā)明相反，通過合成后滲透法，生物分子在MOF內(nèi)的滲透固有地阻礙了生物分子在整個(gè)骨架體積中的均勻分布。

另外，與根據(jù)合成后滲透法，可以滲透到預(yù)形成的MOF中的每單位體積生物分子的量相比，通過本發(fā)明的方法獲得的MOF內(nèi)包封的生物分子的均勻分布固有地在每單位體積MOF骨架內(nèi)提供了更大量的生物分子。

例如，本發(fā)明的方法可以提供包封約1％wt至約32％wt的生物分子，約5％wt至約30％wt的生物分子，或約10％wt至20％wt的生物分子的MOF，其表示為包封蛋白質(zhì)的量(毫克)和所得MOF的重量(毫克)之間的比值。包封蛋白質(zhì)的量來源于對包封之前和之后，對液體溶液的樣品實(shí)施的溶液中蛋白質(zhì)的UV-Vis光譜吸光度測量。

MOF骨架“包封”生物分子表示圍繞生物分子形成骨架。

有利地，本發(fā)明的方法允許MOF具有包封處于其天然構(gòu)象的生物分子的骨架?！疤烊粯?gòu)象”的表達(dá)在本文中用于表示導(dǎo)致生物分子的生物活性的三維構(gòu)象。

例如，生物分子如肽、蛋白質(zhì)或核酸的天然構(gòu)象是由多肽或多核苷酸的自發(fā)或輔助折疊造成的以呈現(xiàn)最低焓值的分子構(gòu)象。這種構(gòu)象是由分別形成多肽和多核苷酸的氨基酸和核苷酸的具體化學(xué)特性和序列所產(chǎn)生的。

通過包封處于其天然構(gòu)象的生物分子，MOF可以有利地保持生物分子的生物活性。這表示(i)包封的生物分子顯示與那些游離生物分子相同的生物活性特征，或者(ii)包封的生物分子顯示出掩蔽的生物活性，這是由于其與外部環(huán)境物理地分離。然而，在(ii)中，一旦骨架溶解/破壞，則可以有利地利用生物分子的生物活性。

通過將懸浮在溶劑內(nèi)的MOF溶解，例如，通過引起溶劑pH變化，可以將包封在骨架內(nèi)的生物分子釋放到溶劑中。根據(jù)該方法，MOF可以是pH誘導(dǎo)的包封生物分子的靶向釋放的良好候選，例如，這對于向生物機(jī)體的藥物遞送應(yīng)用是有用的?？蛇x地，光的應(yīng)用可以引發(fā)配體-金屬立體化學(xué)的構(gòu)象變化，因此它可以導(dǎo)致內(nèi)腔尺寸的變化并因此釋放生物分子負(fù)載物。

可以在基于pH-引發(fā)的生物分子的釋放的應(yīng)用中使用的MOF的實(shí)例包括在某些pH值下穩(wěn)定，但在某些其它pH值下溶解的MOF。例如，在高于閾值pH值時(shí)，MOF可以是穩(wěn)定的。在這種情況下在其中懸浮了MOF的溶液中，具有不可檢測的生物分子的釋放。然而，當(dāng)pH降至閾值之下時(shí)，MOF可以溶解，從而導(dǎo)致生物分子在溶液中的釋放。

例如，某些ZIF在胞外pH(約7.4)是穩(wěn)定的，但當(dāng)pH降至6.5以下時(shí)溶解，例如，在胞內(nèi)pH(約6)。這可以導(dǎo)致包封生物分子的釋放，其通過骨架內(nèi)的保護(hù)來維持其生物活性。

在這種背景中，相對于溶解時(shí)通過MOF釋放到溶劑中的金屬離子的量確定某些pH下溶劑中MOF的穩(wěn)定性。通過將MOF暴露于該pH條件2小時(shí)之前和之后實(shí)施的電感耦合等離子體(ICP)確定溶劑中金屬離子的濃度。如果2小時(shí)后溶液中金屬離子的測量濃度與初始值相差小于15％，則認(rèn)為MOF“穩(wěn)定”。

MOF骨架可以有利地保護(hù)包封生物分子抵抗環(huán)境條件，環(huán)境條件否則將破壞處于其游離形式(即未包封在MOF內(nèi))的生物分子。也就是說，在多種環(huán)境條件下，包封骨架改善了生物分子的穩(wěn)定性。例如，發(fā)現(xiàn)包封的生物分子保持了它們的生物活性，即使在MOF暴露于高達(dá)90℃的溫度持續(xù)超過1小時(shí)的一段時(shí)間之后。

本發(fā)明還有利地允許在晶體MOF內(nèi)包封生物分子，而不考慮內(nèi)腔和生物分子之間的相對尺寸。

例如，本發(fā)明的方法允許在晶體MOF內(nèi)包封顯著大于骨架內(nèi)腔的生物分子。該方法可以提供獨(dú)特的MOF，而常規(guī)合成后滲透法排除了它們的可能性。

因此，本發(fā)明還提供了產(chǎn)生具有骨架的晶體MOF的方法，骨架(i)限定了內(nèi)腔，和(ii)包封了生物分子，所述方法包括在溶液中使MOF前體和生物分子結(jié)合，生物分子促進(jìn)包封骨架的形成，其中生物分子具有大于骨架任何內(nèi)腔的最大腔直徑(LCD)的最小尺寸。

本發(fā)明還提供了具有骨架的晶體MOF，骨架：(i)限定了內(nèi)腔和(ii)包封了生物分子，其中生物分子具有大于骨架任何內(nèi)腔的最大腔直徑(LCD)的最小尺寸。

通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)，可以確定生物分子的最小尺寸。

當(dāng)生物分子為出于XRD表征的目的可以結(jié)晶的蛋白質(zhì)或核酸時(shí)，“最小尺寸”的表達(dá)表示獲得自蛋白質(zhì)或核酸的相應(yīng)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(Protein Data Bank，PDB)文件的蛋白質(zhì)或核酸的任何尺寸的最小值(與分子量相反)。

如本領(lǐng)域已知的，蛋白質(zhì)或核酸的PDB文件編碼了形成蛋白質(zhì)或核酸的每個(gè)原子的空間分布，空間分布是通過對處于其結(jié)晶形式的蛋白質(zhì)或核酸實(shí)施XRD和NMR表征所確定的。根據(jù)技術(shù)人員已知的程序?qū)崿F(xiàn)蛋白質(zhì)或核酸的結(jié)晶。

如本領(lǐng)域已知的，可以通過3D編輯軟件讀取PDB文件以獲得所得蛋白質(zhì)或核酸結(jié)構(gòu)的3D顯像。通過一系列處于“a×b×c”形式的3個(gè)長度值，3D顯象軟件使得能夠精確測定模型蛋白質(zhì)或核酸的幾何尺寸。因此，在這種背景中，蛋白質(zhì)或核酸的“最小尺寸”是a、b和c的最小值。

