專利名稱：人類的端粒酶催化亞單位的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼端粒酶和相關(guān)的多肽的催化亞單位的新的核酸。特別是，本發(fā) 明涉及人類端粒酶的催化亞單位。本發(fā)明提供了涉及醫(yī)藥，分子生物學(xué)，化學(xué)，藥理 學(xué)，和醫(yī)學(xué)診斷和預(yù)測(cè)技術(shù)的方法和組合物。
背景技術(shù)：
下面的討論是打算將本發(fā)明領(lǐng)域介紹給讀者。長(zhǎng)期以來人們認(rèn)為真核染色體末端的完全復(fù)制需要特異性的細(xì)胞成分(Watson， 1972，自然，新生物學(xué)，239: 197 ； Olovnikov, 1973，理論生物學(xué)雜志，41: 181)。由 常規(guī)DNA聚合酶進(jìn)行的線性DNA鏈的復(fù)制需要RNA引物，并且能夠僅引導(dǎo)從5’到3’ 進(jìn)行復(fù)制。當(dāng)結(jié)合在真核染色體DNA鏈的極端的5’末端的RNA被去除時(shí)，導(dǎo)入了一 個(gè)缺口，導(dǎo)致隨著復(fù)制的各輪的進(jìn)行，子鏈逐漸縮短。據(jù)認(rèn)為端粒，物理結(jié)構(gòu)定位于染 色體末端的蛋白質(zhì)-DNA結(jié)構(gòu)的縮短與由于正常人類的體細(xì)胞在體外和體內(nèi)的細(xì)胞的衰 老或老化現(xiàn)象相關(guān)(參見，例如Goldstein，1990，科學(xué)249 1129 ； Mrtin等人，1979， 實(shí)驗(yàn)室調(diào)研23: 86; Goldstein,等人，1969，美國(guó)科學(xué)院年報(bào)64: 155 ；和Schneider禾口 Mitsui, 1976，美國(guó)科學(xué)院年報(bào)73: 3584)。因此端粒酶的長(zhǎng)度和完整與細(xì)胞入老化期有關(guān)(即喪失增殖能力)。但是，細(xì)胞 保持(或增加)端粒長(zhǎng)度的能力允許細(xì)胞逃脫老化，即變成永生。已經(jīng)在許多系統(tǒng)中調(diào)研了端粒酶和端粒DNA的結(jié)構(gòu)(參見，例如Harley和 Villeponteau, 1995, Curr.Opin.Genet.Dev.5 249) 在大多數(shù)生物體，端粒 DNA 由串 聯(lián)排列的非常簡(jiǎn)單的序列組成；對(duì)于人類和其它脊椎動(dòng)物端粒DNA由成百上千的串聯(lián) 重復(fù)的序列TTAGGG組成。用于測(cè)定和調(diào)節(jié)細(xì)胞的端粒長(zhǎng)度的方法描述于PCT公開 W093/23572 和 W096/41016。端粒的維持是已知為端粒酶的端粒特異性DNA聚合酶的作用。端粒酶是核糖 核蛋白質(zhì)(RNP)，它利用其RNA成分的一部分作為端粒重復(fù)DNA合成的模板(Morin， 1997，歐洲癌癥雜志 33 750 ； Yu 等人，1990，自然 344 126 ； Singer 和 Gottschl ing，1994，科學(xué) 266: 404 ； Autexier 和 Grei der，1994，基因發(fā)展，8: 563 ； Gil ley 等 人類，1995，基因發(fā)展，9 2214 ； McEachern 和 Blackburn，1995，自然 367 403 ； Blackburn, 1992，生物化學(xué)分析和綜述，61 113 ； Greider, 1996，生物化學(xué)分析和綜 述，65:337)。人類和其它端粒酶的RNA成分已經(jīng)被克隆和定性(參見，PCT公開 W096/01835和Feng等人，1995，科學(xué)269 1236)。但是，端粒酶的蛋白質(zhì)成分的定性 已經(jīng)是困難。部分原因是因?yàn)榧兓肆Ｃ窻NP證明是困難的，在其被表達(dá)的細(xì)胞中RNP 以非常低的水平存在。例如已經(jīng)估測(cè)已知表達(dá)高水平的端粒酶活性的人類細(xì)胞每個(gè)細(xì)胞 僅僅具有約100個(gè)酶分子。
與端粒和端粒酶與細(xì)胞的增殖能力(即細(xì)胞不定期分裂的能力)的關(guān)系相一 致，在永生的細(xì)胞系和非常多樣化的腫瘤組織組中檢測(cè)到端粒酶活性，但是在正常的體 細(xì)胞培養(yǎng)物或與腫瘤鄰接的正常的組織沒有檢測(cè)到(即，沒有或低于測(cè)試的界限)(參 見，例如美國(guó)專利 5,629,154 ； 5,489,508 ； 5,648,215 ；和 5,639,613 ；參見例如，Morin, 1989，細(xì)胞，59: 521 ； Shay 和 Bacchetti 1997，歐洲癌癥雜志 33: 787 ； Kim 等人， 1994，科學(xué) 266: 2011 ； Counter 等人，1992，EMBO J. 11 1921 ； Counter 等人，1994， 美國(guó)科學(xué)院年報(bào)91，2900 ； Counter等人，1994，病毒學(xué)雜志68 : 3410)。但是，腫瘤 中端粒酶活性的水平和患者的可能的臨床結(jié)果之間的關(guān)系已經(jīng)有人報(bào)道(例如，美國(guó)專 利5,639,613，見上文；Langford等人類+，1997，人類病理學(xué)28 416)。在人類的生 殖細(xì)胞，增殖的莖干或祖先細(xì)胞和失活的淋巴細(xì)胞中也已經(jīng)檢測(cè)到端粒酶活性。在體 細(xì)胞莖干或祖先細(xì)胞，和在活化的淋巴細(xì)胞中，通常端粒酶活性是非常低的或僅僅瞬間 表達(dá)(參見，Chiu等人類，1996，莖干細(xì)胞14 239 ； Bodnar等人類，1996，Exp.Cell Res.228 58; Taylor 等人類，1996，皮膚研究雜志 106 759)。人類端粒酶是診斷和治療與細(xì)胞增殖和老化相關(guān)的疾病，例如癌癥的理想 的靶。用于診斷和治療癌癥和其它端粒酶相關(guān)的人類疾病的方法描述于美國(guó)專利 5,489,508，5,639,613，和5,645,986。通過監(jiān)測(cè)端粒酶預(yù)測(cè)腫瘤進(jìn)展的方法描述于美國(guó)專 利5,639,613。人類端粒酶的催化蛋白質(zhì)亞單位的發(fā)現(xiàn)和定性提供了額外的用于端粒酶和 用于疾病診斷和治療的有用的測(cè)試。但是，催化蛋白質(zhì)亞單位的一級(jí)序列的克隆和測(cè)定 允許更有效地治療人類癌癥和與細(xì)胞增殖能力和老化相關(guān)的其他疾病。

發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明提供了端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白質(zhì)或其變異體，或其片段的分離的，基本上 純化的，或重組蛋白質(zhì)制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)的特征在于具有包括下列氨基 酸序列的限定的基序Trp-RfX7-R1-R1-R2-X-Phe-Phe-Tyr-X-Thr-Glu-X8_9-R3-R3-Arg-R4- X2-Trp其中X是任何氨基酸和下方角標(biāo)是指連續(xù)的殘基的數(shù)目，Rl是亮氨酸或異亮氨 酸，R2是谷氨酸或精氨酸，R3是苯丙氨酸或酪氨酸，和R4是賴氨酸或組氨酸。在一個(gè) 實(shí)施方案中，該蛋白質(zhì)具有人類TRT的序列。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及與這樣的 蛋白質(zhì)的亞序列共享基本的序列等同性的肽和多肽。