專利名稱：測定端粒酶活性的端粒重復(fù)擴(kuò)增－微孔板雜交法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種測定人組織、體液中端粒酶活性的方法。
早期測定端粒酶活性的方法是通過測定細(xì)胞提取物將端粒重復(fù)片段加到一個(gè)合成的寡核苷酸、聚丙烯酰胺凝膠電泳后進(jìn)行放射自顯影，該法敏感度極低，已被淘汰。1994年Kim等建立端粒重復(fù)擴(kuò)增法，該法將端粒酶的反應(yīng)產(chǎn)物應(yīng)用聚合酶反應(yīng)(PCR)大量擴(kuò)增，使測定敏感度提高了104倍，是近幾年來被全世界普遍采用的方法，但該法需將擴(kuò)增產(chǎn)物在聚丙烯酰胺凝膠電泳后進(jìn)行放射自顯影，方法十分繁雜。國內(nèi)有作者用銀染法代替同位素顯影，但方法仍然繁雜，檢測敏感度卻有所下降。1996年德國Boehringer公司用標(biāo)記地高辛探針檢測端粒酶擴(kuò)增產(chǎn)物，推出了端粒酶-ELISA檢測試劑盒，該法極大地簡化了PCR產(chǎn)物檢測操作步驟，4小時(shí)內(nèi)即可得出檢測結(jié)果，但在檢測過程中發(fā)現(xiàn)地高辛標(biāo)記系統(tǒng)不穩(wěn)定，提供的試劑盒不同批號(hào)間常出現(xiàn)較大差異，并且試劑價(jià)格極為昂貴，無法常規(guī)應(yīng)用。
本發(fā)明的目的在于提供一種有較好的測定敏感度與重復(fù)性，簡便快速、成本低的測定端粒酶活性的端粒重復(fù)擴(kuò)增-微孔板雜交法。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種測定端粒酶活性的端粒重復(fù)擴(kuò)增-微孔板雜交法，其與現(xiàn)有技術(shù)的不同之處是依次包括下列步驟①樣本處理、溶解細(xì)胞將組織切片磨勻，并懸浮于冷裂解液中冷凍裂解，離心分離，取上清；②逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增用CX引物逆轉(zhuǎn)錄，用含Ts引物的PCR反應(yīng)液對(duì)上述上清液進(jìn)行擴(kuò)增處理，CX引物為5’CCCT TACCCTTACCCTTACCCTTA,Ts引物序列為5’Biotin AATCCGTCGAGCAGCGTT；③固相與雜交a)包被將Streptavidin固定于微孔板上；b)變性將擴(kuò)增產(chǎn)物用NaOH變性處理；c)雜交與呈色將經(jīng)變性處理的變性混合液在微孔板上與含CF探針的雜交液混合，進(jìn)行雜交反應(yīng)，然后加酶標(biāo)抗體，并用呈色液呈色，用酶標(biāo)儀比色，探針CF為5’FITC-CCCTAACCCTAACCCTAACCCTAAA。
樣本處理時(shí)，采用的冷裂解液是1Ommol/L Tris-HCl,PH7.5,1mmol/L MgCl2,1mmol/L EGTA,0.1mmol/L PMSF,5mmol/Lβ-巰基乙醇，5g/L CHAPS,100g/L甘油。
擴(kuò)增時(shí)，所用PCR反應(yīng)液為10XBuffer5μl,1.5mmol/L MgCl2,0.1g/L明膠,200μmol/L dNTP,O.23μmol/L TS引物，2μTaq酶。
包被的具體步驟是將Streptavidin溶于PH10.0碳酸鹽緩沖液中，10mg/L，于微孔板每孔加100μl,4℃過夜，PH7.4PBS洗，到置于干凈濾紙，使干，4℃貯存?zhèn)溆谩?br> 變性的具體步驟是取O.6mol/LNaOH與擴(kuò)增產(chǎn)物等量混合，室溫10分鐘。
雜交液為0.25gFicoll400、0.25gBSA、0.25gPVP、0.0625g牛DNA，加入20XSSC31.25ml、1mol/L HCl375ml，加H2O至1000ml，含CF探針50mmol/L。
雜交與呈色的具體步驟是于微孔板中加入100μl雜交液、25μl變性混合液，37℃1小時(shí)，PH7.4PBS洗三次，加入酶標(biāo)抗體100μl,37℃30分鐘，洗板，加TMB呈色液100μl,37℃10分鐘，加2mol/L H2SO4100μl，分別于酶標(biāo)儀450nm與690nm比色。
本發(fā)明用熒光素-抗熒光素系統(tǒng)建立了微孔板雜交法，用于端粒酶活性測定具有簡便快速、成本低廉、重復(fù)性好敏感度高等優(yōu)點(diǎn)，尤其適用于判斷良、惡性胸腹水。
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明一種測定端粒酶活性的端粒重復(fù)擴(kuò)增-微孔板雜交法，依次包括下列步驟①樣本處理取組織50～100mg用手術(shù)刀片切成薄片、研磨均勻，組織碎片懸浮于冷裂解液(10mmol/L Tris-HCl,PH7.5,1mmol/L MgCl2,1mmol/L EGTA,0.1mmol/L PMSF,5mmol/Lβ-巰基乙醇，5g/L CHAPS,100g/L甘油)中，冰水浴30分鐘，12000rpm離心30分鐘，4℃，取上清迅速置-30℃。
②逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增于0.2ml離心管底加5.75μmol/L CX引物(5’CCCTTACCCTTACCCTTACCCTTA)2μl，加10μl低熔點(diǎn)石蠟，(Paraffin wax,Aldrich)，在石蠟?zāi)毯蠹?6μl PCR反應(yīng)液，其終濃度為10XBuffer5μl,1.5mmol/L MgCl2,0.1g/L明膠，200μmol/L dNTP,0.23μmol/L TS引物，2μTaq酶。其中TS引物序列為5’Biotin AATCCGTCGAGCAGCGTT。測定時(shí)加入樣本處理上清液2μl,25℃30分鐘，94℃5分鐘，94℃30秒、50℃30秒、72℃90秒，30個(gè)循環(huán)，72℃10分鐘。
