本發(fā)明概括而言涉及一種用于促進生長的長雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum)CBTBG7菌株以及用于促進生長的含有該菌株的營養(yǎng)組合物，并且更具體地涉及一種能夠通過促進人乳的消化并合成維生素而促進新生兒、嬰兒、幼兒和成長兒童的生長的長雙歧桿菌CBTBG7菌株，并且涉及一種用于促進生長的營養(yǎng)組合物，該營養(yǎng)組合物含有所述長雙歧桿菌CBTBG7菌株。
背景技術(shù)：
：人類生長發(fā)生在直到青春期的時期，其中大多數(shù)生長板仍然是開放的。生長在醫(yī)學上可以被定義為伴隨成熟的大小的變化，并且具體地，術(shù)語“兒童生長”意在不僅包括身高的增加，而且還包括身體的每個器官的大小和功能的增加。人們普遍認為人類的生長受遺傳因素的影響最大。然而，事實上，遺傳因素對人類生長的影響只有23％左右，其余77％由出生后因素決定。近年來，由于經(jīng)濟持續(xù)增長、西化飲食習慣、改善營養(yǎng)狀況等，大大增加了兒童和青少年的生長和發(fā)育。另外，在社會氛圍重視(其中外部外觀和身高被認為是重要的)的情況下，生長越來越受到人們的關(guān)注。迄今為止，已知的促進生長的方法包括施用生長激素劑的方法。然而，使用生長激素非常昂貴并且可能引起不良作用，包括各種癥狀如注射部位的瘙癢、病發(fā)作、脂肪萎縮、高血壓、葡萄糖不耐受、胰腺炎、全身過敏反應(yīng)、生長激素抗體陽性反應(yīng)、癌癥發(fā)展和男性中的男性乳房發(fā)育。因此，迫切需要開發(fā)能夠基本上有助于生長的安全且有效的食品材料。韓國專利No.0887377(名稱為“嬰兒和青少年的健康補充食品(Healthsupplementfoodforbabiesandteenagers)”)、韓國專利No.10530211(名稱為“用于改善學習能力的功能保健食品組合物及其制備方法(Functionalhealthfoodcompositionforimprovinglearningabilityandpreparationmethodthereof)”)、韓國專利No.0561286(名稱為“用于促進生長發(fā)育的含有干酵母，天然提取物粉末和營養(yǎng)成分混合粉末的健康功能組合物(Healthfunctionalcompositionforpromotionofgrowthanddevelopmentcontainingdriedyeast,naturalextractpowderandmixedpowderofnutritivecomponents)”)等提議了用于促進生長的食物。然而，這些食物具有的生長促進效果不能達到預期。技術(shù)實現(xiàn)要素：技術(shù)問題本發(fā)明人進行了廣泛的努力以發(fā)現(xiàn)具有優(yōu)異的生長促進效果的益生菌，并因此在實驗上發(fā)現(xiàn)了長雙歧桿菌CBTBG7菌株作為生長促進產(chǎn)品的適用性，由此完成了本發(fā)明。本發(fā)明的一個目的是提供一種長雙歧桿菌CBTBG7菌株，其適用于促進新生兒、嬰兒、幼兒和成長兒童的生長。本發(fā)明的另一個目的是提供一種營養(yǎng)組合物，其通過促進人乳寡糖的消化、促進維生素合成和抑制有害細菌的增殖而能夠促進新生兒、嬰兒、幼兒和成長兒童的生長。技術(shù)方案為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的一個方面涉及提供用于促進生長的長雙歧桿菌CBTBG7雙歧桿菌，其國際保藏于韓國生物科學和生物技術(shù)研究所的韓國典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC)，保藏號為KCTC12200BP。本發(fā)明的另一方面涉及提供能夠促進嬰兒、幼兒和成長兒童生長的營養(yǎng)組合物，其含有本發(fā)明的長雙歧桿菌CBTBG7菌株。有益效果本發(fā)明的長雙歧桿菌CBTBG7菌株通過消化和供應(yīng)人乳寡糖而展示出優(yōu)異的生長促進作用，所述人乳寡糖難以在工業(yè)上大量產(chǎn)生并且不被人類酶消化，其也促進維生素生物合成、抑制有害腸細菌的增殖、促進有益細菌的生長和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明所述的促進生長的營養(yǎng)組合物通過激活代謝平衡和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)而可以促進新生兒、嬰兒、幼兒和成長兒童的生長和發(fā)育，并且其還可以促進大腦發(fā)育。另外，根據(jù)本發(fā)明所述的促進生長的營養(yǎng)組合物可以減輕生長遲緩、發(fā)育遲緩、體力降低和低體重。