在相關(guān)的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了編碼端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白質(zhì)的分離的，基 本上純化的或重組的核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，該核酸編碼包括氨基酸序列的蛋白質(zhì)Trp-R1-X7-R1-R1-R2-X-Phe-Phe-Tyr-X-Thr-Glu-X8-9-R3-R3-Arg-R4-X2-Trp。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，該核酸具有編碼人類TRT蛋白質(zhì)的序列。在其它實(shí)施方案中，本 發(fā)明提供了與這樣的核酸序列共享基本序列等同性的寡聚核苷酸和多聚核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶ChTRT)蛋白質(zhì)。因此， 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了 hTRT蛋白質(zhì)或其變異體，或其片段的分離的，基本 上純化的，或重組蛋白質(zhì)制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，該蛋白質(zhì)的特征在于具有與附圖 17 (SEQUENCE ID NO 2)的hTRT蛋白質(zhì)或其變異體，或其片段具有至少約75%或至 少約80%序列等同性的氨基酸序列。在相關(guān)的方面，hTRT蛋白質(zhì)具有SEQUENCE ID NO 2的序列。在一些實(shí)施方案中，該蛋白質(zhì)具有一個(gè)或多個(gè)端粒酶活性，例如催化活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，hTRT蛋白質(zhì)片段具有至少6個(gè)氨基酸殘基。在其它實(shí)施方案 中，hTRT蛋白質(zhì)片段具有天然存在的hTRT多肽的至少約8個(gè)，至少約10個(gè)，至少約12 個(gè)，至少約15個(gè)或至少約20個(gè)鄰接的氨基酸殘基。仍然在其它實(shí)施方案中，hTRT蛋白 質(zhì)片段具有至少約50或至少約100個(gè)氨基酸殘基。本發(fā)明也提供了包括hTRT蛋白質(zhì)和RNA的組合物。該RNA可以是端粒酶 RNA,例如人類端粒酶RNA。在一個(gè)實(shí)施方案中，hTRT蛋白質(zhì)和人類端粒酶RNA ChTR) 形成具有端粒酶活性的核糖核蛋白復(fù)合物。 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包括hTRT蛋白質(zhì)的分離的人類端粒酶，例如 包括hTRT蛋白質(zhì)和包括hTR的基本上純化的人類端粒酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，，端粒 酶是至少約95%純化的。該端粒酶是從表達(dá)端粒酶活性的細(xì)胞，例如重組宿主細(xì)胞中分 離的。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包括編碼hTRT蛋白質(zhì)的核酸序列的分離的，合成 的基本上純化的或重組的多核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，該多聚核苷酸具有編碼具有附

圖17 (SEQUENCE ID NO 2)列出的氨基酸序列或在所述氨基酸序列中包括一個(gè)或多個(gè) 保守的氨基酸(或密碼子)替代或一個(gè)或多活性改變的氨基酸(或密碼子)替代的序列的 hTRT蛋白質(zhì)的核苷酸序列。在相關(guān)的方面，該多聚核苷酸在嚴(yán)格條件下與具有附圖16 列出序列(SEQUENCE ID NO: 1)的多聚核苷酸雜交。在另一個(gè)相關(guān)的方面，當(dāng)與附圖 16列出核苷酸序列(SEQUENCE ID NO: 1)相比時(shí)，利用具有缺席參數(shù)的BLAST算法， 該多聚核苷酸的核苷酸序列具有低于約0.5的最小的總數(shù)的可能性。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了具有可操作連接到編碼hTRT蛋白質(zhì)的序列的啟動(dòng) 子序列的多聚核苷酸。該啟動(dòng)子可以是除了天然存在的hTRT啟動(dòng)子以外的啟動(dòng)子。在 相關(guān)的方面，本發(fā)明提供了包括hTRT啟動(dòng)子的表達(dá)載體。本發(fā)明也提供了長(zhǎng)度至少為10個(gè)核苷酸的分離的，合成的，基本上純化的或重 組的多核苷酸，它包括與天然存在的hTRT基因或hTRT mRNA的鄰接序列相同或精確互 補(bǔ)的至少10個(gè)核苷酸的鄰接序列。在一些實(shí)施方案中，該多聚核苷酸是RNA，DNA, 或含有一個(gè)或多個(gè)非天然存在的，合成的核苷酸。在一個(gè)方面，該多聚核苷酸與天然存 在的hTRT基因或hTRT mRNA的至少10個(gè)鄰接核苷酸的鄰接序列相同或精確互補(bǔ)。例 如，該多聚核苷酸可以是反義多聚核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，反義的多聚核苷酸包括 至少約20個(gè)核苷酸。本發(fā)明進(jìn)一步提供了通過將重組hTRT蛋白質(zhì)與端粒酶成分在一定的條件下接觸 制備重組端粒酶的方法，所述條件是便于所述的重組蛋白質(zhì)和所述的端粒酶RNA成分結(jié) 合以形成能夠純化核苷酸加入到端粒酶底物的端粒酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，hTRT蛋白 質(zhì)具有附圖17列出的序列(SEQUENCE ID NO 2)。該hTRT蛋白質(zhì)可以是在體外表達(dá) 系統(tǒng)產(chǎn)生的并且與端粒酶RNA混合，或在另一個(gè)實(shí)施方案中，該端粒酶RNA可以是在體 外表達(dá)系統(tǒng)中共表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該端粒酶RNA是hTR。在另一個(gè)可選擇的 實(shí)施方案中，所述的接觸出現(xiàn)于細(xì)胞中，例如人類細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，該細(xì)胞在 hTRT和該RNA接觸之前或在導(dǎo)入，例如通過轉(zhuǎn)染hTRT多聚核苷酸之前不具有端粒酶活 性。在一個(gè)實(shí)施方案中，端粒酶RNA由所述的細(xì)胞天然地表達(dá)。本發(fā)明也提供了含有本發(fā)明的重組多聚核苷酸例如具有可操作連接到一個(gè)啟動(dòng)子上的hTRT蛋白質(zhì)編碼序列的多核苷酸的細(xì)胞，例如人類細(xì)胞，鼠，或酵母細(xì)胞。在 特定的方面，細(xì)胞是脊椎動(dòng)物細(xì)胞，例如來自于哺乳動(dòng)物，例如人類的細(xì)胞，并且相對(duì) 于其它方面相同但是不具有所述的重組多聚核苷酸的細(xì)胞而言具有增加的增殖能力，或 相對(duì)于其它方面相同但是不具有所述的重組多聚核苷酸的細(xì)胞而言具有增加的端粒酶活 性。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是永生的細(xì)胞。 在相關(guān)的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包括編碼人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶多肽的多聚 核苷酸的生物體和細(xì)胞，例如轉(zhuǎn)基因非人類生物體例如酵母，植物，細(xì)菌或非人類動(dòng) 物，例如小鼠。本發(fā)明也提供了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和細(xì)胞，其中已經(jīng)缺失(敲出)了 hTRT基 因或進(jìn)行了突變以致于該基因不表達(dá)天然存在的hTRT基因產(chǎn)物。