在就出于XRD和NMR表征的目的不能結(jié)晶的生物分子如蛋白質(zhì)或核酸的情況下，“最小尺寸”的表達(dá)是指根據(jù)Harold P.Erickson,'Size and Shape of Protein Molecules at the Nanometer Level Determined by Sedimentation,Gel Filtration,and Electron Microscopy’Biological Procedures Online,11卷,1號中詳細(xì)描述的過程確定的蛋白質(zhì)或核酸的斯托克斯半徑(Stokes radiu)。

只要生物分子的最小尺寸大于結(jié)晶骨架的內(nèi)腔的LCD，則相對于晶體MOF內(nèi)腔的LCD，對生物分子的尺寸無限制。

只要生物分子包封在晶體MOF骨架內(nèi)，則生物分子的最小尺寸可以有利地是晶體MOF內(nèi)腔的LCD的任何程度大。例如，生物分子的最小尺寸可以是骨架的任何內(nèi)腔的LCD的至少1.5、2、5、10、25、50、75、100、250、500、750或1000倍大。

生物分子可以相對緊密地包封在MOF骨架內(nèi)，從而阻礙例如生物分子和包封骨架之間的相對運(yùn)動(dòng)。據(jù)信生物分子在自限定腔內(nèi)作為非均相且不連續(xù)的客體相位于MOF骨架內(nèi)。也就是說，生物分子不位于MOF骨架的內(nèi)腔內(nèi)。的確，SAXS測量確認(rèn)了MOF骨架內(nèi)這種自限定腔的存在，發(fā)現(xiàn)其在比包封的生物分子的尺寸大17％至30％的范圍內(nèi)。

通過在MOF骨架內(nèi)緊密包封，生物分子可以與骨架相互作用。生物分子和骨架之間可能的相互作用可以是生物分子內(nèi)帶負(fù)電荷的域和骨架的金屬離子之間的離子配位或混合的離子/共價(jià)相互作用。例如，對包封蛋白質(zhì)的ZIF-8實(shí)施FTIR表征顯示了蛋白骨架的羰基和ZIF-8骨架的Zn²⁺離子之間可能的相互作用。據(jù)信當(dāng)包封在MOF骨架內(nèi)時(shí)，這些相互作用在多種環(huán)境條件下有助于改善生物分子的物理和化學(xué)穩(wěn)定性。

通過允許包封最小尺寸大于結(jié)晶骨架任何內(nèi)腔的最大腔直徑的生物分子，可以克服合成后滲透法的固有限制。

在合成后滲透法的情況下，考慮到相對于晶體MOF骨架內(nèi)腔尺寸的生物分子尺寸，可用的晶體MOF/生物分子系統(tǒng)的數(shù)目受限制。也就是說，所報(bào)道的合成后滲透法僅允許合成其中生物分子足夠小以擴(kuò)散穿過骨架，并且骨架內(nèi)腔足夠大以在空間上容納生物分子的那些晶體MOF/生物分子系統(tǒng)。

因此，通過合成后滲透途徑可獲得的晶體MOF和生物分子的可用組合受限。例如，孔尺寸通常小于2nm的微孔MOF(其代表了最常見的MOF種類)固有地不適合于被大部分生物分子如蛋白質(zhì)(包括酶)或核酸(其最小尺寸通常超過2nm)滲透，。

在一個(gè)實(shí)施方式中，生物分子是氨基酸。

如本文所使用的，“氨基酸”的表達(dá)是指含有堿性氨基(NH₂)和酸性羧基(COOH)的有機(jī)酸。該表達(dá)以其最廣泛的含義使用并且可以表示處于其多種不同化學(xué)形式的氨基酸，包括單次施用的氨基酸、其生理學(xué)活性鹽或酯，其與其多種鹽的組合，其互變異構(gòu)、聚合和/或異構(gòu)形式，其類似物形式、其衍生形式和/或其脫羧產(chǎn)物。

通過非限制性實(shí)例，在本發(fā)明中有用的氨基酸的實(shí)例包括胍基丁胺、β-丙氨酸、精氨酸、天門冬酰胺、門冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯基β-丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸。

只要形成MOF，對具有MOF前體的溶液中存在的氨基酸濃度沒有具體限制。

溶液中適合的氨基酸濃度可以包括以下范圍：約0.1和100mg/mL之間、約0.1和75mg/mL之間、約0.1和50mg/mL之間、約0.1和25mg/mL之間、約0.2和25mg/mL之間、約0.25和25mg/mL之間、約0.25和20mg/mL之間、約0.25和15mg/mL之間、約0.25和10mg/mL之間以及約0.025和1.5mg/mL之間。

在一個(gè)實(shí)施方式中，生物分子是蛋白質(zhì)。

如本文所使用的，術(shù)語“蛋白質(zhì)”是指氨基酸殘基的聚合物并且是指它們的變體和合成類似物。因此，這些術(shù)語適用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基為合成的非天然存在的氨基酸，如對應(yīng)于天然存在的氨基酸的化學(xué)類似物的氨基酸聚合物以及天然存在的氨基酸聚合物。如本文所使用的，術(shù)語“蛋白質(zhì)”還包含酶。

蛋白質(zhì)通常折疊成獨(dú)特的3-維結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)可以呈現(xiàn)多種3-維形狀。將單個(gè)蛋白質(zhì)分子的整體形狀鑒別為“三級結(jié)構(gòu)”。通過其三級結(jié)構(gòu)決定/控制蛋白質(zhì)的基本生物活性功能。

根據(jù)本發(fā)明，蛋白質(zhì)可以選自治療性或預(yù)防性蛋白。這些可以包括血漿蛋白、激素和生長因子、胞外蛋白和用于疫苗的蛋白質(zhì)抗原。它們還可以選自在化妝品和食品中使用的結(jié)構(gòu)有用的蛋白。

血漿蛋白的實(shí)例包括(但不限于)白蛋白(HSA)、血紅蛋白、凝血酶、纖連蛋白、纖維蛋白原、免疫球蛋白、凝血因子(FX、FVIII、FIX)。胞外蛋白的實(shí)例(并且在一些情況下，還將它們描述為結(jié)構(gòu)蛋白)包括(但不限于)膠原蛋白、彈性蛋白、角蛋白、肌動(dòng)蛋白、微管蛋白、肌球蛋白、驅(qū)動(dòng)蛋白和動(dòng)力蛋白。

激素和生長因子的實(shí)例包括(但不限于)胰島素、EGF、VEGF、FGF、胰島素樣生長因子、雄激素、雌激素。

抗原蛋白的實(shí)例包括(但不限于)卵清蛋白(OVA)，鑰孔戚血藍(lán)素和牛血清白蛋白(BSA)和免疫球蛋白。

可以在本發(fā)明中使用的蛋白質(zhì)包括酶。如本文所使用的，術(shù)語“酶”是指來源于活細(xì)胞或人工合成的蛋白質(zhì)，其能夠通過催化作用在有機(jī)物質(zhì)中產(chǎn)生化學(xué)變化。

酶在多個(gè)領(lǐng)域是工業(yè)可用的，如食品、紡織、動(dòng)物飼料、個(gè)人護(hù)理和去污劑、生物修復(fù)和催化。在這些應(yīng)用領(lǐng)域中，構(gòu)象和活性的保持、生物利用率和釋放譜以及包封載體的采用均在它們的工業(yè)應(yīng)用中起到一些作用。由于它們的高選擇性，酶還在生物醫(yī)學(xué)裝置和傳感器中有用。

