本發(fā)明涉及一種用于包被固體支持物的方法，所述固體支持物適合用在細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用中。該方法包括以下步驟：將載體蛋白(該載體蛋白包括附著在其上或作為其氨基酸序列一部分的至少一種細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽序列)溶液加熱到至少50℃，并在引起含2個(gè)至1000個(gè)蛋白分子的可溶性載體蛋白聚集體形成的條件下進(jìn)行孵育。隨后，在蛋白聚集體能非共價(jià)吸附至固體支持物的條件下，將蛋白聚集體與固體支持物接觸。本發(fā)明還涉及一種經(jīng)包被的固體支持物，所述經(jīng)包被的固體支持物具有在其表面上非共價(jià)吸附的至少一種上述載體蛋白聚集體。
背景技術(shù)：
：體外細(xì)胞培養(yǎng)通常在塑料細(xì)胞培養(yǎng)容器(例如，聚苯乙烯培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿)中進(jìn)行。這種培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿在通常使用的37℃或更高的溫度下非常穩(wěn)定，同時(shí)它們還是透明的且易于制造。然而，目前可用于細(xì)胞培養(yǎng)的大多數(shù)細(xì)胞或細(xì)胞系未顯示出足夠的與疏水塑料表面的附著能力。因此，通過(guò)在未改性塑料表面上生長(zhǎng)細(xì)胞所獲得的結(jié)果通常較差。為了克服細(xì)胞在塑料細(xì)胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿上附著能力不足的問(wèn)題，現(xiàn)有技術(shù)中提出了若干使這些物品表面更親水的方法。例如，進(jìn)行在表面上提供反應(yīng)性親水基團(tuán)的等離子體處理。然而，已證明通過(guò)這些技術(shù)獲得的表面改性產(chǎn)物不適用于某些應(yīng)用，例如干細(xì)胞或高度分化的細(xì)胞的培養(yǎng)。此外，通過(guò)等離子體處理進(jìn)行表面改性是昂貴且費(fèi)力的。因此，開(kāi)發(fā)了用于提供表面改性的培養(yǎng)容器的替代方法。在細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域早已認(rèn)識(shí)到，使用細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的組分能極大地影響表面結(jié)合活細(xì)胞的能力。在體內(nèi)，細(xì)胞主要通過(guò)形成部分ECM的結(jié)構(gòu)蛋白的結(jié)合來(lái)彼此相互作用并且與它們的環(huán)境相互作用。發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞與ECM的粘附相互作用影響許多重要的細(xì)胞活性，包括細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞分化、細(xì)胞遷移和組織形成。事實(shí)上，ECM參與許多復(fù)雜的生理過(guò)程，如形態(tài)發(fā)生、血管生成、傷口愈合和腫瘤轉(zhuǎn)移。ECM是組成上有差異的三維分子復(fù)合體，其包括生物活性蛋白(例如，層粘連蛋白和纖連蛋白)、糖蛋白、透明質(zhì)酸、彈性蛋白、蛋白聚糖和膠原。細(xì)胞通過(guò)在其表面上表達(dá)的特異性表面受體的結(jié)合而與ECM相互作用。已知與ECM的組分相互作用的最著名的細(xì)胞表面受體是整聯(lián)蛋白。在脊椎動(dòng)物中，發(fā)現(xiàn)了24種整聯(lián)蛋白亞型，每種亞型表現(xiàn)出不同的配體特異性。這些整聯(lián)蛋白亞型總結(jié)于Barczyketal.2010(CellTissueRes339,269-280)和Yurchenco&Patton2009(CurrPharmaDes.15,1277-1294)中。一些整聯(lián)蛋白與其ECM靶組分的結(jié)合受ECM分子中的特異性結(jié)合序列的影響。在許多基質(zhì)蛋白，例如纖連蛋白、層粘連蛋白和骨橋蛋白中已經(jīng)鑒定出的一著名結(jié)合序列是肽序列Arg-Gly-Asp(RGD)，該肽序列描述于PierschbacherandRuoslahti,J.BiolChem1987,262,17294-17298中。為了提高培養(yǎng)的細(xì)胞在支持物品如培養(yǎng)瓶或微量滴定板上的附著，現(xiàn)有技術(shù)中考慮將源自ECM的材料枝接到這些物品的表面。在第一種方式中，提出提供具有完整ECM材料的培養(yǎng)容器的表面。來(lái)自小腸、胃或膀胱組織的黏膜下層用作ECM的來(lái)源。參見(jiàn)，例如US5281422、US5554389、US6099567和US6206931。凝膠狀蛋白混合物MatrigelTM是另一種完整ECM材料的適當(dāng)來(lái)源，其廣泛用于細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域并且可用于如CorningLifeSciences的制造商的細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用中。MatrigelTM由鼠Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)肉瘤分泌，并且含有形成培養(yǎng)細(xì)胞的天然的、生物相容性環(huán)境的過(guò)量的生長(zhǎng)因子和其他生物活性分子。然而，經(jīng)完整ECM材料(例如，MatrigelTM)包被的物品缺乏確定的特征，因?yàn)槿匀徊恢啦煌珽CM組分中的哪一組分是混合物的一部分并且在包被后是可接近的。此外，在含有全部ECM提取物的表面上培養(yǎng)細(xì)胞是有問(wèn)題的，因?yàn)椴豢赡車(chē)?yán)格控制由細(xì)胞與不同ECM組分結(jié)合所引發(fā)的細(xì)胞信號(hào)級(jí)聯(lián)放大。鑒于這些問(wèn)題，考慮提供已用單一ECM蛋白或ECM蛋白片段包被的更加定制化的表面。然而，全長(zhǎng)ECM蛋白的生產(chǎn)是昂貴的且在技術(shù)上是麻煩的。為了克服這些問(wèn)題，建議將帶有細(xì)胞結(jié)合序列基序(例如RGD基序)的較短的肽枝接到支持物表面上，以改善細(xì)胞的附著?？梢匀菀椎卮罅亢铣呻?，并且它們?cè)谥訔l件下相對(duì)穩(wěn)定。而經(jīng)全長(zhǎng)蛋白和肽包被的產(chǎn)品都不夠穩(wěn)定。用于在支持物品表面上固定蛋白或肽的常規(guī)技術(shù)依賴(lài)于蛋白或肽在表面上的非共價(jià)吸附。然而，不幸的是，已發(fā)現(xiàn)蛋白或肽在細(xì)胞培養(yǎng)條件下(特別是在37℃溫育期間)的解吸附導(dǎo)致培養(yǎng)的細(xì)胞從其支持物上脫離下來(lái)，這可能最終誘導(dǎo)這些細(xì)胞發(fā)生程序性細(xì)胞死亡(凋亡)。防止蛋白解吸附問(wèn)題的一種方法是使用蛋白或肽與支持物材料表面上的羥基、胺或其它反應(yīng)性基團(tuán)進(jìn)行共價(jià)化學(xué)固定?？梢允褂媚墚a(chǎn)生諸如胺、羥基、羧基或醛基等官能團(tuán)的化學(xué)物質(zhì)(如三氟代乙烷磺酰氯(tresylchloride)、戊二醛或氰基硼氫化物)，通過(guò)表面活化來(lái)實(shí)現(xiàn)直接共價(jià)偶聯(lián)。隨后，這些基團(tuán)與蛋白或肽中的官能團(tuán)反應(yīng)，從而得到共價(jià)偶聯(lián)。這樣的偶聯(lián)方法詳細(xì)描述于例如，US5278063、US2005/0059140和US7399630中。然而，培養(yǎng)的細(xì)胞對(duì)化合物的存在非常敏感。即使非常低量的反應(yīng)性化學(xué)物質(zhì)也能顯著抑制或甚至完全破壞細(xì)胞的生長(zhǎng)或附著。因此，蛋白或肽在細(xì)胞培養(yǎng)物表面上的化學(xué)固定是不理想的。從上文可以看出，需要提供將蛋白或肽穩(wěn)定固定在細(xì)胞培養(yǎng)物品(例如容器、培養(yǎng)瓶、平板和平皿)表面上的新方法。對(duì)于應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)表面的蛋白或肽包被的需求相當(dāng)高。包被應(yīng)當(dāng)是穩(wěn)定的，并且在37℃孵育1至10天期間，不釋放或釋放非常少量的固定的蛋白或肽。此外，為了用于細(xì)胞培養(yǎng)，表面通常需要是無(wú)菌的。本發(fā)明提供了一種滿(mǎn)足這些需求并還提供了額外優(yōu)點(diǎn)的新方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了用載體蛋白包被固體支持物的方法。該方法快速、可重復(fù)性高且易于在細(xì)胞培養(yǎng)消耗品的現(xiàn)有生產(chǎn)過(guò)程中實(shí)施。通過(guò)將細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽序列引入載體蛋白中，可以定制能夠例如通過(guò)促進(jìn)粘附、生長(zhǎng)、遷移和/或分化來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞某些功能的合成表面，其中細(xì)胞培養(yǎng)在該表面上。本文公開(kāi)的方法提供了非常適合用在細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用中的產(chǎn)品，因?yàn)槠淠墚a(chǎn)生穩(wěn)定和均勻的包被。此外，所述方法能生產(chǎn)包被，其特征在于可針對(duì)某些應(yīng)用特別定制的細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽序列的多樣性。最后，本發(fā)明的方法不使用可能干擾包被表面下游應(yīng)用的任何反應(yīng)性化學(xué)物質(zhì)。在第一方面，本發(fā)明涉及一種用于包被固體支持物的方法，所述固體支持物適合用在細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用中。本發(fā)明的所述方法包括以下步驟：(a)制備至少一種載體蛋白的溶液，所述載體蛋白包括附著于其上或作為其氨基酸序列一部分的至少一種細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽序列；(b)將所述溶液加熱到至少50℃，并在引起含2個(gè)至1000個(gè)蛋白分子的可溶性載體蛋白聚集體形成的條件下孵育所述溶液；(c)在所述載體蛋白聚集體能非共價(jià)吸附至所述固體支持物的條件下，將所述載體蛋白聚集體與所述固體支持物接觸；(d)可選地，洗滌所述固體支持物以去除未結(jié)合的載體蛋白和載體蛋白聚集體；由此提供在其表面上包括多種細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽序列的固體支持物。本發(fā)明的方法優(yōu)選不包括使用反應(yīng)性化學(xué)物質(zhì)將載體蛋白偶聯(lián)到支持物上。