專利名稱：實時熒光定量rt－pcr檢測人細胞角蛋白19試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，為一種通過逆轉(zhuǎn)錄(RT)mRNA樣品得到cDNA，再結(jié)合實時熒光定量PCR檢測技術(shù)，可以精確定量檢測標本中人細胞角蛋白19(CK19)的mRNA表達量的試劑盒。
血道轉(zhuǎn)移是腫瘤擴散的主要途徑之一，因此在患者外周血中進行腫瘤細胞基因表達檢測、腫瘤特異性標記產(chǎn)物檢測是了解腫瘤轉(zhuǎn)移情況的一個有效的方式，因此腫瘤標記物(tumormarker)的檢測對腫瘤形成及轉(zhuǎn)移的診斷具有極大的幫助。但是在腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生的早期，外周血中的腫瘤細胞常常很少，無法完全依賴病理形態(tài)檢查，同時腫瘤特異性抗原的含量也很少，也很難通過常用的酶標免疫吸附分析(ELISA)或放射免疫分析(RIA)等方法檢測到，因此，對循環(huán)血中的微量腫瘤細胞基因表達和一些特異性產(chǎn)物檢測的研究，已經(jīng)引起了人們的廣泛關(guān)注。
目前腫瘤發(fā)病率和死亡率居高不下，某些惡性腫瘤還有上升的趨勢。如能對腫瘤轉(zhuǎn)移患者早期發(fā)現(xiàn)，對進一步治療方案的制定有非常重要的意義，是提高腫瘤的治愈率重要途徑之一。對我國醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)的發(fā)展有極重要的社會意義與經(jīng)濟意義。因此，我們致力于開發(fā)惡性腫瘤轉(zhuǎn)移早期檢測及診斷技術(shù)，以解決臨床治療的一大難題。
隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展及其在醫(yī)學(xué)研究中的廣泛應(yīng)用，通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)檢測外周血中微量腫瘤細胞已成為可能并被嘗試。RT-PCR有著比病理學(xué)或ELISA/RIA等方法無法比擬的高靈敏度及相對的高特異性，為外周血中微量腫瘤細胞的檢測帶來了希望，但在高靈敏度、高特異性的背后也隱藏著一些無法避免的假陽性問題，因此也在某種程度上阻礙了這一高新技術(shù)在臨床檢測中的推廣應(yīng)用。
CK19是上皮細胞特異性表達基因產(chǎn)物，在正常人外周血等組織細胞中無CK19 mRNA的表達。因此檢測患者外周血、淋巴結(jié)、骨髓等標本中有無CK19 mRNA的表達，可以對上皮類來源腫瘤的轉(zhuǎn)移診斷和治療提供有力證據(jù)，還可以對腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)情況以及療效觀察提供幫助。以往對CK19 mRNA的檢測采用的是定性RT-PCR法，但從技術(shù)角度來講，定性PCR雖然從靈敏度比傳統(tǒng)的ELISA等方法有了明顯提高，但其特異性相對較差，且無法精確定量。TaqMan熒光定量PCR技術(shù)及相應(yīng)檢測儀器的推出使得人們可以在利用PCR高靈敏性的情況下，對PCR產(chǎn)物進行實時精確定量檢測，不僅解決了PCR的定量問題，而且還大大提高了檢測的特異性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明試劑盒包含RT反應(yīng)液、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、Rnasin、PCR反應(yīng)液、Taq、標準品、對照品。
其中RT反應(yīng)液的成份含有DEPC-H2O、MMLV-RT緩沖液、Oligo(dT)15-18、dNTPs。
其中PCR反應(yīng)液的成份含有PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs、檢測用引物、探針。