附圖說明圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明所述的長雙歧桿菌CBTBG7菌株(KCTC12200BP)的16SrRNA序列，并且還顯示了本發(fā)明的長雙歧桿菌CBTBG7菌株與相關(guān)物種之間的16SrRNA序列同源性和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的比較；圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明所述的長雙歧桿菌CBTBG7菌株的基因組DNA的RAPD(隨機擴增多態(tài)性DNA)分析的結(jié)果；圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明所述的長雙歧桿菌CBTBG7菌株(KCTC12200BP)的基因組DNA的PFGE(脈沖場凝膠電泳)分析的結(jié)果；圖4顯示了本發(fā)明的長雙歧桿菌CBTBG7菌株和相關(guān)的雙歧桿菌屬物種的系統(tǒng)發(fā)育樹；圖5顯示了根據(jù)本發(fā)明所述的長雙歧桿菌CBTBG7菌株的人乳低聚糖代謝相關(guān)基因的數(shù)目；圖6顯示了次級代謝產(chǎn)物生物合成基因是否存在于本發(fā)明的長雙歧桿菌CBTBG7菌株中；和圖7是顯示本發(fā)明的長雙歧桿菌CBTBG7菌株對小鼠生長的生長促進效果的圖譜。具體實施方式在下文中，將更詳細地描述本發(fā)明。本發(fā)明的一個方面涉及長雙歧桿菌CBTBG7菌株，其具有優(yōu)異的生長促進效果，并且國際保藏于韓國生物科學和生物技術(shù)研究所的韓國典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC)，保藏號為KCTC12200BP。根據(jù)本發(fā)明所述的長雙歧桿菌CBTBG7菌株可以通過消化人乳寡糖(HMOs)——所述人乳寡糖由于結(jié)構(gòu)非常復雜而不被人類酶消化并且難以大量工業(yè)化生產(chǎn)——并且通過向接受該菌株的嬰兒或幼兒供應(yīng)人乳寡糖，并且還通過產(chǎn)生可以在人體中用作營養(yǎng)物的代謝物例如維生素來促進新生兒、嬰兒和成長兒童的生長和發(fā)育。已知人乳含有200種以上具有有用功能的寡糖。已知人乳低聚糖促進有益腸微生物菌群的增殖和繁殖、抑制有害細菌的增殖、作為細胞反應(yīng)的調(diào)節(jié)劑、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，并且通過提供作為新生兒和嬰兒腦部生長發(fā)育所必需成分的腦活動能量而有助于新生兒和嬰兒的大腦發(fā)育。人乳寡糖在上胃腸道和小腸中具有抵抗酶消化的能力，并因此到達結(jié)腸而不被損壞并且在結(jié)腸中用作發(fā)酵的底物。據(jù)認為，人乳含有幾種因子，其促進抑制病原微生物增殖的有益腸微生物菌群的增殖。一種使得人乳寡糖能夠增加有益細菌的數(shù)量并減少潛在病原菌的數(shù)量的方法，其通過競爭細胞表面受體、競爭必需營養(yǎng)素、產(chǎn)生抗菌劑、以及產(chǎn)生抑制化合物如單鏈脂肪酸(SCFAs)而發(fā)生，所述單鏈脂肪酸可以降低排泄物的pH并抑制潛在的病原菌。人乳寡糖被發(fā)酵以產(chǎn)生SCFAs，例如乙酸、丙酸和丁酸。據(jù)認為，這種SCFAs有助于卡路里、作為腸上皮的主要能量來源、刺激結(jié)腸中的鈉和水的吸收、并且增強小腸中的消化和吸收。另外，SCFAs通過調(diào)節(jié)胃腸道發(fā)育和免疫功能來促進一般胃腸道健康。人乳寡糖(HMOs)由各種寡糖組成，主要有五種單糖：D-葡萄糖(Glc)、D-半乳糖(Gal)、N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)、L-巖藻糖(Fuc)和唾液酸(Sia；N-乙酰神經(jīng)氨酸[Neu5Ac])。根據(jù)本發(fā)明所述的短長雙歧桿菌CBTBG7菌株的基因組包括編碼消化人乳寡糖(HMOs)的酶的各種基因，所述酶諸如水解α-甘露糖的α-甘露糖苷酶、水解β-半乳糖的β-半乳糖苷酶、和內(nèi)橋-α-N-乙酰葡糖胺糖苷酶，該內(nèi)橋-α-N-乙酰葡糖胺糖苷酶水解α-甘露糖苷酶以及粘蛋白與粘蛋白型糖蛋白的絲氨酸和蘇氨酸殘基的半乳糖基-β-1,3-N-乙酰基-半乳糖胺的α鍵。另外，根據(jù)本發(fā)明所述的長雙歧桿菌CBTBG7菌株的基因組可以從L-天冬氨酸合成B族維生素中的煙酸(B3)。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明的長雙歧桿菌CBTBG7菌株可用作益生菌雙歧桿菌或可用于各種乳制品和其他發(fā)酵產(chǎn)物中。