因此，本發(fā)明的方法涉及在適合用在細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用中的固體支持物品上提供含有蛋白或肽材料的包被。支持物品可以是任何材料，其中，在此尤其優(yōu)選包被玻璃或塑料表面。通過(guò)應(yīng)用本發(fā)明的方法包被的固體支持物可以是通常用于細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用中的產(chǎn)品的表面，尤其是細(xì)胞培養(yǎng)容器，例如細(xì)胞培養(yǎng)瓶、滾瓶、培養(yǎng)板、管、微量滴定板、膜或培養(yǎng)皿。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述固體支持物是具有6、12、24或48個(gè)孔的細(xì)胞培養(yǎng)板。這些平板可獲自許多不同的制造商，例如，可以是由FisherScientific以商品名CorningTM銷(xiāo)售的平板。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述固體支持物可以是小塑料盤(pán)或小塑料珠，該小塑料盤(pán)或小塑料珠通常用作在培養(yǎng)貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞系的生物發(fā)酵器中的基底。這種由聚丙烯制成的盤(pán)可以例如自EppendorfAG以商品名購(gòu)得。在又一個(gè)實(shí)施方式中，所述固體支持物可以是較大的載體板，所述較大的載體板用作培養(yǎng)貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞系的生物發(fā)酵器中的基底。可以使用本發(fā)明的包被方法的另一固體物體是醫(yī)療植入物，所述醫(yī)療植入物在植入患者體內(nèi)之前接種了細(xì)胞。待用蛋白材料包被的固體支持物的表面可以是親水性的或疏水性的，這意味著大量的物品可以使用本發(fā)明的方法來(lái)產(chǎn)生能接種細(xì)胞的表面。該方法避免了對(duì)表面進(jìn)行任何種類(lèi)的侵蝕性化學(xué)處理，這些處理可能對(duì)隨后細(xì)胞生長(zhǎng)帶來(lái)影響。本發(fā)明在一定程度上基于這樣的認(rèn)識(shí)，即通過(guò)使細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽序列(例如，提供細(xì)胞附著的肽序列)偶聯(lián)到載體蛋白上，或者通過(guò)重組方法將它們包括在所述載體蛋白的氨基酸序列中，可將這些細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽序列吸附到固體支持物(例如，細(xì)胞培養(yǎng)容器)上。然后加熱載體蛋白，以誘導(dǎo)部分變性，并且形成可以吸附到載體表面的可溶性蛋白聚集體。在加熱時(shí)，聚集體內(nèi)的載體蛋白部分變性，但仍保持可溶，這使蛋白聚集體均勻地分布在待包被的表面上。相反，完全變性的蛋白會(huì)形成沉淀的蛋白斑塊，從而使蛋白發(fā)生不期望的局部堆積，而非均勻分布。根據(jù)本發(fā)明，載體蛋白在支持物品上的包被相應(yīng)地使隨后在支持物表面上培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行均勻分布。細(xì)胞的均勻分布是在許多細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用中要實(shí)現(xiàn)的重要目標(biāo)。用于評(píng)價(jià)細(xì)胞在表面上均勻分布的方法已描述于，例如，Amentaetal.(1998),Proceedingsofthe25thAnnualConferenceonComputerGraphicsandInteractiveTechniques,415-421中。用于本發(fā)明方法的載體蛋白可以具有任何尺寸，但優(yōu)選載體蛋白具有至少20000或更大的分子量。在本發(fā)明的甚至更優(yōu)選的實(shí)施方式中，載體蛋白具有至少30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000或更大的尺寸。在本發(fā)明的方法中使用時(shí)，載體蛋白的尺寸尤其優(yōu)選為至少50000?？捎糜诒景l(fā)明方法的合適的載體蛋白包括白蛋白，例如人血清白蛋白或牛血清白蛋白，和卵白蛋白。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，用于本發(fā)明方法的載體蛋白是不在ECM中天然存在的蛋白，例如白蛋白，更優(yōu)選牛血清白蛋或人血清白蛋白或其片段。在本發(fā)明的方法中使用的載體蛋白經(jīng)修飾以包括一種或多種細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽序列。根據(jù)本發(fā)明，所述載體蛋白用于為細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽提供適當(dāng)?shù)沫h(huán)境。細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽序列可以利用化學(xué)偶聯(lián)或通過(guò)重組技術(shù)與載體蛋白相關(guān)聯(lián)。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，所述載體蛋白是重組蛋白，所述重組蛋白包括作為其氨基酸序列一部分的一種或多種細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽。根據(jù)甚至更優(yōu)選的實(shí)施方式，所述載體蛋白是重組白蛋白，例如其中插入了一種或多種細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽的牛血清白蛋白或人血清白蛋白。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式，所述載體蛋白包括1種或更多種、2種或更多種、3種或更多種、4種或更多種、5種或更多種或甚至10種或更多種的細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽。在又一實(shí)施方式中，所述載體蛋白包括1種細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽。所述細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽與所述載體蛋白偶聯(lián)或整合至所述載體蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)中，使得在形成熱誘導(dǎo)的聚集體時(shí)，存在于不同載體蛋白上的細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽形成細(xì)胞功能調(diào)節(jié)序列的分子嵌合體。由不同或相同的肽組成的這種陣列提供與細(xì)胞表面上的大量受體或結(jié)合分子的強(qiáng)相互作用。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽被包括在載體蛋白中，以便形成細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽的分子嵌合體，所述細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽存在于聚集體的不同載體蛋白上或不同載體蛋白中。根據(jù)本發(fā)明，尤其優(yōu)選每個(gè)載體蛋白存在2、3、4、5、6或更多個(gè)相同或不同的細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽。在同一聚集體內(nèi)的大量相同或不同的細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽序列對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用是特別令人感興趣的，該同一聚集體是可用于細(xì)胞結(jié)合的肽的分子嵌合體形式。待培養(yǎng)的細(xì)胞在其表面上具有許多受體分子，這些受體分子與它們?cè)谠鲋称陂g所附著的表面相互作用。通過(guò)本發(fā)明的方法包被的物品表面上的聚集體所提供的細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽的分子嵌合體確保這些細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽以足夠高的密度存在，以調(diào)節(jié)附著到聚集體的細(xì)胞的功能。通過(guò)將天然載體蛋白的氨基酸替換成在細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽所起源的天然蛋白內(nèi)，細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽的位于三級(jí)結(jié)構(gòu)相同或相似位置中的氨基酸，可將細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽序列引入載體蛋白中。可以通過(guò)諸如Swiss-PdbViewer、ICM-Browser、Phyre、Modeller、HHpred、Robetta或BioInfoBank服務(wù)器的計(jì)算機(jī)程序計(jì)算和可視化包含一種或多種細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽的載體蛋白的構(gòu)象。如在本發(fā)明的上下文中使用的，術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽”是指在與細(xì)胞結(jié)合時(shí)能夠調(diào)節(jié)一種或多種細(xì)胞功能(例如，細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞遷移、細(xì)胞活化、細(xì)胞衰老或細(xì)胞凋亡)的任何肽序列。該術(shù)語(yǔ)還包含一種肽，該肽用于將細(xì)胞附著到經(jīng)這種肽包被的表面。能夠調(diào)節(jié)某些細(xì)胞功能的許多肽序列是本領(lǐng)域已知的。待包被在支持物上的細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽或細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽的組合的選擇將決定經(jīng)包被的支持物品促進(jìn)培養(yǎng)細(xì)胞在基質(zhì)上的粘附、生長(zhǎng)、移動(dòng)或分化的能力。術(shù)語(yǔ)“肽”的含義中還包括肽模擬物，例如含有一個(gè)或多個(gè)非天然存在的氨基酸的肽模擬物。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，所述支持物被包被有含一種或多種肽序列的載體蛋白，所述肽序列提供細(xì)胞錨定，即通過(guò)肽序列的結(jié)合使細(xì)胞附著到經(jīng)包被的表面上。