檢測用引物分上游引物和下游引物上游引物序列為5′-GCAGAACCGGAAGGATGCT-3′，下游引物序列為5′-TCCGTTTCTGCCAGTGTGTC-3′熒光探針序列為5′-FAM-AGGTCGCTGGCCACACGGAGC-TAMRA-3′標準品序列為GAAGGCCTGA AGGAAGAGCT GGCCTACCTG AAGAAGAACC ATGAGGAGGA AATCAGTACGCTGAGGGGCC AAGTGGGAGG CCAGGTCAGT GTGGAGGTGG ATTCCGCTCC GGGCACCGATCTCGCCAAGA TCCTGAGTGA CATGCGAAGC CAATATGAGG TCATGGCCGA GCAGAACCGGAAGGATGCTG AAGCCTGGTT CACCAGCCGG ACTGAAGAAT TGAACCGGGA GGTCGCTGGCCACACGGAGC AGCTCCAGAT GAGCAGGTCC GAGGTTACTG ACCTGCGGCG CACCCTTCAGGGTCTTGAGA TTGAGCTGCA GTCACAGCTG AGCATGAAAG CTGCCTTGGA AGACACACTGGCAGAAACGG AGGCGCGCTT TGGAGCCCAG CTGGCGCATA TCCAGGCGCT GATCAGCGGTATTGAAGCCC AGCTGGGCGA TGTGCGAGCT GATAGTGAGC GGCAGAATCA GGAGTACCAGCGGCTCATGG ACATCAAGTC GCG對照品分為陽性對照和陰性對照，陰性對照為無CK19 mRNA的RNA樣品，陽性對照為有CK19mRNA的RNA樣品。
本試劑盒保存于-20℃，盡量減少反復(fù)凍融。
本發(fā)明建立了利用TaqMan技術(shù)檢測CK19表達的方法，并經(jīng)檢測患者標本，表明該方法切實可行。由于本方法采用了PCR擴增技術(shù)，使得CK19表達的檢測敏感性大大提高，而且由于熒光探針的應(yīng)用，使得其特異性亦大大提高，降低了常規(guī)PCR擴增的假陽性率，使得我們可以在極少的標本中獲得足夠的信息。本方法所設(shè)計的引物、探針以及檢測結(jié)果，可以為熒光定量PCR檢測試劑盒的開發(fā)提供可靠的依據(jù)。
在本檢測項目中，我們采用了目前最先進的特異性熒光探針雜交定量PCR檢測技術(shù)，在保持高敏感性的前提下盡量減少假陽性干擾。在實時熒光定量PCR檢測技術(shù)出現(xiàn)之前，人們對PCR模板的定量不論是直接PCR還是競爭性PCR，基本上都要通過PCR產(chǎn)物電泳，再將電泳結(jié)果經(jīng)計算機圖像處理，根據(jù)電泳條帶的亮度來確定最終PCR產(chǎn)物量的多少，或?qū)擞浀腜CR產(chǎn)物以ELISA的方式進行檢測，再由此推測起始模板的量，但這些方法實際上都屬于半定量水平，因為即使PCR條件已最優(yōu)化，電泳及后續(xù)步驟的操作的不穩(wěn)定性仍會給結(jié)果分析帶來影響，從而影響定量這一目的。隨著實時熒光定量PCR技術(shù)的出現(xiàn)，人們可以真正地做到對PCR模板的精確定量，這種定量不僅保持了常規(guī)PCR的高靈敏性，而且由于特異性熒光探針雜交技術(shù)的應(yīng)用，使得被檢測基因的特異性大大提高。
本發(fā)明試劑盒使用方法每次檢測均應(yīng)設(shè)立陽性對照和陰性對照。標準品用無菌去離子水稀釋為1×102-1×109拷貝/ml。
逆轉(zhuǎn)錄總體積25μl，其中2μl 70℃預(yù)變性5分鐘的待測RNA，20.75μl RT反應(yīng)液，1.0μl M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，1.25μl Rnasin。于37℃水浴反應(yīng)10-15分鐘。
擴增檢測在熒光定量PCR儀上進行，總體積50μl，其中47.0μl PCR反應(yīng)液，2.5μl檢測樣品(逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、標準品、陽性或陰性對照)，0.5μl Taq DNA聚合酶。反應(yīng)條件95℃預(yù)變性5分鐘，95℃30秒、62℃15秒、75℃15秒共40個循環(huán)，72℃延伸10分鐘，置4℃。根據(jù)所獲得的標準曲線，計算得到各待測標本中CK19的量(拷貝數(shù)/ml)。
圖2為實時熒光定量RT-PCR標準曲線。
實施例1熒光定量RT-PCR法檢測CK19的表達一、材料Trizol試劑及限制性內(nèi)切酶均購自美國LTI/Gibco公司，pGEM-T-Easy克隆系統(tǒng)、MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶、Oligo(dT)15-18購自美國Promega公司，測序試劑、377型測序儀、2400型PCR儀及7700型定量PCR儀均為美國Perkin Elmer公司產(chǎn)品。