因此，在本發(fā)明中有用的酶可以根據(jù)它們的最終用途分類。

在食品工業(yè)中使用的酶的實(shí)例包括(但不限于)果膠酶、高血壓蛋白原酶、木質(zhì)素-修飾酶、木瓜蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶。

在紡織工業(yè)中使用的酶的實(shí)例包括(但不限于)內(nèi)切葡聚糖酶、氧化酶、淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶和木聚糖酶。

在生物醫(yī)學(xué)/傳感器工業(yè)中使用的酶的實(shí)例包括(但不限于)脫氫酶、脂肪酶、辣根過氧化物酶(HRP)、脲酶和RNA或DNA酶，如核糖核酸酶。

只要由前體形成MOF，對具有MOF前體的溶液存在中的蛋白質(zhì)濃度沒有具體限制。

溶液中適合的蛋白質(zhì)濃度可以包括以下范圍：約0.1和20mg/mL之間、約0.15和10mg/mL之間、約0.15和7.5mg/mL之間、約0.2和5mg/mL之間、約0.25和5mg/mL之間、約0.03和5mg/mL之間、約0.025和2.5mg/mL之間、約0.025和2mg/mL之間、約0.025和1.5mg/mL之間或約0.025和1.25mg/mL之間。

在一個(gè)實(shí)施方式中，生物分子是核酸。

如本文所使用的，“核酸”的表達(dá)是術(shù)語“多核苷酸”的同義詞，其表示所有已知形式的生命所必需的聚合物大分子或大生物分子，其可以包括(但不限于)DNA(cDNA、cpDNA、gDNA、msDNA、mtDNA)、寡核苷酸(雙鏈或單鏈)、RNA(正義RNA、反義RNA、mRNA(pre-mRNA/hnRNA)、tRNA、rRNA、tmRNA、piRNA、aRNA、RNAi、YRNA、gRNA、shRNA、stRNA、ta-siRNA、SgRNA、Sutherland RNA、小干擾RNA(siRNA)、雙鏈RNA(dsRNA)、短發(fā)夾RNA(shRNA)、piwi-相互作用RNA(PiRNA)、微小RNA(miRNA)、小核仁RNA(SnoRNA)、小核RNA(SnRNA)、核糖酶、適體、DNA酶、核糖核酸酶-類復(fù)合物以及如本文的其它這些分子。

為了避免引起疑問，“核酸”的表達(dá)包括非天然存在的修飾形式以及天然存在的形式。

在一些實(shí)施方式中，核酸分子包含約8至約80個(gè)核堿基(即約8至約80個(gè)連續(xù)連接的核酸)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解本發(fā)明包含長度為8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80個(gè)核堿基的核酸分子。

只要形成MOF，對具有MOF前體的溶液中存在的核酸濃度沒有具體限制。

溶液中適合的核酸濃度包括以下范圍：相對于含有MOF前體和核酸的溶液的總體積，約0.001至100μM之間、約2至50μM之間、約2至10μM之間、約3至5μM之間、約3.45至5μM之間或約3.45至4μM之間。

現(xiàn)將參考以下非限制性實(shí)施例描述本發(fā)明的具體實(shí)施方式。

實(shí)施例

生物分子

實(shí)施例中使用的氨基酸為丙氨酸、蛋氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、甘氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸、天門冬酰胺、谷氨酰胺、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、天門冬氨酸、谷氨酸。

實(shí)施例中使用的蛋白質(zhì)為DQ-卵清蛋白(DQ-OVA，來自雞蛋清，MW～44kDa)、牛血清白蛋白(BSA，來自牛血清，部分V，MW～66kDa)、人血清白蛋白(HSA，來自人血清，MW～66kDa)、卵清蛋白(OVA，來自雞蛋清，MW～44kDa)、血紅蛋白(來自牛血液，MW～64.5kDa)和胰島素(來自牛胰腺，MW～5.8kDa)。這些優(yōu)選實(shí)施方式的酶為胰蛋白酶(來自牛胰腺，MW～23.8kDa)、葡萄糖脫氫酶吡咯喹啉醌((PQQ)GDH，來自弱氧化葡糖桿菌(Gluconobacter suboxydans)，MW～100kDa)、溶菌酶(來自雞蛋清，MW～14.3kDa)、辣根過氧化物酶(HRP，來自山葵(Amoracia rusticana)，II型，MW～44kDa)、核糖核酸酶A(來自牛胰腺，I-AS型，MW～13.7kDa)、脂肪酶(來自洋蔥假單胞菌(Pseudomonas cepacia)，MW～34kDa)和脲酶(來自矮生刀豆(Canavalia ensiformis)，III型，單個(gè)亞單位(single subunit)MW～90.8kDa，共6個(gè)亞單位，～544.6kDa)。

用于這些優(yōu)選實(shí)施方式的核酸為Cy3-標(biāo)記的寡核苷酸。

獲得自蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的典型尺寸(晶胞，a×b×c，)：DQ-OVA和OVA：62.9×84.7×71.5；BSA：217.8×44.9×143.6；HSA：54.84×55.62×l20.27；血紅蛋白：63.1×82.91×53.65；胰島素：81.56×81.56×33.54；胰蛋白酶：76.9×53.4×46.6；(PQQ)GDH：60.59×158.72×221.39；溶菌酶：77.93×77.93×36.96；HRP：40.04×66.81×116.36；核糖核酸酶A：100.74×32.82×72.69；脂肪酶：244.33×244.33×244.33；脲酶：138.57×138.57×198.35。

Cy3-標(biāo)記的寡核苷酸(50個(gè)堿基，MW：16kDa)購自Trilink Biotechnologies Inc.(San Diego,California,USA)。DQ-卵清蛋白(DQ-OVA)得自Life Technologies(VIC,Australia)。所使用的所有其它反應(yīng)物購自Sigma-Aldrich并且使用時(shí)無需進(jìn)一步修飾。

MOF

實(shí)施例中制備的MOF為ZIF-8(LCD)、HKUST-1(LCD)、Eu(bdc)(bdc＝l,4-苯三羧酸酯MOF，)、Tb(bdc)(LCD[請?jiān)诖瞬迦隩b(BDC)的最大腔直徑值]MIL-88A(LCD[請?jiān)诖瞬迦隡IL-88A的最大腔直徑值])。

FITC-標(biāo)記的蛋白質(zhì)的合成

在一些實(shí)例中，用FITC標(biāo)記蛋白質(zhì)。將1mg FITC和35mg BSA溶于2.5mL MOPS緩沖液(CAS 1132-61-2，10mM，pH 7.0)并且通過溫和攪拌在室溫下保持2h。將混合物通過GE Healthcare illustra NAP-25柱(GE Healthcare Life sciences,NSW,Australia)回收FITC-標(biāo)記的BSA。