因此，在另一種可選 的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因非人類動(dòng)物具有突變的端粒酶基因，是端粒酶活性缺陷的動(dòng)物， 是一種其TRT缺陷是由于編碼TRT的突變基因引起的動(dòng)物，所述TRT與野生型的TRT相 比，具有降低的端粒酶活性水平的并且是具有攜帶一個(gè)或多個(gè)突變包括錯(cuò)義突變，無義 突變，插入或缺失的突變TRT基因的動(dòng)物。本發(fā)明也提供了特異性地與hTRT蛋白質(zhì)結(jié)合的分離或重組抗體，或其片段。在 一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體與以至少IO8M-1的親和力結(jié)合。該抗體可以是單克隆或可以是 多克隆組合物，例如多克隆抗血清。在相關(guān)的方面，本發(fā)明提供了能夠分泌該抗體的細(xì) 胞，例如雜交瘤。本發(fā)明也提供了測(cè)定化合物或治療劑是否是端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶活性或hTRT表達(dá)的 調(diào)節(jié)劑的方法。該方法涉及檢測(cè)或監(jiān)測(cè)在該化合物或治療劑給藥之后，在細(xì)胞，動(dòng)物或 包括hTRT蛋白質(zhì)或多聚核苷酸的組合物中活性或表達(dá)的變化。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方 法包括步驟提供了 TRT組合物，將TRT與測(cè)試化合物接觸，測(cè)量TRT的活性，其中在 測(cè)試化合物存在下TRT活性的變化是所述測(cè)試化合物調(diào)節(jié)TRT活性的指示劑。在一些實(shí) 施方案中，所述組合物是細(xì)胞，生物體，轉(zhuǎn)基因生物體或體外系統(tǒng)，例如表達(dá)系統(tǒng)，它 含有編碼hTRT多肽的重組多聚核苷酸。因此，該方法的hTRT可以是體外表達(dá)產(chǎn)物。在 各種實(shí)施方案中，可以通過檢測(cè)hTRT基因產(chǎn)物的豐度的變化，監(jiān)測(cè)核苷酸標(biāo)記物摻入到 端粒酶的底物，監(jiān)測(cè)探針與延伸的端粒酶底物的雜交，監(jiān)測(cè)延伸的端粒酶底物的擴(kuò)增， 監(jiān)測(cè)與測(cè)試化合物接觸的細(xì)胞的端粒長(zhǎng)度，監(jiān)測(cè)端粒酶與染色體結(jié)合能力的喪失，或測(cè) 量端粒結(jié)構(gòu)的積累或喪失而進(jìn)行端粒酶活性或表達(dá)的檢測(cè)。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了通過將生物學(xué)樣品與特異性地與基因產(chǎn)物結(jié)合的探 針接觸而檢測(cè)生物學(xué)樣品中hTRT基因產(chǎn)物的方法，其中該探針與基因產(chǎn)物形成復(fù)合物， 和檢測(cè)該復(fù)合物，其中該復(fù)合物的存在與生物學(xué)樣品中的hTRT基因產(chǎn)物的存在相關(guān)。該 基因產(chǎn)物可以是RNA，DNA或多肽。可以用于檢測(cè)的探針的例子包括，但不限于核酸 和抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，基因產(chǎn)物是通過擴(kuò)增該基因和檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物而檢測(cè)的核 酸，其中復(fù)合物或擴(kuò)增產(chǎn)物的存在與生物學(xué)樣品中的hTRT基因產(chǎn)物的存在相關(guān)。在一個(gè)實(shí)施方案中，生物學(xué)樣品是來自于患者，例如人類患者。在另一個(gè)實(shí)施 方案，生物學(xué)樣品包括至少來自于體外細(xì)胞培養(yǎng)物例如人類細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步提供了檢測(cè)包括人類細(xì)胞的生物學(xué)樣品中至少一種永生或端粒酶 陽性人類細(xì)胞的存在的方法，包括獲得包括人類細(xì)胞的生物學(xué)樣品；和檢測(cè)該樣品中具有高水平的hTRT基因產(chǎn)物的細(xì)胞的存在，其中具有高水平的hTRT基因產(chǎn)物的細(xì)胞的存 在與生物學(xué)樣品中一種永生或端粒酶陽性細(xì)胞的存在相關(guān)。本發(fā)明也提供了用于診斷端粒酶相關(guān)狀況的方法，該方法包括從患者獲得的細(xì) 胞或組織樣品；測(cè)定細(xì)胞或組織中hTRT基因產(chǎn)物的量；和將細(xì)胞或組織中hTRT基因產(chǎn) 物的量與健康細(xì)胞或相同類型的組織的量進(jìn)行比較，其中來自于患者和健康細(xì)胞或組織 的樣品的hTRT基因產(chǎn)物的不同量可以診斷端粒酶相關(guān)的狀況。在一個(gè)實(shí)施方案中，端 粒酶相關(guān)的狀況是癌癥和在該樣品中檢測(cè)到較大的hTRT基因產(chǎn)物的量。本發(fā)明進(jìn)一步提供了診斷癌癥患者的方法，該方法包括從患者獲得生物學(xué)樣 品；檢測(cè)患者樣品中hTRT基因產(chǎn)物，其中樣品檢測(cè)到的hTRT基因產(chǎn)物與癌癥的診斷相 關(guān)。本發(fā)明進(jìn)一步提供了診斷患癌癥者的方法，該方法包括獲得生物學(xué)樣品；檢測(cè) 患者樣品中hTRT基因產(chǎn)物的量，和將hTRT基因產(chǎn)物的量與正?；?qū)φ罩档牧窟M(jìn)行比 較，其中大于正?；?qū)φ罩档幕颊叩膆TRT基因產(chǎn)物的量可以診斷為癌癥。本發(fā)明也提供了診斷癌癥患者的方法，該方法包括獲得含有至少一個(gè)細(xì)胞的生 物學(xué)樣品；測(cè)定樣品中細(xì)胞的hTRT基因產(chǎn)物的量，和將細(xì)胞的hTRT基因產(chǎn)物的量與細(xì) 胞的正常值進(jìn)行比較，其中大于正常值的hTRT基因產(chǎn)物的量可以診斷為癌癥。在一個(gè) 實(shí)施方案中，據(jù)信該樣品含有至少一個(gè)惡性細(xì)胞。本發(fā)明也提供了預(yù)測(cè)癌癥患者的方法，包括測(cè)定從患者獲得的癌癥細(xì)胞中hTRT 基因產(chǎn)物的量，和將癌癥細(xì)胞的hTRT基因產(chǎn)物的量與預(yù)測(cè)的與癌癥的預(yù)測(cè)一致的hTRT 的值進(jìn)行比較；其中作為預(yù)測(cè)值的樣品的hTRT的量提供了特定的預(yù)測(cè)。本發(fā)明也提供了監(jiān)測(cè)降低患者的癌癥細(xì)胞的增殖能力的抗癌癥治療能力的方 法，該方法包括從患者的至少一個(gè)癌癥細(xì)胞中第一次測(cè)量hTRT基因產(chǎn)物的量；從患者的 至少一個(gè)癌癥細(xì)胞中第二次測(cè)量hTRT基因產(chǎn)物的量，其中在第二次測(cè)量之前該患者以抗 癌癥治療劑給藥；和將第一次測(cè)量和第二次測(cè)量進(jìn)行比較，其中第二次測(cè)量的較低水平 的hTRT基因產(chǎn)物與降低患者的癌癥細(xì)胞的增殖能力的抗癌癥治療相關(guān)。本發(fā)明也提供了用于檢測(cè)hTRT基因或基因產(chǎn)物的試劑盒。在一個(gè)實(shí)施方案中， 該試劑盒包括含有選自于hTRT核酸或其亞序列，hTRT多肽或其亞序列的分子，和抗 hTRT抗體的容器。本發(fā)明也提供了治療人類疾病的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于 增加脊椎動(dòng)物細(xì)胞的增殖能力的方法，該方法包括將重組多核苷酸導(dǎo)入到細(xì)胞，其中所 述的多核苷酸包括編碼hTRT多肽的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，hTRT多肽具有顯示于附 圖17的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，該序列可操作連接到一個(gè)啟動(dòng)子上。