本發(fā)明涉及，例如，用于檢測傳染病的一線(point-of-need)(PON)或即時(shí)檢測(point-of-care)(POC)診斷設(shè)備的領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

已經(jīng)存在著從傳染病的傳統(tǒng)檢驗(yàn)方法(如培養(yǎng)和抗原檢測)向更靈敏的核酸擴(kuò)增測試(本文中稱為NAAT)的轉(zhuǎn)移。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增為實(shí)驗(yàn)室提供了檢測傳染病的靈敏和特異性的工具，并已經(jīng)被全世界的臨床實(shí)驗(yàn)室采用。

當(dāng)前的分子診斷工具受到大量的“芯片外(off-chip)”臨床樣品制備時(shí)間和對熟練技師的需要的限制。這限制了分子診斷在家庭或資源貧乏的環(huán)境中的應(yīng)用。典型的診斷測試可以在3小時(shí)到5天的時(shí)間內(nèi)完成。但是，這在某些情況下不能提供有用的診斷信息。

使用微流體裝置使診斷分析小型化成“芯片實(shí)驗(yàn)室”形式在過去十年間獲得了許多的關(guān)注。微流體裝置通常是小的且需要非常低的樣品量，這有利于分子診斷。這一技術(shù)可以用于構(gòu)建用于例如床旁使用的POC診斷工具和提供快速診斷結(jié)果。但是，POC設(shè)備的成本是重要的且應(yīng)當(dāng)盡可能低，特別是用于資源貧乏的環(huán)境中。此時(shí)，復(fù)雜和昂貴的樣品制備和DNA檢測技術(shù)阻礙了便宜的完全一次性POC設(shè)備的構(gòu)建。

已經(jīng)開發(fā)了允許以自動的“芯片上”方式或無需人干預(yù)從臨床樣品(血液、尿液、鼻咽拭子、糞便材料)分離傳染性顆粒(病毒、細(xì)菌或真菌)的裝置。例如，WO110019A1公開了可以將病原體或核酸與磁珠結(jié)合并隨后使它們移動到次級室進(jìn)行檢測的微流體平臺。另外，WO122564A2公開了用于從病原體釋放細(xì)胞內(nèi)內(nèi)容物和隨后轉(zhuǎn)運(yùn)一部分內(nèi)容物進(jìn)行檢測的裝置。US 2008/0299648A1公開了一種自持的診斷試劑盒，其包括樣品收集元件和免疫色譜測試條。US8,574,923B2公開了使用整塊吸附劑或使用樣品過濾器特異性地結(jié)合核酸以結(jié)合任何目標(biāo)分析物和裂解細(xì)胞膜的樣品制備裝置。WO2012/013733A1公開了用于通用樣品制備的裝置以從多種液體基質(zhì)分離核酸而用于診斷目的。最后，WO2013/158686A1公開了需要最小時(shí)間帶且可以從各種細(xì)胞混合物純化核酸的核酸樣品制備裝置。

在傳染病的檢測中，傳染性顆粒首先被分離且然后必須裂解以釋放細(xì)胞內(nèi)內(nèi)容物，包括DNA、RNA和蛋白質(zhì)。盡管幾種方法已經(jīng)描述用于從細(xì)胞釋放核酸和蛋白質(zhì)，但將其集成到診斷POC平臺中顯著地提高了該設(shè)備的復(fù)雜性。對于機(jī)械裂解，需要可增加該設(shè)備的成本和復(fù)雜性的電動機(jī)元件。對于化學(xué)裂解，難以施用準(zhǔn)確量的裂解試劑且隨后在下游分析之前除去該試劑。NAAT技術(shù)對于化學(xué)污染特別敏感且所有裂解化學(xué)品必須在后續(xù)步驟(包括酶學(xué)擴(kuò)增和檢測)之前除去。

聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)是使用熱穩(wěn)定DNA聚合酶和熱循環(huán)的組合將病原性DNA序列擴(kuò)增到高濃度的常用技術(shù)。但是，PCR通常需要～50℃和95℃之間的熱循環(huán)以使擴(kuò)增發(fā)生，且將熱循環(huán)集成到POC診斷平臺中將增加開發(fā)POC分子診斷設(shè)備的復(fù)雜性和成本。

使用POC診斷的一次性系統(tǒng)對于家庭檢驗(yàn)、不能接觸中心實(shí)驗(yàn)室的資源貧乏環(huán)境或社區(qū)醫(yī)院是有吸收力的，但讀數(shù)所需的輔助系統(tǒng)通常是昂貴的和專用的，這限制了其可處置性。這也可導(dǎo)致對于單獨(dú)單元或閱讀器的高昂初始資本投入。

因此，希望的是開發(fā)便攜的和一次性的即時(shí)檢測診斷設(shè)備。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

現(xiàn)在已經(jīng)開發(fā)了適應(yīng)于接受原始臨床樣品(例如，血液、尿液、糞便物質(zhì)、鼻咽拭子等)、釋放病原體細(xì)胞內(nèi)內(nèi)容物并擴(kuò)增和檢測病原體核酸的即時(shí)檢測設(shè)備。

因此，提供了即時(shí)檢測設(shè)備，其包括：

適應(yīng)于接受生物樣品的提取室，其中所述提取室包含提取和裂解該樣品以釋放核酸的裝置；

與提取室連通的第一擴(kuò)增室，其中所述擴(kuò)增室包含引發(fā)靶核酸序列的核酸擴(kuò)增發(fā)生的裝置；和

與擴(kuò)增室連通的檢測室，其中所述檢測室包含可檢測地標(biāo)記靶核酸的裝置和檢測與標(biāo)記的靶核酸相關(guān)的信號的裝置。

在本發(fā)明的另一方面，提供了檢測生物樣品中的靶核酸的方法，包括：

在拭子上收集生物樣品和將拭子插入適應(yīng)于從拭子提取所述樣品和裂解病原體以釋放核酸的封閉提取室中；

轉(zhuǎn)移一部分釋放的核酸到與提取室連接的核酸擴(kuò)增室并將所述核酸暴露于試劑以誘導(dǎo)核酸擴(kuò)增；

在與擴(kuò)增室連接的檢測室中標(biāo)記和檢測靶核酸。

本發(fā)明的這些和其它方面參照以下附圖和說明將變得明顯。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的實(shí)施方式的框圖(A)，和按照本發(fā)明的實(shí)施方式的POC設(shè)備的示意圖(B)(包括各種視圖)；

圖2圖示說明自調(diào)節(jié)加熱器可以通過施加電壓以不同電阻(3.8歐姆、3.5歐姆和3.4歐姆)加熱250μl水到95℃ 20分鐘；

圖3圖示說明自調(diào)節(jié)加熱器可以通過施加電壓以8.6歐姆的電阻加熱250μl水到62℃；

圖4圖示說明在擴(kuò)增后使用熒光染料(SYBR綠)檢測無乳鏈球菌(S.agalactiae)；

圖5說明使用Quant-iT PicoGreen DNA結(jié)合染料分析擴(kuò)增之前和之后的顏色變化；

圖6圖示說明使用2個(gè)濃度的亞甲基藍(lán)和測量陽極峰電流(peak anodic current)電化學(xué)檢測擴(kuò)增的無乳鏈球菌DNA；

圖7是顯示可用于實(shí)施本技術(shù)的方面的示例計(jì)算機(jī)系統(tǒng)的框圖；和

圖8是顯示可用于實(shí)施本技術(shù)的方面的示例智能手機(jī)的框圖。

具體實(shí)施方式

提供了用于檢測靶核酸的即時(shí)檢測設(shè)備。該設(shè)備包括適應(yīng)于接收生物樣品和裂解樣品以釋放核酸的提取室；與提取室連通的第一擴(kuò)增室，其從提取室接收樣品并包含擴(kuò)增樣品中的靶核酸的裝置；和與擴(kuò)增室連通的檢測室，其包含標(biāo)記靶核酸以用于檢測的裝置和檢測該標(biāo)記的裝置。如本文中使用的，術(shù)語“提取室”是指其中發(fā)生樣品提取和裂解兩者的腔室。

