專利名稱：端粒酶結(jié)合蛋白p23的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一種端粒酶結(jié)合蛋白p23用作檢測肝癌的蛋白質(zhì)分子標(biāo)記的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肝癌是一種嚴(yán)重危害人類的疾病。西方發(fā)達(dá)國家肝癌的發(fā)病率較低，國際上對肝癌的基礎(chǔ)研究仍較為薄弱，而我國是肝癌高發(fā)國家，發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)上升趨勢，且發(fā)病年齡構(gòu)成年輕化，每年用于肝癌治療的醫(yī)療支出大為增加，肝癌成了嚴(yán)重危害我國人民生命財產(chǎn)安全的頭號敵人，并且是影響社會經(jīng)濟發(fā)展的一個重要因素，加大力度進(jìn)行我國肝癌的基礎(chǔ)研究具有戰(zhàn)略意義，而分離和鑒定新的肝癌相關(guān)基因是目前肝癌基礎(chǔ)研究中的前沿課題。
到目前為止，已有不下20種的基因異常表達(dá)被確定與肝癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但已確定的肝癌相關(guān)基因在肝癌中的異常表達(dá)率并不高，肝癌的發(fā)病機制至今仍未闡明，肝癌的早期診斷率仍有待提高。此外，傳統(tǒng)的肝癌手術(shù)加化療以及近年來配合使用的多種基因治療方法仍沒有明顯提高肝癌患者的生存率，因而尋找新的肝癌相關(guān)基因尤其是肝癌高表達(dá)基因?qū)τ谔接懜伟┑陌l(fā)病機制具有重要意義。
因此，為治療和診斷目的研究和開發(fā)在肝癌中高表達(dá)的基因和/或蛋白具有重要意義。本領(lǐng)域迫切需要新的在肝癌中高表達(dá)的基因和/或蛋白。
端粒酶結(jié)合蛋白p23(Telomerase-binding protein p23；Hsp90 co-chaperone；Progesteronereceptor complex p23)的Genebank登錄號為gi|8928247，NCBI的登錄號為NP_006592，Swissprot登錄號為Q15185，IPI號為IPI00015029.1。它是端粒酶(telomerase)和孕酮受體(progesterone receptor)的結(jié)合蛋白，具有分子伴侶活性(chaperone activity)，體內(nèi)的端粒酶結(jié)合蛋白p23在激素依賴的情況下跟整個轉(zhuǎn)錄相關(guān)，通過解散轉(zhuǎn)錄體復(fù)合物打斷受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性。2002年發(fā)表在Science上的一篇文獻(xiàn)就報道了，p23在激素依賴的基因組反應(yīng)元件中其作用，他通過打斷激素受體，從而終止信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，起到調(diào)控轉(zhuǎn)錄活性的作用(Disassembly of transcriptional regulatory complexes by molecular chaperones.Science，2002.Jun 21；296(5576)2232-5)。
很少有文獻(xiàn)報道端粒酶結(jié)合蛋白p23的結(jié)構(gòu)與功能，截止目前，還沒有端粒酶結(jié)合蛋白p23與肝細(xì)胞癌的相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容
通過篩選在肝細(xì)胞癌癌組織以及肝細(xì)胞癌癌旁組織中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，本申請的發(fā)明人找到了一種在肝細(xì)胞癌的癌組織和癌旁組織中存在差異表達(dá)的蛋白質(zhì)(在癌組織中上調(diào)表達(dá))，經(jīng)質(zhì)譜鑒定為端粒酶結(jié)合蛋白p23。進(jìn)一步的免疫印跡實驗證實，端粒酶結(jié)合蛋白p23的確在肝細(xì)胞癌的癌組織與癌旁組織中存在差異表達(dá)(在癌組織中上調(diào)表達(dá))。
基于端粒酶結(jié)合蛋白p23與肝細(xì)胞癌的這種相關(guān)性，以該蛋白作為一個蛋白質(zhì)分子標(biāo)記對其表達(dá)量進(jìn)行檢測可以用于檢測肝癌。