在一個(gè)實(shí)施方 案中，該hTRT具有端粒酶的催化活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞是人類細(xì)胞，例如人 類患者的細(xì)胞。在另一種可選的實(shí)施方案中，將細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)。在相關(guān)的實(shí)施方案 中，將該細(xì)胞導(dǎo)入到人類患者。 本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于治療人類疾病的方法，該方法包括將重組hTRT多核苷 酸導(dǎo)入到患者的至少一個(gè)細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用了基因治療載體。在一個(gè)相關(guān) 的實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步由將包括編碼hTR序列的多核苷酸，例如可操作連接到啟 動(dòng)子的hTR多核苷酸導(dǎo)入到細(xì)胞組成。
本發(fā)明也提供了用于增加脊椎動(dòng)物細(xì)胞的增殖能力的方法，所述方法包括將有效量的hTRT多肽導(dǎo)入到細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，hTRT多肽具有端粒酶 催化活性。本發(fā)明進(jìn)一步提供了具有增加的增殖能力的細(xì)胞和細(xì)胞子代。

本發(fā)明也提供了用于治療與細(xì)胞內(nèi)增高水平的端粒酶活性相關(guān)的狀況的方法， 包括將治療有效量的所述端粒酶活性的抑制劑導(dǎo)入到細(xì)胞，其中所述的抑制劑是hTRT多 肽或hTRT多核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，抑制劑是多肽或多核苷酸，包括至少例如顯示 于附圖16，17或20的序列的亞序列。在其他實(shí)施方案中，多肽或多核苷酸抑制了 TRT 活性，例如將內(nèi)源性TRT與端粒酶RNA結(jié)合。本發(fā)明也提供了包括hTRT多肽和佐劑的疫苗。本發(fā)明也提供了含有藥物學(xué)可 接受載體和選自于hTRT多肽，編碼hTRT多肽的多核苷酸，和hTRT核酸或其亞序列 的分子的藥物組合物。附圖簡(jiǎn)述附圖1顯示來自于人類，粟灑裂殖酵母(tezl)，啤酒酵母(EST2)和Euplotes aediculatus(pl23)的TRT基序中的高度保守的殘基。用星號(hào)(*)(稍微上抬)表示相同的 氨基酸，而類似的氨基酸用點(diǎn)(·)表示。附圖的基序“0”也被稱之為基序T ；基序
“3”也被稱之為基序A。附圖2顯示端粒酶特異性的和RT特異性的端粒酶蛋白質(zhì)和其它逆轉(zhuǎn)錄酶的序列 基序的定位。盒子表示端粒酶特異性的基序T和保守的RT基序1，2和A-E的定位。 開口的長(zhǎng)方形標(biāo)記的HIV-IRT描述了顯示于附圖3的蛋白質(zhì)的部分。附圖3顯示了 Hiv-I逆轉(zhuǎn)錄酶的p66亞單位的晶體結(jié)構(gòu)CBrookhaven密碼 1HNV)。該觀點(diǎn)是根據(jù)右手的背部以便能夠顯示所有的基序。附圖4顯示了端粒酶RTs(Sp-Trtlp，粟灑裂殖酵母TRT (本文也稱之為 “tezlp” ) ； hTRT,人類 TRT ； Ea_pl23，Euplotesp 123 ； Sc_Est2p，啤酒酵母 Est2p)和
其它RT家族成員(Sc-al，來自于啤酒酵母線粒體的細(xì)胞色素氧化酶組II內(nèi)含子1-編碼 的蛋白質(zhì)，Dm-TART，來自于Drosophila melanogasterTART非-LTR可反相轉(zhuǎn)座的元件 的逆轉(zhuǎn)錄酶；HIV-1，人類免疫缺陷病毒逆轉(zhuǎn)錄酶)的多個(gè)序列的排列。TRT con和RT con代表用于端粒酶RTs和非端粒酶RTs的共有序列。用h，疏水；p，極性；c，帶電， 命名氨基酸。三角表示在端粒酶蛋白質(zhì)之間保守的，但是在其它RTs中不同的殘基?；?序E下面的實(shí)體線突出該引物控制區(qū)域。附圖5顯示了 hTRT RNA在如實(shí)施例2描述的端粒酶陰性的可滅細(xì)胞株和端粒酶 陽性的不滅細(xì)胞株中的表達(dá)。附圖6顯示了端粒酶的系統(tǒng)樹和以RNA依賴性RNA聚合酶為根部的逆轉(zhuǎn)錄因子。附圖7顯示λ克隆GO5的限制性圖譜。附圖8顯示具有標(biāo)明了 STS標(biāo)記物D5S678 (定位于hTRT基因附近)定位的染 色體5p的圖譜。附圖9顯示hTRT啟動(dòng)子報(bào)道質(zhì)粒的構(gòu)建。附圖10，在2頁上，顯示hTRT和hTR在體外共表達(dá)以產(chǎn)生具有催化活性的人
端粒酶。
附圖11，在2頁上，顯示來自于4個(gè)TRT蛋白質(zhì)的序列的比較和鑒別需要的基 序。TRTcon顯示TRT共有序列。RTcon顯示其它逆轉(zhuǎn)錄酶的共有殘基。對(duì)于上面的情 況，表示共有殘基在TRT蛋白質(zhì)中絕對(duì)的保守。附圖12顯示hTRT內(nèi)含子的拓?fù)洚悩?gòu)酶II裂解位點(diǎn)和NFkB結(jié)合位點(diǎn)基序，并 且顯示了對(duì)應(yīng)于SEQUENCE ID NO 7的序列。附圖13，在2頁上，顯示編碼Euplotesl23千道爾頓端粒酶蛋白質(zhì)亞單位 (EuplotesTRT)的 DNA 的序列。附圖14顯示Euplotesl23千道爾頓端粒酶蛋白質(zhì)亞單位(EuplotespTRT蛋白質(zhì))
的氨基酸的序列。

附圖15，在5頁上，顯示粟灑裂殖酵母端粒酶催化亞單位(粟灑裂殖酵母TRT) 的DNA和氨基酸序列。附圖16，在2頁上，顯示hTRT c DNA的序列，并且顯示了對(duì)應(yīng)于SEQUENCE ID NO 1的序列。附圖17顯示由附圖16的cDNA編碼的hTRT蛋白質(zhì)，所顯示的蛋白質(zhì)序列對(duì)應(yīng) 于 SEQUENCE ID NO 2。附圖18顯示克隆712562的序列，并且顯示了對(duì)應(yīng)于SEQUENCE IDNO 3的序列。附圖19顯示由克隆712562的序列編碼的259個(gè)殘基蛋白質(zhì)，所顯示的序列對(duì)應(yīng) 于 SEQUENCE ID NO 10。附圖20，在7頁上，顯示具有編碼Δ 182變異體多肽的開放讀框的核酸序列，所 顯示的序列對(duì)應(yīng)于SEQUENCE ID NO 4。該附圖也顯示Δ 182變異體多肽的氨基酸序 列，所顯示的氨基酸序列對(duì)應(yīng)于SEQUENCE IDNO 5。附圖21，在6頁上，顯示來自于hTRT基因組克隆的序列，所顯示的序列對(duì)應(yīng)于 SEQUENCE ID NO 6。指明了共有基序和元件，包括拓?fù)洚悩?gòu)酶II裂解位點(diǎn)，NFkB結(jié) 合位點(diǎn)，和Alu序列和其它序列元件序列特性。附圖22顯示TRT基因的突變?cè)诮湍钢械淖饔?，如?shí)施例1描述的。附圖23 顯示 EST AA281296 的序列，對(duì)應(yīng)于 SEQUENCE ID NO 8。附圖24顯示缺失182堿基對(duì)的克隆712562的序列，所顯示的序列對(duì)應(yīng)于 SEQUENCE ID NO 9。附圖25顯示用于來自于BJ細(xì)胞的端粒酶活性的測(cè)試結(jié)果，所述的細(xì)胞用編碼 hTRT蛋白質(zhì)的表達(dá)載體(pGRN133)或?qū)φ召|(zhì)粒(pBBS212)轉(zhuǎn)染，如實(shí)施例13描述的。