生物樣品可以使用用于將樣品轉(zhuǎn)移到設(shè)備的提取室中的任何適宜媒介獲得。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，拭子用于收集包含核酸的生物或臨床樣品(例如，血液、尿液、鼻咽拭子、糞便樣品、陰道拭子、眼淚、在傷口部位或炎癥部位排出的流體或者包含核酸的任何其它臨床物質(zhì))。如本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的，生物樣品可以通過拭子以外的裝置獲得，例如通過注射器或通過收集容器(拭子可以浸入其中)。包含樣品的拭子置于該設(shè)備的提取室的拭子-接收開口中。所使用的拭子可以是標(biāo)準(zhǔn)拭子或特別設(shè)計(jì)用于該設(shè)備的拭子。例如，拭子可以調(diào)整大小以配合在提取室內(nèi)從而允許提取室開口用帽或蓋密封。當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)拭子時(shí)，拭子桿可以在提取室開口處折斷以允許提取室開口用蓋密封。拭子可以具有適于收集特定樣品如陰道和鼻咽樣品的較小頭部?；蛘撸米涌梢园ㄑ仄錀U的塞，其起到密封提取室的開口和防止從設(shè)備的泄漏的作用。一旦提取室封閉，其在設(shè)備內(nèi)形成封閉的包含環(huán)境。用于樣品轉(zhuǎn)移的其它適宜媒介包括小棍、泡沫粘桿或能夠吸附用于轉(zhuǎn)移到設(shè)備的生物樣品的其它媒介。

提取室包含使得能夠?qū)崿F(xiàn)樣品提取(按照需要)和裂解以從樣品釋放核酸的裝置。因此，提取室含有適合從遞送媒介提取樣品和樣品裂解的裂解液(例如，磷酸鹽緩沖鹽水溶液、水、0.1％Triton-X100溶液、0.1％SDS溶液、用于提取和裂解的其它合適清潔劑或這些中任何的組合)或可利用該裂解液。在一個(gè)實(shí)施方式中，提取室包含適合提取和裂解的量的裂解液，例如，約0.2-0.5mL的體積的裂解液，以浸沒含樣品媒介和促進(jìn)其樣品提取/裂解。在這種情況中，提取室具有單向進(jìn)入點(diǎn)(在設(shè)備的開口處或附近)，例如，膜，其允許樣品經(jīng)由媒介(例如，拭子等)輸入到提取室中，但防止裂解液從提取室泄漏。在另一個(gè)實(shí)施方式中，提取室與在樣品進(jìn)入提取室中時(shí)起到釋放提取和裂解液到提取室中的作用的緩沖釋放裝置連通。例如，裂解液可以包含在小袋、泡罩包裝或其它儲器中(在提取室內(nèi)或鄰近提取室)，其在樣品進(jìn)入時(shí)被激活以將溶液釋放到提取室中。就此而言，小袋或泡罩包裝可以在進(jìn)入時(shí)通過含樣品媒介(例如，拭子)刺穿、在腔室密封或蓋封閉時(shí)通過腔室內(nèi)的裝置刺穿或者在腔室密封時(shí)通過腔室內(nèi)的壓力爆破。鄰近的儲器可以通過相似地將連接儲器與提取室的膜刺穿或爆破而導(dǎo)致裂解液釋放到提取室中。如本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的，也可以采用從小袋或儲器釋放裂解液的其它裝置。

在提取室密封時(shí)，例如，通過蓋封閉提取室的開口，設(shè)備通過如所述地完成一個(gè)或多個(gè)回路來激活。因此，加熱器、泵和其它電子部件(如所述的)通過連接于內(nèi)置的(on-board)或外加的(off-board)(通過連接于外部電源)控制單元(包括電池)、經(jīng)由任何適宜的適配器(DC適配器)和/或轉(zhuǎn)換器(D/A轉(zhuǎn)換器)適當(dāng)?shù)毓╇?。該連接可以是至電源(例如，電池)的標(biāo)準(zhǔn)電連接(DC適配器)，或該連接可以經(jīng)由至外部電源如處理裝置(例如計(jì)算機(jī)、手機(jī)、平板電腦或其它外部裝置)的端口(例如，USB)。因此，該設(shè)備可以具有連接至電源的裝置。

提取室包含促進(jìn)樣品提取和裂解以從其釋放核酸的裝置。在一個(gè)實(shí)施方式中，加熱裝置，例如，自調(diào)節(jié)加熱器，用于加熱提取室至適合促進(jìn)樣品提取和裂解的溫度(例如，約88℃-100℃之間的溫度)足夠的時(shí)間段(例如，至少約2-3分鐘)。自調(diào)節(jié)加熱器可以包括，但不限于，PTC(正溫度系數(shù))陶瓷加熱器、蒸發(fā)溫度控制加熱器或散熱溫度控制加熱器。加熱器在提取室的蓋封閉時(shí)激活，由此完成將加熱器連接于電源(例如，電池)的回路。

或者，提取室可以包含產(chǎn)生機(jī)械力的裝置(例如，小電動機(jī))以促進(jìn)樣品從拭子釋放和任何存在的病原體的裂解。電動機(jī)可以與放置于提取室內(nèi)的玻璃或陶瓷珠的使用相結(jié)合以加速裂解。電動機(jī)可以位于提取室的基部，且以對于加熱器所描述的方式供電。這一實(shí)施方式可以另外地包括或不包括加熱器以促進(jìn)裂解。

在某些樣品(例如鼻咽樣品)中，病原體可以用熱裂解且核酸可以在沒有核酸純化的情況下直接擴(kuò)增。

在其它樣品，例如包含核酸擴(kuò)增抑制劑(如膽汁鹽、亞鐵血紅素、蛋白酶、尿素或血紅蛋白)的血液或尿液中，提取室內(nèi)的核酸純化可能是需要的。在這種情況中，提取室可以涂布有固定的寡核苷酸捕獲探針(其與靶核酸同源)(例如，以約10⁴-10⁵拷貝的量)，或涂布有對于靶病原體序列(例如，表1中示例的那些)的靶核酸特異性的寡核苷酸探針。該設(shè)備可以任選地在提取室(其在設(shè)備的蓋封閉時(shí)供電或激活)內(nèi)包括帶正電的電極，以促進(jìn)核酸結(jié)合到捕獲探針上。一旦核酸結(jié)合于探針，例如在如約2分鐘的短時(shí)間內(nèi)，未結(jié)合的污染物可以從提取室除去。污染物移除可以通過吸引或泵送到與提取室連接的廢物室中來完成，或者污染物可以用從第二緩沖室釋放的緩沖液洗滌到廢物室中。這一步驟除去潛在的擴(kuò)增抑制劑并濃縮核酸(例如，DNA或RNA)用于擴(kuò)增。這一核酸結(jié)合步驟在室溫和35℃之間進(jìn)行而不需要加熱器。在結(jié)合后，用于從提取室除去污染物的裝置(例如，微泵和/或緩沖液釋放裝置)如前所述激活，且可以利用定時(shí)器以使得廢物移除在捕獲所有或足夠量的核酸后發(fā)生。然后，核酸可以隨后如前所述地洗脫。

在裂解和核酸釋放后，測定體積(例如，約5-10μl)的這一經(jīng)裂解物質(zhì)經(jīng)由通道如微流體通道轉(zhuǎn)移(例如通過微泵)到擴(kuò)增室。如所述的，微泵可以通過內(nèi)置電源如電池或通過與外部電源的連接供電。泵可以在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間(例如，一旦樣品提取和裂解完成)激活以轉(zhuǎn)移經(jīng)裂解的物質(zhì)到擴(kuò)增室。在一個(gè)實(shí)施方式中，泵的激活通過連接于電源的定時(shí)器延遲以確保樣品發(fā)生提取和裂解，且由此防止未裂解的物質(zhì)轉(zhuǎn)移到擴(kuò)增室。關(guān)于測定體積的經(jīng)裂解物質(zhì)的轉(zhuǎn)移，這可以通過微控制器控制?；蛘撸D(zhuǎn)移到擴(kuò)增室中的經(jīng)裂解物質(zhì)的體積可以通過擴(kuò)增室的尺寸進(jìn)行控制(例如，調(diào)整大小以包含足夠量的擴(kuò)增混合物和所需量的經(jīng)裂解物質(zhì))。在這種情況中，擴(kuò)增室的入口可以通過允許在擴(kuò)增室填充時(shí)氣體從擴(kuò)增室內(nèi)輸出和液體輸入到擴(kuò)增室中直到擴(kuò)增室被填充的疏水膜覆蓋。