因此，本發(fā)明的首要目的即在于提供一種端粒酶結(jié)合蛋白p23用作檢測肝癌的蛋白質(zhì)分子標(biāo)記的應(yīng)用。
本發(fā)明的另一個目的在于提供一種抗端粒酶結(jié)合蛋白p23的抗體，包括單克隆抗體和多克隆抗體，用于制備檢測肝癌的制劑的應(yīng)用。
本發(fā)明的再一個目的還在于提供一種抗端粒酶結(jié)合蛋白p23的抗體，包括單克隆抗體和多克隆抗體，用于制備檢測肝癌的試劑盒的應(yīng)用。
本發(fā)明的又一個目的在于提供一種體外檢測肝細(xì)胞組織中端粒酶結(jié)合蛋白p23的表達(dá)是否異常的方法，該方法包括以下步驟A、用特異性抗端粒酶結(jié)合蛋白p23的抗體檢測待測肝細(xì)胞中端粒酶結(jié)合蛋白p23的數(shù)量；B、將步驟A測得的端粒酶結(jié)合蛋白p23的數(shù)量與正常肝組織中的端粒酶結(jié)合蛋白p23的數(shù)量進(jìn)行比較，如測得的蛋白數(shù)量高于正常值，則表示被檢測肝組織中端粒酶結(jié)合蛋白p23的表達(dá)異常。
現(xiàn)有技術(shù)中很少有關(guān)于端粒酶結(jié)合蛋白p23結(jié)構(gòu)與功能的報道，到目前為止，還沒有端粒酶結(jié)合蛋白p23與肝細(xì)胞癌的相關(guān)性的報道，因此，本發(fā)明的這一發(fā)現(xiàn)將為肝細(xì)胞癌的診斷和/或治療提供一條全新的途徑。


圖1為端粒酶結(jié)合蛋白p23的免疫印跡分析結(jié)果示意圖，Beta-actin為對照。
圖2顯示了對隨機抽取的36例肝癌患者血清樣品、24例乙肝而非肝癌患者的血清樣品以及36例正常人血清樣品中端粒酶結(jié)合蛋白p23的免疫印跡分析結(jié)果，transferrin為對照；其中N代表正常人血清，I代表乙肝而非肝癌患者血清，C代表肝癌患者血清。
圖3為采用R數(shù)據(jù)分析軟件對圖2的免疫印跡圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)分析得出的蛋白質(zhì)表達(dá)量相對分布圖。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
本申請的發(fā)明人用非酶解樣品制備法(nonenzymatic sample preparation，NESP)制備了肝細(xì)胞癌的癌組織與癌旁組織蛋白質(zhì)樣品，以同位素親和標(biāo)簽與凝膠增強的液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(gel-enhanced liquid chromatography-mass spectrometry coupled with isotope-coded affinitytag，GeLC-MS-ICAT)對其中的蛋白進(jìn)行鑒定并比較其表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)端粒酶結(jié)合蛋白p23在肝細(xì)胞癌癌組織中高表達(dá)。免疫印跡實驗進(jìn)一步證實端粒酶結(jié)合蛋白p23的確在肝細(xì)胞癌的癌組織與癌旁組織中存在差異表達(dá)。
因此，以端粒酶結(jié)合蛋白p23作為一個蛋白質(zhì)分子標(biāo)記對其表達(dá)量進(jìn)行檢測可以用于檢測肝癌，即端粒酶結(jié)合蛋白p23可以用作檢測肝癌的蛋白質(zhì)分子標(biāo)記。
實施例1、肝細(xì)胞癌癌組織及癌旁組織蛋白質(zhì)樣品的制備本實施例中所使用的尿素、3-[(3-膽酰胺丙基)-二乙銨]-1-丙磺酸(CHAPS)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、二硫蘇糖醇(DTT)均購自Sigma公司。
本實施例以非酶解樣品制備法(nonenzymatic sample preparation，NESP)制備肝細(xì)胞癌的癌組織及癌旁組織蛋白質(zhì)樣品，具體如下手術(shù)切除的新鮮組織塊迅速置于冰上，快速切成幾個肉眼可見、無壞死區(qū)域的小塊。用預(yù)冷的不含谷氨酰胺的RPMI1640培養(yǎng)基(5％胎牛血清，0.2mM PMSF，1mM EDTA，苯甲異噁唑青霉素25mg/mL，慶大霉素50mg/mL，青霉素100U/mL，鏈霉素100mg/mL，兩性霉素B 0.25mg/mL，制霉菌素50U/mL)洗滌組織小塊數(shù)次后，在液氮中快速研磨成細(xì)胞沉淀，細(xì)胞沉淀分別溶于適量裂解液(8mol/L尿素、4％CHAPS、40mmol/L Tris和65mmmol/L DTT)中，超聲細(xì)胞破碎儀(Soniprep 150，英國，MSE)冰浴間歇超聲2min，15000r/min、4℃離心1h。