附圖26是顯示結(jié)合和替代洗脫步驟的端粒酶的親和純化示意圖。附圖27是在如實(shí)施例1描述的純化方案中獲得的端粒酶制劑的Northern印跡的 照片。泳道1含有1.5ftnol的端粒酶RNA，泳道2含有4.6fmol的端粒酶RNA，泳道3含 有14fmol的端粒酶RNA，泳道4含有41fmol的端粒酶RNA，泳道5含有核提取物(42ftnol 的端粒酶)，泳道6含有Affi-Gel-肝素-純化的端粒酶(47fmol的端粒酶)，泳道7含有 親和純化的端粒酶(68fmol)，和泳道8含有甘油梯度純化的端粒酶(35ftnol)。附圖28顯示經(jīng)過純化方案后的端粒酶活性。附圖29是SDS-PAGE凝膠的照片，顯示來自于Euplotesaediculatus的約123千道爾頓多肽和約43千道爾頓成對(duì)物的存在。附圖30顯示Euplotes aediculatus端粒酶的沉淀系數(shù)的圖。附圖31是具有36%的甲酰胺的聚丙烯酰胺/脲凝膠的照片，顯示Euplotes端粒 酶底物的應(yīng)用。附圖32顯示假設(shè)的 端粒酶RNA模板，和具有端粒酶RNA的肝素引物的序列比較。附圖33是顯示于附圖31的凝膠的泳道25-30的照片，以較亮的曝光水平顯示。附圖34顯示編碼來自于Euplotes的43千道爾頓端粒酶蛋白質(zhì)亞單位的基因的 DNA序列。附圖35在4頁上，顯示來自于Euplotes的43千道爾頓端粒酶蛋白質(zhì)亞單位的所 有的開放讀框的DNA序列，以及氨基酸序列。附圖36顯示來自于Euplotes的123千道爾頓端粒酶蛋白質(zhì)亞單位(上面序列) 和T.thermophila的80千道爾頓多肽的亞單位(底下序列)的序列比較。附圖37顯示來自于Euplotes aediculatus的123千道爾頓端粒酶蛋白質(zhì)亞單位(上 面序列)和T.thermophi Ia的端粒酶多肽的95千道爾頓(底下序列)的序列比較。附圖38顯示來自于Euplotes aediculatus的43千道爾頓端粒酶蛋白質(zhì)亞單位的 "La-區(qū)域”的一部分(上面序列)和T.thermophila的95千道爾頓亞單位的一部分(底
下序列)的最適合的配合序列對(duì)比。附圖39顯示來自于Euplotes aediculatus的43千道爾頓端粒酶蛋白質(zhì)亞單位的 "La-區(qū)域”的一部分(上面序列)和T.thermophila的80千道爾頓亞單位的一部分(底
下序列)的最適合的配合的序列對(duì)比。附圖40顯示來自于Euplotes aediculatus的123千道爾頓端粒酶蛋白質(zhì)亞單位的 聚合酶區(qū)域和包括來自于啤酒酵母線粒體的細(xì)胞色素氧化酶組II內(nèi)含子1編碼的蛋白質(zhì) (alS.c.(組II))，Dong (LINE)，和酵母ESTp (L8543.12)的各種逆轉(zhuǎn)錄酶的聚合酶區(qū)域的
序列對(duì)比和基序。附圖41顯示具有各種La蛋白質(zhì)的43千道爾頓端粒酶蛋白質(zhì)亞單位的區(qū)域的序 列對(duì)比。附圖42顯示編碼T.thermophila的80千道爾頓蛋白質(zhì)亞單位的核苷酸序列。附圖43顯示T.thermophila的80千道爾頓蛋白質(zhì)亞單位的氨基酸序列。附圖44顯示編碼T.thermophila的95千道爾頓蛋白質(zhì)亞單位的核苷酸序列。附圖45顯示T.thermophila的95千道爾頓蛋白質(zhì)亞單位的氨基酸序列。附圖鉍顯示L8543.l2( ‘‘EstZp”)的氨基酸序列。附圖47顯示由Oxytricha PCR產(chǎn)物編碼的氨基酸序列與Euplotesp 123序列的的序
列對(duì)比。附圖48顯示Est2的DNA序列。附圖49顯示來自于編碼人類端粒酶肽基序的CDNA克隆的部分氨基酸序列。附圖50顯示來自于編碼人類端粒酶肽基序的CDNA克隆的部分DNA序列。附圖51顯示tezl，也稱之為粟灑裂殖酵母trt的氨基酸序列。附圖52，在2頁上，顯示tezl的DNA序列，內(nèi)含子和其它非編碼區(qū)域顯示于底下框子和外顯子(即編碼區(qū)域)顯示于上面框子。附圖53顯示EST2p，Euplotes和Tetrahymena序列，以及共有序列的序列對(duì)比。附圖54顯示用于生產(chǎn)抗hTRT抗體的肽的序列。附圖55是tezl+測(cè)序?qū)嶒?yàn)的概括示意圖。附圖56顯示用于PCR的兩個(gè)簡(jiǎn)并引物以便鑒別Euplotesaediculatus pl23序列的
粟灑裂殖酵母同系物。附圖57顯示利用鑒別Euplotes aediculatus pl23序列的粟灑裂殖酵母同系物的兩
個(gè)簡(jiǎn)并引物進(jìn)行PCR產(chǎn)生四個(gè)主要的譜帶。

附圖58 顯示 M2PCR 產(chǎn)物與 Euplotes aediculatus pl23,啤酒酵母，禾Π Oxytricha
端粒酶蛋白質(zhì)序列對(duì)比。附圖59是顯示用于鑒別Euplotes aediculatus pl23序列的粟灑裂殖酵母同系物的 3’ RT PCR方案的示意圖。附圖60顯示用于篩選粟灑裂殖酵母端粒酶蛋白質(zhì)序列的文庫的特性和顯示篩選 粟灑裂殖酵母端粒酶蛋白質(zhì)序列的文庫的結(jié)果。附圖61顯示用HindIII消化含有粟灑裂殖酵母端粒酶序列的陽性基因組克隆獲得 的陽性結(jié)果。附圖62是用于獲得全長(zhǎng)粟灑裂殖酵母TRT克隆的5’ RT PCR方案的示意圖。附圖63顯示來自于粟灑裂殖酵母(S.p.)，啤酒酵母(S.c.)和Euplotes aediculatus(E.a.)的端粒酶催化亞單位的RT區(qū)域的序列對(duì)比。附圖64 顯示來自于 Euplotes ( “Ea_pl23”)，啤酒酵母(“Sc-Est2p”)，禾口 粟灑裂殖酵母(“Sp-Tezlp”)的序列對(duì)比。在A組，有陰影部分的區(qū)域指示兩個(gè)序列 之間共享的殘基。在B組，有陰影部分的區(qū)域指示所有三個(gè)序列之間共享的殘基。附圖65顯示端粒酶基因一起用于粟灑裂殖酵母破碎的方案。附圖66顯示證實(shí)tezl的破碎的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。附圖67顯示由于tezl破碎的粟灑裂殖酵母的端粒的逐漸縮短。附圖68，在4頁上，顯示編碼由EcoRI-NotI插入的克隆712562編碼的約63千 道爾頓的端粒酶蛋白質(zhì)的ORF的DNA和氨基酸序列。附圖69顯示來自于各種來源的逆轉(zhuǎn)錄酶基序的序列對(duì)比。附圖70提供了質(zhì)粒pGRN121的限制性和功能圖譜。附圖71，在2頁上，顯示hTRT cDNA序列的初步核酸測(cè)序分析結(jié)果。附圖72，在10頁上，顯示hTRT的初步核酸測(cè)序和推測(cè)的三個(gè)開放讀框的ORF 序列。附圖73提供了質(zhì)粒pGRN121的限制性和功能圖譜。附圖74，在8頁上，顯示hTRT的提純的核酸序列和推測(cè)hTRT的ORF序列。附圖75顯示λ克隆25-1.1的限制性圖譜。發(fā)明詳述導(dǎo)言端粒酶是包括RNA成分和催化蛋白質(zhì)成分的核糖核蛋白質(zhì)復(fù)合物(RNP)。本發(fā) 明涉及端粒酶催化蛋白質(zhì)成分，下文稱之為“TRT”(端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶)的克隆和定性。對(duì)TRT這樣命名是因?yàn)樵摰鞍踪|(zhì)具有RNA-依賴性DNA聚合酶(逆轉(zhuǎn)錄酶)的作用，它 利用該端粒酶RNA成分(下文稱之為“TR”)以指導(dǎo)端粒DNA重復(fù)序列的合成。而 且，TRT在進(jìn)化上與其它逆轉(zhuǎn)錄酶相關(guān)(參見實(shí)施例12).在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及人類端粒酶催化蛋白質(zhì)成分的克隆和定性，下文稱之 為“hTRT”。人類TRT是特別有興趣和價(jià)值，如上文說明的，人類(和其它哺乳動(dòng)物 細(xì)胞)的端粒酶活性與細(xì)胞增殖能力，細(xì)胞不滅性，和瘤形成表現(xiàn)型相關(guān)。例如，與可 滅的細(xì)胞相比(例如大多數(shù)人類體細(xì)胞)，端粒酶活性和如在下文實(shí)施例2中證明的，人 類TRT基因產(chǎn)物的水平在不滅的人類細(xì) 胞中增高(例如惡性腫瘤細(xì)胞和不滅細(xì)胞系)。本發(fā)明進(jìn)一步提供了可用于人類疾病和疾病狀態(tài)的診斷，預(yù)測(cè)和治療的方法和 組合物，如下文的詳細(xì)描述。也提供了可用于使細(xì)胞不滅(體內(nèi)和體外)，產(chǎn)生具有所需 的特性的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和許多其它用途的方法和試劑，許多在下文中描述。本發(fā)明也提供 了用于制備，克隆，或再克隆來自于纖毛蟲，真菌，脊椎動(dòng)物，例如哺乳動(dòng)物和其它生 物體的TRT基因和蛋白質(zhì)的方法和試劑。如在下文詳細(xì)描述的，從纖毛蟲Euplotes aediculatus純化端粒酶之后首先對(duì)TRT