擴(kuò)增室包含使得核酸擴(kuò)增能夠發(fā)生的擴(kuò)增混合物。擴(kuò)增室中存在的擴(kuò)增混合物可以凍干(任選地用pullanin或海藻糖穩(wěn)定)，在該情況中約25-50μl的裂解溶液添加到孔中。擴(kuò)增也可以是在液體形式中，在該情況中約5-10μl的裂解溶液添加到孔中。擴(kuò)增混合物包含用于靶核酸序列的擴(kuò)增的寡核苷酸引物(例如，約0.2-1.8μM)、鏈置換DNA聚合酶如Taq聚合酶(例如，約8單位)、脫氧核苷三磷酸或dNTP(例如，各約15-30mM)、緩沖液(例如，約1X終濃度)、陽離子如鎂(例如，約2.0-8.0mM)。當(dāng)靶核酸是RNA時(shí)，擴(kuò)增混合物另外地包含逆轉(zhuǎn)錄酶。如本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的，寡核苷酸引物選擇為擴(kuò)增來自目標(biāo)微生物的特定靶DNA序列。因此，為擴(kuò)增靶序列，利用與目標(biāo)微生物內(nèi)的DNA序列互補(bǔ)的引物(例如，包含約10至約100個(gè)堿基)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的，擴(kuò)增混合物中寡核苷酸引物的數(shù)量隨使用的擴(kuò)增技術(shù)變化，且可以使用5’-3’定向以及3’-5’定向的引物。在一個(gè)實(shí)施方式中，目標(biāo)微生物是病原生物體，例如但不限于，大腸桿菌(Escherichia coli)、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、艱難梭菌(Clostridium difficile)、肺炎支原體(Mycoplasma pneumonia)、肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae)、沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)、嗜肺軍團(tuán)菌(Legionella pneumophilia)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhea)、鏈球菌屬(Streptococcus sp.)(包括B組鏈球菌感染)、皰疹病毒、乳頭狀瘤病毒、葡萄球菌屬(Staphylococcus sp.)(包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA))、流感病毒、呼吸道合胞體病毒、諾瓦克病毒、西尼羅病毒、登革熱病毒、SARS Co-V、埃博拉病毒、拉沙熱病毒、結(jié)核病毒、HIV、中東呼吸綜合癥冠狀病毒和基孔肯亞病毒。用于擴(kuò)增這些病原體中的一些的引物的實(shí)例可以在表1中發(fā)現(xiàn)。

在一個(gè)實(shí)施方式中，擴(kuò)增通過等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)完成，包括但不限于，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)、交叉引物擴(kuò)增(CPA)、重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)、滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)、賴解旋酶擴(kuò)增(HDA)、信號介導(dǎo)的RNA擴(kuò)增技術(shù)(signal-mediated amplification of RNA technology)(SMART)、切刻酶介導(dǎo)的擴(kuò)增(NEMA)、等溫鏈擴(kuò)增(ICA)、Smart擴(kuò)增(Smart-AMP)、指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)(EXPAR)或網(wǎng)狀分枝擴(kuò)增(RAM)。在擴(kuò)增過程中，腔室使用加熱器如自調(diào)節(jié)加熱器加熱到適合于擴(kuò)增的溫度(例如約58℃-66℃的溫度)足夠的時(shí)間(例如，約15-20分鐘)。加熱器在適宜的時(shí)間激活，例如，在將經(jīng)裂解的材料轉(zhuǎn)移到擴(kuò)增室中時(shí)或略微提前。在一個(gè)實(shí)施方式中，加熱器的激活通過連接于電源的定時(shí)器延遲以防止擴(kuò)增室內(nèi)的過早加熱。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，擴(kuò)增可以通過pH循環(huán)依賴性擴(kuò)增完成。在這種情況中，溶液的pH例如從約pH 3至約pH 8循環(huán)以使核酸變性和復(fù)性，由此允許聚合酶訪問和隨后擴(kuò)增。例如，擴(kuò)增室可以包含氫加載的板而將擴(kuò)增室分成兩個(gè)區(qū)段。通過板任一側(cè)上的兩個(gè)電極產(chǎn)生的電場反復(fù)地牽引氫離子，從而循環(huán)pH。這通過電子或機(jī)械定時(shí)器控制以激活板的任一側(cè)上的電極。

電場擴(kuò)增(EFA)也可以用于核酸擴(kuò)增，從而電場施加以使DNA變性和由此允許聚合酶訪問而無需熱循環(huán)。在這種情況中，約0.01-0.1mV范圍內(nèi)的電場通過使用電源在位于擴(kuò)增室相對側(cè)的電極上施加電壓來產(chǎn)生。電壓使用機(jī)械或電子定時(shí)器以10-20秒的特定時(shí)間間隔激活和關(guān)閉(以導(dǎo)致變性接著復(fù)性和擴(kuò)增)。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，設(shè)備適應(yīng)用于在擴(kuò)增室中進(jìn)行熱循環(huán)PCR擴(kuò)增。對于這一途徑，擴(kuò)增室內(nèi)的自調(diào)節(jié)加熱器使用機(jī)械或電子定時(shí)器以特定時(shí)間間隔(例如，20-40s)激活和關(guān)閉以導(dǎo)致加熱到變性溫度(例如，94-96℃)和冷卻到退火/擴(kuò)增溫度(例如，約70℃)。溫度用連接于微處理器的熱敏電阻監(jiān)測。如本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的，使用的溫度及其時(shí)間間隔可以隨所使用的聚合酶、反應(yīng)中的二價(jià)離子和dNTP的濃度及引物的解鏈溫度而變化。

設(shè)備可任選地包括第二(并行)擴(kuò)增室以擴(kuò)增樣品內(nèi)的核酸序列而用作擴(kuò)增對照。因此，第二擴(kuò)增室包含擴(kuò)增混合物以及針對對照核酸序列的寡核苷酸引物，以使得當(dāng)設(shè)備激活時(shí)，發(fā)生對照序列的擴(kuò)增。盡管可以使用任何合適的對照序列，但如本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的，對照序列的實(shí)例包括人基因如人β-肌動蛋白，以及來自共生細(xì)菌如咽峽炎鏈球菌(Streptococcus anginosus)或表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)的核酸序列。因此，對照序列的擴(kuò)增將確認(rèn)樣品適當(dāng)?shù)孬@得、提取和裂解及擴(kuò)增在設(shè)備內(nèi)適當(dāng)?shù)匕l(fā)生，且缺乏來自目標(biāo)微生物的信號是由于樣品內(nèi)缺乏靶序列，而不是由于設(shè)備的故障。

在擴(kuò)增后，靶核酸的存在可以使用多種方法檢測，包括但不限于：電化學(xué)檢測、側(cè)流檢測、熒光檢測或比色檢測。這一步驟在擴(kuò)增室內(nèi)或在單獨(dú)的檢測室中完成，由此一部分流體使用如前所述供電的微泵輸送到檢測室并使用定時(shí)器延遲流體到檢測室中的輸送直到擴(kuò)增完成。DNA擴(kuò)增的檢測可以在擴(kuò)增室中在檢測傳感器如電化學(xué)檢測器(例如，穩(wěn)壓器)、光檢測器(例如，光電二極管、熒光計(jì))、比色檢測器(例如，照度計(jì))等等的存在下直接進(jìn)行?；蛘?，檢測可以在包括檢測傳感器的單獨(dú)檢測室中進(jìn)行。對于比色檢測，檢測傳感器可以是允許觀看檢測室內(nèi)的顏色改變的窗口。