取上清，以改良的Bradford法(見Bio-Rad公司產(chǎn)品說明書)進(jìn)行總蛋白質(zhì)定量，制備好的肝細(xì)胞癌癌組織及相應(yīng)癌旁組織的蛋白質(zhì)樣品分裝，-80℃保存?zhèn)溆谩?br> 以上述方法制備11對肝細(xì)胞癌癌組織及癌旁組織蛋白質(zhì)樣品。11例肝細(xì)胞癌標(biāo)本均來自東方肝膽外科醫(yī)院，由2個病理科醫(yī)生明確為肝細(xì)胞癌。均為男性，平均年齡48.5歲(31～65歲)，血清檢測hepatitis B病毒感染陽性，11例(100％)屬臨床分級(TNM分級)III級。其中，甲胎蛋白(AFP)高于25μg/L的10例(90.9％)；9例腫瘤大于5cm。11例肝細(xì)胞癌標(biāo)本的病理資料詳見表1。
表1、11例肝細(xì)胞癌標(biāo)本的病理資料

本實施例所用癌組織及癌旁組織樣品均為取自同一肝細(xì)胞癌患者的成對樣品，所有11例肝細(xì)胞癌病例有極相似的病例診斷指標(biāo)均為男性，平均年齡48.5歲(31～65歲)，血清檢測hepatitis B病毒感染陽性，11例(100％)屬TNM分級III級。其中，AFP高于25μg/L的10例(93.75％)；9例腫瘤大于5cm。這種取樣方法有利于降低個體間差別對實驗分析工作的影響。
實施例2、差異表達(dá)蛋白的篩選本實施例中使用的尿素、3-[(3-膽酰胺丙基)-二乙銨]-1-丙磺酸(CHAPS)、十二烷基磺酸鈉(SDS)、二硫蘇糖醇(DTT)購自Sigma公司；碘乙酰胺(IAA)、丙烯酰胺、N，N-甲叉雙丙烯酰胺等購自Fluka公司；cleavable ICAT試劑購自Applied BiosystemsFramingham，MA公司。
過硫酸胺(AP)、TEMED、Tri-n-butylphosphat(TBP)、PDQuest軟件等為Bio-Rad產(chǎn)品。
Avidin親和柱購自Applied Biosystems，F(xiàn)ramingham，MA公司。
LCQTMDeca XP system和ProteomeXTMWorkstation購自Thermo Finnigan公司。
所使用的上樣緩沖液的組成為1mol/L Tris-HCl(pH6.8)0.6ml，50％甘油5ml，10％SDS 2ml，巰基乙醇0.5ml，蒸餾水1.9ml，少量六溴酚藍(lán)。
首先采用同位素親和標(biāo)簽與凝膠增強的液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(gel-enhanced liquidchromatography-mass spectrometry coupled with isotope-coded affinity tag，GeLC-MS-ICAT)對實施例1得到的11對蛋白質(zhì)樣品中的其中一對(病例編號為429)肝細(xì)胞癌的癌組織及癌旁組織中的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行篩選鑒定，方法參照2003年Steven P.Gygi發(fā)表在MCP上的文獻(xiàn)(Jiaxu Li.et al.Mol Cell Proteomics.2003 Nov；2(11)1198-204.Epub.2003 Sep.23)，具體過程如下NESP法制備的一對肝細(xì)胞癌癌組織與相應(yīng)癌旁組織蛋白質(zhì)樣品(病例編號為429)，分別取100μg，先用TBP還原蛋白質(zhì)，而后分別用cleavable ICAT試劑(C12和C13)標(biāo)記(其中C12與C13分別對應(yīng)癌組織與相應(yīng)癌旁組織，標(biāo)記方法參照產(chǎn)品說明書)?；旌虾蠹尤脒m量上樣緩沖液，跑5％濃縮膠(上層膠)和7.5％～17.5％分離膠(下層膠)，電泳條件為15mA/膠30min，然后30mA/膠，保持至溴酚藍(lán)前沿入濃縮膠8em左右。
考染染出條帶后，將整個上樣條帶平均切為8份，每份再分別切成1mm3的小塊，在100mM NH4HCO3、30％ACN中脫色，真空冷凍干燥，100μl 50mmol/LNH4HCO3(pH8.3，蛋白質(zhì)胰蛋白酶＝1∶5，w/w)中4℃放置2hr，加入50μl 50mmol/L NH4HCO3(pH8.3)，37℃酶解過夜。