實(shí)施例1

氨基酸@ZIF-8

為了制備ZIF-8，在溶液中使用20種氨基酸對相關(guān)前體試劑接種，每種氨基酸處于單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中，共計(jì)20個(gè)實(shí)驗(yàn)。首先，將等量(0.02g)的每種氨基酸引入到HmIm的水溶液中(160mM，2mL)。隨后并且單獨(dú)將這些第一溶液中的每一種與含有MOF金屬前體的水溶液(即醋酸鋅，40mM，2mL)混合。

觀察到含有不同氨基酸的MOF前體溶液的pH無顯著變化。將溶液保持在室溫下。溶液濁度隨時(shí)間的升高顯示出ZIF-8晶體的形成。用NMR、SEM和PXRD測量驗(yàn)證晶體性質(zhì)。ZIF-8的形成速度取決于所使用的氨基酸。

在使氨基酸與ZIF-8前體結(jié)合10分鐘后實(shí)施，將使用UV-Vis光譜儀測量的光散射用作定性參數(shù)以鑒別晶體形成的效率/速率。結(jié)果收集在圖3中。

粉末XRD分析確認(rèn)了形成的晶體具有與模擬的ZIF-8以及使用標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程合成的ZIF-8相同的峰值。在圖3中，根據(jù)氨基酸側(cè)基團(tuán)的性質(zhì)，對單獨(dú)的氨基酸接種MOF晶體形成的效率進(jìn)行分組。

發(fā)現(xiàn)晶體形成與氨基酸的電荷和親水性密切相關(guān)；親水性最強(qiáng)和帶負(fù)電荷的氨基酸顯示出比疏水性更強(qiáng)和帶正電荷的氨基酸更好的引起ZIF-8晶體形成的能力。這些觀察結(jié)果導(dǎo)致以下假設(shè)：帶負(fù)電荷的分子將吸引陽性的Zn²⁺離子并且在成核階段幫助穩(wěn)定Zn-HmIm簇，這促進(jìn)了ZIF-8晶體的形成。

實(shí)施例2

蛋白質(zhì)@ZIF-8

將10mg適當(dāng)?shù)牡鞍缀兔讣尤氲?-甲基咪唑(160mM，20mL，pH 10.3)在去離子水的溶液中。對于胰島素，將10mg胰島素加入水中，用HCl(20mM)將pH調(diào)至3-4以完全溶解胰島素并且在加入2-甲基咪唑(160mM)前調(diào)回到pH 10.3。還制備了溶于去離子水的單獨(dú)的醋酸鋅溶液(40mM，20mL)。使這兩種溶液結(jié)合，然后攪拌10s。將所得溶液在室溫下(23℃)老化12h。通過在6000rpm離心10min回收所得沉淀物，然后在去離子水或乙醇中清洗并離心。

使用預(yù)先確定的FITC-標(biāo)記蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過熒光分光光度法確定ZIF-8中蛋白的包封效率(wt％)。

蛋白質(zhì)包封效率；BSA約100％；HSA約100％，約100％；溶菌酶約96％；HRP約100％；核糖核酸酶A約86％；血紅蛋白約90％；胰蛋白酶約96％；脂肪酶約88％；胰島素約86％；(PQQ)GDH約82％；脲酶約95％。

BSA@ZIF-8 MOF形成的動(dòng)力學(xué)

在BSA的情況下，在1秒內(nèi)形成ZIF-8，然后將蛋白質(zhì)引入到ZIF-8前體的溶液中。

一旦引入BSA，則MOF前體和BSA的溶液幾乎立刻(1s)變得不太透明，并且然后在多至30s的反應(yīng)中濁度增加。

在沒有BSA的情況下，檢測透明度無變化，這是因?yàn)閷τ谌魏窝芯康姆磻?yīng)時(shí)間(長達(dá)30天)，MOF骨架不生長。X射線散射的分析顯示出盡管在沒有BSA的情況下，在注入ZIF-8前體后確實(shí)立刻在水溶液中形成了小顆粒(回轉(zhuǎn)半徑R_g＝35nm)，但是它們以非常少量形成，并且不夠大以促進(jìn)骨架生長。相反，當(dāng)使用BSA時(shí)，約30秒后形成較大的MOF顆粒(R_g＝100nm)，并且同時(shí)發(fā)生小顆粒的減少(以下詳細(xì)描述了用于由SAXS數(shù)據(jù)確定R_g的程序)。

在存在BSA的情況下，溶液幾乎即刻變得不太透明，同時(shí)濁度逐漸升高。在不存在BSA的情況下，檢測透明度無變化，從而排除了在任何研究反應(yīng)時(shí)間下ZIF-8的形成?；旌衔锉３滞该髑覠o色超過1個(gè)月，并且掃描電子顯微鏡(SEM)研究確認(rèn)了在這些條件下晶體不可能形成。

含有BSA的溶液的濁度與散射粒子的形成有關(guān)，可以使散射粒子沉淀并分析。

XRD分析確認(rèn)了單獨(dú)的顆粒為晶體ZIF-8，這是因?yàn)閷τ谒泻铣晌镔|(zhì)，測量的衍射圖與純ZIF-8的模擬衍射圖一致，如圖5所示。

對分離自含有生物分子的樣品的晶體進(jìn)行的掃描電子顯微鏡(SEM)分析使得能夠鑒別ZIF-8晶體形態(tài)對所使用的生物分子類型的依賴性，如圖4(a-k)所示。根據(jù)所使用的生物分子，形態(tài)從立方體至星形ZIF-8顆粒。因此，控制晶形的能力表明生物分子在作為MOF晶體形態(tài)的模板中起作用。

可以使用共聚焦顯微鏡檢測包封在ZIF-8骨架內(nèi)的FlTC-標(biāo)記的生物分子的光發(fā)射(圖4(l))。圖4(l)的插圖示出了含有包封FITC-標(biāo)記的生物分子的ZIF-8晶體的懸濁液的小瓶的照相圖像。

可以通過對包封FITC-標(biāo)記的BSA的ZIF-8進(jìn)行共聚焦激光顯微鏡觀察來研究ZIF-8骨架內(nèi)生物分子的空間分布，如圖4(l)、7和8所示。圖像使得能夠理解穿過每個(gè)掃描的ZIF-8晶體截面的均一發(fā)射信號，從而確認(rèn)熒光標(biāo)記的BSA在每個(gè)晶體內(nèi)平均且均勻分布。

BSA@ZIF-8、HRP@ZIF-8和脲酶@ZIF-8的SAXS表征

通過小角度X射線散射(SAXS)評價(jià)BSA@ZIF-8的分層多孔結(jié)構(gòu)。在澳大利亞同步加速器中心的SAXS光束線(SAXS beamline of the Australian Synchrotron facility)采集同步加速器SAXS數(shù)據(jù)。對毛細(xì)管加載清洗且干燥的樣品。使用SAXS/WAXS光束線(9.3keV，2675mM相機(jī)長度，使用Pilatus 1M作為檢測器，傳輸方式)研究樣品。對于每個(gè)SAXS分析，對每個(gè)毛細(xì)管，將4次測量(不同位置)取平均值，并且減去空毛細(xì)管的背景。將Scatterbrain軟件用于取平均值和背景扣除過程。

