一種循環(huán)腫瘤細胞的富集方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)的富集方法及其試劑盒。應(yīng)用于從血液中快速高效富集CTCs。包括步驟：通過把抗上皮細胞粘附分子(EpCAM)抗體偶聯(lián)到磁性納米球上，制備得到免疫磁珠。將免疫磁珠投入到血液樣本中孵育5min，再通過磁分選和洗滌等步驟即實現(xiàn)了對CTCs的分離富集和純化，該法捕獲效率高，富集時間短，特異性好，非?？煽俊Ｋ东@的細胞的活性率保持在(90.5±1.2)%，可以直接用于培養(yǎng)、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、以及免疫細胞化學分析。這將為CTCs的檢測和研究提供有力的手段，具有極其重要的醫(yī)學意義。
【專利說明】一種循環(huán)腫瘤細胞的富集方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種循環(huán)腫瘤細胞的富集方法，屬于納米材料【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]癌癥是當今世界人類健康和生命的最大威脅，以至于人人“談癌色變”。而上皮來源的惡性腫瘤是最常見的一種癌癥，乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、食道癌等都屬于這類癌癥，這類癌癥帶來的死亡主要是由于癌癥的復發(fā)和轉(zhuǎn)移造成的。近年來的研究表明，癌細胞可以從原發(fā)腫瘤組織脫落進入血液系統(tǒng)，成為循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)，是癌癥轉(zhuǎn)移的重要中間事件，CTCs的數(shù)目與癌癥病人的生存率關(guān)系極大，因此檢測CTCs在醫(yī)學上具有重要的意義。但是CTCs以極低濃度存在于血液中，所以檢測CTCs面臨的最大的困難就是濃度低環(huán)境復雜。
[0003]隨著科學技術(shù)的發(fā)展，人們建立了很多種檢測CTCs的方法。由于CTCs濃度低，所以一般要先對CTCs進行有效的分離和純化。其中，磁富集是應(yīng)用最為廣泛的一種分離技術(shù)，其操作容易，捕獲效率高，應(yīng)用前景好。但目前大多用微米級磁球捕獲CTCs，捕獲腫瘤細胞后需要經(jīng)過磁球釋放過程才能進行分析，這無疑使CTCs的檢測和分析變得比較繁瑣。只有Veridex公司開發(fā)的CellSearch系統(tǒng)以及MiltenyiBiotec公司開發(fā)的MACS系統(tǒng)是使用納米級磁球捕獲腫瘤細胞。CellSearch系統(tǒng)使用的是120-200 nm磁性納米球,其在捕獲細胞過程中增加了額外的步驟來增強納米球的磁性:首先在磁性納米球上偶聯(lián)上抗上皮細胞粘附分子抗體和生物素類似物，用這種免疫磁球去捕獲CTCs ;然后加入鏈酶親和素與生物素類似物結(jié)合；再加入過量的磁球與SA結(jié)合，這樣增大了磁球的體積，使磁響應(yīng)變快從而使磁分選容易進行；經(jīng)過分離和洗滌等步驟后，加入生物素，由于其與鏈酶親和素的結(jié)合能力強于生物素類似物，可以把鏈酶親和素競爭的結(jié)合下來，從而釋放多余的磁球。這種方法為CTCs的捕獲引入了很多步驟，操作比較繁瑣。而MACS系統(tǒng)使用的是50 nm的磁性納米球，磁響應(yīng)較慢，需要強磁性的磁分離工具——磁分離柱(MACS Columns和MACSSeparator)才能完成分選,這不方便普通用戶。所以開發(fā)一種磁響應(yīng)迅速，用普通磁鐵就可以完成磁分選，且處于納米尺寸，用其捕獲CTCs后不用經(jīng)過磁球釋放可直接用于后續(xù)分析和檢測的磁球，將為CTCs的研究提供更有力的手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的問題在于制備一種處于納米尺寸且響應(yīng)迅速的磁球并提供一種快速、高效捕獲循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)的方法及其試劑盒，為CTCs的檢測、分析、研究提供有力的手段。