定性。利用RNA親和層析和其它方法充分地純化Euplotes aediculatus端粒酶產(chǎn)生蛋白質(zhì) “pl23”。令人驚奇地，pl23與以前認(rèn)為構(gòu)成端粒酶全酶(即T.thermophila的p80禾口 p95蛋白質(zhì))的蛋白質(zhì)亞單位的蛋白質(zhì)不相關(guān)。pl23DNA和蛋白質(zhì)序列(GenBank入藏 號(hào)U95964 ；附圖13和14)的分析顯示與pl23的作用一致的逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)的基序作為 端粒酶的催化亞單位(參見，例如附圖1，4和11)。但是，pl23與啤酒酵母(酵母)蛋 白質(zhì)，Est2p相關(guān)，已知它具有在啤酒酵母中維持端粒的作用(GenBank入藏號(hào)S5396)， 但是在本發(fā)明之前，它被認(rèn)作為編碼端粒酶催化的亞單位蛋白質(zhì)(參見，例如Lendvay等 人，1996，遺傳學(xué)，144 1399)。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于鑒別和克隆新的TRTs的方法和試劑，其中利 用從所公開(例如從克隆TRT基因和cDNAs)的TRT多核苷酸產(chǎn)生或衍生的核酸探針 和引物；特異性地識(shí)別基序或基序序列或其它TRT抗原決定基(例如表達(dá)克隆TRT基因 或純化TRT蛋白質(zhì))的抗體；通過篩選計(jì)算計(jì)數(shù)據(jù)庫；或其它手段。例如，如在實(shí)施例 1中描述的，用從Euplotes pi23RT基序B’和C設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并序列引物實(shí)施粟灑裂殖酵母的 DNA的PCR擴(kuò)增(聚合酶鏈反應(yīng))。所產(chǎn)生的四個(gè)主要產(chǎn)物，一個(gè)編碼與Euplotes pl23和 啤酒酵母Est2p同源的肽序列。利用該P(yáng)CR產(chǎn)物作為探針，通過篩選粟灑裂殖酵母cDNA 和基因組文庫和通過逆轉(zhuǎn)錄和PCR(RT-PCR)擴(kuò)增粟酒裂殖酵母RNA獲得粟灑裂殖酵母 TRT同系物的整個(gè)序列。粟灑裂殖酵母基因(“trtl” ； GenBank入藏號(hào)AF015783 ；附 圖15)的整個(gè)序列顯示與pl23和Est2p的同源性在逆轉(zhuǎn)錄酶基序中尤其高。粟灑裂殖酵 母trtl也稱之為tezl。利用來源于端粒酶RT基序的簡(jiǎn)并引物的擴(kuò)增也用于在Oxytrichatrifalhx和 T.thermophila中獲得TRT基因序列，如實(shí)施例1描述的。本發(fā)明的Euplotes pl23，粟灑裂殖酵母trtl和啤酒酵母Est2p核酸的序列用于 利用程序BLAST (Altschul等人，1990，分子生物學(xué)雜志，215 403)在人類表達(dá)的序 列標(biāo)簽(ESTs)的計(jì)算計(jì)化數(shù)據(jù)庫中檢索。用Est2p序列檢索數(shù)據(jù)庫沒有顯示匹配， 但是用pl23和trtl序列進(jìn)行檢索識(shí)別假設(shè)編碼同源蛋白質(zhì)的人類EST (GenBank入藏號(hào)AA281296 ；參見SEQUENCE ID NO 8)，如在實(shí)施例1中描述的。含有EST(下文 稱之為“克隆712562”，參見SEQUENCE ID NO 3)的cDNA克隆的整個(gè)測(cè)序顯示存 在7個(gè)RT基序。但是，該克隆不編碼具有所有7個(gè)基序的鄰接的人類TRT。因?yàn)榛?序B’，C，D和E包含于與多個(gè)NH2末端基序不同的開放讀框(ORF)。另外，基序 A和B’之間的距離基本上短于三個(gè)前面定性的TRTs之間的距離?？寺?12562是從 I.M.A.G.E.Consortium ； Lennon 等人，1996，基因組 33 151 獲得。 從如實(shí)施例1描述的來源于人293細(xì)胞系的cDNA文庫分離的編碼功能hTRT (參 見附圖 16，SEQUENCE ID NO 1)的 cDNA 克隆，pGRN121。將克隆 712562 和 PGRN121比較顯示克隆712562在基序A和B，之間具有182堿基對(duì)的缺失(參見附圖 24，SEQUENCE ID NO 9)。存在于pGRN121的另外的182個(gè)堿基對(duì)在單個(gè)開放讀框 放置所有的TRT基序，并且將基序A和B’區(qū)域之間的間隔增加到與其它已知的TRTs 一致的距離。如在下文實(shí)施例(例如實(shí)施例7)中描述的，SEQUENCE ID NO 1編碼純 化活性的端粒酶蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有SEQUENCE ID NO 2的序列。SEQUENCE ID NO 2多肽具有1132個(gè)殘基和約127千道爾頓(kD)的計(jì)算的分子量。如在下文討論的，和在下文實(shí)施例9中描述的，在從端粒酶陽性細(xì)胞(例如， testis和293細(xì)胞)的RNA逆轉(zhuǎn)錄后檢測(cè)到具有克隆712562的182個(gè)堿基缺失特性的TRT cDNAs。失去該182堿基對(duì)序列的hTRT RNAs通常稱之為“ Δ 182變異體”和可以代 表一個(gè)，兩個(gè)或幾個(gè)種類。雖然失去存在于pGRN121 cDNA的182堿基對(duì)序列的hTRT RNAs變異體不可能編碼完全有活性的端粒酶催化酶，但是它們?cè)诙肆Ｃ刚{(diào)節(jié)起作用，如 下文討論的，和/或具有部分端粒酶活性，例如端粒結(jié)合或hTRT結(jié)合活性，如在下文討 論的。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了具有天然存在的人類TRT基因或mRNA的序 列的分離的多核苷酸，包括但不限于具有附圖16 (SEQ VENCE IDNO : 1)列出的序列的 多核苷酸。在相關(guān)的方面，本發(fā)明提供了編碼hTRT蛋白質(zhì)，片段，變異體或衍生物的 多核苷酸。在另一個(gè)相關(guān)的方面，本發(fā)明提供了結(jié)合到hTRT基因或mRNA的有意義和 反義核酸。本發(fā)明進(jìn)一步提供了合成的或從天然來源的純化的hTRT蛋白質(zhì)，以及特異 性地與hTRT蛋白質(zhì)或其片段結(jié)合的抗體和其它試劑。本發(fā)明也提供了許多新的方法， 包括例如通過提供用于人類疾病的診斷和預(yù)測(cè)的測(cè)試，使用前面提到的組合物的方法， 用于研制治療劑和治療方法，鑒別端粒酶結(jié)合的蛋白質(zhì)的方法，用于篩選能夠激活或抑 制端粒酶活性的試劑的方法。下文提供了本發(fā)明的許多其它的方面和實(shí)施方案。