③固相與雜交a)包被將Streptavidin溶于PH10.0碳酸鹽緩沖液中，10mg/L，于微孔板每孔加100μl,4℃過夜，PH7.4PBS洗三次，倒置于干凈濾紙，使干，4℃貯存?zhèn)溆谩?br> b)變性取0.6mol/LNaOH與擴(kuò)增產(chǎn)物等量混合，室溫10分鐘。
c)雜交與呈色于微孔板中加入100μl雜交液(0.25gFicoll400、0.25gBSA、0.25gPVP、0.0625g牛DNA，加入20XSSC31.25ml、1mol/L HCl375ml，加H2O至1000ml，含CF探針50mmol/L，探針CF為5’FITC-CCCTAACCCTAACCCTAACCCTAAA),25μl變性混合液，37℃1小時(shí)，PH7.4PBS洗三次，加入酶標(biāo)抗體(臨用前用PH7.4PBS1:1000稀釋)100μl,37℃30分鐘，洗板三次，加TMB呈色液100μl,37℃10分鐘，加2mol/L H2SO4100μl，分別于酶標(biāo)儀450nm與690nm比色。
權(quán)利要求
1.一種測定端粒酶活性的端粒重復(fù)擴(kuò)增-微孔板雜交法，其特征在于依次包括下列步驟①樣本處理、溶解細(xì)胞將組織切片磨勻，并懸浮于冷裂解液中冷凍裂解，離心分離，取上清；②逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增用CX引物逆轉(zhuǎn)錄，用含Ts引物的PCR反應(yīng)液對(duì)上述上清液進(jìn)行擴(kuò)增處理，CX引物為5’CCCT TACCCTTACCCTTACCCTTA,Ts引物序列為5’Biotin AATCCGTCGAGCAGCGTT；③固相與雜交a)包被將Streptavidin固定于微孔板上；b)變性將擴(kuò)增產(chǎn)物用NaOH變性處理；c)雜交與呈色將經(jīng)變性處理的變性混合液在微孔板上與含CF探針的雜交液混合，進(jìn)行雜交反應(yīng)，然后加酶標(biāo)抗體，并用呈色液呈色，用酶標(biāo)儀比色，CF探針為針CF5’FITC-CCCTAACCCTAACCCTAACCCTAAA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定端粒酶活性的端粒重復(fù)擴(kuò)增-微孔板雜交法，其特征在于樣本處理時(shí)，采用的冷裂解液是10mmol/L Tris-HCl,PH7.5,1mmol/L MgCl2,1mmol/L EGTA,0.1mmol/L PMSF,5mmol/L B-巰基乙醇，5g/LCHAPS,100g/L甘油。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的測定端粒酶活性的端粒重復(fù)擴(kuò)增-微孔板雜交法，其特征在于擴(kuò)增時(shí)，所用PCR反應(yīng)液為10XBuffer5μl,1.5mmol/L MgCl2,0.1g/L明膠，200μmol/L dNTP,0.23μmol/L TS引物，2μTaq酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的測定端粒酶活性的端粒重復(fù)擴(kuò)增-微孔板雜交法，其特征在于包被的具體步驟是將Streptavidin溶于PH10.0碳酸鹽緩沖液中，10mg/L，于微孔板每孔加100μl,4℃過夜，PH7.4PBS洗，到置于干凈濾紙，使干，4℃貯存?zhèn)溆谩?br> 5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的測定端粒酶活性的端粒重復(fù)擴(kuò)增-微孔板雜交法，其特征在于變性的具體步驟是取0.6mol/LNaOH與擴(kuò)增產(chǎn)物等量混合，室溫10分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定端粒酶活性的端粒重復(fù)擴(kuò)增-微孔板雜交法，其特征在于雜交液為0.25gFicoll400、0.25gBSA、0.25gPVP、0.0625g牛DNA，加入20XSSC31.25ml、1mol/L HCl375ml，加H2O至1000ml，含CF探針50mmol/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的測定端粒酶活性的端粒重復(fù)擴(kuò)增-微孔板雜交法，其特征在于雜交與呈色的具體步驟是于微孔板中加入100μl雜交液、25μl變性混合液，37℃1小時(shí)，PH7.4PBS洗三次，加入酶標(biāo)抗體100μl,37℃ 30分鐘，洗板，加TMB呈色液100μl,37℃10分鐘，加2mol/L H2SO4100μl，分別于酶標(biāo)儀450nm與690nm比色。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種測定端粒酶活性的端粒重復(fù)擴(kuò)增—微孔板雜交法,依次包括樣本處理、擴(kuò)增、包被、變性、雜交與呈色等步驟,本發(fā)明用于端粒酶活性測定具有簡便快速、成本低廉、重復(fù)性好、敏感度高等優(yōu)點(diǎn),尤其適用于判斷良、惡性胸腹水。
文檔編號(hào)C12Q1/00GK1230598SQ9811164
公開日1999年10月6日 申請(qǐng)日期1998年12月29日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月29日
發(fā)明者王惠民, 瞿曉慈, 張冬雷, 施健, 劉俊華, 楊振華 申請(qǐng)人:南京醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院