本發(fā)明的另一方面涉及用于促進生長的營養(yǎng)組合物，其含有本發(fā)明的長雙歧桿菌CBTBG7菌株。目前，人乳寡糖(HMOs)不能大量生產(chǎn)也不可商購，因此不被包含在大多數(shù)配方奶或配方食品中。雖然人乳寡糖(HMOs)是嬰兒的必需營養(yǎng)源，但是這些寡糖不被人類酶消化，并且如果這些寡糖不被消化，則被作為糞便排泄出。根據(jù)本發(fā)明所述的用于促進生長的營養(yǎng)組合物可以通過消化和供應(yīng)人乳寡糖來促進新生兒和嬰兒的大腦發(fā)育和生長。食品組合物是食品、補充劑、益生菌或共生體。本文使用的術(shù)語“益生菌”是指當以合適量提供時有益于宿主生物體健康的活微生物。本文使用的術(shù)語“共生體”是指含有益生元(prebiotic)和益生菌的混合物的食品。在一些實施方式中，除了長雙歧桿菌CBTBG7菌株之外，本發(fā)明的組合物還可以含有一種或多種乳酸菌或雙歧桿菌菌株，它們選自于由唾液乳桿菌(Lactobacillussalivarius)、短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)、瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus)、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)、副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)、干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)、德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckii)、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)、布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)、加氏乳桿菌(Lactobacillusgasseri)、約氏乳桿菌(Lactobacillusjohonsonii)、高加索酸奶乳桿菌(Lactobacilluskefir)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、兩歧雙歧桿菌(Bifidobacteriumbifidum)、假長雙歧桿菌(Bifidobacteriumpseudolongum)、嗜熱雙歧桿菌(Bifidobacteriumthemophilum)和青春雙歧桿菌(Bifidobacteriumadolescentis)組成的組。根據(jù)本發(fā)明所述的長雙歧桿菌CBTBG7菌株可以通過在通常用于雙歧桿菌培養(yǎng)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)而增殖，并且可以從培養(yǎng)物中回收。培養(yǎng)后得到的培養(yǎng)物可以原封不動地使用，如果需要，可以進行使用離心的粗純化和/或進行使用過濾或滅菌操作的固液分離。優(yōu)選地，僅通過離心回收雙歧桿菌細胞。此外，用于本發(fā)明的雙歧桿菌可以是濕細胞或干細胞。例如，可以通過凍干將雙歧桿菌配制為益生菌并在該狀態(tài)下使用。除了長雙歧桿菌CBTBG7菌株外，本發(fā)明的組合物還可以含有常規(guī)載體或賦形劑。另外，本發(fā)明的組合物可以與各種添加劑諸如粘合劑、崩解劑、包衣劑、潤滑劑等一起配制。本發(fā)明的組合物可以通過將長雙歧桿菌CBTBG7菌株與合適的載體、賦形劑、其它活性成分等混合而配制為粉末、顆粒、片劑或液體的形式。此外，本發(fā)明的菌株可以使用已知的方法進行腸溶包衣，使得活性成分雙歧桿菌在通過胃腸道后到達結(jié)腸，并且將在腸中快速釋放。可用于本發(fā)明的賦形劑包括糖類如蔗糖、乳糖、甘露糖醇或葡萄糖，以及淀粉如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉或部分預膠化淀粉?？捎糜诒景l(fā)明的粘合劑包括多糖，諸如糊精、海藻酸鈉、角叉菜膠、瓜爾膠、阿拉伯樹膠、瓊脂等；天然存在的大分子物質(zhì)，諸如黃蓍膠、明膠、谷蛋白等；纖維素衍生物，諸如羥丙基纖維素、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、乙基纖維素、羥丙基乙基纖維素、羧甲基纖維素等；和聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、聚乙二醇、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸和乙酸乙烯酯樹脂?？