為實(shí)現(xiàn)靶核酸的檢測，其用DNA-結(jié)合的可檢測標(biāo)記如熒光、化學(xué)發(fā)光和生色標(biāo)記及電化學(xué)檢測標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記。合適的DNA-結(jié)合可檢測標(biāo)記的實(shí)例包括亞甲基藍(lán)染料、隱色結(jié)晶紫、Quant-iT PicoGreen或花色素苷DNA結(jié)合染料。

在一個(gè)實(shí)施方式中，DNA-結(jié)合可檢測標(biāo)記存在于擴(kuò)增混合物中并隨著DNA濃度提高通過嵌入DNA的雙重螺旋中結(jié)合于DNA。添加到擴(kuò)增室的DNA-結(jié)合可檢測標(biāo)記的量是在約5-10μl的范圍內(nèi)的量。標(biāo)記的DNA(例如，DNA/亞甲基藍(lán)復(fù)合物)在電場的存在下與未結(jié)合標(biāo)記(例如，單獨(dú)的亞甲基藍(lán))差異地遷移，這用作DNA濃度的量度。電場通過存在于擴(kuò)增室內(nèi)并浸沒于樣品中的電極提供。電極連接于提供電壓的穩(wěn)壓器，之后測量陽極峰電流并傳送至內(nèi)置或外部微處理器。

DNA擴(kuò)增可以使用DNA結(jié)合熒光染料監(jiān)測。合適的DNA-結(jié)合熒光染料的實(shí)例包括SYBR綠、CYTO9、羥基萘酚藍(lán)(hydroxynapthol blue)或Quant-iT PicoGreen，其在擴(kuò)增室中或在單獨(dú)的檢測室中。用于檢測的DNA-結(jié)合熒光染料的量是約5-10μl范圍中的量。該設(shè)備可以配備與擴(kuò)增或檢測室連接的熒光檢測器，及處理單元以提供經(jīng)處理的輸出。或者，來自檢測器的信號可以傳送到外部處理單元以提供處理的輸出。

DNA的擴(kuò)增可以使用金納米顆粒、脫氧核酶(DNAzymes)或如上所述的DNA結(jié)合染料比色檢測，其在DNA存在的情況下引發(fā)顏色變化。這種顏色變化可以通過允許觀看到檢測室內(nèi)部的窗口人工(通過眼睛)檢測、使用連接于檢測或擴(kuò)增室的內(nèi)置比色檢測器檢測或者使用檢測室如所述地與其連接的外加檢測裝置檢測，例如，以通過顏色變化的分析(如RGB分析)來分析在與比色標(biāo)記反應(yīng)后溶液的彩色圖像。這也可以通過使匹配色光照射到最終擴(kuò)增反應(yīng)混合物上并用光度計(jì)監(jiān)測作為輸出的顏色強(qiáng)度來完成。

擴(kuò)增的DNA可以在擴(kuò)增室或檢測室中使用側(cè)流分析檢測。使用側(cè)流分析進(jìn)行檢測的多種配置是可能的。在一個(gè)實(shí)施方式中，擴(kuò)增的DNA用配體(例如，生物素或另一配體)和對于靶核酸的標(biāo)記的寡核苷酸引物進(jìn)行標(biāo)記(例如，用熒光素標(biāo)記如6-羧基熒光素或異硫氰酸熒光素(FITC)或者另一標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記)，隨后使用該配體的結(jié)合劑(例如，抗生物素蛋白或鏈霉親和素)復(fù)合并通過固定的抗體(例如，抗-FITC抗體)捕獲。如上所述，捕獲的擴(kuò)增DNA然后基于所使用的標(biāo)記進(jìn)行檢測，例如，通過熒光或比色信號，如上所述。

在該設(shè)備的另一實(shí)施方式中，檢測在含有DNA結(jié)合染料(其不可能在擴(kuò)增過程中存在)(例如，Hersch染料)的單獨(dú)檢測室中進(jìn)行。用于檢測的DNA-結(jié)合染料的量是約5-10μl范圍內(nèi)的量。DNA結(jié)合如對于亞甲基藍(lán)DNA結(jié)合所述的在電場的存在下通過電化學(xué)檢測進(jìn)行監(jiān)測。

檢測室可以任選地是可移除地連接于設(shè)備外部的適合于后續(xù)分析的小瓶。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，該設(shè)備可以適應(yīng)以使得在單一室中進(jìn)行裂解、擴(kuò)增和檢測。為此，含有臨床樣品的媒介浸入包含擴(kuò)增混合物(例如，熱穩(wěn)定DNA聚合酶和/或用于RNA靶的逆轉(zhuǎn)錄酶、鎂、核苷酸、用于特定靶標(biāo)的核酸引物和DNA結(jié)合染料)的單一室中。包括自調(diào)節(jié)加熱器的腔室通過定時(shí)器激活以加熱到約95℃的溫度而裂解病原體?；蛘?，游離DNA/RNA被擴(kuò)增而無需加熱到95℃。在這種情況中，加熱步驟可以省略。加熱器然后關(guān)閉以允許冷卻整個(gè)樣品到約50-70℃的溫度用于DNA擴(kuò)增。在DNA擴(kuò)增后，DNA結(jié)合染料與任何擴(kuò)增的DNA反應(yīng)并導(dǎo)致單一室內(nèi)的顏色變化，其可以如前所述進(jìn)行檢測。

在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，該設(shè)備可以適應(yīng)以使得裂解和擴(kuò)增在單一室中發(fā)生，而檢測在單獨(dú)的檢測室中發(fā)生。在這種情況中，裂解-擴(kuò)增室包含自調(diào)節(jié)加熱器，其使用機(jī)械或電子定時(shí)器以特定時(shí)間間隔激活和關(guān)閉以允許加熱到變性溫度(例如，95℃)和冷卻到擴(kuò)增溫度(例如，約70℃)。擴(kuò)增的DNA然后可以例如通過泵轉(zhuǎn)運(yùn)到單獨(dú)的檢測室中用于如前所述的檢測。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，該設(shè)備可以適應(yīng)以檢測兩種或更多種微生物，例如兩種或更多種病原體。在這一實(shí)施方式中，該設(shè)備可以包括兩個(gè)或更多個(gè)擴(kuò)增室，各適應(yīng)于擴(kuò)增不同目標(biāo)生物體的核酸。因此，設(shè)備的這一實(shí)施方式的各擴(kuò)增室將包含靶向于不同微生物的擴(kuò)增混合物，包含用于所靶向的微生物的寡核苷酸引物。例如，第一擴(kuò)增室可以包含用于大腸桿菌的寡核苷酸引物，而第二擴(kuò)增室包含用于單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的寡核苷酸引物，和第三擴(kuò)增室包含用于金黃色葡萄球菌(S.aureus)的寡核苷酸引物。在另一實(shí)例中，該設(shè)備可以包括靶向于各種皮膚感染的擴(kuò)增室如皰疹、乳頭狀瘤病毒和金黃色葡萄球菌。該設(shè)備可以適應(yīng)以用于第三世界國家，并包括各適應(yīng)于鑒別相關(guān)目標(biāo)生物體(如，但不限于登革熱病毒、SARS Co-V、埃博拉病毒、拉沙熱病毒、結(jié)核病毒和/或HIV)的擴(kuò)增室。

該設(shè)備的檢測傳感器可以適應(yīng)于與可操作以接收由檢測傳感器提供的信號和將該信號翻譯成所需輸出的信號處理單元連接。因此，如果需要，信號處理單元可操作以將由檢測傳感器提供的輸出數(shù)字化成可以呈現(xiàn)于例如顯示器(例如，監(jiān)視器等)上的可記錄輸出。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，診斷分析的結(jié)果可以傳輸?shù)絻?nèi)置智能閱讀器供用戶察看結(jié)果。信號處理單元可以以包括用于翻譯來自檢測傳感器的輸出的任何所需轉(zhuǎn)換器(模-數(shù)轉(zhuǎn)換器)的微處理器(例如，數(shù)字信號處理器)的形式或用于數(shù)字化來自檢測傳感器的信號的數(shù)據(jù)采集卡的形式包括在設(shè)備內(nèi)?；蛘?，信號處理單元可以是外部處理系統(tǒng)。在這樣的實(shí)施方式中，該設(shè)備配備有用于與外部處理系統(tǒng)通訊的端口。該端口可以是可起到將電力從外部處理系統(tǒng)傳輸?shù)皆撛O(shè)備和將來自檢測傳感器的輸出傳輸?shù)酵獠刻幚硐到y(tǒng)用于信號處理的作用的物理端口(例如，USB端口)?；蛘?，端口可以是無線通訊端口，例如使用WiFi或藍(lán)牙協(xié)議，其起到將來自檢測傳感器的輸出傳輸?shù)酵獠刻幚硐到y(tǒng)用于信號處理的作用。外部處理系統(tǒng)的實(shí)例包括個(gè)人計(jì)算機(jī)、個(gè)人數(shù)字助理、網(wǎng)絡(luò)化移動無線遠(yuǎn)程通信計(jì)算裝置如智能手機(jī)和內(nèi)容播放器。