使用設(shè)置在統(tǒng)一模型(Unified model)中的Guinier knee確定自限定腔(即不是MOF骨架的內(nèi)腔，而是將生物分子包封其中的骨架的腔)的尺寸值(回轉(zhuǎn)半徑，R_g)。Beaucage等人(Beaucage,G.Small-Angle Scattering from Polymeric Mass Fractals of Arbitrary Mass-Fractal Dimension.J.Appl.Crystallogr.29,134-140(1996))描述了Guinier定律和結(jié)構(gòu)限制指數(shù)定律(Guinier's law and structurally limited power laws)如何可以來源于互相排斥的散射事件。在最簡單的情況下，所觀察的散射是雙組分的總和，

其中G是經(jīng)典Guinier前因子并且B是對指數(shù)散射定律(power-law scattering)的類型特異的前因子，其通過其中指數(shù)P下降的狀態(tài)指明。動(dòng)量傳遞q的單位為(長度)^-1，因此大的q散射檢測小的長度范圍。對于表面分形，

B＝4π²ρ²R_g^(6-P)τ((P-1)sin(π(P-3)/2)(P-3))，

其中R_g是大顆粒回轉(zhuǎn)半徑。誤差函數(shù)(eft)在一些擬合程序(例如，Igor)中是可用的，或者可以使用漸進(jìn)展開計(jì)算。

圖6(a)示出了通過BSA@ZIF-8生物復(fù)合物獲得的數(shù)據(jù)。可以使用回轉(zhuǎn)半徑(R_g)為的統(tǒng)一模型擬合所觀察到的Guinier knee，回轉(zhuǎn)半徑稍大于BSA的最大尺寸(當(dāng)根據(jù)E.Mylonasa等人，Accuracy of molecular mass determination of proteins in solution by small-angle X-ray scattering,Journal of Applied Crystallography 2007,40卷,s245)，來源于1N5U PBD數(shù)據(jù)時(shí)，R_g為約)。

在純ZIF-8中未檢測到具有足夠尺寸以容納生物分子的這種半徑的孔。數(shù)據(jù)支持本文所做出的解釋：生物分子作為自限定腔內(nèi)的非均勻且不連續(xù)客體相位于MOF骨架內(nèi)，即生物分子不位于MOF骨架的內(nèi)腔內(nèi)。

圖6(b)和6(c)示出了得自對HRP@ΖIF-8和脲酶@ΖIF-8樣品進(jìn)行的SAXS的數(shù)據(jù)。那些圖顯示了強(qiáng)度(計(jì)數(shù))相對于HRP@ZIF-8和脲酶@ZIF-8的的圖。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)一擬合(Unified fit)和統(tǒng)一擬合的Guinier組元顯示ZIF-8內(nèi)存在新一代自限定腔，對于HRP@ZIF-8，對于脲酶@ZIF-8，其大于各個(gè)生物分子的R_g。

實(shí)施例3

DNA@ZIF-8

將200μL寡核苷酸(20.8μM)加入到2-甲基咪唑(160mM，0.5mL)的去離子水的溶液中。制備溶于去離子水的單獨(dú)的醋酸鋅溶液(40mM，0.5mL)。然后，將這兩種溶液混合并渦旋10s?；旌衔镌谑覝叵吕匣?2h。通過6000rpm離心20min回收所得沉淀物，然后在乙醇中清洗并離心。使用在561nm(Cy3最大發(fā)射波長)采集發(fā)射的熒光分光光度計(jì)，根據(jù)預(yù)先確定的標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過測量前體溶液中以及所得晶體的上清液中的DNA濃度確定ZIF-8中DNA的負(fù)載效率(75％wt)。

從加入到2-甲基咪唑(160mM，20mL)的去離子水的溶液中的單個(gè)氨基酸(6.67mM)合成了氨基酸-引起的ZIF-8。還制備了溶于去離子水的單獨(dú)的醋酸鋅溶液(40mM，20mL)。然后，將這兩種溶液混合并渦旋10s。將混合物在室溫下老化10分鐘。通過在20000g下離心10min回收所得沉淀物，然后在乙醇中清洗并離心。

實(shí)施例4

HKUST-1的生物接種

將苯-1,3,5-三羧酸(btc)溶于乙醇(53.45mM，20mL)。還制備了溶于去離子水的單獨(dú)的硝酸銅(II)溶液(40.09mM，20mL)。然后，將這兩種溶液混合并渦旋10s。然后，將120μL BSA溶液(10mg/mL，在MQ中)加入到混合物中。將混合物溶液在室溫下老化12h。將懸濁液以6000rpm離心20min，并使用乙醇作為清洗緩沖液，進(jìn)行三次離心-清洗循環(huán)。產(chǎn)率：11％。

實(shí)施例5

Eu-BDC和Tb-BDC的生物接種

根據(jù)Daiguebonne,C.等人的"Structural and Luminescent Properties of Micro-and Nanosized Particles of Lanthanide Terephthalate Coordination Polymers"Inorganic Chemistry 47,3700-3708,(2008)的程序，制備對苯二甲酸二鈉鹽。將5g對苯二甲酸溶于去離子水，向其中加入2.32g氫氧化鈉。將所得溶液蒸干，然后將固體再懸浮在乙醇中并在過濾、用水清洗和干燥前回流1h。然后，將對苯二甲酸的二鈉鹽溶于去離子水(10mM，20mL)，向其中溶解200mg BSA。還將EuCl₃·6H₂O或TbCl₃·6H₂O溶于去離子水(10mM，20mL)。然后，將鑭系元素鹽溶液和BSA配體溶液混合并渦旋震蕩10s。通過在6000rpm下離心20min回收沉淀物，然后在乙醇中清洗并離心3次之前，將溶液輕輕攪拌12h。

MIL-88A的生物接種

將不同量的BSA(2、4、8、16mg/mL)溶于富馬酸的去離子水的溶液中(25mM)。制備單獨(dú)的FeCl₃·6H₂O溶液(25mM)，并立即與等體積的含有BSA的富馬酸溶液混合，并渦旋震蕩10秒。將溶液混合物在室溫下老化7天。將懸浮液以6000rpm離心20min，并使用乙醇作為清洗緩沖液，進(jìn)行三次離心-清洗循環(huán)。

實(shí)施例6

HRP@ZIF-8的生物活性

首先將實(shí)施例2中獲得的HRP@ZIF-8晶體在70℃下在十二烷基硫酸鈉(SDS，10％w/w，在去離子水中，2mL)溶液中再分散10分鐘以洗去晶體表面上的游離酶。根據(jù)Chance,B.&MaeMy.A,C.Methods in enzymology 2卷,764-775(Academic Press,1955)中的程序，以焦棓酸(pyrogallol)作為氫供體(其可以轉(zhuǎn)化為淺黃色產(chǎn)物紅紫剖精(purpurogallin))，通過測量過氧化氫的分解速度確定HRP的活性。在典型的測定中，制備了含有76μL KH₂PO₃(100mM，pH 6.0)、38μL H₂O₂(5％w/w，在去離子水中)、76μL焦棓酸(5％w/w，在去離子水中)和1.8mL PBS緩沖液(pH 7.4)的溶液A。