捎糜诒景l(fā)明的崩解劑包括纖維素衍生物，諸如羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈣、低取代羥丙基纖維素等；和淀粉，諸如羧甲基淀粉鈉、羥丙基淀粉、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、米淀粉和部分預膠化淀粉?？捎糜诒景l(fā)明的潤滑劑的實例包括滑石粉、硬脂酸、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、膠體二氧化硅、含水二氧化硅、各種蠟和油等?？捎糜诒景l(fā)明的包衣劑包括水不溶性聚合物，諸如甲基丙烯酸二甲氨基乙酯-甲基丙烯酸共聚物、聚乙烯縮乙醛二乙基氨基乙酸酯、丙烯酸乙酯-甲基丙烯酸共聚物、丙烯酸乙酯-甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸氯代三甲基銨乙基酯共聚物、乙基纖維素等；腸溶聚合物，諸如甲基丙烯酸-丙烯酸乙酯共聚物、羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯、羥丙基甲基纖維素乙酸琥珀酸酯等；和水溶性聚合物，諸如甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等，但不必限于此。根據(jù)本發(fā)明所述的促進生長用的組合物中，活性成分長雙歧桿菌CBTBG7菌株的含量可以根據(jù)受試者的體重、年齡或性別來適當確定。例如，本發(fā)明的組合物相對于該組合物的總重量以營養(yǎng)有效濃度含有作為活性成分的長雙歧桿菌CBTBG7菌株。優(yōu)選地，所述組合物含有量為108～1012cfu/g的長雙歧桿菌CBTBG7菌株或含有具有相同數(shù)量活細菌的培養(yǎng)物產(chǎn)品。通常，對于成人，可以根據(jù)需要服用一次或多次1×106個以上活細菌，優(yōu)選1×108至1×1012個活細菌。在另一方面，根據(jù)本發(fā)明所述的用于促進生長的營養(yǎng)組合物可以進一步包含從由長雙歧桿菌bv.嬰兒CBTBT1(KCTC11859BP)、短雙歧桿菌CBTBR3(KCTC12201BP)和兩歧雙歧桿菌CBTBF3(KCTC12199BP)組成的組中選擇的一種或多種其它益生元。該組合物可以以相同的百分比含有每種雙歧桿菌菌株。在下文中，將參考實施例描述本發(fā)明。然而，應(yīng)當理解的是，這些實施例僅用于說明性目的，而不意圖限制本發(fā)明的范圍。實施例實施例1：長雙歧桿菌CBTBG7菌株的分離和鑒定1-1：新型菌株的選擇將1g人糞便連續(xù)稀釋在無菌無氧水中，并將1ml每種稀釋液倒在葡萄糖血肝(BL.BD.USA)固體培養(yǎng)基上，并在厭氧條件下培養(yǎng)3天。使用通過將BCP(溴甲酚紫,0.17g/L)添加至BL中獲得的雙歧桿菌選擇培養(yǎng)基對產(chǎn)生的菌落進行選擇，然后在相同條件下培養(yǎng)3天。選擇周圍的顏色變?yōu)辄S色的雙歧桿菌菌落，然后對所選擇的菌落進行生物化學和分子生物學鑒定。此后，選擇具有最佳物理性質(zhì)的一種菌株。1-2：選定菌株的鑒定1)糖利用的分析使用API50CHL試劑盒檢查從人糞便中分離出的菌株的糖利用。使用API網(wǎng)(https://apiweb.biomerieux.com)分析通過檢查糖利用所獲得的結(jié)果，并且將分析的結(jié)果示于下表1中：表1序號碳水化合物利用序號碳水化合物利用0對照-25七葉靈+1甘油-26水楊苷+2赤藻糖醇-27纖維二糖-3D-阿拉伯糖-28麥芽糖+4L-阿拉伯糖+29乳糖+5核糖+30蜜二糖+6D-木糖+31蔗糖+7L-木糖-32海藻糖-8阿東糖-33菊粉-9β-甲基木糖苷-34松三糖-10半乳糖+35D-棉子糖+11D-葡萄糖+36美沙酮-12D-果糖+37糖基-13D-甘露糖+38木糖醇-14L-山梨糖-39β-龍膽二糖-15鼠李糖-40D-土瑞糖w16半乳糖醇-41D-來蘇糖-17肌醇-42D-塔格糖-18甘露糖醇+43D-巖藻糖-19山梨糖+44L-巖藻糖-20α-甲基-D-甘露糖苷-45D-阿拉伯糖醇-21α-甲基-D-葡糖苷+46L-阿拉伯糖醇-22N-乙酰葡萄糖胺-47葡萄糖酸鹽-23杏仁苷-482-酮-葡萄糖酸-24熊果苷+495-酮-葡萄糖酸w2)16srRNA鑒定為了使用分子生物學方法鑒別所選擇的菌株，分析了該菌株的16srRNA序列。通過使用Accuprep基因組提取試劑盒(Bioneer,Korea)從1ml菌株(從糞便中分離)的純培養(yǎng)物中提取基因組DNA。