用于實(shí)施信號處理單元的本技術(shù)的方面可以在系統(tǒng)、方法、計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品或其任何組合內(nèi)實(shí)現(xiàn)。計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品可以包括在其上具有計(jì)算機(jī)可讀程序指令的一種或多種計(jì)算機(jī)可讀存儲介質(zhì)，該計(jì)算機(jī)可讀程序指令導(dǎo)致處理器完成本技術(shù)的方面。計(jì)算機(jī)可讀存儲介質(zhì)可以是可保持和存儲由指令執(zhí)行裝置使用的指令的有形裝置。計(jì)算機(jī)可讀存儲介質(zhì)可以是，例如，但不限于電子存儲裝置、磁存儲裝置、光存儲裝置、電磁存儲裝置、半導(dǎo)體存儲裝置或前述的任意合適的組合。

計(jì)算機(jī)可讀存儲介質(zhì)的更具體實(shí)例的非窮盡列表包括以下：便攜計(jì)算機(jī)磁盤、硬盤、隨機(jī)存取存儲器(RAM)、只讀存儲器(ROM)、可擦除可編程只讀存儲器(EPROM或閃存)、靜態(tài)隨機(jī)存取存儲器(SRAM)、便攜只讀光盤存儲器(CD-ROM)、數(shù)字通用光盤(DVD)、記憶棒、軟盤、具有記錄于其上的指令的機(jī)械編碼裝置如穿孔卡片或槽中凸起結(jié)構(gòu)(raised structures in a groove)及前述的任意合適組合。如本文中使用的，計(jì)算機(jī)可讀存儲介質(zhì)不理解為是瞬時(shí)信號本身，如無線電波或其它自由傳播電磁波、通過波導(dǎo)或其它傳輸介質(zhì)傳播的電磁波(例如，通過光纖電纜的光脈沖)或通過電線傳輸?shù)碾娦盘枴?/p>

本文描述的計(jì)算機(jī)可讀程序指令可以從計(jì)算機(jī)可讀存儲介質(zhì)下載到相應(yīng)的計(jì)算/處理裝置或者經(jīng)由網(wǎng)絡(luò)(例如，互聯(lián)網(wǎng)、局域網(wǎng)、廣域網(wǎng)和/或無線網(wǎng)絡(luò))下載到外部計(jì)算機(jī)或外部存儲裝置。網(wǎng)絡(luò)可以包括銅傳輸電纜、光傳輸纖維、無線傳輸、路由器、防火墻、交換器、網(wǎng)關(guān)計(jì)算機(jī)和/或邊緣服務(wù)器。各計(jì)算/處理裝置中的網(wǎng)絡(luò)適配卡或網(wǎng)絡(luò)接口從網(wǎng)絡(luò)接收計(jì)算機(jī)可讀程序指令并轉(zhuǎn)發(fā)計(jì)算機(jī)可讀程序指令用于存儲到相應(yīng)計(jì)算/處理裝置內(nèi)的計(jì)算機(jī)可讀存儲介質(zhì)中。

用于進(jìn)行本技術(shù)的操作的計(jì)算機(jī)可讀程序指令可以是匯編指令、指令集架構(gòu)(ISA)指令、機(jī)器指令、機(jī)器相關(guān)指令(machine dependent instructions)、微碼、固件指令、狀態(tài)設(shè)置數(shù)據(jù)(state-setting data)或者以一種或多種編程語言(包括面向?qū)ο蟮木幊陶Z言或常規(guī)過程式編程語言)的任何組合編寫的源代碼或目標(biāo)代碼。計(jì)算機(jī)可讀程序指令可以完全地在用戶的計(jì)算機(jī)上、部分地在用戶的計(jì)算機(jī)上、作為獨(dú)立的軟件包、部分地在用戶的計(jì)算機(jī)上和部分地在遠(yuǎn)程計(jì)算機(jī)上執(zhí)行或者完全地在遠(yuǎn)程計(jì)算機(jī)或服務(wù)器上執(zhí)行。在后一情形中，遠(yuǎn)程計(jì)算機(jī)可以通過任何類型的網(wǎng)絡(luò)(包括局域網(wǎng)(LAN)或廣域網(wǎng)(WAN))連接于用戶的計(jì)算機(jī)，或者可以進(jìn)行到外部計(jì)算機(jī)的連接(例如，利用互聯(lián)網(wǎng)服務(wù)提供商(Internet Service Provider)通過互聯(lián)網(wǎng)連接)。在一些實(shí)施方式中，包括例如可編程邏輯電路、現(xiàn)場可編程門陣列(FPGA)或可編程序邏輯陣列(PLA)的電子電路可以通過利用計(jì)算機(jī)可讀程序指令的狀態(tài)信息使電子電路個(gè)性化來執(zhí)行計(jì)算機(jī)可讀程序指令，從而實(shí)施本技術(shù)的方面。

這些計(jì)算機(jī)程序指令也可以存儲在可指導(dǎo)計(jì)算機(jī)、其它可編程數(shù)據(jù)處理設(shè)備或其它裝置的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)中而以特定的方式發(fā)揮功能，以使得存儲在計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)中的指令產(chǎn)生包括指令的制品，該指令實(shí)施在一個(gè)或多個(gè)流程和/或框圖模塊中指定的功能/活動。計(jì)算機(jī)程序指令也可以加載到計(jì)算機(jī)、其它可編程數(shù)據(jù)處理設(shè)備或其它裝置上以導(dǎo)致一系列的操作步驟在計(jì)算機(jī)、其它可編程數(shù)據(jù)處理設(shè)備或其它裝置上執(zhí)行而產(chǎn)生計(jì)算機(jī)執(zhí)行的過程，以使得在計(jì)算機(jī)或其它可編程設(shè)備上執(zhí)行的指令提供用于實(shí)施在一個(gè)或多個(gè)流程和/或框圖模塊中指定的功能/活動的過程。

關(guān)于本文描述的技術(shù)的方面可以用于實(shí)施(例如，其可以作為信號處理單元發(fā)揮功能)的說明性計(jì)算機(jī)系統(tǒng)在圖7中作為框圖呈現(xiàn)。說明性計(jì)算機(jī)系統(tǒng)總體上通過附圖標(biāo)記800表示且包括顯示器802、鍵盤804A和點(diǎn)擊裝置804B形式的輸入裝置、計(jì)算機(jī)806和外部設(shè)備808。盡管點(diǎn)擊裝置804B描繪為鼠標(biāo)，但應(yīng)理解也可以使用其它類型的點(diǎn)擊裝置。

計(jì)算機(jī)806可以包含一個(gè)或多個(gè)處理器或微處理器，如中央處理單元(CPU)810。CPU 810執(zhí)行算術(shù)計(jì)算和控制函數(shù)以執(zhí)行在內(nèi)部存儲器812，優(yōu)選隨機(jī)存取存儲器(RAM)和/或只讀存儲器(ROM)，及可能的附加存儲器814中的軟件。附加存儲器814可以包括，例如，大容量存儲裝置、硬盤驅(qū)動器、光盤驅(qū)動器(包括CD和DVD驅(qū)動器)、磁盤驅(qū)動器、磁帶驅(qū)動器(包括LTO、DLT、DAT和DCC)、閃存盤、程序盒和盒式接口如視頻游戲裝置中存在的那些、可移除存儲芯片如EPROM或PROM、新興存儲介質(zhì)如全息存儲或如本領(lǐng)域中已知的類似存儲介質(zhì)。這種附加存儲器814對于計(jì)算機(jī)806可以是物理內(nèi)部的，或如圖7中所示是外部的，或者兩者。