本發(fā)明的一個(gè)方面是使用至少10個(gè)核苷酸到約10千堿基對(duì)或更多的長(zhǎng)度的多核 苷酸并且包括與天然存在的hTRT基因或hTRT mRNA的鄰接序列相同或正確互補(bǔ)的至少 10個(gè)核苷酸鄰接序列，以便用于測(cè)試或篩選hTRT基因序列或hTRT mRNA，或制備重組 宿主細(xì)胞。本發(fā)明的另一個(gè)方面是增加hTRT在制備用于治療疾病狀態(tài)的藥物中的表達(dá)的藥 劑的應(yīng)用，非強(qiáng)制性地該藥物用于抑制老化作用，所述的狀態(tài)是由于增加脊椎動(dòng)物細(xì)胞 的增殖能力引起的。本發(fā)明的另一個(gè)方面是端粒酶活性抑制劑在制備用于治療與人類細(xì)胞內(nèi)的端粒 酶活性的增高的水平相關(guān)的狀態(tài)的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的再一方面也是提供了用作為藥物的本發(fā)明的蛋白質(zhì)，變異體和片段， 和編碼多核苷酸或片段。本發(fā) 明進(jìn)一步包括在本文定義的各種情況下蛋白質(zhì)，變異體或片段，或編碼其 的多核苷酸或片段在制備例如用于制備用于抑制老化作用或癌癥的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一個(gè)方面是選自于下列組的多核苷酸(a)具有附圖16列出的序列的DNA ；(b)與前面所述的DNA雜交的并且編碼hTRT蛋白質(zhì)或變異體或與編碼這樣的變 異體的編碼序列雜交的至少10個(gè)核苷酸的多核苷酸；和(c)與(a)和(b)定義的DNA序列有遺傳密碼簡(jiǎn)并的和編碼hTRT多肽或變異體 的DNA序列。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，hTRT多核苷酸是不同于SEQUENCE IDNI: 8的 389個(gè)核苷酸的多核苷酸和/或不同于克隆712562，含有插入物的質(zhì)粒，插入物的序列顯 示于附圖 18 (SEQUENCE ID NO 3)。以主題劃分來進(jìn)行下面的描述。II部分進(jìn)一步描述了 TRT蛋白質(zhì)的氨基酸基序 特性，以及編碼具有這樣的基序的蛋白質(zhì)的TRT基因。III-VI部分特別描述了本發(fā)明的 核酸，蛋白質(zhì)，抗體和純化的組合物，特別關(guān)注的是人類TRT相關(guān)的組合物。VII部分 特別描述了用于治療人類疾病的本發(fā)明的方法和組合物。XIII部分描述了不滅的人細(xì)胞 系的生產(chǎn)和鑒定。IX部分特別描述了本發(fā)明的核酸，多核苷酸，和其它組合物用于診斷 人類疾病。X部分特別描述了用于篩選和鑒別調(diào)節(jié)(例如抑制或促進(jìn))端粒酶活性或表 達(dá)的藥劑和治療劑的本發(fā)明的方法和組合物。XI部分特別描述了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如端粒 酶敲出口動(dòng)物和細(xì)胞)。XII部分是用于部分I-XI的術(shù)語的匯編。部分XIII描述了涉及 本發(fā)明的特定的實(shí)施方案的實(shí)施例。采用主題和亞主題方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描述更清晰， 和不以任何方式限制。II.TRT基因和蛋白質(zhì)本發(fā)明提供了分離的和/或重組基因和具有端粒酶催化亞單位蛋白質(zhì)(即端粒酶 逆轉(zhuǎn)錄酶)的蛋白質(zhì)，包括但不限于這樣的基因的天然存在形式和分離的或重組形式的 蛋白質(zhì)。通常，TRTs是大的，堿性的，具有逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)和端粒酶特異性(T)氨基酸 基序的蛋白質(zhì)，如本文公開的。由于不同種類的生物體中這些基序是保守的，因此利用 本發(fā)明的方法可以獲得許多生物體的TRT基因或利用例如特異于一個(gè)或多個(gè)基序序列的 本發(fā)明的引物，核酸探針，和抗體可以鑒別。當(dāng)與存在于其它逆轉(zhuǎn)錄酶中的相似時(shí)，存在于TRTs中的7個(gè)RT基序具有特定 的標(biāo)志。例如如附圖4顯示的，在TRT RT基序內(nèi)，在其它RTs中許多氨基酸替代的殘 基是高度保守的。例如在基序C中，與其它RTs的(F/Y)xDDh(當(dāng)“h’是疏水氨基 酸和” χ “是任何氨基酸時(shí)；參見Xiong等人，1990，EMBO J 9 3353 ； Eickbush, 病毒演變生物學(xué)，(S.Morse，Ed.Raven出版社，紐約，第121頁，1994))相比，端粒酶 RTs含有的hxDD(F/Y)出現(xiàn)了協(xié)調(diào)活性位點(diǎn)金屬離子(參見，Kohlstaedt等人，1992， 科學(xué) 256: 1783 ； Jacobo-Molina 等人，1993，美國(guó)科學(xué)院年報(bào)，90: 6320 ； Patel 等人， 1995，生物化學(xué)34 5351)的兩個(gè)天冬氨酸(DD)。在基序E中出現(xiàn)了另一個(gè)端粒酶亞 單位的系統(tǒng)性的改變特性，其中WxGxSx是保守序列或在端粒酶蛋白質(zhì)之間是高度保守的，而hLGxxh的特性是其它的RTx(Xiong等人，見上文，Eickbush，見上文)。該基序 E被稱之為“引物柄”，和已經(jīng)報(bào)道了該區(qū)域的突變以實(shí)現(xiàn)RNA的啟動(dòng)但不是DNA的啟 動(dòng)(Powell等人，1997，生物化學(xué)雜志，272: 13262)。因?yàn)槎肆Ｃ感枰狣NA引物(例 如染色體3’末端)，但是端粒酶不同于引物柄區(qū)域的其它RTs不是令人滿意的。例如， 在TRTs中基序A和B’之間的距離長(zhǎng)于典型的其它RTs，這可以代表類似于右手的該結(jié) 構(gòu)的“手指”區(qū)域內(nèi)的插入(附圖3;參見Kohlstaedt等人，見上文，Jacobo-Molina等 人，見上文；Patel等人，見上文)。而且，如上文所述，基序T是TRT蛋白質(zhì)的另外的標(biāo)志。如在附圖4(W-L_X-Y-X-X-h-h-X-h-h-X-p-F-F-T-E-X-p-X-X-X-p-X-X-X-Y-X-R-K-X-X-W (X 是任何
氨基酸，h是疏水，ρ是極性))顯示的該基序T包括利用通式Trp-RfX7-R1-R1-R2-X_Phe-Phe-Tyr-X-Thr-Glu-X8_9-R3-R3-Arg-R4- X2-Trp 描 述的序列，其中X是任何氨基酸和下標(biāo)是指連續(xù)的殘基數(shù)，Rl是亮氨酸或異亮氨酸，R2是 谷氨酸或精氨酸，R3是苯丙氨酸或酪氨酸，R4是賴氨酸或組氨酸。利用通式Trp-R1-Xq-h-h-X-h-h-R2-p-Phe-Phe-Tyr-X-Thr-Glu-X-p-X3-p-X2_3-R3-R3_Arg-R4-X2-Trp 也可 以描述T基序，其中X是任何氨基酸，下標(biāo)是指連續(xù)的殘基數(shù)目，R1是亮氨酸或異亮氨酸， R2是谷氨酸或精氨酸，R3是苯丙氨酸或酪氨酸，R4是賴氨酸或組氨酸，h是選自于丙 氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸和甲硫氨酸的疏水氨基 酸，ρ是選自于甘氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，半胱氨酸，天冬酰胺和谷氨酰胺的極 性氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的天然存在的和重組的TRT蛋白質(zhì)，它 包括一個(gè)或多個(gè)描述于附圖11的基序，例如基序TW-X12-FFY-X-TE-Xichu-R-X3-W-X7-I基序T，E-X2-V-X基序1 X3-R-X2-PK-X3基序2 X-R-X-I-X基序A X4-F-X3-D-X4-YD-X2基序B，Y-X4-G-X2-QG-X3-S-X8基序C X6-DD-X-L-X3當(dāng)顯示的TRT蛋白質(zhì)含有一個(gè)以上的TRT基序時(shí)，按照(NH2 > COOH)的順