[0005]具體的技術(shù)方案是:
利用層層組裝法制備380 nm磁性納米球，并將抗上皮細胞粘附分子抗體共價偶聯(lián)到磁性納米球表面，制備得到免疫磁球；
將免疫磁球加入到待檢樣品中，37° C孵育5 min,磁分選并用I XPBS緩沖溶液洗滌，即實現(xiàn)了對循環(huán)腫瘤細胞的分離和富集。
[0006]所述免疫磁球是按照下面方法制備的:首先以苯乙烯-丙烯酰胺共聚納米球為模板，在其表面層層組裝油溶性的磁性納米粒子nano- y -Fe2O3,組裝五層后，再在其表面包被SiO2，之后經(jīng)過丁二酸酐化在納米球表面引入羧基，再通過1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)/N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化磁球表面的羧基，然后與抗體上的氨基共價偶聯(lián)。
[0007]免疫磁球粒徑約為380 nm,處于納米尺寸,飽和磁化強度大于30 emu/g,磁響應(yīng)迅速，置于磁力架上吸附I min，絕大部分磁球即可被捕獲。
[0008]所述待檢樣品為患有上皮組織來源惡性腫瘤的病人的外周血樣品。
[0009]本發(fā)明方法捕獲的細胞，無需進行磁球釋放，即可以采用免疫細胞化學進行鑒定，也可以直接用于培養(yǎng)、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)。
[0010]對捕獲的細胞進行免疫細胞染色鑒定過程如下:①向捕獲的細胞中，加入4%多聚甲醛溶液重懸細胞并在37° C下孵育10 min，固定細胞；②磁分選后加入0.1%曲通X-100 (Triton-X 100)溶液重懸細胞并在37° C下孵育10 min，通透細胞。③磁分選后加入1%牛血清白蛋白(BSA)溶液重懸細胞并在37° C下孵育30 min，封閉細胞。④磁分選加入30 yg/mL DAPI核染料溶液重懸細胞。再加入FITC標記的抗角蛋白(CK19)抗體、別藻藍素(APC)標記的抗白細胞共同抗原(⑶45)抗體，在37° C下孵育30 min，進行免疫細胞染色。⑤磁分選并用I XPBS緩沖溶液洗滌三次，重懸于50 μ LlXPBS緩沖溶液中。并將細胞懸液置于聚二甲基硅氧烷(PDMS)小室中，用磁鐵將其吸至小室底部，然后利用共聚焦熒光顯微鏡對細胞進行觀察和鑒定。PDMS小室是這樣制作的，首先在PDMS上打約6 mm的孔，然后將其鍵合到蓋玻片上。
[0011]本發(fā)明方法捕獲的細胞，也可以直接用于培養(yǎng)。培養(yǎng)捕獲的細胞過程如下:將捕獲的細胞用DMEM培養(yǎng)基(其中含有10%胎牛血清、60 μ g/mL青霉素、100 μ g/mL鏈霉素溶液)，于37° C 5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0012]本發(fā)明方法捕獲的細胞也可以直接用于逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)，對捕獲的細胞進行RT-PCR分析。具體可為對人的角蛋白(CK19)和表皮生長因子受體(EGFR)基因進行RT-PCR分析，但不應(yīng)理解為只局限于這兩種基因的分析。
[0013]本發(fā)明還提供一種循環(huán)腫瘤細胞的富集試劑盒。所述試劑盒包括免疫磁球、I XPBS緩沖溶液、離心管和EDTA抗凝真空采血管。所述試劑盒的使用方法是:利用EDTA抗凝真空采血管收集血樣，將免疫磁球與血樣在37° C下孵育5 min，然后用磁力架進行磁分選并用IXPBS緩沖溶液洗滌，則循環(huán)腫瘤細胞得以富集和純化。