計(jì)算機(jī)系統(tǒng)800還可以包括用于允許計(jì)算機(jī)程序或其它指令被加載的其它類似裝置。這類裝置可包括，例如，允許軟件和數(shù)據(jù)在計(jì)算機(jī)系統(tǒng)800與外部系統(tǒng)和網(wǎng)絡(luò)之間傳輸?shù)耐ㄓ嵔涌?16。通訊接口816的實(shí)例可以包括調(diào)制解調(diào)器、網(wǎng)絡(luò)接口如以太網(wǎng)卡、無線通訊接口或者串聯(lián)或并聯(lián)通訊端口。經(jīng)由通訊接口816傳輸?shù)能浖蛿?shù)據(jù)是能夠被通訊接口816接收的可以作為電子、聲、電磁、光或其它信號的信號形式。當(dāng)然，可以在單一計(jì)算機(jī)系統(tǒng)800上提供多個(gè)接口。

計(jì)算機(jī)806的輸入和輸出通過輸入/輸出(I/O)接口818執(zhí)行。這一I/O接口818實(shí)施顯示器802、鍵盤804A、外部設(shè)備808和計(jì)算機(jī)系統(tǒng)800的其它這類部件的控制。計(jì)算機(jī)806也包括圖形處理單元(GPU)820。后者也可以作為用于數(shù)學(xué)計(jì)算的(CPU)810的附加或替代(CPU)810用于計(jì)算目的。

計(jì)算機(jī)系統(tǒng)800的各種部件直接地或通過與合適的總線耦合而彼此偶聯(lián)。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，結(jié)果可以使用網(wǎng)絡(luò)化的移動無線遠(yuǎn)程通訊計(jì)算裝置(如裝有用于解釋結(jié)果的特定應(yīng)用的智能手機(jī))來解釋。圖9顯示智能手機(jī)900形式的示例性網(wǎng)絡(luò)化移動無線遠(yuǎn)程通訊計(jì)算裝置；該智能手機(jī)900可以作為信號處理單元發(fā)揮功能。智能手機(jī)900包括顯示器902、鍵盤904形式的輸入裝置和內(nèi)置計(jì)算機(jī)系統(tǒng)906。顯示器902可以是觸屏顯示器且由此用作附加的輸入裝置，或作為鍵盤904的替代。內(nèi)置計(jì)算機(jī)系統(tǒng)906包括具有一個(gè)或多個(gè)用于執(zhí)行算術(shù)計(jì)算和控制函數(shù)的處理器或微處理器的中央處理器(CPU)910，以執(zhí)行在內(nèi)部存儲器912，優(yōu)選隨機(jī)存取存儲器(RAM)和/或只讀存儲器(ROM)，中的軟件，其與通常包括閃存的附加存儲器914耦合，該附加存儲器可以集成到智能手機(jī)900中或可以包含可移除的閃存卡或兩者。智能手機(jī)900也包括通訊接口916，其允許軟件和數(shù)據(jù)在智能手機(jī)900與外部系統(tǒng)和網(wǎng)絡(luò)之間傳輸。通訊接口916與一個(gè)或多個(gè)無線通訊模塊924耦合，其通常包括用于連接于蜂窩網(wǎng)絡(luò)、無線數(shù)字網(wǎng)絡(luò)或Wi-Fi網(wǎng)絡(luò)的一個(gè)或多個(gè)的無線電波。通訊接口916通常也能夠?qū)崿F(xiàn)智能手機(jī)900與外部計(jì)算機(jī)系統(tǒng)的有線連接。麥克風(fēng)926和揚(yáng)聲器928與內(nèi)置計(jì)算機(jī)系統(tǒng)906耦合以支持由內(nèi)置計(jì)算機(jī)系統(tǒng)906管理的電話功能，且GPS接收器硬件922也可以與通訊接口916耦合以支持內(nèi)置計(jì)算機(jī)系統(tǒng)906的導(dǎo)航操作。內(nèi)置計(jì)算機(jī)系統(tǒng)906的輸入和輸出通過輸入/輸出(I/O)接口918執(zhí)行，其實(shí)施顯示器902、鍵盤904、麥克風(fēng)926和揚(yáng)聲器928的控制。內(nèi)置計(jì)算機(jī)系統(tǒng)906還可以包括單獨(dú)的圖形處理單元(GPU)920。各種部件直接地或通過與合適的總線耦合彼此偶聯(lián)。

如本文中使用的，術(shù)語“計(jì)算機(jī)系統(tǒng)”及相關(guān)術(shù)語不限于任何特定類型的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，且包括服務(wù)器、臺式計(jì)算機(jī)、手提電腦、網(wǎng)絡(luò)化移動無線遠(yuǎn)程通訊計(jì)算裝置如智能手機(jī)、平板電腦以及其它類型的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)。

因此，用于實(shí)施本文描述的技術(shù)的方面的計(jì)算機(jī)可讀程序代碼可以包含或存儲在智能手機(jī)900的內(nèi)置計(jì)算機(jī)系統(tǒng)906的存儲器912中或計(jì)算機(jī)806的存儲器812中，或者在智能手機(jī)900的內(nèi)置計(jì)算機(jī)系統(tǒng)906或計(jì)算機(jī)906外部的計(jì)算機(jī)可用或計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)上，或其任何組合上。

因此，在該設(shè)備的一個(gè)實(shí)施方式中，診斷結(jié)果使用有線或無線連接發(fā)送到智能手機(jī)、手提電腦或任何合適的計(jì)算裝置。計(jì)算裝置包括可以對用戶解釋和呈現(xiàn)診斷信息的軟件。另外，PON診斷平臺可以使用內(nèi)置電池電源通過DC電源適配器供電，或者通過智能手機(jī)、計(jì)算機(jī)或其它裝置經(jīng)USB或其它合適的連接供電。

在該設(shè)備的另一實(shí)施方式中，可提供直接對用戶分析/解釋/顯示即時(shí)檢測(POCT)結(jié)果的內(nèi)置閱讀器。

在一個(gè)實(shí)施方式中，各設(shè)備包括射頻身份識別(RFID)標(biāo)簽以允許追蹤和數(shù)據(jù)分析。

潛在應(yīng)用

提供了一次性的經(jīng)濟(jì)的POC設(shè)備，其具有在寬范圍的行業(yè)和部門內(nèi)的應(yīng)用。起始，該設(shè)備有利地制造為一次性的而保持制造成本為可控的，避免在使用后清潔該設(shè)備的必要和避免由進(jìn)一步操作已使用的設(shè)備導(dǎo)致可能的病原體感染的擴(kuò)散。在使用后，該設(shè)備可利用建立為避免感染擴(kuò)散的方案來處置。

這種POC設(shè)備的一種用途是快速檢測病原體微生物。例如，POC設(shè)備可以用于檢測病原體微生物，例如但不限于，大腸桿菌、單核細(xì)胞增多李斯特氏菌、艱難梭菌、肺炎支原體、肺炎衣原體、沙眼衣原體、嗜肺軍團(tuán)菌、淋病奈瑟氏菌、鏈球菌、葡萄球菌、流感病毒、呼吸道合胞體病毒、諾瓦克病毒、西尼羅病毒、登革熱病毒、SARS Co-V、埃博拉病毒、拉沙熱病毒、結(jié)核病毒、HIV或中東呼吸綜合征冠狀病毒。