向溶液A中，加入0.1mg HRP@ZIF-8晶體，并且立即在420nm，以30秒的增量通過UV-Vis監(jiān)控溶液的吸光值。在對照實(shí)驗(yàn)中，開始將1mg HRP@ZIF-8晶體再分散在去離子水(1mL)中并在90℃下培育1h。然后，將100μL所得溶液加入到溶液A中，并立即在420nm，以30秒的增量通過UV-Vis監(jiān)控溶液的吸光值。在使用無HRP的酶活性測定中，將引入到溶液A中的游離酶的量調(diào)節(jié)至等于負(fù)載到HRP@ZIF-8中的酶的量，如根據(jù)負(fù)載效率所確定的。

實(shí)施例7

(PQQ)GDH@ZIF-8的生物活性

將實(shí)施例2中獲得的(PQQ)GDH@ZIF-8晶體在70℃下在SDS(10％w/w，在去離子水中，2mL)溶液中再分散10分鐘以洗去晶體表面上的游離酶。在典型的測定中，制備了含1mL葡萄糖(20mM，在10mM MOPS緩沖液中，pH 7.0)、10μL 2,6-二氯靛酚(0.1mM，在去離子水中)、10uL吩嗪硫酸甲酯(0.06mM，在去離子水中)的溶液B。向溶液B中，加入0.1mg(PQQ)GDH@ZIF-8晶體，并且立即在600nm，以30秒的增量通過UV-Vis監(jiān)控溶液的吸光值。在對照實(shí)驗(yàn)中，將1mg(PQQ)GDH@ZIF-8晶體再分散在去離子水(1mL)中并在90℃下培育1h。然后，將100μL所得溶液加入到溶液B中，并立即在600nm，以30秒的增量通過UV-Vis監(jiān)控溶液的吸光值。在使用無(PQQ)GDH的酶活性測定中，將引入溶液B中的游離酶的量調(diào)節(jié)至等于負(fù)載到(PQQ)GDH@ZIF-8中的酶的量，如根據(jù)負(fù)載效率所確定的。

圖9示出了在存在蛋白水解試劑的情況下并且在沸水中處理后，相對于無(PQQ)GDH的(PQQ)GDH@ZIF-8的歸一化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化。使用吩嗪硫酸甲酯作為電子受體確定(PQQ)GDH的活性。

脲酶@ZIF-8的生物活性

當(dāng)脲酶(在高于45℃下變性)包封在MOF骨架內(nèi)時(shí)，可以保護(hù)高達(dá)80℃。由于脲酶尺寸(約600kDa，177.9A水動(dòng)力)及其在存在醇(例如，甲醇)時(shí)快速降解，因此所提議的方法可以克服先前報(bào)道的旨在使用MOF作為生物大分子的主體和/或需要有機(jī)溶劑的方法的限制。

使用酚紅作為pH指示劑，通過測量由于脲轉(zhuǎn)化為氨所造成的pH升高，確定脲酶@ZIF-8的活性。通過將10mg酚紅溶解在284μL NaOH溶液(0.1M)中制備酚紅溶液，并用去離子水組成10mL的最終體積。在典型的測定中，將10μL酚紅溶液、990μL脲溶液(0.5M)和ZIF-8@脲酶加入到UV-Vis比色皿(cuvette)中，并在560nm，以30秒的增量，通過UV-Vis監(jiān)控溶液吸光值。

圖10示出了在80℃水中熱處理1小時(shí)之前和之后，脲酶@ZIF-8相對于游離脲酶的歸一化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化。實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行三次。由于脲向氨的轉(zhuǎn)化，使用酚紅作為pH指示劑確定脲酶的活性。半衰期是達(dá)到最大底物轉(zhuǎn)化一半的時(shí)間；V₀是酶的初始底物轉(zhuǎn)化速率。

實(shí)施例8

pH-引發(fā)的蛋白質(zhì)釋放

圖11(a-d)示出了測試程序。在37℃下，在溫和攪拌下，在pH 7.4或pH 6.0下，將1mg通過實(shí)施例2的合成中使用的標(biāo)記的BSA所制備的FITC-BSA@ZIF-8分散在2mL pH調(diào)節(jié)的PBS中。在24小時(shí)內(nèi)，以固定時(shí)間間隔，將晶體分散體系以20000g離心10min，并通過使用熒光分光光度計(jì)監(jiān)控上清液的熒光強(qiáng)度來評價(jià)釋放的FITC-BSA的熒光強(qiáng)度。圖11(e)示出了測量數(shù)據(jù)。

pH-引發(fā)的酶的釋放以及所釋放的酶的生物活性

通過使用ZIF作為主物質(zhì)所提供的其它優(yōu)勢在于Zn離子和HmIm有機(jī)配體之間的配位在生理學(xué)相關(guān)條件下是pH依賴性的。也就是說，骨架可以在特定pH值下溶解，從而將包封的生物分子釋放到外界環(huán)境中。這對于藥物遞送應(yīng)用是特別有用的，其中例如酶必須在以特定pH值為特征的特定位置釋放。

通過實(shí)驗(yàn)已對FITC-標(biāo)記的BSA-@ZIF-8樣品晶體發(fā)現(xiàn)了這種情況，對其測量了具體的pH引起的釋放譜。圖11(a-d)示出了該測試。在pH 7.4(即胞外pH)，24h內(nèi)從晶體釋放的BSA小于10％，表明晶體保持穩(wěn)定。然而，在pH 6.0的PBS(即胞內(nèi)條件)中，可以在約24h后測量到BSA的定量釋放(圖11(e)，由于MOF骨架的逐漸溶解)。

pH-引發(fā)的反應(yīng)生物分子向相同溶液的釋放

為了證明包封的分子保留了它們的生物活性，根據(jù)圖11(f-i)中所示的測試，對與包封DQ-卵清蛋白(DQ-OVA)的ZIF-8混合的包封酶胰蛋白酶的ZIF-8進(jìn)行了類似的pH-釋放測試。DQ-OVA是熒光蛋白底物，并且一旦發(fā)生通過胰蛋白酶的DQ-OVA的酶促蛋白水解，則形成高度熒光染料標(biāo)記的肽。因此，如果從MOF釋放了胰蛋白酶和卵清蛋白，則酶可以進(jìn)行其切割所釋放的蛋白卵清蛋白的催化活性。單獨(dú)清洗含有生物分子的兩批MOF，然后在pH 7.4下混合在一起以形成懸濁液。使用熒光分光光度計(jì)測量來自生物官能化的ZIF-8的溶液發(fā)射的熒光強(qiáng)度，其顯示了隨時(shí)間可忽略的變化(圖11(j))。

圖11(f-j)示出了測試的程序。在37℃下，溫和攪拌下，在pH 7.4或pH 6.0下，將1mg胰蛋白酶@ZIF-8和1mgDQ-OVA@ZIF-8分散在2mL pH-調(diào)節(jié)的PBS中。使用熒光分光光度計(jì)持續(xù)監(jiān)控溶液中通過胰蛋白酶對DQ-OVA的蛋白水解所產(chǎn)生的來自BQDIPY染料的熒光。圖11(j)示出了測量數(shù)據(jù)。