優(yōu)選地，經(jīng)包被的支持物包括至少一種載體蛋白，所述載體蛋白包括一個(gè)或多個(gè)如SEQIDNO：1～26所示的肽序列。這些序列含有源自ECM組分(例如，層粘連蛋白、纖連蛋白和膠原)的細(xì)胞結(jié)合基序。根據(jù)本發(fā)明的尤其優(yōu)選的實(shí)施方式，所述固體支持物包被有至少一種載體蛋白，所述載體蛋白包括提供細(xì)胞錨定且含RGD序列基序的一個(gè)或多個(gè)肽序列。RGD序列優(yōu)選是載體蛋白的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的一部分。在另一個(gè)實(shí)施方式中，提供細(xì)胞錨定的肽序列是環(huán)狀肽。根據(jù)本發(fā)明的尤其優(yōu)選的實(shí)施方式，所述固體支持物包被有不同的載體蛋白，每個(gè)載體蛋白都包括提供細(xì)胞錨定且含RGD序列基序的不同的肽序列。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，上述支持物包被有至少一種載體蛋白，所述載體蛋白包括調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的一種或多種肽序列。SEQIDNO：27～56中示出已報(bào)道具有生長(zhǎng)因子活性的肽序列。SEQIDNO：27～56中的序列含有已知來(lái)自不同生長(zhǎng)因子分子的基序，除其他之外，所述生長(zhǎng)因子分子包括堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α(TGF-α)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、骨橋蛋白、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)。根據(jù)本發(fā)明，NO：1～56中公開(kāi)的所有肽可以以線性形式或以環(huán)狀形式使用(即，環(huán)狀肽可用于基于肽與它們的載體蛋白化學(xué)偶聯(lián)的實(shí)施方式)。因此，當(dāng)序列表提到環(huán)狀肽時(shí)，這應(yīng)理解為還指該肽的線性形式，反之亦然。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述支持物包被有至少一種載體蛋白，所述載體蛋白包括已發(fā)現(xiàn)對(duì)促進(jìn)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)和分化有效的一種或多種肽序列。這些肽包括SEQIDNO：1、13、15、22和49所示的序列。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述支持物包被有至少一種載體蛋白，所述載體蛋白包括已發(fā)現(xiàn)對(duì)促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞生長(zhǎng)和分化有效的一種或多種肽序列。這些肽包括SEQIDNO：1、5～7、17、24～25、27～29和55～56所示的序列。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述支持物包被有至少一種載體蛋白，所述載體蛋白包括已發(fā)現(xiàn)對(duì)促進(jìn)肝細(xì)胞生長(zhǎng)和分化有效的一種或多種肽序列。這些肽包括SEQIDNO：1、6、16～19、27～32和34所示的序列。根據(jù)本發(fā)明，所述支持物品可以?xún)H包被有單一種類(lèi)的細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽或包被有不同調(diào)節(jié)肽的混合物。然而，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，在同一或不同的載體蛋白中使用2、3、4、5或更多種不同的細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽序列。因此，所述支持物的表面優(yōu)選包被有含至少2種不同的細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽的載體蛋白聚集體，其中，至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種或至少10種不同的肽同樣是可能的。本發(fā)明的方法還可以提供含10、20或30種不同的細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽的包被。例如，可以將提供細(xì)胞錨定的第一細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽與促進(jìn)細(xì)胞分化的第二肽的組合使用。第一和第二細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽可包含在相同或不同的載體蛋白分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)中。例如，如果BSA用作載體蛋白，則可以產(chǎn)生重組BSA分子，所述重組BSA分子在其一級(jí)結(jié)構(gòu)中包括(a)SEQIDNO：1～26中的任意種的肽以及(b)SEQIDNO：27～56中的任意種的肽?；蛘撸瑢?duì)于某些應(yīng)用可能期望產(chǎn)生不同的重組BSA分子，每一個(gè)重組BSA分子在其一級(jí)結(jié)構(gòu)中僅包括一種細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽。然后，在制備本文所述方法的步驟(a)中的載體蛋白溶液時(shí)，可混合不同的BSA載體蛋白，所述不同的BSA載體蛋白的特征為擁有特定的細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽。可以定制附著或包括在載體蛋白序列中的細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽的組合，以實(shí)現(xiàn)或抑制某些細(xì)胞功能。在一個(gè)實(shí)施方式中，包被在固體支持物表面上的不同的細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽序列的特定組成促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽序列的組成誘導(dǎo)或促進(jìn)細(xì)胞活化，包括一種或多種激酶的活化。激酶活化可以涉及，例如，酪氨酸激酶、Src酪氨酸激酶和Ras-MAPK通路的活化。在又一個(gè)實(shí)施方式中，所包含的不同肽序列的組成抑制細(xì)胞分裂和/或細(xì)胞分化。在又一個(gè)實(shí)施方式中，支持物品的表面已包被有防止細(xì)胞從包被表面剝離的肽或肽的組合。在一個(gè)替代的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽可以化學(xué)偶聯(lián)至各自的載體蛋白。將小肽偶聯(lián)至較大蛋白的方法是本領(lǐng)域已知的。例如，如下面實(shí)施例中更詳細(xì)描述的，可以通過(guò)使用胺-巰基交聯(lián)劑將細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽偶聯(lián)至載體蛋白(例如，白蛋白)，其中胺-巰基交聯(lián)劑用于產(chǎn)生可用于與細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽偶聯(lián)的巰基反應(yīng)性、馬來(lái)酰亞胺活化的載體蛋白。也可以使用將肽偶聯(lián)到蛋白的其它方法。這樣的方法描述于例如，G.T.Hermanson"Bioconjugatetechniques",3rded.(2013)AcademicPress；ISBN-13:978-0123822390中。在本發(fā)明的包被方法的第一步驟中，制備載體蛋白的溶液，這意味著蛋白溶解在如水或水性緩沖液(例如，磷酸鹽緩沖液)的水性介質(zhì)中。載體蛋白的量應(yīng)適于避免溶液中的蛋白出現(xiàn)任何沉淀。當(dāng)使用不同的載體蛋白進(jìn)行包被時(shí)，優(yōu)選在加熱之前將這些載體蛋白混合成單一溶液。或者，對(duì)于每種載體蛋白可制備單獨(dú)的溶液，并且分別對(duì)每種載體蛋白溶液?jiǎn)为?dú)進(jìn)行后續(xù)的加熱步驟。根據(jù)載體蛋白的大小和性質(zhì)，包含在溶液中的載體蛋白的量可有差異。通常，在本發(fā)明方法的步驟(a)的溶液中所使用的載體蛋白的量在1～50mg/ml的范圍內(nèi)，例如5～40mg/ml、10～30mg/ml或20-25mg/ml的范圍內(nèi)?？蛇x地，在步驟(a)之后對(duì)含有載體蛋白的溶液進(jìn)行滅菌。由于大多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用需要在無(wú)菌條件下進(jìn)行培養(yǎng)，因此必須避免步驟(a)中使用的蛋白溶液中存在污染。用于提供無(wú)菌蛋白溶液的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的且包括，例如，通過(guò)孔徑在0.1μm至0.5μm，優(yōu)選0.2μm至0.3μm，更優(yōu)選0.22μm的過(guò)濾膜來(lái)過(guò)濾蛋白溶液。合適的過(guò)濾膜可從許多不同的制造商處購(gòu)得，例如從Sartorius、Millipore、Pall等購(gòu)得。本發(fā)明的方法避免使用影響肽和蛋白完整性的殺菌的化學(xué)物質(zhì)或物理過(guò)程(如UV或γ輻射)。在本發(fā)明方法的后續(xù)步驟中，將含有載體蛋白的溶液加熱至誘導(dǎo)形成可溶性蛋白聚集體的溫度，所述蛋白聚集體平均包括2～1000個(gè)蛋白分子/聚集體。優(yōu)選地，由所述方法的步驟(b)所得到的聚集體中，每個(gè)聚集體包括2至1000個(gè)蛋白分子，最優(yōu)選每個(gè)聚集體包括5個(gè)至100個(gè)蛋白分子。如本文所使用的，形成含2個(gè)至1000個(gè)蛋白分子的聚集體意指溶液中的至少50％，優(yōu)選至少80％、至少90％、甚至更優(yōu)選至少95％的載體蛋白存在于含2個(gè)至1000個(gè)蛋白分子的聚集體中。在加熱步驟期間使用的溫度為至少50℃，其中，更高的溫度是更優(yōu)選的，例如，至少55℃、至少60℃、至少65℃、至少70℃。換句話說(shuō)，在步驟(b)中將蛋白溶液加熱至50℃至75℃，優(yōu)選65℃至73℃，更優(yōu)選68℃至72℃的溫度。加熱步驟進(jìn)行10分鐘至48小時(shí)，其中，在大多數(shù)情況下，高溫施加1小時(shí)～24小時(shí)，例如，2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20或22h。在所述方法的步驟(b)中使用的最佳溫度隨著載體蛋白的大小和性質(zhì)以及溶液的組成(例如，加入的鹽或緩沖液的濃度)的不同而不同。對(duì)于給定的載體蛋白溶液，本領(lǐng)域技術(shù)人員能容易地確定形成含所述數(shù)目的蛋白分子的可溶性聚集體所需的溫度和孵育時(shí)間。