二、引物及探針設(shè)計與合成以CK19全長cDNA序列(GenBank登錄號M17303)為模板，使用Primer ExpressTM(V1.0，美國Perkin Elmer公司)軟件分析TaqMan引物和探針位點，并根據(jù)同時考慮CK19基因組DNA序列情況，從中選擇最佳組合。
標準品PCR上游引物序列為5′-GAAGGCCTGAAGGAAGAGCTG-3′；下游引物為5′-CGCGACTTGATGTCCATGAG-3′；檢測用PCR上游引物序列為5′-GCAGAACCGGAAGGATGCT-3′；下游引物序列為5′-TCCGTTTCTGCCAGTGTGTC-3′，均由上海生工公司合成。
熒光探針序列為5′-FAM-AGGTCGCTGGCCACACGGAGC-TAMRA-3′，由大連寶生物技術(shù)公司合成。
三、檢測標準品制備患者的新鮮手術(shù)標本立即液氮凍存，并于液氮存在下于研缽中磨碎后用Trizol試劑提取總RNA，取1μl RNA，在25μl總反應(yīng)體積內(nèi)用oligo(dT)15-18為引物對其進行逆轉(zhuǎn)錄后，用標準品上下游引物在2400型PCR儀上進行PCR擴增，條件為95℃5分鐘變性，95℃30秒、62℃30秒、72℃30秒進行30個循環(huán)擴增，最后于72℃延伸10分鐘后置4℃。
PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后即用克隆系統(tǒng)插入pCR2.1克隆載體，并將陽性克隆經(jīng)測序驗證。EcoRI酶切后回收503bp片段，即為標準品。測定濃度并換算成(拷貝數(shù)/體積)。
實施例2一、標本檢測7例經(jīng)病理確診的惡性腫瘤患者外周血標本，分離外周血有核細胞，經(jīng)PBS洗滌后，離心收集細胞用Trizol試劑提取細胞總RNA，取1μgRNA，在25μl總反應(yīng)體積內(nèi)用oligo(dT)15-18為引物對其進行逆轉(zhuǎn)錄后，用檢測用上下游引物在PE公司7700型定量PCR儀上進行PCR擴增，條件為95℃5分鐘變性，95℃30秒、62℃30秒、72℃30秒進行40個循環(huán)擴增，最后于72℃延伸10分鐘后置4℃。同時加標準品檢測作標準曲線。測定結(jié)果經(jīng)儀器處理根據(jù)標準曲線計算出檢測標本的CK19表達量。
二、結(jié)果(一)標準品的制備經(jīng)測序，上述設(shè)計標準品完全與預(yù)期相符，回收的標準品片段序列如下(包括兩端EcoRI位點)
GAATTCGAAGGCCTGA AGGAAGAGCT GGCCTACCTG AAGAAGAACC ATGAGGAGGA AATCAGTACGCTGAGGGGCC AAGTGGGAGG CCAGGTCAGT GTGGAGGTGG ATTCCGCTCC GGGCACCGATCTCGCCAAGA TCCTGAGTGA CATGCGAAGC CAATATGAGG TCATGGCCGA GCAGAACCGGAAGGATGCTG AAGCCTGGTT CACCAGCCGG ACTGAAGAAT TGAACCGGGA GGTCGCTGGCCACACGGAGC AGCTCCAGAT GAGCAGGTCC GAGGTTACTG ACCTGCGGCG CACCCTTCAGGGTCTTGAGA TTGAGCTGCA GTCACAGCTG AGCATGAAAG CTGCCTTGGA AGACACACTGGCAGAAACGG AGGCGCGCTT TGGAGCCCAG CTGGCGCATA TCCAGGCGCT GATCAGCGGTATTGAAGCCC AGCTGGGCGA TGTGCGAGCT GATAGTGAGC GGCAGAATCA GGAGTACCAGCGGCTCATGG ACATCAAGTC GCGGAATTC(二)樣品檢測標準品檢測結(jié)果參見