抽提蛋白(60％ACN、0.1％TFA)，真空冷凍干燥。酶解后的每份肽段混合物經(jīng)Avidin親和柱純化出已標(biāo)記肽段后，再用LCQTMProteomeXTMWorkstation進(jìn)行液相串聯(lián)(LC-MS/MS)質(zhì)譜鑒定，Bioworks軟件(Thermo finnigan公司)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫搜索并用relex軟件(Scripps Research Institute，USA)進(jìn)行數(shù)值計算。
運用NESP法和GeLC-MS-ICAT技術(shù)，我們共鑒定到426種有定量關(guān)系的蛋白質(zhì)。其中兩倍以上量變的蛋白質(zhì)共201種，肝細(xì)胞癌癌組織高表達(dá)的有155種蛋白質(zhì)；肝細(xì)胞癌癌旁組織高表達(dá)的有46種蛋白質(zhì)。
用LC-MS/MS質(zhì)譜鑒定、數(shù)據(jù)庫搜索及比值計算得3個含Cys的肽段被總共鑒定到8次，與端粒酶結(jié)合蛋白p23(Telomerase-binding protein p23)相符，氨基酸覆蓋率為20.00％。relex軟件計算結(jié)果顯示端粒酶結(jié)合蛋白p23在肝細(xì)胞癌癌組織中高表達(dá)，癌組織/癌旁組織的比值為3.74(SD＝1.665)，詳細(xì)的鑒定情況及肽段打分結(jié)果見表格2(表格中C*代表C13標(biāo)記的Cys)。
表2、GeLC-MS-ICAT中3個含Cys的肽段的詳細(xì)鑒定結(jié)果

實施例3、端粒酶結(jié)合蛋白p23差異表達(dá)的免疫印跡驗證為確認(rèn)端粒酶結(jié)合蛋白p23的差異表達(dá)，取10位肝細(xì)胞癌患者的癌組織及相應(yīng)癌旁組織蛋白質(zhì)樣品(NESP法制備，表1中除429例以外的其它10例)，用購買的抗端粒酶結(jié)合蛋白p23抗體進(jìn)行免疫印跡分析，具體過程簡述如下每個樣品取20μg蛋白質(zhì)樣品用12％SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜(購自Amersham Biosciences公司)上，一抗使用鼠抗人端粒酶結(jié)合蛋白p23單抗(購自ABRAffinity BioEeagentsTM公司，1∶1000稀釋)，室溫孵育2小時，用TBST(每升含Tris 2.42g，氯化鈉8g，Tween 20ml，用HCl調(diào)節(jié)pH到7.6)洗滌三次，每次5分鐘，二抗為抗鼠抗體(購自Santa Cruz公司，1∶10000稀釋)室溫孵育1小時，再用TBST洗滌三次，每次10分鐘，最后用ECL plus試劑(Amersham Biosciences)反應(yīng)5分鐘后，以X-光片曝光檢測，檢測結(jié)果如圖1所示。同時我們采用beta-actin作為等量上樣的對照(beta-actin單抗購自abcam公司，1∶1000稀釋，二抗為小鼠)，結(jié)果如圖1所示。
圖1的免疫印跡結(jié)果顯示，10對癌組織與癌旁組織基本上是等量上樣，并且10對癌組織與癌旁組織中除三對(317，49，418)不甚明顯外，其余各對均呈現(xiàn)癌組織中端粒酶結(jié)合蛋白p23的雜交條帶的濃度都明顯高于相應(yīng)的癌旁組織的現(xiàn)象；可見端粒酶結(jié)合蛋白p23在肝細(xì)胞癌的癌組織中存在高表達(dá)，該結(jié)果與質(zhì)譜檢測結(jié)果一致。
為了能夠體現(xiàn)更好的應(yīng)用價值，我們隨機挑取了36例肝癌患者的血清(樣品資料見表3)，24例乙肝而非肝癌患者的血清(樣品資料見表4)，36例正常人血清(樣品資料見表5)，隨機進(jìn)行分組(每一組包含一例正常人血清、一例乙肝而非肝癌患者血清，一例肝癌患者血清)，每例樣品取10ug蛋白質(zhì)樣品，同樣運用上述的免疫印跡方法進(jìn)行檢測，同時采用transferrin作為等量上樣的對照(transferrin單抗購自abcam公司，1∶1000稀釋，二抗為小鼠)，結(jié)果如圖2所示。
同時，我們采用R數(shù)據(jù)分析軟件(免費從http://www.r-project.org/下載)對圖2的免疫印跡圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得出蛋白質(zhì)表達(dá)量的相對分布圖，結(jié)果如圖3所示。
從圖2和圖3我們可以看出，所有樣品的上樣量基本相同(從圖3的transferrin中可以得出此結(jié)論)，但是端粒酶結(jié)合蛋白p23在肝癌患者血清中的表達(dá)量明顯的高于正常人血清中的量，可見端粒酶結(jié)合蛋白p23在肝細(xì)胞癌患者的血清中高表達(dá)，該結(jié)果與質(zhì)譜檢測結(jié)果一致。