用于監(jiān)測(cè)聚集體溶解度的相當(dāng)簡(jiǎn)單的方法是，測(cè)量蛋白溶液在335nm波長(zhǎng)下的光密度(OD)。OD將隨著溶液中蛋白聚集體的形成而增加。如圖2所示，用于聚集體形成的最合適的溫度是容易確定的。如該圖所示，將BSA加熱至不同溫度(65℃、70℃和75℃)并持續(xù)不同的時(shí)間段，通過(guò)測(cè)量335nm處的OD來(lái)監(jiān)測(cè)BSA聚集體的形成。65℃的溫度明顯太低而不能誘導(dǎo)BSA聚集體的形成(參見(jiàn)圖2中的A、A')，而75℃的溫度太高，因?yàn)?5℃的溫度誘導(dǎo)了大部分聚集體從溶液中沉淀出來(lái)，通過(guò)離心去除沉淀蛋白后OD值下降證明了這一點(diǎn)(參見(jiàn)圖2中的C')。對(duì)于BSA，發(fā)現(xiàn)70℃的溫度是尤其有利的，因?yàn)榧訜峒s18小時(shí)形成的聚集體中只有一小部分在離心時(shí)從溶液中沉淀出來(lái)(參見(jiàn)圖2中的B')。因此，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法來(lái)確定導(dǎo)致可溶性載體蛋白聚集體形成的條件。優(yōu)選地，通過(guò)測(cè)量355nm處的OD來(lái)監(jiān)測(cè)聚集體的形成。在離心后保持335nm處的高OD表明強(qiáng)蛋白聚集和低水平的沉淀(或沒(méi)有沉淀)。一旦確定了最佳條件，它們就可以常規(guī)地用于生產(chǎn)相應(yīng)載體蛋白的可溶性聚集體。同樣，也可以容易地確定聚集體所含的蛋白分子的平均數(shù)量。為此，將經(jīng)加熱以誘導(dǎo)聚集體形成的蛋白溶液的一部分，在非還原條件下進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)。這種電泳將提供關(guān)于加熱時(shí)形成的蛋白聚集體的分子量的信息。一旦知道了載體蛋白的分子量，就可以計(jì)算聚集體中的蛋白的數(shù)量。優(yōu)選地，對(duì)本發(fā)明方法的步驟(b)中的條件進(jìn)行選擇，使得至少50％，優(yōu)選至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的蛋白聚集體保持為可溶形式。加熱步驟(b)可以在標(biāo)準(zhǔn)熱混合器裝置中進(jìn)行。在溫度升高的孵育期間可以使用100rpm～500rpm的攪拌速率。在溶液加熱完成后，將蛋白聚集體在能非共價(jià)吸附至固體支持物的條件下與固體支持物接觸。為此，可以將含有蛋白聚集體的溶液進(jìn)行離心，例如，在1000rpm至5000rpm下離心5分鐘以除去任何不溶和沉淀的蛋白材料。然后將由離心步驟獲得的上清液施加到待包被的支持物上。在一個(gè)實(shí)施方式中，將一部分溶液直接吸取到支持物品的表面上，隨后支持物品在25℃～37℃的溫度下進(jìn)行干燥，直到液體從支持物品表面完全蒸發(fā)掉。干燥也可以在標(biāo)準(zhǔn)蒸發(fā)器中進(jìn)行。在一個(gè)替代的實(shí)施方式中，將步驟(b)中獲得的蛋白聚集體凍干，然后溶解在水性介質(zhì)中，隨后將水性介質(zhì)施加到支持物上。步驟(c)中的孵育時(shí)間為1小時(shí)至48小時(shí)，優(yōu)選2小時(shí)至24小時(shí)，例如4小時(shí)、6小時(shí)、8小時(shí)、10小時(shí)、12小時(shí)、14小時(shí)、16小時(shí)、18小時(shí)或20小時(shí)?？蛇x地，在步驟(c)之后洗滌進(jìn)行了包被的支持物品，以除去任何未結(jié)合的載體蛋白和載體蛋白聚集體。可以通過(guò)用水或合適的緩沖液(例如，磷酸鹽緩沖液)沖洗支持物品的表面來(lái)進(jìn)行洗滌。洗滌緩沖液應(yīng)優(yōu)選不含任何變性化合物或洗滌劑(如SDS)，以避免從支持物品的表面上除去吸附的聚集體。在洗滌和干燥后，可以將支持物品儲(chǔ)存起來(lái)，直到進(jìn)一步用于細(xì)胞培養(yǎng)。當(dāng)進(jìn)行上述方法時(shí)，提供在其表面上包括多個(gè)細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽序列的固體支持物，所述細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽序列存在于非共價(jià)吸附的載體蛋白聚集體中。優(yōu)選地，經(jīng)包被的固體支持物的表面平均每mm2表面積包括1000個(gè)至1000000個(gè)，優(yōu)選100000個(gè)至400000個(gè)細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽序列。在又一方面，本發(fā)明涉及可通過(guò)上述方法獲得的經(jīng)包被的固體支持物。在又一方面，本發(fā)明涉及經(jīng)包被的固體支持物，所述經(jīng)包被的固體支持物具有非共價(jià)吸附在其表面上的至少一種載體蛋白聚集體，其中，所述載體蛋白包括附著于其上或作為其氨基酸序列一部分的至少一種細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽序列，并且所述聚集體包括2個(gè)至1000個(gè)蛋白分子，優(yōu)選5個(gè)至100個(gè)，更優(yōu)選50個(gè)至100個(gè)蛋白分子。如本文其他處所述，所述固體支持物可以是任何材料，其中，特別優(yōu)選具有玻璃或塑料表面的支持物品。所述固體支持物可以是細(xì)胞培養(yǎng)物品的表面，例如，細(xì)胞培養(yǎng)容器(例如，細(xì)胞培養(yǎng)瓶、滾瓶、培養(yǎng)板，培養(yǎng)管、微量滴定板、膜、盤(pán)、珠、載玻片、用于生物發(fā)酵器的載板或培養(yǎng)皿)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的固體支持物是具有6個(gè)、12個(gè)、24個(gè)或48個(gè)孔的細(xì)胞培養(yǎng)板。本發(fā)明的固體支持物包括在其表面上的至少一種本文其他處所述的載體蛋白的聚集體。聚集的載體蛋白提供細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽序列的分子嵌合體。因此，在優(yōu)選實(shí)施方式中，所述支持物的表面包括細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽序列的分子嵌合體，所述細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽序列存在于聚集體的不同載體蛋白上或不同載體蛋白中。所述載體蛋白優(yōu)選是在細(xì)胞外基質(zhì)中非天然存在的蛋白。本發(fā)明的經(jīng)包被的支持物表面可僅包括如上描述的細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽序列之一，但優(yōu)選在一種或多種載體蛋白中包括兩種或更多種不同的細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽序列。例如，所述支持物品的表面可包括至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種或至少10種不同的細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽序列。在具體實(shí)施方式中，所述支持物的表面包括載體蛋白聚集體，所述載體蛋白聚集體包括可用于細(xì)胞結(jié)合的細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽序列的分子嵌合體。形成的嵌合體可以包括相同或不同的細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽序列。考慮到存在于待培養(yǎng)的細(xì)胞表面上的大量受體并且它們可能在促進(jìn)或抑制細(xì)胞功能中相互作用的事實(shí)，這是尤其令人感興趣的。在尤其優(yōu)選的方面，經(jīng)包被的固體支持物包括至少一種具有細(xì)胞結(jié)合肽基序(優(yōu)選RGD基序)的細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽序列。例如，所述支持物可包括選自SEQIDNO：1～26中的一種或多種細(xì)胞結(jié)合肽和/或選自SEQIDNO：27～56中的具有生長(zhǎng)因子活性的一種或多種肽。通過(guò)非共價(jià)吸附，將載體蛋白固定在固體支持物的表面上，所述載體蛋白包含附著在其上或包含于其中的細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽序列。盡管細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽序列非共價(jià)吸附至本發(fā)明的支持物品的表面，但是通過(guò)本發(fā)明的方法提供的包被是高度穩(wěn)定的。優(yōu)選地，在37℃孵育24小時(shí)后，在PBS或細(xì)胞培養(yǎng)基中，從經(jīng)包被的表面去除小于30％的載體蛋白，更優(yōu)選去除小于25％、小于20％、小于15％、小于10％或小于5％的載體蛋白。甚至更優(yōu)選地，在這些條件下小于4％、3％、2％、1％或小于0.5％或0.1％的載體蛋白從表面脫離下來(lái)。當(dāng)然，非共價(jià)吸附的蛋白的脫離可以通過(guò)研磨性化學(xué)物質(zhì)如有機(jī)溶劑或洗滌劑來(lái)實(shí)現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明，也可以在載體蛋白聚集后再附著細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽。在細(xì)胞培養(yǎng)中用RGD肽對(duì)HEK293細(xì)胞測(cè)試15分鐘時(shí)，發(fā)現(xiàn)僅在聚集后提供細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽的載體蛋白顯示與聚集前這些肽已附著的蛋白類(lèi)似的結(jié)果。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，固體支持物的表面平均每mm2表面積包括1000個(gè)至1000000個(gè)，優(yōu)選100000個(gè)至400000個(gè)細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽序列。本發(fā)明的支持物品的表面可包括至少5個(gè)或更多個(gè)，優(yōu)選至少10個(gè)或更多個(gè)已經(jīng)被不同載體蛋白，例如因各自的細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽序列而彼此不同的BSA蛋白包被的位置或點(diǎn)。附圖說(shuō)明圖1示出了本發(fā)明的方法的原理。說(shuō)明了固體表面包被的不同制備方法和所得產(chǎn)物。圖2示出了孵育時(shí)間和溫度對(duì)BSA聚集的影響。經(jīng)不同時(shí)間段將白蛋白溶液加熱至不同溫度(65℃、70℃和75℃)，并通過(guò)測(cè)量335nm處的光密度OD來(lái)監(jiān)測(cè)BSA聚集體的形成。