以提取的DNA為模板，使用引物F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和引物R(5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’)，通過PCR(MyCycler,BIO-RAD,USA)擴增16srRNA區(qū)域。將PCR產(chǎn)物連接到pGEM-Teasy載體(Promega,USA)上并且轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α菌株中，之后將其接種在LB/x-gal/amp平板上，并在37℃下培養(yǎng)過夜。通過篩選從轉(zhuǎn)化體中分離含有插入片段的重組質(zhì)粒，隨后進行DNA測序。在DNA測序中，使用DNA星程序的簇V方法，分析分離的菌株與各種雙歧桿菌sp.菌株(包括長雙歧桿菌T(ATCC15707))的同源性。如圖1所示，分離菌株的16srRNA序列顯示出與長雙歧桿菌T(ATCC15707)99.1％的同源性。3)RAPD(隨機擴增多態(tài)性DNA)分析為了RAPD分析，從分離自糞便的長雙歧桿菌CBTBG7菌株中提取基因組DNA。使用分離的DNA作為模板，使用(GTG)5(5’-GTGGTGGTGGTGGTG-3’)引物進行PCR-RAPD(MyCycler,BIO-RAD,USA)。使用EtBr將所得PCR產(chǎn)物染色，然后使用G:BOX(SYNGENE,UK)觀察。此外，在PFGE分析中，將純培養(yǎng)的長雙歧桿菌CBTBG7菌株調(diào)整至OD600＝4的最終OD，以構(gòu)建膠塊(plug)。然后，使用各種酶消化基因組DNA并進行電泳，之后比較對照長雙歧桿菌T(ATCC15707)進行分析。如從圖2中可以看出，RAPD的結(jié)果表明，長雙歧桿菌CBTBG7菌株顯示出與長雙歧桿菌T(ATCC15707)不同的條帶模式。在圖2中，泳道1表示長雙歧桿菌T(ATCC15707)的結(jié)果，且泳道2表示長雙歧桿菌CBTBG7菌株的結(jié)果?；谏鲜鼋Y(jié)果，發(fā)現(xiàn)從糞便中分離出的微生物長雙歧桿菌CBTBG7是與長雙歧桿菌T(ATCC15707)不同的新型菌株。4)PFGE(脈沖場凝膠電泳)分析測量了純培養(yǎng)在BL肉湯中的長雙歧桿菌CBTBG7的O.D.，然后使用2％低熔點瓊脂糖將其調(diào)節(jié)至最終的O.D.，O.D600＝4，從而構(gòu)成膠塊。然后，使用各種酶消化基因組DNA并進行電泳，之后比較對照長雙歧桿菌T(ATCC15707)進行分析。將構(gòu)建的膠塊置于1ml溶菌酶緩沖液(2mg/ml溶菌酶(Sigma)，0.05％N-十二烷基肌氨酸(Sigma))中，并向其中加入10μl4mg/ml溶葡萄球菌素(Sigma)，隨后在37℃溫育過夜。小心地取出膠塊并且加入到4mlNDS緩沖液(1ml1MTris-HCl(pH＝8.0),10ml100％SDS,89ml0.5MEDTA(pH＝8.5))中，隨后在50℃溫育過夜。接下來，輕微振蕩，用10ml50mMEDTA(pH8.5)將膠塊洗滌6次，然后小心地轉(zhuǎn)移到400μl待處理的酶緩沖液中，隨后在室溫下溫育30分鐘。將各個膠塊轉(zhuǎn)移到400μl新鮮的酶緩沖液中并且向其中加入限制酶(20U)，隨后在37℃溫育過夜。作為限制酶，使用XbaI和ApaI。使用CHEF系統(tǒng)(BIO-RAD，USA)在0.5XTBE中以5.3cm/V和脈沖時間1s至15s進行電泳18小時。電泳完成后，將膠塊用EtBr溶液染色，并用G:BOX(SYNGENE，UK)觀察其帶狀圖案。使用XbaI和ApaI進行的PFGE的結(jié)果表明，從糞便中分離的長雙歧桿菌CBTBG7是新型菌株，其顯示出與長雙歧桿菌T(ATCC15707)不同的帶狀圖案。在圖3中，泳道1表示長雙歧桿菌T(ATCC15707)的結(jié)果，且泳道2表示長雙歧桿菌CBTBG7的結(jié)果。5)酶活性試驗為了測量長雙歧桿菌CBTBG7的酶活性，使用APIZYM試劑盒檢查酶的差異。當將長雙歧桿菌CBTBG7的酶活性與長雙歧桿菌T(ATCC15707)進行比較時，長雙歧桿菌CBTBG7顯示出與長雙歧桿菌T(ATCC15707)幾乎相似的酶活性。特別地，長雙歧桿菌CBTBG7顯示出了在長雙歧桿菌T(ATCC15707)中未顯示出的β-葡糖苷酶活性，該酶用于降解革蘭氏陰性致病菌株細胞壁的肽聚糖中所含的葡萄糖，從而抑制致病菌株的生長。此外，長雙歧桿菌CBTBG7沒有顯示出作為致癌酶的β-葡糖醛酸糖苷酶的活性。表26)其他真菌學特征根據(jù)本發(fā)明所述的長雙歧桿菌CBTBG7的特征如下：表3基于上述結(jié)果，將分離的菌株命名為“長雙歧桿菌CBTBG7”菌株，于2012年5月7日保藏于韓國典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC)，該保藏中心是國際保藏機構(gòu)，保藏號為KCTC12200BP。