因此，本POC設(shè)備特別可用于在不能利用中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分子檢驗(yàn)的資源貧乏的情況中檢測傳染病。例如，這一設(shè)備可用于在非洲檢測傳染病(例如，使用直腸拭子檢測腹瀉病)或HIV。POC設(shè)備可用于在食品加工廠中檢驗(yàn)表面的李斯特氏菌或大腸桿菌污染。POC設(shè)備可用于在食品加工廠中的實(shí)時(shí)污染監(jiān)測和確保清潔過程中的滅菌及防止食品相關(guān)的胃腸疾病的爆發(fā)。POC設(shè)備的另一應(yīng)用是檢測動物中的疾病，如由獸醫(yī)檢測豬中的豬呼吸道病毒，其嚴(yán)重地影響?zhàn)B豬業(yè)。這一設(shè)備也可以用于在護(hù)理和老年療養(yǎng)院中或者在病人入院時(shí)監(jiān)測醫(yī)源性(醫(yī)院獲得性)感染。這一設(shè)備的另一應(yīng)用是性傳播感染如衣原體的家庭檢驗(yàn)。女人可以獲取陰道拭子(其對于衣原體檢測是高度靈敏的)，且使用POC設(shè)備進(jìn)行分析。這一設(shè)備也可以用于在大的群體中的實(shí)時(shí)監(jiān)視和爆發(fā)控制。另外，其可以用于對登機(jī)或下機(jī)的乘客進(jìn)行呼吸道病毒檢驗(yàn)。

本發(fā)明的實(shí)施方式在以下具體實(shí)施例中描述，該實(shí)施例不認(rèn)為是限制性的。

實(shí)施例1–用于病原體檢測的PON設(shè)備

設(shè)備設(shè)計(jì)

提供了手持的一次性設(shè)備10(圖1B)。該設(shè)備10包括具有最大約250μl的容積的第一提取室12。提取室12包含具有0.1％Triton X-100的PBS的裂解試劑。提取室12包含用于接受含樣品拭子的頭部的開口11且提取室12大小調(diào)節(jié)為接受拭子。蓋13提供為密封提取室12的開口11。蓋13的封閉通過導(dǎo)致緩沖液從泡罩包裝釋放到提取室12中而激活設(shè)備10。提取室12配備有在封閉蓋13時(shí)激活的第一自調(diào)節(jié)加熱器14，其加熱提取室12到約95℃的溫度并維持這一溫度至少2分鐘，例如，通過使用定時(shí)器。加熱器14連接于控制單元30并通過電池34供電。

提取室12通過微流體通道16連接于擴(kuò)增室20。泵裝置18，例如，微泵或注射器，位于微流體通道16內(nèi)并起到將經(jīng)裂解物質(zhì)從提取室12移動到擴(kuò)增室20的作用。泵18連接于控制單元30并通過電池34供電?？刂茊卧舶―/A轉(zhuǎn)換器15用于溫度和/或電位控制，及包括A/D轉(zhuǎn)換器25以將模擬檢測信號轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號。定時(shí)器在適當(dāng)時(shí)間激活泵18。擴(kuò)增室20包含通過如所述的定時(shí)器激活的第二自調(diào)節(jié)加熱器22，其維持?jǐn)U增室20內(nèi)的溫度在62℃下20分鐘以允許等溫?cái)U(kuò)增，包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)、交叉引物擴(kuò)增(CPA)、重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)、滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)、賴解旋酶擴(kuò)增(HDA)、信號介導(dǎo)的RNA擴(kuò)增技術(shù)(SMART)、切刻酶介導(dǎo)的擴(kuò)增(NEMA)、等溫鏈擴(kuò)增(ICA)、Smart擴(kuò)增(Smart-AMP)、指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)(EXPAR)、網(wǎng)狀分枝擴(kuò)增(RAM)或缺口末端擴(kuò)增反應(yīng)(nicking end amplification reaction)(NEAR)。

一旦經(jīng)裂解材料隨時(shí)間冷卻到約62℃的目標(biāo)溫度，5-10μl的經(jīng)裂解材料通過泵18轉(zhuǎn)移到擴(kuò)增室20。經(jīng)裂解材料在擴(kuò)增室內(nèi)用第二自調(diào)節(jié)加熱器24維持在約62℃。第二加熱器24連接于控制單元30并通過電池34供電。擴(kuò)增室包含鹽緩沖劑、DNA聚合酶、5mM MgSO₄和靶特異性引物的擴(kuò)增主混合物，例如，15μl的鹽緩沖劑溶液、1μl的聚合酶和4μl的特異性引物，以及5-10μl的DNA結(jié)合染料(Quant-iT PicoGreen、羥基萘酚藍(lán)和隱色三苯基甲烷(leuco triphenylmethane)染料)。

擴(kuò)增室20包含檢測傳感器26，其可以是用于RGB分析的色度計(jì)、用熒光染料檢測擴(kuò)增后的熒光變化的熒光計(jì)、用亞甲基藍(lán)進(jìn)行樣品的電化學(xué)分析的電位計(jì)或分析視覺顏色變化的透明觀察端口。

在圖1A中顯示的替代實(shí)施方式中，擴(kuò)增室20通過微流體通道28連接于單獨(dú)的檢測室50，且檢測室50包含檢測傳感器26。

裂解驗(yàn)證

為確認(rèn)提取室可以使用自調(diào)節(jié)加熱器達(dá)到目標(biāo)溫度(93℃)并維持該溫度兩分鐘，使用熱電偶監(jiān)測溫度20分鐘。測試不同電阻(3.8歐姆、3.5歐姆和3.4歐姆)。所有測量在用熱膠粘附于耦合的PTC加熱器的錫箔室中進(jìn)行。為進(jìn)一步確認(rèn)這些條件足以裂解各種臨床樣品，包含呼吸道合胞體病毒A(RSV-A)、無乳鏈球菌和流感病毒H1的拭子各自置于含有250μl具有0.1％Triton-X100的PBS的提取室中并裂解3分鐘，接著在熒光計(jì)，Genie II儀上使用擴(kuò)增混合物，Optigene Lamp主混合物擴(kuò)增。在各種情況中擴(kuò)增時(shí)間與未裂解的對照比較。在各種情況中使用的來自表1的寡核苷酸引物如下：用于RSV-A的具有SEQ ID NO:20、21、22、23和24的引物，用于無乳鏈球菌的具有SEQ ID NO:32、33、34、35和36的引物，和用于流感病毒H1的具有SEQ ID NO:7、8、9、10和11的序列的引物。

擴(kuò)增驗(yàn)證

為確認(rèn)擴(kuò)增室20達(dá)到所需溫度(62℃)并維持這一溫度20分鐘，熱敏電阻用于隨時(shí)間監(jiān)測室20溫度。使用8.6歐姆的固定電阻，溫度監(jiān)測20分鐘。為進(jìn)一步確認(rèn)樣品在這些條件下成功地?cái)U(kuò)增，RSV-A、無乳鏈球菌和流感病毒H1在95℃下在加熱塊上熱裂解10分鐘并在含有15μl的Optigene主混合物和5μl的如上所述的特異性引物的擴(kuò)增室20中擴(kuò)增15分鐘。樣品然后從擴(kuò)增室移除，與10μl的SYBR綠DNA結(jié)合染料混合，并與未擴(kuò)增的陰性對照相比在Genie II儀上測定500-520nm之間的終點(diǎn)熒光。

檢測

為評估擴(kuò)增的DNA是否可以目視或使用電化學(xué)檢測方式進(jìn)行檢測，使用了多種DNA結(jié)合染料(包括Quant-iT PicoGreen(Life Technologies)、羥基萘酚藍(lán)、隱色三苯基甲烷染料和亞甲基藍(lán))。大約100拷貝的RSV-A、無乳鏈球菌或流感病毒H1使用包括如上所述的引物的擴(kuò)增混合物，Optigene LAMP主混合物進(jìn)行擴(kuò)增，之后擴(kuò)增的物質(zhì)在室溫下與10μl的單個(gè)DNA結(jié)合染料混合3分鐘。對于Quant-iT PicoGreen、羥基萘酚藍(lán)和隱色三苯基甲烷染料，由至少10個(gè)個(gè)體觀察染料顏色的視覺變化。對于亞甲基藍(lán)，檢測使用利用PalmSens穩(wěn)壓器的循環(huán)伏安法基于樣品中陽極峰電流的變化實(shí)現(xiàn)并與擴(kuò)增前的基線讀數(shù)比較。