然后將溶液離心，再次測(cè)量335nm處的OD。65℃離心前(A)和離心后(A')，70℃離心前(B)和離心后(B')，75℃離心前(C)和離心后(C')。圖3示出了將聚集的BSA包被到聚苯乙烯板上的效率。該圖顯示了與在70℃聚集的BSA溶液孵育不同時(shí)間段(1h、4h、18h)后，包被到聚苯乙烯孔中的BSA的量。BSACTL表示未受熱的加熱的BSA。圖4示出了在疏水和親水表面上的包被效率的對(duì)比。提供為細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行了預(yù)先處理(組織培養(yǎng)處理(TCT)，Corning#3524)或未經(jīng)處理(Corning#3738)的24個(gè)平板。這些平板的孔經(jīng)1mg/ml聚集的BSA包被4小時(shí)，其中如實(shí)施例2所述，該聚集的BSA已偶聯(lián)至線性或環(huán)狀RGD。在洗滌后，將平板在37℃干燥。將150000個(gè)HEK293細(xì)胞加入到每個(gè)孔中并在含有10％FCS的培養(yǎng)基中孵育15分鐘。孵育15分鐘后，通過(guò)使用WST-1試劑的比色測(cè)定法估算附著的細(xì)胞數(shù)。使用690nm處的吸光度作為參考，測(cè)量在450nm處的吸光度。白柱＝TCT；灰柱＝未經(jīng)處理的表面。A：僅BSA，B：BSA+SMCC，C：BSA+SMCC+RGD線性，D：BSA+SMCC+RGD環(huán)狀，E:無(wú)包被。具體實(shí)施方式實(shí)施例實(shí)施例1：在其序列中插入細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽序列的BSA載體蛋白的構(gòu)建體構(gòu)建了不同的重組人血清白蛋白(HAS)，這些不同的重組人血清白蛋白(HAS)包括作為其一級(jí)結(jié)構(gòu)一部分的源自ECM蛋白的細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽序列。為此目的，使用VectorNTI軟件(Invitrogen)的組件3DMoleculeViewer軟件，測(cè)定天然ECM蛋白內(nèi)的細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽序列的構(gòu)象。在隨后的步驟中，將天然ECM蛋白的構(gòu)象與HAS蛋白的構(gòu)象進(jìn)行比較，以鑒定出具有相似構(gòu)象的區(qū)域。當(dāng)鑒定出相似區(qū)域時(shí)，BSA的位于所選區(qū)域中的氨基酸被替換成細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽的氨基酸，并且使用程序“SWISS-MODEL”重新計(jì)算所得重組蛋白的結(jié)構(gòu)。以這種方式，在天然HAS蛋白中鑒定出適于被替換成SEQIDNO：2(GRGDS)的細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽序列的三個(gè)環(huán)。第一個(gè)環(huán)(環(huán)-1)含有天然HAS(SEQIDNO：57)的氨基酸80至84(DESAE)。第二個(gè)環(huán)(環(huán)-2)含有天然HAS的氨基酸116至120(AKQEP)，而第三個(gè)環(huán)(環(huán)-3)含有氨基酸194至198(QAADK)。這些環(huán)的氨基酸被替換成SEQIDNO：2(GRGDS)的序列。所得構(gòu)建體分別示于SEQIDNO：58～60中，其中所得構(gòu)建體具有在HAS環(huán)區(qū)1、2或3中的SEQIDNO：2的細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽序列。在SEQIDNO：61中，描述了在HAS的所有三個(gè)環(huán)區(qū)中都包括SEQIDNO：2的細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽序列的構(gòu)建體。在另一構(gòu)建體中，將序列REDV引入BSA蛋白的位于氨基酸137至140(PRLV)的線性段中。所得構(gòu)建體如SEQIDNO：62所示。在另一個(gè)構(gòu)建體中，將肽RYVVLPR引入BSA蛋白的位于氨基酸129至135(HKDDNPN)的反向環(huán)中。所得構(gòu)建體如SEQIDNO：63所示。包括引入到環(huán)3中的RGD，引入到線性段中的REDV以及引入到反向環(huán)中的RYVVLPR的構(gòu)建體如SEQIDNO：64所示。在其序列中具有1、2或3種細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽序列的不同構(gòu)建體按下文進(jìn)一步的描述來(lái)使用。將VSV-G標(biāo)簽或His標(biāo)簽添加到C末端序列用于進(jìn)行親和純化。在畢赤酵母Pichiapastoris中進(jìn)行表達(dá)。表達(dá)后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，與未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，68kD處的條帶鑒定為表達(dá)的HAS。實(shí)施例2：通過(guò)細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽序列附著到BSA表面來(lái)構(gòu)建BSA載體蛋白在1ml100mM磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中的10mgHAS(Sigma#021M7353V)的溶液與3mgSulfo-SMCC(#MF158668,ThermoScientific,Rockford,Il,USA)在21℃孵育1.5小時(shí)。將溶液在相同的緩沖液中透析過(guò)夜。通過(guò)在21℃，將1mg活化的HAS與1mg肽孵育過(guò)夜進(jìn)行肽的偶聯(lián)。RGD環(huán)狀或間隔肽由Eurogentec(Liège,比利時(shí))或BachemAG(Bubendorf,瑞士)綜合性合成。將肽懸浮在含10mMEDTA的PBS溶液中。使用相同的方法將肽偶聯(lián)在聚集的蛋白上。實(shí)施例3：蛋白聚集在70℃，含在1ml100mM磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中的10mgBSA(Sigma#A3059)的溶液在低結(jié)合管(EppendorfAG,漢堡,德國(guó))中，在(EppendorfAG,漢堡,德國(guó))上以500rpm混合速率孵育4小時(shí)。孵育后，測(cè)定溶液在335nm處的光密度(OD)以確定蛋白聚集體的存在。實(shí)施例4：確定用于獲得可溶性蛋白聚集體的實(shí)驗(yàn)條件制備含有在1ml100mM磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中的10mgBSA(Sigma#A3059,圣路易斯,USA)和1μg生物素化的BSA(Sigma#A8549,圣路易斯,USA)。將溶液分成在ProteinLoBindTubes(Eppendorf,漢堡,德國(guó))中的等份，并在(Eppendorf,漢堡,德國(guó))上以500rpm混合速率在不同的溫度下加熱不同的時(shí)間。孵育后，測(cè)定335nm處的OD以監(jiān)測(cè)蛋白聚集體的形成。天然可溶性BSA的OD在該波長(zhǎng)處為0。更高的OD值表明蛋白聚集體的形成。然后將溶液在5000rpm離心5分鐘，并再次測(cè)量OD。離心將不可溶的聚集體從溶液中去除。結(jié)果示于圖2中。溶液在70℃加熱4小時(shí)后的OD為0.04，離心后是相同的。溶液在75℃加熱18小時(shí)后在335nm處的OD為0.407，但在離心后OD僅0.07。這表明部分蛋白通過(guò)加熱而變性并從溶液中沉淀出來(lái)。將加熱的蛋白溶液在非變性的電泳藍(lán)色非變性丙烯酰胺凝膠(梯度從4.5％至16％)上進(jìn)行分離。電泳條件如下：在4mA下，于50mM兩性離子緩沖劑Tricine、15mMBis-TrispH7、0.02％考馬斯藍(lán)的負(fù)極緩沖液和50mMBis-TrispH7的正極緩沖液之間移動(dòng)18h。在70℃孵育4小時(shí)的聚集的BSA溶液顯示出大部分聚集體的分子量在600000和1百萬(wàn)之間，只有少量聚集體具有較低的分子量。在65℃孵育4小時(shí)的蛋白溶液顯示出低分子量的BSA聚集體(主要是二聚體至八聚體)。在75℃孵育的溶液不顯示任何條帶，這是因?yàn)榈鞍拙奂w和/或沉淀物太大而不能進(jìn)入凝膠。以上顯示了如何確定在沒(méi)有蛋白材料的實(shí)質(zhì)性損失的情況下，實(shí)現(xiàn)聚集體形成的溫度和時(shí)間的最佳參數(shù)。實(shí)施例5：聚集的BSA在聚苯乙烯孔中的包被制備含有在1ml100mM磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中的10mgBSA(Sigma#A3059,圣路易斯,USA)和1μg生物素化的BSA(Sigma#A8549,圣路易斯,USA)。將溶液分成在ProteinLoBindTubes(Eppendorf,漢堡,德國(guó))中的等份，并在(Eppendorf,漢堡,德國(guó))上以500rpm混合速率在70℃加熱0h、1h、4h和18h。在加熱步驟之后，使不同的聚集的BSA溶液與“組織培養(yǎng)處理(TCT)”多孔板(Corning#3595,NY,USA)的聚苯乙烯孔接觸。使用50μl/孔(500μgBSA+50ng生物素化的BSA/孔)進(jìn)行包被。用塑料膜密封孔并在室溫下孵育18小時(shí)。孵育后，清空孔，用200μlPBS洗滌1×5分鐘，隨后洗滌2×1分鐘，然后在室溫下與50μl鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶綴合物溶液(0.5％脫脂牛奶+在100mM磷酸鹽緩沖液中的1μg/mlSTAV-HRP)孵育30分鐘。在孵育綴合物后，孔在室溫下用200μlPBS洗滌3×1分鐘，并在室溫下用50μlTMB溶液精確孵育5分鐘。通過(guò)在每個(gè)孔中加入50μl1NHCl溶液來(lái)終止反應(yīng)，在MultiskanTM讀板器(LabSystems,ThermoScientific)中在450nm波長(zhǎng)下進(jìn)行讀板。不同BSA溶液的光密度的圖示于圖3中?？梢钥闯?，包被的聚集體的量隨著聚集時(shí)間而增加。然后將經(jīng)包被的平板在37℃的PBS溶液中孵育24小時(shí)，以測(cè)量從平板中釋放的蛋白的量。發(fā)現(xiàn)在這些條件下，在PBS溶液中未檢測(cè)到生物素化的BSA，這意味著沒(méi)有蛋白從包被中釋放出來(lái)。進(jìn)行直接鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶測(cè)定，用于在PBS水溶液在37℃洗滌24小時(shí)之前和之后，檢測(cè)在經(jīng)包被的孔的表面上生物素化的BSA的存在。通過(guò)三種不同的聚集條件(70℃下1小時(shí)、4小時(shí)、18小時(shí))來(lái)包被孔。如上所述，通過(guò)測(cè)定光密度來(lái)測(cè)量生物素化的BSA。