[0014]本發(fā)明方法制備了處于納米尺寸且磁響應(yīng)迅速的納米球，并在其上偶聯(lián)上抗上皮細胞粘附分子的抗體。制得的免疫磁球可以直接用于患上皮來源腫瘤的病人的血液樣本，由于其尺寸小，所以具有較快的反應(yīng)動力學特征，可以在5 min內(nèi)即可實現(xiàn)對循環(huán)腫瘤細胞的快速高效捕獲和富集。該法操作簡便省時、富集效果好、特異性強、重現(xiàn)性好、非?？煽?。而且納米磁球?qū)λ东@細胞的影響較小，捕獲的細胞可以直接進行免疫染色鑒定，培養(yǎng)、RT-PCR等，從而實現(xiàn)對循環(huán)腫瘤細胞的分析研究和靈敏檢測。
【專利附圖】

【附圖說明】[0015]圖1為磁性納米球的制備及生物功能化的示意圖。
[0016]圖2為免疫磁球?qū)ρh(huán)腫瘤細胞的富集及鑒定分析示意圖。
[0017]圖3為磁性納米球的表征結(jié)果:A磁性納米球的透射電鏡圖；B磁性納米球的磁滯回線圖；C利用磁力架吸附不同時間后的磁性納米球的捕獲率；D磁性納米球的顯微鏡圖片；E磁性納米球與血液孵育一段時間的后的顯微鏡圖片。
[0018]圖4為免疫磁球?qū)O低濃度腫瘤細胞的捕獲情況:A免疫磁球在不同環(huán)境中對SK-BR-3細胞的捕獲情況(腫瘤細胞的濃度為5-300個/mL):1 XPBS體系(□)，混合細胞體系(背景細胞為Jurkat T細胞，濃度為10 6個/mL) (.),經(jīng)過紅細胞裂解處理后的血液(▲)，未經(jīng)處理的全血(▼) ;B不同孵育時間下免疫磁球?qū)K-BR-3細胞的捕獲情況(腫瘤細胞的濃度約為100個/mL) ；C免疫磁球?qū)煸谌械腟K-BR-3、HuH-7、H印G2、MCF-7細胞的捕獲情況。
[0019]圖5 A為用鈣黃綠素乙酰甲酯(Calcein AM)和碘化丙啶(PI)對捕獲的腫瘤細胞染色后的熒光顯微鏡圖片；B-E依次為被捕獲的SK-BR-3細胞剛剛貼壁、長滿、第一次傳代長滿、第五次傳代長滿后的顯微鏡圖片；F-G分別為對人的角蛋白(CK19)和表皮生長因子受體(EGFR)基因的RT-PCR的凝膠電泳圖。
[0020]圖6為用免疫磁球捕獲模擬血樣中的循環(huán)腫瘤細胞并通過免疫染色鑒定的共聚焦顯微鏡圖片。核(DAPI):激發(fā)405 nm,發(fā)射447 土 30 nm ；CK (FITC):激發(fā)488 nm,發(fā)射525 土 25 nm ;CD45 (APC):激發(fā)605 nm,發(fā)射685 土 20 nm ;共定位:三個通道的共定位圖片。
【具體實施方式】
[0021]以下實施例僅用于進一步說明本發(fā)明，但不應(yīng)理解為本發(fā)明的實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干推演或替換。
[0022]實施例1 循環(huán)腫瘤細胞的富集和分析
下面以乳腺癌細胞SK-BR-3為例，對利用磁性納米球高效快速捕獲和靈敏檢測循環(huán)腫瘤細胞進行詳細說明。
[0023]一、方法
1.磁性納米球的制備
磁性納米球的制備是在本實驗室制備熒光-磁性雙編碼球的基礎(chǔ)上進行的，即利用組裝的方法，在苯乙烯-丙酰胺納米球表面層層組裝磁性納米顆粒nano- y -Fe2O30具體為--①采用無乳聚合法制備得到苯乙烯-丙烯酰胺共聚納米球，并依此通過酰肼化、丁二酸酐化在納米球表面修飾上羧基，并利用EDC/NHS活化法在得到的羧基納米球表面組裝一層聚乙烯亞胺(PEI)，并通過洗滌除去未反應(yīng)的PEI 將上一步所得納米球用乙醇脫水處理后分散在正己醇中，通過PEI上的氮和鐵的配位作用，將同樣分散在正己醇中的nano- y -Fe2O3磁性納米顆粒組裝到納米球表面，并通過洗滌除去未反應(yīng)的納米顆粒；③將上一步所得納米球分散到PEI溶液中，在其表面組裝第二層PEI。再重復②③四次，在納米球表面一共組裝五層nano-Y-Fe2O3磁性納米顆粒；④將所得的磁性納米球通過四乙氧基硅氧烷和(3-氨基丙基)三乙氧基硅氧烷處理在其表面包覆一層硅殼并引入氨基；?將上一步得到的磁性納米球通過丁二酸酐處理在其表面引入羧基。
[0024]2.磁性納米球的生物功能化