綜上所述，端粒酶結(jié)合蛋白p23在肝細(xì)胞癌的癌組織及癌旁組織中存在差異表達(dá)，顯然與肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展有著密切的相關(guān)性，因此，以端粒酶結(jié)合蛋白p23作為一個蛋白質(zhì)分子標(biāo)記對其表達(dá)量進(jìn)行檢測可以用于檢測肝細(xì)胞癌。相應(yīng)的，特異性抗端粒酶結(jié)合蛋白p23的抗體，包括各種抗端粒酶結(jié)合蛋白p23的單克隆抗體和多克隆抗體，由于其能夠用于檢測端粒酶結(jié)合蛋白p23的表達(dá)量，因而可以用于檢測肝癌和/或肝癌易感性，或者用于制備檢測肝癌肝癌易感性的制劑，這對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的。
雖然有關(guān)端粒酶結(jié)合蛋白p23動態(tài)的生物學(xué)功能及腫瘤相關(guān)機制還有待進(jìn)一步研究，但是將其作為檢測肝癌或肝癌易感性的標(biāo)記物卻是肯定的。端粒酶結(jié)合蛋白p23可作為肝細(xì)胞癌的潛在標(biāo)志，而其在胞內(nèi)的生物學(xué)功能提示端粒酶結(jié)合蛋白p23可能作為肝癌的預(yù)后分子標(biāo)記和臨床治療的靶分子。
表3、肝癌血清樣品資料

表4、乙肝血清樣品資料

表5、正常血清樣品資料

權(quán)利要求
1.一種端粒酶結(jié)合蛋白p23的應(yīng)用，其特征在于，用作檢測肝癌的蛋白質(zhì)分子標(biāo)記。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述用作檢測肝癌的蛋白質(zhì)分子標(biāo)記是檢測該蛋白在肝細(xì)胞組織中的表達(dá)量。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述檢測該蛋白在肝細(xì)胞組織中的表達(dá)量是檢測該蛋白在肝細(xì)胞組織中是否存在上調(diào)表達(dá)。
4.一種抗端粒酶結(jié)合蛋白p23的抗體的應(yīng)用，其特征在于，用于制備檢測肝癌的制劑。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述抗端粒酶結(jié)合蛋白p23的抗體包括單克隆抗體和多克隆抗體。
6.一種抗端粒酶結(jié)合蛋白p23的抗體的應(yīng)用，其特征在于，用于制備檢測肝癌的試劑盒。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述抗端粒酶結(jié)合蛋白p23的抗體包括單克隆抗體和多克隆抗體。
8.一種體外檢測肝細(xì)胞組織中端粒酶結(jié)合蛋白p23的表達(dá)是否異常的方法，其特征在于包括以下步驟A、用特異性抗端粒酶結(jié)合蛋白p23的抗體檢測待測肝細(xì)胞中端粒酶結(jié)合蛋白p23的數(shù)量；B、將步驟A測得的端粒酶結(jié)合蛋白p23的數(shù)量與正常肝組織中的端粒酶結(jié)合蛋白p23的數(shù)量進(jìn)行比較，如測得的蛋白數(shù)量高于正常值，則表示被檢測肝組織中端粒酶結(jié)合蛋白p23的表達(dá)異常。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述所述抗端粒酶結(jié)合蛋白p23的抗體包括單克隆抗體和多克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明通過篩選在肝細(xì)胞癌的癌組織和癌旁組織中存在差異表達(dá)的蛋白，找到了一種在肝細(xì)胞癌的癌組織中高表達(dá)的蛋白，免疫印跡實驗進(jìn)一步證實了端粒酶結(jié)合蛋白p23的確在肝細(xì)胞癌的癌組織與癌旁組織中存在差異表達(dá)。鑒于端粒酶結(jié)合蛋白p23與肝細(xì)胞癌的這種相關(guān)性，該蛋白可以用作檢測肝細(xì)胞癌的蛋白質(zhì)分子標(biāo)記。
文檔編號G01N33/577GK1952663SQ20061011588
公開日2007年4月25日 申請日期2006年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月26日
發(fā)明者曾嶸, 周曉, 李辰, 袁新雨 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院