結(jié)果示于下表1中?？梢钥闯觯瑢?duì)于所有三種聚集條件，生物素化的BSA的量在洗滌前后基本相同。在37℃洗滌24小時(shí)后，生物素化的BSA沒(méi)有損失。這些結(jié)果顯示聚集的BSA的包被是穩(wěn)定的且不溶于水性介質(zhì)中。使用未聚集的BSA作為對(duì)照(CTL)。表1：洗滌包被的BSA聚集體的效果未洗滌經(jīng)洗滌(24h)CTL0.170.16在70°聚集1h0.250.33在70°聚集4h0.560.60在70°聚集18h1.541.64實(shí)施例6：在疏水或親水表面上培養(yǎng)細(xì)胞在經(jīng)處理用于細(xì)胞培養(yǎng)(TCT,Corning#3524)或未經(jīng)處理的(Corning#3738)24個(gè)平板中培養(yǎng)HEK293細(xì)胞。將150000個(gè)細(xì)胞加入到每個(gè)孔中并在含有10％FCS的培養(yǎng)基中孵育15分鐘。孔的包被如實(shí)施例3那樣用1mg/ml聚集的BSA進(jìn)行4小時(shí)，并且如實(shí)施例5那樣包被在孔上。包被后，洗滌平板并在37℃下干燥。使用SMCC(如實(shí)施例2中所述)將含有線性或環(huán)狀RGD的肽偶聯(lián)至BSA。孵育15分鐘后，通過(guò)使用WST-1試劑(N°10008883,CaymanChemical,密歇根,US)的比色測(cè)定法估算附著的細(xì)胞數(shù)，并使用690nm處吸光度作為參考，讀取450nm處的吸光度。結(jié)果示于圖4中。在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中可以看出，與未處理的表面(E)相比，TCT增加附著到表面的細(xì)胞數(shù)。當(dāng)使用已包被了聚集的BSA的平板時(shí)，TCT和非TCT平板之間實(shí)現(xiàn)了相同的細(xì)胞附著效率，其中聚集的BSA包括含線性RGD的肽(C)或含環(huán)狀RGD的肽(D)。不包括任何細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽的包被對(duì)細(xì)胞附著具有負(fù)面效果(A)。實(shí)施例7：干細(xì)胞分化將若干肽或肽的組合偶聯(lián)至BSA以提供載體蛋白。如實(shí)施例3所述的，加熱蛋白溶液以獲得聚集體。隨后，如實(shí)施例5所述的，將蛋白聚集體包被到培養(yǎng)瓶的表面。人間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSC)獲自Lonza(#PT-2501,Vervier,比利時(shí))。在誘導(dǎo)分化前，細(xì)胞首先在干細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基(BulletKitTM,LonzaPT-3001)中生長(zhǎng)1天～2天。用于成骨分化的細(xì)胞培養(yǎng)：細(xì)胞在第0天以3.7×103個(gè)細(xì)胞/cm的密度接種到經(jīng)包被的平板的孔中。使用hMSC成骨分化BulletKitTM(Lonza,PT-3002)在第1天開(kāi)始誘導(dǎo)分化。在第3、6和10天更新誘導(dǎo)培養(yǎng)基。在第14天進(jìn)行試驗(yàn)。成骨細(xì)胞的分化引起基質(zhì)成熟和礦化。成骨細(xì)胞含有由羥基磷灰石和含1型膠原的有機(jī)組分構(gòu)成的礦化結(jié)節(jié)；通過(guò)OsteolmageTM骨礦化試驗(yàn)(Lonza,PA-1503)測(cè)定羥基磷灰石。OsteolmageTM與羥基磷灰石的結(jié)合引起可觀察和測(cè)量的熒光信號(hào)。分化的其他標(biāo)記物是前膠原1、TGF-β和纖連蛋白的合成。在分化14和21天后測(cè)試細(xì)胞培養(yǎng)物。SEQIDNO：1和SEQIDNO：13的肽的組合或SEQIDNO：1和SEQIDNO：15的肽的組合對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞分化都特別有效。在預(yù)分化步驟中和在較高分化時(shí)，與TCT相比，含RGD的、聚集的BSA使細(xì)胞生長(zhǎng)好得多。分化程度與用BioCoatTM纖連蛋白包被的平板(BD,比利時(shí))觀察到的程度相似。用于成脂分化的細(xì)胞培養(yǎng)：hMSC細(xì)胞在第0天以2.1×104個(gè)細(xì)胞/cm的密度接種到孔中。培養(yǎng)基是hMSC成脂分化BulletKitTM(Lonza,PT-3004)，并且根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行培養(yǎng)。在第4天更新培養(yǎng)基。使用hMSC成脂分化BulletKitTM(Lonza,PT3004)在第5天開(kāi)始誘導(dǎo)分化。在第8天，用維持培養(yǎng)基替換誘導(dǎo)培養(yǎng)基，培養(yǎng)3天。在第11天開(kāi)始另一個(gè)誘導(dǎo)周期，在第15天開(kāi)始第三個(gè)誘導(dǎo)周期。在第18、20、22、25天添加維持培養(yǎng)基，在第26天進(jìn)行測(cè)定。包括SEQIDNO：1的肽的、聚集的BSA使細(xì)胞生長(zhǎng)良好并分化為脂肪細(xì)胞。實(shí)施例8：干細(xì)胞的神經(jīng)分化將SEQIDNO：1的含環(huán)狀RGD的肽偶聯(lián)至BSA以提供載體蛋白，經(jīng)加熱以獲得如實(shí)施例3所述的聚集體。然后，如實(shí)施例5中所述，將聚集體包被在培養(yǎng)容器表面上。干細(xì)胞是獲自(#N7800-200)(LifeTechnologies,比利時(shí))的人神經(jīng)干細(xì)胞(H-9hNSC)。它們?cè)醋訬IH批準(zhǔn)的H9(WA09)胚胎干細(xì)胞。培養(yǎng)基和分化培養(yǎng)基來(lái)自根據(jù)制造商推薦的方案，在誘導(dǎo)分化前，細(xì)胞首先在干細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基(NSCSFM,LifeTechnolgies)中生長(zhǎng)2天。若干培養(yǎng)表面用于分化步驟：標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)處理(TCT)表面、(Corning,比利時(shí))、PureCoatTMECM模擬培養(yǎng)皿纖連蛋白(PureCoatTMECMMimeticCulturewareFibronectinProtein)(BectonDickinson,BD,比利時(shí))、BioCoatTM聚L-鳥(niǎo)氨酸/層粘蛋白(BD,比利時(shí))，和用根據(jù)本發(fā)明制備的含RGD的BSA聚集體包被的表面。實(shí)施例9：在無(wú)血清培養(yǎng)基中的培養(yǎng)將SEQIDNO：1的含環(huán)狀RGD的肽偶聯(lián)至HSA以提供載體蛋白，經(jīng)加熱以獲得如實(shí)施例3所述的聚集體。然后，如實(shí)施例5中所述，將聚集體包被在培養(yǎng)容器表面上。人間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSC)獲自Lonza(#PT-2501,Vervier,比利時(shí))。根據(jù)制造商的要求，將細(xì)胞在補(bǔ)充有谷氨酰胺的CTSTMMSCSFM培養(yǎng)基(A10332-01,LifeTechnologies)中生長(zhǎng)。將細(xì)胞培養(yǎng)10天，在此期間對(duì)細(xì)胞進(jìn)行檢查：在顯微鏡下檢查培養(yǎng)物，在細(xì)胞從支持物上分離后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。觀察到，細(xì)胞在這段期間在肽處理的表面上增殖良好，而它們?cè)赥CT表面上不增殖并最終退化。序列表<110>艾本德股份公司<120>包被固體支持物的方法<130>P98350<160>64<170>PatentIn3.5版<210>1<211>5<212>PRT<213>人工<220><223>細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽,環(huán)狀<220><221>MOD_RES<222>(1)..(1)<223>第1位和第5位連接形成環(huán)狀肽<220><221>MOD_RES<222>(5)..(5)<223>第1位和第5位連接形成環(huán)狀肽<400>1ArgGlyAspProCys15<210>2<211>5<212>PRT<213>人工<220><223>細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽<400>2GlyArgGlyAspSer15<210>3<211>9<212>PRT<213>人工<220><223>細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽<400>3GlySerGlyArgGlyAspSerGlySer15<210>4<211>10<212>PRT<213>人工<220><223>細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽<400>4ValThrGlyArgGlyAspSerProAlaSer1510<210>5<211>15<212>PRT<213>人工<220><223>細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽<400>5CysGlyGlyAsnGlyGluProArgGlyAspThrTyrArgAlaTyr151015<210>6<211>12<212>PRT<213>人工<220><223>細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽,包括C末端的NH2基團(tuán)<220><221>MOD_RES<222>(12)..(12)<223>酰胺化<400>6GlyProArgGlyAsnArgGlyAspSerIleAspGln1510<210>7<211>12<212>PRT<213>人工<220><223>細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽,包括C末端的NH2基團(tuán)<220><221>MOD_RES<222>(12)..(12)<223>酰胺化<400>7GlySerProGlyGluArgGlyAspGlnGlyAlaArg1510<210>8<211>10<212>PRT<213>人工<220><223>細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽,包括C末端的NH2基團(tuán)<220><221>MOD_RES<222>(10)..(10)<223>酰胺化<400>8AspGlyArgGlyAspSerValAlaTyrGly1510<210>9<211>11<212>PRT<213>人工<220><223>細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽,包括C末端的NH2基團(tuán)<220><221>MOD_RES<222>(11)..