利用EDC/NHS活化的方法將抗體修飾到磁性納米球表面。具體為:取大約5 mg磁性納米球，用0.01 M pH 6.8 PBS洗滌兩次后分散到0.01 M pH 6.8 PBS中，并加入EDC、NHS使其最終濃度為均為50禮，反應(yīng)活化0.5 h，用0.01 M pH 7.2 PBS通過磁力架將球洗滌三次，然后分散到I mL 0.01 M pH 7.2 PBS中，加入約50 μ g抗上皮細胞粘附分子抗體，反應(yīng)四小時，用0.01 M pH 7.2 PBS洗滌五次除去未反應(yīng)的抗體。最后存于4° C冰箱待用。
[0025]3.極低濃度的腫瘤細胞的捕獲
O復雜體系中極低濃度腫瘤細胞的捕獲
將用Hoechst 33342染核的SK-BR-3細胞與I XPBS、Jurkat T細胞(IO6個/mL分散于IXPBS中)、經(jīng)過紅細胞裂解液處理的健康人的外周血、未處理的健康人的外周血(全血)混合，調(diào)節(jié)SK-BR-3細胞的濃度在5、50、100、200、300個/mL，將免疫磁球投入到上述體系，37° C孵育，磁分選并洗滌，收集濁液和清液并對其中的SK-BR-3細胞計數(shù)，計算捕獲率。
[0026]2)孵育時間對腫瘤細胞捕獲率的影響
將用Hoechst 33342染核的SK-BR-3細胞與健康人的外周血混合，調(diào)節(jié)SK-BR-3細胞的濃度約為100個/mL,加入免疫磁球,37° C下孵育5 min、10 min、20 min、30 min。磁分選用I XPBS洗滌，收集濁液和清液并對其中的SK-BR-3細胞計數(shù)，計算捕獲率。
[0027]3)普適性實驗
將用Hoechst 33342染核的SK-BR-3細胞、MCF-7細胞、HuH-7細胞、H印G2細胞與健康人的外周血混合，調(diào)節(jié)細胞的濃度約為100個/mL，加入免疫磁球，37° C下孵育5 min。磁分選用I XPBS洗滌，收集濁液和清液并對其中的染核的細胞計數(shù)，計算捕獲率。
[0028]4.捕獲的腫瘤細胞的活性分析
將免疫磁球投入到SK-BR-3細胞懸液中，孵育5 min,磁分選并洗滌后，用2 μ M鈣黃綠素乙酰甲酯(Calcein AM)和4.5 μ M碘化丙啶(PI)染色30 min，將處理好的細胞在熒光顯微鏡下用藍光激發(fā)觀察，統(tǒng)計500個細胞，計算綠色細胞的數(shù)目占總細胞數(shù)的百分比即為捕獲細胞的活性率。另外，將捕獲的SK-BR-3細胞用DMEM培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清、60 μ g/mL青霉素、100 μ g/mL鏈霉素溶液)，于37° C 5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察其貼壁、生長、增值及傳代過程。
[0029]5.捕獲的腫瘤細胞的RT-PCR分析
將免疫磁球投入到SK-BR-3細胞懸液中，孵育5 min,磁分選并洗滌后，用RNApreppure cell/bacteria kit (天根生化科技有限公司)提取細胞內(nèi)的總RNA,再用Promega RTsystem (Promega Corporation)進行逆轉(zhuǎn)錄。然后用引物 5’-GACTACAGCCACTACTACACGACCAT-3，(SEQ ID N0.1)和 5，-GAGCGGA ATCCACCTCCACACT-3’ (SEQ ID N0.2)擴增人的角蛋白(CK19)的基因編碼區(qū) 346-bp 片段，用引物 5’-CCAGTGACTGCTGCCACAACCA-3’ (SEQ IDN0.3)和 5’ -CGCCGTCTTCCTCCATCTCATAGC-3’ (SEQ ID N0.4)擴增人的表皮生長因子受體(EGFR)的基因編碼區(qū)285-bp片段。反應(yīng)條件分別為:CK19:94° C預變性5 min ；94° C變性30 s，55° C退火30 s，72° C延伸30 S，循環(huán)35次；最后在72。C延伸10 min。EGFR:94° C預變性5min;94° C變性30 s，67° C退火30 s，72° C延伸30 S，循環(huán)35次；最后在72° C延伸10 min。產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠分離并用溴化乙錠(EB)染色觀察。