一旦將嵌入胰蛋白酶或DQ-OVA的MOF晶體暴露于pH 6.0，則MOF開始分解，從而將相應(yīng)的生物分子釋放到溶液中。一旦溶液中的生物分子反應(yīng)，則引起熒光強(qiáng)度的升高，這是由于來源于胰蛋白酶對DQ-OVA的蛋白水解活性的染料標(biāo)記的肽的形成所造成的(圖11(j))。

圖12示出了在pH 6.0下，BSA@ZIF-8晶體隨時(shí)間的逐漸分解的SEM圖。

實(shí)施例9

形成提高BSA濃度的ZIF-8

進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以改變可以包封的生物分子的量。結(jié)果還表明通過改變蛋白質(zhì)的量，可以調(diào)節(jié)MOF的結(jié)晶性。除了一些批次是通過提高BSA的量制備的，根據(jù)實(shí)施例2制備了BSA@MOF樣品。具體地，在室溫下，在與醋酸鋅的水溶液(40mM，2mL)混合前，使用溶于HmIm水溶液(160mM，2mL)的1mg，5mg、10mg和20mg的量的BSA制備樣品。使用SEM、XRD和Brunauer-Emmett-Teller(BET)研究所制備的BSA@MOF。

在圖13、14和15中采集結(jié)果。

圖13示出了包封BSA并且使用提高量的BSA合成的ZIF-8的SEM圖像。在室溫下，在與醋酸鋅的水溶液(40mM，2mL)混合前，將1mg(a)、5mg(b)、10mg(c)和20mg(d)BSA溶于HmIm的水溶液(160mM，2mL)中。

圖14示出了XRD圖像，其示出了在生物接種方法中使用提高濃度的BSA時(shí)，結(jié)晶性降低。在室溫下，在與醋酸鋅的水溶液(40mM，2mL)混合前，將1mg(藍(lán)色)、5mg(綠色)、10mg(橙色)和20mg(紅色)BSA溶于HmIm的水溶液(160mM，2mL)中。XRD光譜顯示出如何通過改變前體溶液中BSA的量，可以將產(chǎn)物從晶體(ZIF-8)調(diào)整至主要為無定形。結(jié)果表明大量蛋白質(zhì)可以包封在MOF中，而不影響形成任何類型晶體MOF的能力。

實(shí)施例10

蛋白@ZIF-8的BET表征

如圖15所示，使用BET測量數(shù)據(jù)，測量了包封BSA并且使用不同量的BSA獲得的ZIF-8的孔徑分布。隨著BSA的量的提高，孔體積逐漸降低?？讖綗o明顯改變，這表明圍繞生物分子形成ZIF-8。注意到集中在約孔隙寬度的第二峰值不代表ZIF-8骨架內(nèi)的內(nèi)腔，而是反映樣品中存在ZIF-8聚集體。由包裝在一起的單個(gè)ZIF-8晶體組成聚集體。聚集體的特征在于形成聚集體的相鄰晶體間的平均尺寸為的空隙。注意第一峰值顯示約11的孔隙直徑，其與LCD預(yù)測良好吻合。

BET還用于評價(jià)接種不同蛋白的ZIF-8的可接近表面積，蛋白包括BSA、HSA、OVA、胰蛋白酶、(PQQ)GDH、血紅蛋白、溶菌酶、HRP、核糖核酸酶A。提供了不著色的ZIF-8的BET用于比較。使用本文所列蛋白，合成與實(shí)施例2一致。

使用Micromeritics 6端口ASAP 2420分析儀，在-196℃下使用氮吸附確定BET表面積。分析前，將樣品在120℃下，真空脫氣8小時(shí)。使用密度泛函理論確定孔隙分布。這是通過實(shí)驗(yàn)測量孔徑分布的典型方法。將結(jié)果與數(shù)學(xué)衍生值，如LCD值相關(guān)聯(lián)，如Haldoupis,S.Nair and D.S.Sholl,Journal of the American Chemical Society,132(2010)7528中所列。

在77K下使用1mg(a)BSA、(b)HSA、(c)OVA、(d)胰蛋白酶、(e)(PQQ)GDH、(f)血紅蛋白、(g)溶菌酶、(h)HRP、(i)核糖核酸酶A對ZIF-8生物接種的BET N₂吸附/解吸曲線分別提供了(a)1381、(b)1025、(c)1031、(d)1307、(e)1278、(f)1329、(g)1370、(h)1376和(i)1404m²g^-1的表面積。

實(shí)施例11

用寡核苷酸接種ZIF-8(活性、SEM、CLSM)

將200μL的Cy3-寡核苷酸(20.8μM)添加至2-甲基咪唑的去離子水中的溶液(160mM，0.5mL)中。制備了溶于去離子水的單獨(dú)的乙酸鋅溶液(40mM，0.5mL)。然后，將這兩個(gè)溶液混合并渦旋震蕩10秒。將混合物在室溫下老化24h。在16000rpm下離心10min回收所得沉淀物，然后在乙醇中清洗并離心。使用在561nm(Cy3最大發(fā)射波長)的發(fā)射下采集的熒光分光光度計(jì)，根據(jù)預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過測量前體溶液中和所得晶體上清液中DNA的濃度，確定DNA在ZIF-8中的負(fù)載效率(75％)。

對比例1

合成后BSA向ZIF-8的滲透

根據(jù)本文描述的標(biāo)準(zhǔn)程序制備了一批純ZIF-8，并隨后將其暴露于FITC-標(biāo)記的BSA溶液。對后暴露于FITC-標(biāo)記的BSA的純ZIF-8進(jìn)行共聚焦研究以驗(yàn)證蛋白質(zhì)在MOF中的擴(kuò)散能力。

使用Leica TCS SP5進(jìn)行CLSM。合成后滲透的樣品顯示了如圖16所示的發(fā)射特性。滲透樣品的發(fā)射可以與根據(jù)本發(fā)明制備的BSA@ZIF-8樣品的發(fā)射相比，如圖7和8所示。BSA的確不在ZIF-8樣品內(nèi)擴(kuò)散，這是因?yàn)榇蟛糠职l(fā)射信號是在晶體表面上檢測到的。

FTIR還用于進(jìn)一步比較滲透后的MOF(現(xiàn)有技術(shù))和根據(jù)本發(fā)明制備的含有BSA的MOF內(nèi)蛋白的分布。圖17示出了測量數(shù)據(jù)。因此，研究了以下樣品：