1-3：功能性和穩(wěn)定性1)抗生素耐藥性試驗為了驗證分離的長雙歧桿菌CBTBG7菌株(KCTC12200BP)的安全性，分析了分離菌株的抗生素耐藥性?？股啬退幮詼y試使用由歐洲食品安全局(EFSA)推薦的微量稀釋法進行，并且在測試中使用10種抗生素，包括氨芐青霉素(AMP)、萬古霉素(VAN)、慶大霉素(GEN)、卡那霉素(KAN)、鏈霉素(STM)、紅霉素(ERM)、奎奴普丁/達福普汀(Q/D)、克林霉素(CLM)、四環(huán)素(TET)和氯霉素(CP)。對于不包括克林霉素的抗生素，將每種抗生素以256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5μg/ml的濃度加入到10％ISO-敏檢肉湯和90％MRS肉湯的混合物中?？肆置顾匾?6、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625和0.03125μg/ml的濃度添加，因為乳桿菌群的EFSA轉(zhuǎn)效點值為0.25μg/ml或更少。此外，使用E測試條(BioMeriux)進行奎奴普丁/達福普汀(Q/D)的測試。將微板在37℃下在厭氧條件下溫育48小時，然后測量MIC作為沒有觀察到可見生長的最小抗生素濃度?；谒鯡FSA轉(zhuǎn)效點，分析了長雙歧桿菌CBTBG7是否對每種抗生素具有耐藥性，并且分析的結(jié)果示于下表4中：表4顯示出分離的長雙歧桿菌CBTBG7菌株對所有在測試中使用的抗生素的耐藥性均低于EFSA抗生素耐藥性標準，表明分離的菌株滿足EFSA抗生素的穩(wěn)定性標準。由于據(jù)報道雙歧桿菌因為不存在細胞色素介導的藥物轉(zhuǎn)運系統(tǒng)而對氨基糖苷類如卡那霉素具有耐藥性，所以EFSA不要求雙歧桿菌的藥物的MIC值。2)腸道定殖測試在來自人結(jié)腸上皮細胞的HT-29細胞系中進行了長雙歧桿菌CBTBG7的腸道定殖的測量，同時將長雙歧桿菌T(ATCC15707)用作對照。將HT-29細胞系用每種菌株處理1小時，并進行革蘭氏染色和活細胞計數(shù)以比較菌株之間的腸道定殖能力。測量結(jié)果示于下表5中。表5長雙歧桿菌CBTBG7長雙歧桿菌T腸道定殖率(％)92.1583.40腸道定殖的測量結(jié)果表明，長雙歧桿菌CBTBG7菌株與長雙歧桿菌T(ATCC15707)菌株相比，顯示出優(yōu)異的腸道定殖能力。此種結(jié)果表明，本發(fā)明的菌株可以附著于腸上皮細胞以改善腸環(huán)境。3)急性毒性測試為了驗證本發(fā)明的長雙歧桿菌CBTBG7菌株的安全性，對試驗動物進行急性毒性測試。以1.0×1011cfu/kg的量將本發(fā)明的凍干菌株口服施用于6周齡的雄性和雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠。對于對照組，胃內(nèi)施用0.85％鹽水。每天觀察一次所有試驗動物中的臨床癥狀，持續(xù)14天(從樣品施用后1天到解剖日期的一段時間)。觀察結(jié)果示于下表6中。施用長雙歧桿菌CBTBG7菌株后，在所有對照組和施用組中均未觀察到死亡，并且沒有發(fā)現(xiàn)顯示特定臨床癥狀的動物。另外，在施用后14天觀察飼料和水的攝取和體溫，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)施用組和對照組之間統(tǒng)計學上的顯著性差異。表6實施例2：長雙歧桿菌CBTBG7菌株的基因分析使用PacBioRSII系統(tǒng)(DNALink,RepublicofKorea)進行長雙歧桿菌CBTBG7菌株(KCTC12200BP)的基因組測序。對于菌株的基因組，構(gòu)建10-kb文庫，并使用具有C2-P4化學的SMRT細胞之一進行基因組測序。通過基因組測序，獲得長度為337,655,282bp的序列。使用SMRTpipeHGAP進行從頭裝配，并使用SMRTpipeAHA進行支架和間隙填充。使用Glimmer3進行結(jié)構(gòu)基因的預測，并使用通過BLASTP獲得的用于Pfam、Uniref100、KEGG、COG和GenBankNR數(shù)據(jù)庫的結(jié)果，通過AutoFACT(Koskietal.2005)進行基因注釋。分別使用tRNAscan-SE(Lowe和Eddy1997)和RNAmmer(Lagesenetal.2007)進行轉(zhuǎn)運RNA和核糖體RNA。使用RPS-BLAST在小于1e-2的e值截止值下進行直系同源群組(COG)類別的成簇對基因的功能分類(Mavromatisetal.2009).對于收集的數(shù)據(jù)集，使用BLASTP以序列同源性≥50％的參數(shù)確定基因組上特定基因的存在。