(11)<223>酰胺化<400>9ProArgGlyAspSerGlyTyrArgGlyAspSer1510<210>10<211>12<212>PRT<213>人工<220><223>細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽<400>10CysGlyGlyGluProArgGlyAspThrTyrArgAla1510<210>11<211>9<212>PRT<213>人工<220><223>細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽<400>11CysGlyProArgGlyAspThrTyrGly15<210>12<211>15<212>PRT<213>人工<220><223>細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽,包括N末端的乙?；?lt;220><221>MOD_RES<222>(1)..(1)<223>乙?；?lt;400>12LysGlyGlyProGlnValThrArgGlyAspValPheThrMetPro151015<210>13<211>19<212>PRT<213>人工<220><223>細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽<400>13GluGluIleGlnIleGlyHisIleProArgGluAspValAspTyrHis151015LeuTyrPro<210>14<211>5<212>PRT<213>人工<220><223>細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽<400>14GluIleLeuAspVal15<210>15<211>20<212>PRT<213>人工<220><223>細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽<400>15ArgTyrValValLeuProArgProValCysPheGluLysGlyMetAsn151015TyrThrValArg20<210>16<211>19<212>PRT<213>人工<220><223>細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽<400>16CysSerArgAlaArgLysGlnAlaAlaSerIleLysValAlaValSer151015AlaAspArg<210>17<211>11<212>PRT<213>人工<220><223>細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽<400>17GlyCysGlyTyrIleGlySerArgSerProGly1510<210>18<211>9<212>PRT<213>人工<220><223>細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽<220><221>MOD_RES<222>(3)..(3)<223>Xaa是羥脯氨酸(Hyp)<400>18GlyPheXaaGlyGluArgGlyValGln15<210>19<211>7<212>PRT<213>人工<220><223>細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽<400>19AlaAspGlyGluAlaAspPro15<210>20<211>5<212>PRT<213>人工<220><223>細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽<400>20ProHisSerArgAsn15<210>21<211>5<212>PRT<213>人工<220><223>細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽<400>21LeuHisSerArgAsn15<210>22<211>21<212>PRT<213>人工<220><223>細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽<400>22ArgGlyAspGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGly151015ProHisSerArgAsn20<210>23<211>21<212>PRT<213>人工<220><223>細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽<400>23ArgGlyAspGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGly151015LeuHisSerArgAsn20<210>24<211>15<212>PRT<213>人工<220><223>細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽<400>24GlyThrProGlyProGlnGlyIleAlaGlyGlnArgGlyValVal151015<210>25<211>7<212>PRT<213>人工<220><223>細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽<400>25MetAsnTyrTyrSerAsnSer15<210>26<211>10<212>PRT<213>人工<220><223>細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽,包括C末端的NH2基團(tuán)和N末端的乙酰化<220><221>MOD_RES<222>(1)..(1)<223>乙?；?lt;220><221>MOD_RES<222>(10)..(10)<223>酰胺化<400>26CysGlyGlyPheHisArgArgIleLysAla1510<210>27<211>16<212>PRT<213>人工<220><223>細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽<400>27ThrGlyGlnTyrLeuAlaMetAspThrAspGlyLeuLeuTyrGlySer151015<210>28<211>16<212>PRT<213>人工<220><223>細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽<400>28AlaAsnArgTyrLeuAlaMetLysGluAspGlyArgLeuLeuAlaSer151015<210>29<211>15<212>PRT<213>人工<220><223>細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽<400>29GluValTyrValValAlaGluAsnGlnGlnGlyLysSerLysAla151015<210>30<211>9<212>PRT<213>人工<220><223>細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽<400>30ValValAsnGlyIleProThrArgAsn15<210>31<211>7<212>PRT<213>人工<220><223>細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽<400>31LysGlnLeuArgAlaMetCys15<210>32<211>11<212>PRT<213>人工<220><223>細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽<400>32ProAlaSerAspAlaPheGlnArgLysLeuGlu1510<210>33<211>6<212>PRT<213>人工<220><223>細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽<400>33LeuAlaArgLeuLeuThr15<210>34<211>14<212>PRT<213>人工<220><223>細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽<400>34SerPheLeuLeuArgAsnProAsnAspLysTyrGluProPhe1510<210>35<211>37<212>PRT<213>人工<220><223>細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽<400>35LeuLeuGlyAspPhePheArgLysSerLysGluLysIleGlyLysGlu151015PheLysArgIleValGlnArgIleLysAspPheLeuArgAsnLeuVal202530ProArgThrGluSer35<210>36<211>12<212>PRT<213>人工<220><223>細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽<400>36CysGlyThrGlyTyrGlySerSerSerArgArgCys1510<210>37<211>36<212>PRT<213>人工<220><223>細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽<400>37SerLeuGluGluGluTrpAlaGlnValGluCysGluValTyrGlyArg151015GlyCysProSerGlySerLeuAspGluSerPheTyrAspTrpPheGlu202530ArgGlnLeuGly35<210>38<211>18<212>PRT<213>人工<220><223>細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽<400>38GlySerLeuAspGluSerPheTyrAspTrpPheGluArgGlnLeuGly151015LysLys<210>39<211>10<212>PRT<213>人工<220><223>細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽<400>39ArgLysIleGluIleValArgLysLysCys1510<210>40<211>10<212>PRT<213>人工<220><223>細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽<400>40IleValArgLysLysCysArgLysIleGlu1510<210>41<211>12<212>PRT<213>人工<220><223>細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽,包括C末端的NH2基團(tuán)<220><221>MOD_RES<222>(12)..