1)純BSA；

2)BSA@ZIF-8；

3)根據(jù)實(shí)施例2的程序并用表面活性劑清洗的BSA@ZIF-8；

4)純ZIF-8；

5)合成后用BSA滲透的預(yù)形成的純ZIF-8；

6)合成后用BSA滲透并用表面活性劑清洗的預(yù)形成的純ZIF-8。

參考圖17中的光譜，在BSA@ZIF-8(橙色)和在BSA中培育的ZIF-8(藍(lán)色)上檢測到了蛋白質(zhì)(BSA)的酰胺I(1655cm^-1)和酰胺II(1548cm^-1)峰特征。然而，在SDS清洗后，僅在通過本發(fā)明制備的BSA@ZIF-8上檢測到了酰胺峰，表明從后暴露于BSA溶液的ZIF-8上洗掉了蛋白質(zhì)。接種的ZIF-8中BSA的另一個(gè)指示與3600-2800cm^-1范圍內(nèi)的寬帶有關(guān)，這主要是通過屬于蛋白質(zhì)的化學(xué)基團(tuán)引起的。

表面活性劑(十二烷基硫酸鈉，SDS)清洗顯示出后暴露于BSA溶液的ZIF-8中，與酰胺有關(guān)的光譜模式消失。在接種的BSA@ZIF-8中仍存在振動(dòng)模式，從而確定了蛋白質(zhì)位于ZIF-8內(nèi)部，因此蛋白質(zhì)被包封并可能通過空間限制緊密結(jié)合。

對比例2

暴露于高溫之前和之后HPR@CaCO₃和HRP@SiO₂顆粒的生物活性比HRP@ZIF-8和(PQQ)GDH

根據(jù)先前報(bào)道的方法，合成了HRP-負(fù)載的CaCO₃顆粒(Volodkin,D.V,Larionova,N.I.&Sukhorukov G.B.'Protein Encapsulation via Porous CaCO3Microparticles Templating'Biomacromolecules 5,1962-1972(2004)和Petrov,A.I.,Volodkin D.V.&Sukhorukov G.B.‘Protein-Calcium Carbonate Coprecipitation:A Tool for Protein Encapsulation',Biotechnology Progress,21,918-925(2005))。

進(jìn)行合成以比較常規(guī)負(fù)載了蛋白質(zhì)的CaCO₃顆粒的生物活性與根據(jù)本發(fā)明制備的包封蛋白質(zhì)的MOF的生物活性。

將Na₂CO₃(330mM，在去離子水中)溶液與等體積的含有HRP(2mg/mL，在去離子水中)的CaCl₂(330mM)溶液快速混合，然后在室溫下強(qiáng)烈攪拌30s。然后，將所得溶液在不攪拌的情況下老化15分鐘。通過在水中以1000g離心2分鐘回收所得沉淀物。在280nm使用UV-Vis光譜，根據(jù)預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過測量前體溶液中和所得顆粒的上清液中HRP的濃度來確定CaCO₃顆粒中HRP的負(fù)載效率。負(fù)載效率：28wt％。

對于負(fù)載了HRP的SiO₂顆粒的制備，用氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)修飾顆粒表面。將10mg二氧化硅顆粒(平均孔徑7nm，SBA-15，ACS Material,LLC；20、50和100nm孔徑，TESSEK Ltd.)懸浮在包含0.5mL APTES的甲苯(5mL)中。在室溫下攪拌12h后，用乙醇和水以連續(xù)的清洗/離心循環(huán)清洗APTES-修飾的二氧化硅顆粒三次，并最后分散在MES緩沖液中(1mL，0.1M，pH 5)。

然后，將HRP(1mg)和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC，1mg)引入到二氧化硅顆粒懸濁液中并在恒定溫和攪拌下培育2h。酶負(fù)載效率：82.0％(7nm孔SiO₂)，68.8％(20nm孔SiO₂)，69.1％(50nm孔SiO₂)，66.2％(100nm孔SiO₂)。

在70℃下，將負(fù)載了HRP的ZIF-8、CaCO₃和SiO₂顆粒再分散在SDS(10％w/w，在去離子水中，2mL)溶液中10分鐘以洗掉顆粒表面上的游離酶。在典型的生物活性測定中，將引入溶液A的ZIF-8、CaCO₃和SiO₂顆粒的量調(diào)至與負(fù)載在顆粒中的酶的量相同，如根據(jù)負(fù)載效率所確定的。一旦將顆粒加入至溶液A，立即在420nm下，以30秒的增量通過UV-Vis監(jiān)控溶液的吸光值。在對照實(shí)驗(yàn)中，在開始生物活性測定之前，將ZIF-8、CaCO₃和SiO₂顆粒再分散在去離子水中(1mL)并在90℃培育1h。

明顯地，在高溫下，MOF晶體像穩(wěn)健的屏障一樣保護(hù)生物分子。在存在焦棓酸的情況下，嵌入在ZIF-8晶體中的HRP引起酶促反應(yīng)(游離酶活性的88.5％，圖18(a))，而(PQQ)GDH處理葡萄糖(游離酶活性的74.2％，圖18(b))。

MOF生物復(fù)合物在90℃水熱處理1h僅導(dǎo)致少量生物活性損失(即總效率仍較高，對于HRP為82.3％，對于(PQQ)GDH為68.2％)。重要地，對溶液中游離酶的相同熱處理將其效率降至對于HRP僅6％和對于(PQQ)GDH僅6％，從而突出顯示了MOF的顯著保護(hù)作用。

然而，在90℃下將CaCO₃和SiO₂顆粒處理1h后，記錄了包含其中的酶的酶活性的顯著損失，盡管MOF顆粒表明酶活性無顯著損失(圖18(c))。

在另外的實(shí)驗(yàn)中，還將游離的HRP、HRP@CaCO₃、HRP@SiO₂和HRP@ZIF-8生物復(fù)合物浸沒在沸水中1小時(shí)。游離酶完全喪失活性，而HRP@CaCO₃轉(zhuǎn)化39％，且HRP@SiO₂復(fù)合物分別轉(zhuǎn)化65％(7nm孔)、44％(20nm孔)、17％(50nm孔)和13％(10nm孔)的底物。這些值顯著小于相同條件下ZIF-8保護(hù)的HRP所實(shí)現(xiàn)的88％的轉(zhuǎn)化。

在另外一組實(shí)驗(yàn)中，將相同體系浸沒在沸DMF(153℃)中1小時(shí)。同樣，游離酶完全喪失活性，而嵌入在碳酸鹽和二氧化硅顆粒中的酶分別顯示32％和22％的底物轉(zhuǎn)化。在這些條件下，MOF生命復(fù)合物顯示出90％的轉(zhuǎn)化，再次證明了MOF層顯著的保護(hù)性。

實(shí)驗(yàn)證明了MOF結(jié)構(gòu)具有保護(hù)酶抵抗熱降解的優(yōu)異性質(zhì)(保護(hù)中110％的相對改善)。這表明MOF可以更緊密地圍繞生物分子形成(通常CaCO₃具有20-70nm的范圍內(nèi)的孔徑[ref A.I.Petrov,D.V.Volodkin,G.B.Sukhorukov Biotechnol.Prog,2005,21,918-925；Yu-Ho Won,Ho Seong Jang,Ding-Wen Chunga,Lia A.Stanciu J.Mater.Chem.,2010,20,7728-7733])，從而防止熱使生物大分子去折疊。

因此，與CaCO₃和SiO₂相比，通過包封MOF所提供的優(yōu)良穩(wěn)定性可以與MOF骨架對生物分子的緊密包封直接相關(guān)。

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