使用KEGG自動注釋服務(wù)器進行基因組的代謝路徑分析(Moriyaetal.2007)。使用antiSMASH版本3.0.0進行次生代謝物生物合成基因的分析(Blinetal.2013；Blinetal.2014)(http://antismash.secondarymetabolites.org/)。2-1：HMO(人乳寡糖)代謝相關(guān)基因分析了根據(jù)本發(fā)明所述的長雙歧桿菌CBTBG7菌株的基因組的基因內(nèi)容。作為這種分析的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)菌株的基因組含有人乳寡糖代謝相關(guān)基因中編碼β-半乳糖苷酶、α-甘露糖苷酶和內(nèi)橋-α-N-乙酰半乳糖胺酶的基因。這表明本發(fā)明的菌株可以消化和供應(yīng)不被人酶消化的人乳寡糖(參見圖5)。表7株菌酶登錄號長雙歧桿菌CBTBG7β-半乳糖苷酶RY68_0416長雙歧桿菌CBTBG7β-半乳糖苷酶RY68_0534長雙歧桿菌CBTBG7β-半乳糖苷酶RY68_0735長雙歧桿菌CBTBG7α-甘露糖苷酶RY68_1335長雙歧桿菌CBTBG7α-甘露糖苷酶RY68_1336長雙歧桿菌CBTBG7內(nèi)橋-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶RY68_1329長雙歧桿菌CBTBG7內(nèi)橋-α-N-乙酰半乳糖胺酶RY68_0178長雙歧桿菌CBTBG7內(nèi)橋-α-N-乙酰半乳糖胺酶RY68_18422-2：維生素生物合成基因基因分析結(jié)果表明，本發(fā)明的長雙歧桿菌CBTBG7菌株具有從L-天冬氨酸合成B族維生素中的煙酸(B3)的基因。表8表92-3：抑制有害細菌的生長為了檢查本發(fā)明的菌株是否具有通過產(chǎn)生抗生素而抑制有害細菌生長的作用、分析了次級代謝產(chǎn)物生物合成基因和抗生素生產(chǎn)相關(guān)基因是否存在于長雙歧桿菌CBTBG7菌株的基因組中。檢查了次級代謝物的生物合成。結(jié)果，如圖6所示，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的長雙歧桿菌CBTBG7菌株包括編碼細菌素的基因。從這些結(jié)果可以看出，本發(fā)明的長雙歧桿菌CBTBG7菌株可以通過產(chǎn)生抗生素化合物如細菌素來抑制致病菌的增殖。2-4：缺乏致病基因使用PAI數(shù)據(jù)庫的PAI查找器進行PAI(致病性島)和REI(抗菌性抗性島)的分析(Yoonetal.2007；Yoonetal.2015)。分析結(jié)果表明，本發(fā)明的長雙歧桿菌CBTBG7菌株的基因組中不存在PAI(致病性島)和PAI樣區(qū)域。實施例3：長雙歧桿菌CBTBG7菌株的生長促進效果下面的實施例說明了本發(fā)明的菌株的特征和生長促進效果。在實施例中獲得的所有實驗結(jié)果均表示為平均值±SD，并使用GraphPadPrismTM6.0進行實驗結(jié)果的統(tǒng)計處理。此外，通過單因素ANOVA確定測試組之間平均值差異的顯著性，然后使用Tukey的多范圍測試進行PostHoc測試。3-1：本發(fā)明的菌株的培養(yǎng)物和包含其的組合物的制備在37℃下將長雙歧桿菌CBTBG7菌株(KCTC12200BP)在BL肉湯(BDDiagnostics,Sparks,MD)中培養(yǎng)24小時，并且在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS,10mM磷酸鈉,130mM氯化鈉,pH7.4)中稀釋至1011CFU/ml。將稀釋物超聲處理并離心以分離上清液，隨后通過孔徑為0.45μm的過濾器過濾。將濾液冷凍干燥，然后儲存在-20℃下直到用于體內(nèi)實驗。3-2：肥胖動物模型和取樣根據(jù)機構(gòu)動物護理和使用委員會(IACUC)的動物使用和護理方案進行動物試驗。作為試驗動物，使購自SaeronBioInc.(Uiwang,Korea)的6周齡SD大鼠(每組10只，由5只雄性大鼠和5只雌性大鼠組成)使用24小時。然后，在24±2℃的溫度和55±15％的濕度下，以12小時光/12小時黑暗循環(huán)，將大鼠養(yǎng)育17天。對于基本飲食，允許大鼠服用大麥飼料(A04,UAR,Vilemoisson-sur-Orge,France)17天，并還允許自由地飲用單獨的飲用水或飲用含有長雙歧桿菌CBTBG7(107CFU/頭/天)的飲用水。3-3：本發(fā)明菌株的生長促進效果為了觀察本發(fā)明的長雙歧桿菌CBTBG7菌株的生長促進效果，用大麥飼料喂養(yǎng)大鼠17天以誘導基本飲食，并且每天測量體重以及飲用水和飼料的攝入量直到實驗開始后的第17天。