圖1，標準曲線參見圖27例患者外周血標本檢測結(jié)果如下患者編號 性別 年齡 標本 CK19值(拷貝數(shù)/ml)1 男77外周血5×1032 女43外周血1.9×1043 男65外周血9×1034 女45外周血8.8×1025 男65外周血1.0×1036 男59外周血7.0×1027 男56外周血9.4×102本發(fā)明是結(jié)合最佳實施例進行描述的，然而在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種實時熒光定量RT-PCR檢測人細胞角蛋白19試劑盒，其特征是它含有RT反應(yīng)液、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、Rnasin、PCR反應(yīng)液、Taq、標準品、對照品。
2.如權(quán)利要求1所述的實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，其特征是RT反應(yīng)液包含DEPC-H2O、RT緩沖液、Oligo(dT)15-18、dNTPs。
3.如權(quán)利要求1所述的實時熒光定量RT-PCR檢測人細胞角蛋白19試劑盒，其特征是PCR反應(yīng)液包含PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs、上下游引物、探針。
4.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征是上下游引物序列分別是5′-GCAGAACCGGAAGGATGCT-3′和5′-TCCGTTTCTGCCAGTGTGTC-3′。
5.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征是探針為熒光探針，其序列為5′-FAM-AGGTCGCTGGCCACACGGAGC-TAMRA-3′。
6.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征是標準品序列為GAAGGCCTGA AGGAAGAGCT GGCCTACCTG AAGAAGAACC ATGAGGAGGA AATCAGTACGCTGAGGGGCC AAGTGGGAGG CCAGGTCAGT GTGGAGGTGG ATTCCGCTCC GGGCACCGATCTCGCCAAGA TCCTGAGTGA CATGCGAAGC CAATATGAGG TCATGGCCGA GCAGAACCGGAAGGATGCTG AAGCCTGGTT CACCAGCCGG ACTGAAGAAT TGAACCGGGA GGTCGCTGGCCACACGGAGC AGCTCCAGAT GAGCAGGTCC GAGGTTACTG ACCTGCGGCG CACCCTTCAGGGTCTTGAGA TTGAGCTGCA GTCACAGCTG AGCATGAAAG CTGCCTTGGA AGACACACTGGCAGAAACGG AGGCGCGCTT TGGAGCCCAG CTGGCGCATA TCCAGGCGCT GATCAGCGGTATTGAAGCCC AGCTGGGCGA TGTGCGAGCT GATAGTGAGC GGCAGAATCA GGAGTACCAGCGGCTCATGG ACATCAAGTC GCG
7.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征是對照品分為陰性對照和陽性對照，陰性對照為無CK19 mRNA的RNA樣品，陽性對照為有CK19 mRNA的RNA樣品。
8.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征是利用該試劑盒所設(shè)計的引物及探針進行的PCR/RT-PCR進行CK19 mRNA的定性和定量檢測。
全文摘要
本發(fā)明為一種實時熒光定量RT－PCR檢測人細胞角蛋白19試劑盒，該試劑盒通過逆轉(zhuǎn)錄(RT)mRNA樣品得到cDNA，再結(jié)合實時熒光定量PCR檢測技術(shù)，可以精確定量檢測標本中CK19的mRNA表達量。該試劑盒可以用于臨床及科研中檢測患者的外周血及淋巴結(jié)、骨髓等標本中CK19的表達，用以輔助診斷、指導(dǎo)治療及提示預(yù)后。
文檔編號G01N21/64GK1410761SQ0214528
公開日2003年4月16日 申請日期2002年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月12日
發(fā)明者張行, 曹江, 葉景佳, 鄭樹 申請人:浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院