(12)<223>酰胺化<400>41AlaLeuLysArgGlnGlyArgThrLeuTyrGlyPhe1510<210>42<211>15<212>PRT<213>人工<220><223>細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽<400>42GlyGlnGlyPheSerTyrProTyrLysAlaValPheSerThrGln151015<210>43<211>8<212>PRT<213>人工<220><223>細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽<400>43AlaProSerGlyHisTyrLysGly15<210>44<211>7<212>PRT<213>人工<220><223>細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽<400>44MetGlnLeuProLeuAlaThr15<210>45<211>8<212>PRT<213>人工<220><223>細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽<400>45AlaProSerGlyHisTyrLysGly15<210>46<211>5<212>PRT<213>人工<220><223>細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽<400>46CysValArgAlaCys15<210>47<211>24<212>PRT<213>人工<220><223>細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽<400>47AsnPheCysLeuGlyProCysProTyrIleTrpSerLeuAspThrGln151015TyrSerLysValLeuAlaLeuTyr20<210>48<211>19<212>PRT<213>人工<220><223>細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽<400>48GluCysGlyLeuLeuProValGlyArgProAspArgAsnValTrpArg151015TrpLeuCys<210>49<211>10<212>PRT<213>人工<220><223>細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽<400>49LysProSerSerAlaProThrGlnLeuAsn1510<210>50<211>11<212>PRT<213>人工<220><223>細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽<400>50LysAlaIleSerValLeuTyrPheAspAspSer1510<210>51<211>10<212>PRT<213>人工<220><223>細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽<400>51SerAsnValIleLeuLysLysTyrArgAsn1510<210>52<211>20<212>PRT<213>人工<220><223>細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽<400>52GlyTrpGlnAspTrpIleIleAlaProGluGlyTyrAlaAlaTyrTyr151015CysGluGlyGlu20<210>53<211>20<212>PRT<213>人工<220><223>細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽<400>53AlaIleSerValLeuTyrPheAspAspSerSerAsnValIleLeuLys151015LysTyrArgAsn20<210>54<211>10<212>PRT<213>人工<220><223>細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽<400>54IleValArgLysLysCysArgLysIleGlu1510<210>55<211>16<212>PRT<213>人工<220><223>細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽,環(huán)狀，具有在第1位的NAc和第16位的NH2基團(tuán)<220><221>MOD_RES<222>(1)..(1)<223>乙?；?lt;220><221>MOD_RES<222>(16)..(16)<223>酰胺化<400>55CysSerArgArgGlyGluLeuAlaAlaSerArgArgGlyGluLeuCys151015<210>56<211>9<212>PRT<213>人工<220><223>細(xì)胞功能調(diào)節(jié)肽,具有C末端的NH2基團(tuán)<220><221>MOD_RES<222>(9)..(9)<223>酰胺化<400>56PheProGlnSerPheLeuProArgGly15<210>57<211>609<212>PRT<213>智人<400>57MetLysTrpValThrPheIleSerLeuLeuPheLeuPheSerSerAla151015TyrSerArgGlyValPheArgArgAspAlaHisLysSerGluValAla202530HisArgPheLysAspLeuGlyGluGluAsnPheLysAlaLeuValLeu354045IleAlaPheAlaGlnTyrLeuGlnGlnCysProPheGluAspHisVal505560LysLeuValAsnGluValThrGluPheAlaLysThrCysValAlaAsp65707580GluSerAlaGluAsnCysAspLysSerLeuHisThrLeuPheGlyAsp859095LysLeuCysThrValAlaThrLeuArgGluThrTyrGlyGluMetAla100105110AspCysCysAlaLysGlnGluProGluArgAsnGluCysPheLeuGln115120125HisLysAspAspAsnProAsnLeuProArgLeuValArgProGluVal130135140AspValMetCysThrAlaPheHisAspAsnGluGluThrPheLeuLys145150155160LysTyrLeuTyrGluIleAlaArgArgHisProTyrPheTyrAlaPro165170175GluLeuLeuPhePheAlaLysArgTyrLysAlaAlaPheThrGluCys180185190CysGlnAlaAlaAspLysAlaAlaCysLeuLeuProLysLeuAspGlu195200205LeuArgAspGluGlyLysAlaSerSerAlaLysGlnArgLeuLysCys210215220AlaSerLeuGlnLysPheGlyGluArgAlaPheLysAlaTrpAlaVal225230235240AlaArgLeuSerGlnArgPheProLysAlaGluPheAlaGluValSer245250255LysLeuValThrAspLeuThrLysValHisThrGluCysCysHisGly260265270AspLeuLeuGluCysAlaAspAspArgAlaAspLeuAlaLysTyrIle275280285CysGluAsnGlnAspSerIleSerSerLysLeuLysGluCysCysGlu290295300LysProLeuLeuGluLysSerHisCysIleAlaGluValGluAsnAsp305310315320GluMetProAlaAspLeuProSerLeuAlaAlaAspPheValGluSer325330335LysAspValCysLysAsnTyrAlaGluAlaLysAspValPheLeuGly340345350MetPheLeuTyrGluTyrAlaArgArgHisProAspTyrSerValVal355360365LeuLeuLeuArgLeuAlaLysThrTyrGluThrThrLeuGluLysCys370375380CysAlaAlaAlaAspProHisGluCysTyrAlaLysValPheAspGlu385390395400PheLysProLeuValGluGluProGlnAsnLeuIleLysGlnAsnCys405410415GluLeuPheGluGlnLeuGlyGluTyrLysPheGlnAsnAlaLeuLeu420425430ValArgTyrThrLysLysValProGlnValSerThrProThrLeuVal435440445GluValSerArgAsnLeuGlyLysValGlySerLysCysCysLysHis450455460ProGluAlaLysArgMetProCysAlaGluAspTyrLeuSerValVal465470475480LeuAsnGlnLeuCysValLeuHisGluLysThrProValSerAspArg485490495ValThrLysCysCysThrGluSerLeuValAsnArgArgProCysPhe500505510SerAlaLeuGluValAspGluThrTyrValProLysGluPheAsnAla515520525GluThrPheThrPheHisAlaAspIleCysThrLeuSerGluLysGlu530535540ArgGlnIleLysLysGlnThrAlaLeuValGluLeuValLysHisLys545550555560ProLysAlaThrLysGluGlnLeuLysAlaValMetAspAspPheAla565570575AlaPheValGluLysCysCysLysAlaAspAspLysGluThrCysPhe580585590AlaGluGluGlyLysLysLeuValAlaAlaSerGlnAlaAlaLeuGly595600605Leu<210>58<211>585<212>PRT<213>人工序列<220><223>具有修飾的環(huán)1的HSA<400>58AspAlaHisLysSerGluValAlaHisArgPheLysAspLeuGlyGlu151015GluAsnPheLysAlaLeuValLeuIleAlaPheAlaGlnTyrLeuGln202530GlnCysProPheGluAspHisValLysLeuValAsnGluValThrGlu354045PheAlaLysThrCysValAlaGlyArgGlyAspSerAsnCysAspLys505560SerLeuHisThrLeuPheGlyAspLysLeuCysThrValAlaThrLeu65707580ArgGluThrTyrGlyGluMetAlaAspCysCysAlaLysGlnGluPro859095GluArgAsnGluCysPheLeuGlnHisLysAspAspAsnProAsnLeu100105110ProArgLeuValArgProGluValAspValMetCysThrAlaPheHis115120125AspAsnGluGluThrPheLeuLysLysTyrLeuTyrGluIleAlaArg130135140ArgHisProTyrPheTyrAlaProGluLeuLeuPhePheAlaLysArg145150155160TyrLysAlaAlaPheThrGluCysCysGlnAlaAlaAspLysAlaAla165170175CysLeuLeuProLysLeuAspGluLeuArgAspGluGlyLysAlaSer180185190SerAlaLysGlnArgLeuLysCysAlaSerLeuGlnLysPheGlyGlu195200205ArgAlaPheLysAlaTrpAlaValAlaArgLeuSerGlnArgPhePro21021522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