通過從測量當天的體重減去實驗開始日的體重來計算體重的增加。通過測量每籠的攝入量，然后計算每只大鼠的攝入量，計算飲用水和飼料中每一種的攝入量，作為直到第17天的總攝入量。通過將體重的增加除以飼料的總攝入量來計算體重增加的效率。參見圖7，觀察到，在喂養(yǎng)含有長雙歧桿菌CBTBG7的飲用水的組(CBTBG7)的情況下，與正常喂養(yǎng)普通食用水的組(NC)相比，體重自第9天顯著增加(12天；p<0.05,13至17天；p<0.01)(圖7(A))。然而，17天的飼料總攝入量(FI)和17天的飲用水的總攝入量(WI)在兩組之間沒有顯著差異(圖7(B))?？梢钥闯?，施用本發(fā)明的菌株不影響采食量，并且體重增加(WG)不能歸因于采食量(FI)的差異。與正常組相比，長雙歧桿菌CBTBG7喂養(yǎng)組中的體重增加與體重增加的比值(WG/FI)更顯著，表明通過施用本發(fā)明的長雙歧桿菌CBTBG7菌株促進了大鼠的生長。已經(jīng)以本發(fā)明的優(yōu)選實施方式為重點描述了本發(fā)明。具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通知識的人員能夠理解，在不脫離本發(fā)明的本質(zhì)特征的情況下，本發(fā)明可以以各種修改或改變的形式實施。因此，本發(fā)明的真正保護范圍應(yīng)當由所附權(quán)利要求及其等同范圍來限定，而不是由上述實施方式限定。關(guān)于國際承認用于專利程序的微生物保藏的布達佩斯條約國際保藏機構(gòu)根據(jù)細則第7.1條出具的原始保藏的收據(jù)致：Myung-Jun,Jung134,Gaegok-ri,Wolgot-myeon,Gimpo-siGyeonggi-do415-872,RepublicofKorea關(guān)于國際承認用于專利程序的微生物保藏的布達佩斯條約根據(jù)細則第8.2條關(guān)于科學說明和/或建議的分類名稱的后來載明或修正的證明致:Myung-Jun,Jung134,Gaegok-ri,Wolgot-myeon,Gimpo-siGyeonggi-do415-872,RepublicofKorea附件:根據(jù)細則第8.1條的關(guān)于科學說明和/或分類名稱的后來載明或修正的通信。關(guān)于國際承認用于專利程序的微生物保藏的布達佩斯條約國際保藏機構(gòu)根據(jù)細則第7.1條出具的原始保藏的收據(jù)致:Myung-Jun,Jung134,Gaegok-ri,Wolgot-myeon,Gimpo-si,Gyeonggi-do415-872,RepublicofKorea關(guān)于國際承認用于專利程序的微生物保藏的布達佩斯條約根據(jù)細則第8.2條關(guān)于科學說明和/或建議的分類名稱的后來載明或修正的證明致:Myung-Jun,Jung134,Gaegok-ri,Wolgot-myeon,Gimpo-siGyeonggi-do415-872,RepublicofKorea附件:根據(jù)細則第8.1條的關(guān)于科學說明和/或分類名稱的后來載明或修正的通信。關(guān)于國際承認用于專利程序的微生物保藏的布達佩斯條約國際保藏機構(gòu)根據(jù)細則第7.1條出具的原始保藏的收據(jù)致:Myung-Jun,Jung134,Gaegok-ri,Wolgot-myeon,Gimpo-siGyeonggi-do415-872,RepublicofKorea關(guān)于國際承認用于專利程序的微生物保藏的布達佩斯條約根據(jù)細則第8.2條關(guān)于科學說明和/或建議的分類名稱的后來載明或修正的證明致:Myung-Jun,Jung134,Gaegok-ri,Wolgot-myeon,Gimpo-siGyeonggi-do415-872,RepublicofKorea附件:根據(jù)細則第8.1條的關(guān)于科學說明和/或分類名稱的后來載明或修正的通信。關(guān)于國際承認用于專利程序的微生物保藏的布達佩斯條約國際保藏機構(gòu)根據(jù)細則第7.1條出具的原始保藏的收據(jù)致:Myung-Jun,Jung134,Gaegok-ri,Wolgot-myeon,Gimpo-siGyeonggi-do415-872,RepublicofKorea關(guān)于國際承認用于專利程序的微生物保藏的布達佩斯條約根據(jù)細則第8.2條關(guān)于科學說明和/或建議的分類名稱的后來載明或修正的證明致:Myung-Jun,Jung134,Gaegok-ri,Wolgot-myeon,Gimpo-siGyeonggi-do415-872,RepublicofKorea附件:根據(jù)細則第8.1條的關(guān)于科學說明和/或分類名稱的后來載明或修正的通信。當前第1頁1 2 3