[0030]6.模擬血液樣本的循環(huán)腫瘤細胞的捕獲和染色鑒定
將SK-BR-3細胞與健康人的外周血混合，調(diào)節(jié)SK-BR-3細胞的濃度為50個/mL，加入免疫磁球，37° C下輕搖孵育5 min。磁分選用IXPBS洗滌一次后，加入4%多聚甲醛溶液重懸捕獲的細胞并在37° C下孵育10 min，固定細胞。磁分選后加入0.1%曲通X-100 (Triton-X100)溶液重懸細胞并在37° C下孵育10 min，通透細胞。磁分選后加入1%牛血清白蛋白(BSA)溶液重懸細胞并在37° C下孵育30 min，封閉細胞。磁分選加入30 μ g/mL DAPI核染料溶液重懸細胞，再加入FITC標記的抗角蛋白(CK19)抗體、別藻藍素(APC)標記的抗白細胞共同抗原(CD45)抗體，在37° C下孵育30 min，進行免疫細胞染色。磁分選并用1XPBS緩沖溶液洗滌三次，重懸于50 μ LlXPBS緩沖溶液中。并將細胞懸液置于PDMS小室中，用磁鐵將其吸至小室底部，然后利用共聚焦熒光顯微鏡對細胞進行觀察和鑒定。
[0031]7.檢測方法的重復性考察
用免疫磁球捕獲和免疫染色鑒定分析五個血液樣本,每個樣本分析三次，考察檢測方法的重復性和可靠性。
[0032]8.實際腫瘤患者和健康人血液樣本的檢測
用EDTA抗凝真空采血管收集血樣，加入免疫磁球，輕搖孵育5 min后磁分選并洗滌，然后按照步驟6進行免疫染色鑒定并對CTCs進行計數(shù)。
[0033]二、結(jié)果
1.磁性納米球的表征
磁性納米球的透射電鏡圖(圖3A)表明所合成的納米球粒徑均一 (~380 nm)，分散性好。而通過納米球的磁滯回線(圖3B)可以看出納米球的矯頑力和剩磁幾乎為零，表明磁性納米球在室溫下呈現(xiàn)較好的超順磁性，而且飽和磁化強度達34.9 emu/g。磁性納米球的磁響應(yīng)迅速，置于磁力架上吸附1 min基本上全部被捕獲(圖3C)。用顯微鏡觀察磁性納米球和與血液孵育一段時間的磁性納米球(圖3D和圖3E)，發(fā)現(xiàn)磁性納米球分散性依然保持良好。這表明磁性納米球在復雜體系中很穩(wěn)定，不會發(fā)生團聚。綜上，該磁性納米球處于納米尺寸,粒徑小,磁響應(yīng)快,在血液中可以保持單分散性,這些都為磁性納米球直接用于血液樣本中CTCs的快速高效捕獲提供了非常好的基礎(chǔ)。
[0034]2.極低濃度的腫瘤細胞的捕獲
將免疫磁球用于四種體系中極低濃度腫瘤細胞的捕獲:1X PBS體系、混合細胞體系(背景細胞為Jurkat T細胞，濃度為10 6個/mL)、經(jīng)過紅細胞裂解處理后的血液、未經(jīng)處理的血液。捕獲情況見圖4A，可以看出，免疫磁球在這四種體系中對腫瘤細胞都實現(xiàn)了高效的捕獲，這說明環(huán)境的復雜性對免疫磁球和腫瘤細胞的結(jié)合影響很小，而免疫磁球可以直接應(yīng)用于全血環(huán)境，這保證了該富集方法的可靠性。通過研究孵育時間對捕獲率的影響，我們發(fā)現(xiàn)該免疫磁球具有很快的反應(yīng)動力學特征，孵育5 min即可抓到全血中94%以上的SK-BR-3細胞(圖4B)。而且免疫磁球普適性很好，不僅適用于SK-BR-3細胞，還可以對MCF-7細胞、HuH-7細胞、Hep G2細胞等實現(xiàn)高效的捕獲(圖4C)。
[0035]3.捕獲的腫瘤細胞的活性和RT-PCR分析