樣品分析

大約500個(gè)無乳鏈球菌細(xì)胞、RSV-A顆粒或流感病毒H1顆粒應(yīng)用于相應(yīng)的鼻咽拭子以模擬來自感染患者的臨床拭子樣品。拭子置于提取或設(shè)備10的提取室12中。提取室12包含250μl的磷酸鹽緩沖鹽水和0.1％Triton X-100，其隨后使用自調(diào)節(jié)加熱裝置加熱到95℃。這一溫度維持3分鐘，之后25μl的裂解溶液使用移液管轉(zhuǎn)移到設(shè)備10的擴(kuò)增室22。25μl的裂解溶液與含有來自Geobacillus的鏈置換DNA聚合酶、靶向特定無乳鏈球菌、RSV-A或流感病毒H1基因的引物(如上所述)(總共5μl)、5μl的dNTP、1μl的MgSO₄和15μl的鹽緩沖劑(pH 9.2)的LAMP擴(kuò)增緩沖液混合。擴(kuò)增室22使用自調(diào)節(jié)加熱器維持在63℃ 20分鐘以允許擴(kuò)增發(fā)生。擴(kuò)增使用熒光染料(10μl的SYBR綠)監(jiān)測，且擴(kuò)增在14分鐘內(nèi)可檢測。從臨床拭子檢測表皮葡萄球菌的總時(shí)間是19分鐘，其包括5分鐘樣品釋放和裂解步驟。

也使用DNA擴(kuò)增的電化學(xué)檢測。在擴(kuò)增室22中63℃下溫育20分鐘后，樣品使用亞甲基藍(lán)檢測和利用PalmSens穩(wěn)壓器的循環(huán)伏安法進(jìn)行分析，并與在擴(kuò)增前獲取的基線讀數(shù)比較。陽極峰電流的降低指示擴(kuò)增。兩個(gè)不同濃度的亞甲基藍(lán)(MB)用于檢測500ng的擴(kuò)增DNA。單獨(dú)的亞甲基藍(lán)用作對照。

結(jié)果

自調(diào)節(jié)加熱的分析

精確溫度控制在設(shè)備10中對于傳染性材料裂解和DNA擴(kuò)增進(jìn)行確認(rèn)。使用了維持提取室中的溫度在93℃和擴(kuò)增室中的溫度在62℃的自調(diào)節(jié)加熱器。對于裂解溫度，測試各種不同電阻以調(diào)查自調(diào)節(jié)加熱器是否可以在室溫下的各種條件下適當(dāng)?shù)匕l(fā)揮功能。據(jù)發(fā)現(xiàn)93℃的溫度在所有測試的電阻下維持超過20分鐘(圖2)。對于擴(kuò)增溫度，62℃的溫度可以在8.6歐姆下維持20分鐘(圖3)。基于這些結(jié)果，自調(diào)節(jié)加熱器確定為足以維持用于裂解和擴(kuò)增的溫度。

樣品裂解的評估

為確認(rèn)設(shè)備10在93℃下3分鐘內(nèi)足以裂解臨床材料和使臨床樣本滅菌，呼吸道合胞體病毒(RSV)、流感病毒、大腸桿菌和肺炎鏈球菌單獨(dú)地引入設(shè)備10的提取室12中用于后續(xù)分析。首先確定病毒和細(xì)菌在提取室12中殺死以確保該設(shè)備在使用后不具有生物危害性。為做到這一點(diǎn)，10,000個(gè)細(xì)菌或病毒顆粒引入提取室中，進(jìn)行裂解和隨后基于平板接種試驗(yàn)(對于細(xì)菌)或通過感染和細(xì)胞培養(yǎng)(對于病毒)進(jìn)行分析。在暴露于提取室12后沒有傳染性顆粒保留，表明暴露于93℃ 3分鐘殺死100％的病毒或細(xì)菌。然后確定這些條件釋放可以用于DNA擴(kuò)增的細(xì)胞內(nèi)DNA和RNA。在各樣品裂解后，所得的DNA或RNA與陽性裂解對照(珠裂解)相比在Genie II儀器上使用LAMP進(jìn)行分析。據(jù)發(fā)現(xiàn)LAMP可以檢測來自所有四個(gè)樣本的釋放核酸，表明提取室可用于釋放核酸以進(jìn)行后續(xù)分析。

原位等溫DNA擴(kuò)增的評估

為確認(rèn)等溫?cái)U(kuò)增可以在設(shè)備10中進(jìn)行，RSV、流感病毒、大腸桿菌和肺炎鏈球菌樣品進(jìn)行珠裂解并在擴(kuò)增室22內(nèi)擴(kuò)增。樣品隨后基于使用Sybr綠DNA結(jié)合染料的終點(diǎn)熒光進(jìn)行分析。所有樣本在10分鐘內(nèi)在擴(kuò)增室中擴(kuò)增(圖4)。

原位DNA檢測

DNA的檢測通過使用Quant-It PicoGreen DNA結(jié)合染料的視覺顏色和通過使用亞甲基藍(lán)的電位測定法兩者進(jìn)行。為做到這一點(diǎn)，

擴(kuò)增的DNA與Quant-It PicoGreen或亞甲基藍(lán)染料混合并分別目視地或使用電位測定法進(jìn)行分析。對于目視檢測，DNA存在下的顏色變化且不存在DNA的情況下缺乏顏色變化可通過裸眼檢測(圖5)。對于亞甲基藍(lán)(MB)DNA檢測，測定在DNA存在和不存在的情況下的陽極峰電流。陽極峰電流的20-25％的顯著降低在DNA存在的情況下觀察到，這指示DNA擴(kuò)增(圖6)。在較低MB濃度(0.1μM)下，與DNA存在的情況下的較高M(jìn)B濃度(1μM)相比存在陽極峰電流的更高降低。

臨床分析

設(shè)備10使用臨床流感鼻咽拭子、RSV鼻咽拭子和鏈球菌喉拭子進(jìn)行測試。拭子從基于培養(yǎng)方法已知陽性的感染患者獲得。拭子然后插入到設(shè)備10的提取室12中。提取室填充250μl的PBS并在93℃下加熱3分鐘。隨后，裂解的材料泵送到擴(kuò)增室22中，其在此處與LAMP主混合物混合。擴(kuò)增室22然后激活15分鐘(加熱到62℃)且DNA在與Quant-It PicoGreen DNA結(jié)合染料混合后在觀察小瓶中目視檢測。傳染物質(zhì)使用該設(shè)備在20分鐘內(nèi)檢測。

表1.用于等溫?cái)U(kuò)增和各種病毒和細(xì)胞病原體的檢測的寡核苷酸引物

表1中示例的引物按照通過引入并入本文的以下參考文獻(xiàn)使用：

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本文中使用的術(shù)語僅用于描述特定實(shí)施方式的目的且不意圖是限制的。如本文中使用的，單數(shù)形式“一(a和an)”和“該”意圖也包括復(fù)數(shù)形式，除非上下文明確表明其它情況。應(yīng)進(jìn)一步理解，術(shù)語“包含”和/或“包括”在用于本說明書中時(shí)指定所陳述的特征、整體、步驟、操作、元件和/或組分的存在，但不排除一個(gè)或多個(gè)其它特征、整體、步驟、操作、元件、組分和/或其組合的存在或添加。

以下權(quán)利要求中所有手段或步驟加功能元件的對應(yīng)結(jié)構(gòu)、材料、活動和等同物意圖包括用于與具體要求保護(hù)的其它要求元件結(jié)合以執(zhí)行功能的任何結(jié)構(gòu)、材料或活動。說明書用于說明和描述的目的提供，而不意圖是窮盡的或限制于所公開的形式。許多改進(jìn)和變化對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是明顯的而不脫離權(quán)利要求的范圍。選擇和描述實(shí)施方式以最好地解釋該技術(shù)的原理和實(shí)際應(yīng)用，并使得本領(lǐng)域技術(shù)其他人員能夠理解用于具有適合于預(yù)想的特定應(yīng)用的各種改進(jìn)的各種實(shí)施方式的本技術(shù)。

一個(gè)或多個(gè)當(dāng)前優(yōu)選的實(shí)施方式通過舉例方式描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚，可以進(jìn)行多種變化和改進(jìn)而不脫離權(quán)利要求的范圍。