用鈣黃綠素乙酰甲酯(Calcein AM)和碘化丙啶(PI)鑒定捕獲的腫瘤細胞的活性，Calcein-AM能透過活細胞的細胞膜，并與活細胞內(nèi)的酯酶作用脫去AM，產(chǎn)物Calcein具有綠色熒光。而PI為核染料，其不能穿過活細胞的細胞膜，只能透過死細胞的細胞膜達到細胞核，與核內(nèi)的DNA作用產(chǎn)生紅色熒光。所以用Calcein-AM/PI染色，發(fā)綠色熒光的為活細胞，發(fā)紅色熒光的為死細胞。由圖5A可以看出捕獲的SK-BR-3細胞絕大部分為呈現(xiàn)綠色熒光，說明大部分細胞保持較高的活性，統(tǒng)計捕獲的細胞的活性率為(90.5±1.2)%。圖5B-5E依次為捕獲的SK-BR-3細胞剛剛貼壁、長滿、第一次傳代長滿、第五次傳代長滿的顯微鏡圖片，可以發(fā)現(xiàn)捕獲的細胞基本能正常貼壁、生長增值并可以進行傳代培養(yǎng)，且細胞的形態(tài)正常。說明免疫磁球?qū)毎幕钚杂绊戄^小，捕獲的細胞無需進行磁球釋放過程，就可以直接進行再培養(yǎng)。圖5F為對人的角蛋白(CK19)和表皮生長因子受體(EGFR)基因的RT-PCR的凝膠電泳圖，可以看出捕獲的細胞均擴增出相應(yīng)的條帶，證明免疫磁球捕獲的細胞無需進行磁球釋放過程即可直接用于RT-PCR。
[0036]4.模擬血液樣本的循環(huán)腫瘤細胞的捕獲和染色鑒定
使用DAPI核染料、FITC標記的抗角蛋白(CK19)抗體、別藻藍素(APC)標記的抗白細胞共同抗原(CD45)抗體對捕獲的細胞進行免疫染色鑒定。CK19為上皮細胞標志物，存在于正常上皮細胞和上皮癌細胞中。CD45是白細胞共同抗原，是白細胞的標志物。因此DAPI陽性、CK19陽性、CD45陰性的細胞被鑒定為循環(huán)腫瘤細胞。由圖6可以看出，循環(huán)腫瘤細胞呈現(xiàn)綠色，CK19高表達，而白細胞呈現(xiàn)紅色，⑶45高表達。表1為對五組血液樣本的腫瘤細胞的檢測結(jié)果，每組樣本平行做三次，標準偏差計算得10.8%，表明該法重現(xiàn)性較好，方法可靠。
[0037]表1
【權(quán)利要求】
1.一種循環(huán)腫瘤細胞的富集方法，其特征在于: 利用層層組裝法制備380nm磁性納米球，并將抗上皮細胞粘附分子抗體共價偶聯(lián)到磁性納米球表面，制備得到免疫磁球； 將免疫磁球加入到待檢樣品中，37° C孵育5 min，磁分選并用IXPBS緩沖溶液洗滌，即實現(xiàn)了對循環(huán)腫瘤細胞的分離和富集。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的富集方法，其特征在于，所述的將抗上皮細胞粘附分子抗體共價偶聯(lián)到磁性納米球表面，具體為通過1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽/N-羥基琥珀酰亞胺活化磁球表面的羧基，然后與抗體上的氨基共價偶聯(lián)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的富集方法，其特征在于，所述免疫磁球是按照下面方法制備的:首先以苯乙烯-丙烯酰胺共聚納米球為模板，在其表面層層組裝油溶性的磁性納米粒子nano- y -Fe2O3,組裝五層后，再在其表面包被SiO2，之后經(jīng)過丁二酸酐化在納米球表面引入羧基，再通過1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽/N-羥基琥珀酰亞胺活化磁球表面的羧基，然后與抗體上的氨基共價偶聯(lián)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的富集方法，其特征在于，所述待檢樣品為患有上皮組織來源惡性腫瘤的病人的外周血樣品。
5.一種循環(huán)腫瘤細胞的富集試劑盒，包括免疫磁球、I XPBS緩沖溶液、離心管和EDTA抗凝真空采血管。
6.權(quán)利要求5所述的試劑盒的使用方法，其特征在于，利用EDTA抗凝真空采血管收集血樣，將免疫磁球與血樣在37° C下孵育5 min,然后用磁力架進行磁分選并用I XPBS緩沖溶液洗滌，則循環(huán)腫瘤細胞得以富集和純化。
【文檔編號】G01N1/40GK103630440SQ201310614556
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年11月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月28日
【發(fā)明者】龐代文, 溫聰穎, 吳玲玲, 張志凌 申請人:武漢大學