序顯示于附圖11。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的天然存在的TRT蛋白質(zhì)，它包括超基 序 (NH2) -Xso^oo-W-Xu-FFY-X-TE-X.n-R-XfW-Xfl-XHo-E-X^V-X-XHo-X 3_R_X2_PK-X4-io_R_X_I_X_X60-80 _X4_F_X3_D_X4_YD_X2_X80-130_Y_X4_G-X2_QG-X3_S-X8_X5-35_X6_DD_X_L-X3-Xio-20_Xl2_K 對(duì)本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員來說是顯而易見的，利用本文提供的試劑包括本文公開的 那些試劑的TRT序列和本文提供的方法和指導(dǎo)(包括下文描述的特異性方法)，本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員可以獲得，分離和產(chǎn)生重組形式的TRT基因和蛋白質(zhì)。例如，提供了與編碼 TRT的RT和T基序特性的基因序列雜交的引物(例如簡(jiǎn)并的擴(kuò)增引物)。例如基于靶生 物體的密碼子的使用，可以制備與編碼T基序，其它TRT基序(如下文討論的)或基序 的組合的FFYXTE區(qū)域的序列或共有序列雜交的一個(gè)或多個(gè)引物或簡(jiǎn)并引物和用于擴(kuò)增 來自于從靶生物體制備的基因組DNA或cDNA的TRT基因序列。簡(jiǎn)并引物的使用是本 領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員熟知的并且必須使用引物組，該引物組與潛在地編碼靶基序的氨基酸的 核酸序列組雜交，其中考慮密碼子優(yōu)先和靶生物體的使用，和通過利用適合于在PCR退 火步驟允許堿基錯(cuò)配的擴(kuò)增(例如PCR)條件。通常，使用兩個(gè)引物組；但是單個(gè)引物 (或在這種情況下，單個(gè)簡(jiǎn)并引物組)擴(kuò)增系統(tǒng)是本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員熟知并且可用于獲得 TRT基因。表1提供了本發(fā)明引物的示意圖，所述引物可用于擴(kuò)增新的TRT核酸，特別是 來自于脊椎動(dòng)物的那些(例如人類和其它哺乳動(dòng)物)?！癗”是所有4種核苷酸的等摩爾 混合物，和括號(hào)內(nèi)的核苷酸是特定的核苷酸的等摩爾混合物。表1 TRT核酸擴(kuò)增的簡(jiǎn)并引物的描述基序方向 5'-序列-3’a FFYVTE 正向 TT (CT) TT (CT) TA (CT) GTNACNGA
b FFYVTE 反向 TCNGTNAC (GA) TA (GA) AA (GA) AAc RFIPKP 正向(CA) GNTT (CT) AT (ACT) CCNAA (AG) CCd RFIPKP 反向 GG (TC) TTNGG (TGA) AT (GA) AANCe AYDTI 正向 GCNTA (CT) GA (CT) ACNATf AYDTI 反向 TANGT (GA) TC (GA) TANGCg GIPOG 正向 GGNAT (ACT) CCNCA (AG) GGh GIPOGS 反向(GC) (AT) NCC (TC) TGNGG (TGA) ATNCCi LVDDFL 正向(CT) TNGTNGA (CT) GA(CT) TT (CT) (CT) Ti DDFLLVT 反向 GTNACNA (GA) NA (GA) (GA)AA(GA)TC(GA)TC優(yōu)先的引物結(jié)合(y = yes，η = no)反向正向b d f h ia- η y y y yc~ η η y y ye- η η η y yg- η η η η yi- η η η η η在一個(gè)實(shí)施方案中，將擴(kuò)增的TRT核酸用作為用于與從靶生物體制備的文庫 (例如cDNA文庫)進(jìn)行菌落雜交的雜交探針，這樣具有整個(gè)TRT蛋白質(zhì)編碼序列的核 酸，或其基本序列部分是相同的和被分離或克隆。根據(jù)本文描述的方法將例如剛才描述 的試劑和方法用于獲得Oxytrichatrifallax和T.thermophila的TRT基因序列，如在下文詳細(xì) 描述的。將會(huì)認(rèn)識(shí)到以前未鑒定的TRT基因進(jìn)行克隆后，通過常規(guī)方法測(cè)定該序列，合成編碼的多肽和測(cè)試其TRT活性，例如端粒酶催化活性(如本文描述和/或通過本領(lǐng)域 內(nèi)技術(shù)人員熟知的端粒酶測(cè)試)。利用許多的本發(fā)明克隆方法的任何一種可以克隆TRT基因?qū)Ρ绢I(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員 來說是顯而易見的，因?yàn)楸景l(fā)明的TRT基序序列和包括這樣的序列的核酸可用于各種各 樣的所述的方法。例如可以使用利用基于已知的TRT序列的探針與來自于靶生物體的 DNA或其它核酸文庫進(jìn)行雜交，如在實(shí)施例1中描述的。將會(huì)認(rèn)識(shí)到可以將簡(jiǎn)并PCR 引物或其擴(kuò)增產(chǎn)物例如上文描述的那些標(biāo)記并且用作為雜交探針。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，使用表達(dá)克隆方法。例如，將特異性地與跨越TRT基序或其它TRT抗原決定基例 如FFYXTE基序的肽結(jié)合的一個(gè)或多個(gè)抗體用于分離包括TRT蛋白質(zhì)和編碼它的mRNA 的核糖體復(fù)合體。為了產(chǎn)生本發(fā)明的這樣的抗體，通常肽免疫原是6到30個(gè)氨基酸之間 的長(zhǎng)度，更常見的是約10到20個(gè)氨基酸之間的長(zhǎng)度。也可以將抗體用于探測(cè)來源于所 需的生物體的cDNA表達(dá)文庫以鑒別編碼TRT序列的克隆。在另一個(gè)實(shí)施方案中，也可 以使用計(jì)算計(jì)檢索DNA數(shù)據(jù)庫以尋找含有與已知的TRT保守的序列的DNA以鑒別包括 TRT序列的克隆。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包括具有天然存在的TRT蛋白質(zhì)的氨基酸序列的 分離的或重組的多肽的組合物。通常，天然存在的TRT具有約80,000道爾頓(D)和約 150,000D之間的，最常見的是約95,000D和130,000D之間的分子量。通常，天然存在的 TRT在pH 7.0時(shí)(通常計(jì)算的pi大于9)具有靜正電荷。在一個(gè)實(shí)施方案中，多肽顯示 如本文定義的端粒酶活性。在相關(guān)的實(shí)施方案，多肽具有TRT特異性區(qū)域(T區(qū)域)序 列并且顯示端粒酶活性。本發(fā)明進(jìn)一步提供了這樣的多肽的片段。本發(fā)明也提供了具有 編碼TRT蛋白質(zhì)天然存在的基因的序列的分離的或重組的多聚核苷酸。本發(fā)明提供了用 于從非脊椎動(dòng)物(例如酵母)和脊椎動(dòng)物，例如哺乳動(dòng)物(例如鼠或人)分離TRT序列的 試劑。分離的多聚核苷酸可以與其它天然存在的或重組的或合成的載體核酸序列結(jié)合。 通常，分離的核酸小于約300千堿基對(duì)，通常小于約50千堿基對(duì)，更常見的是小于約20 千堿基對(duì)，最常見的是小于約10千堿基對(duì)并且有時(shí)小于約5千堿基對(duì)或2個(gè)千堿基對(duì)的 長(zhǎng)度。在某些實(shí)施方案中，分離的TRT多聚核苷酸甚至更小，例如小于約1千堿基對(duì)或 小于0.1千堿基對(duì)的基因片段，引物或探針。 III.核酸A)綜述本發(fā)明提供了具有編碼端粒酶催化亞單位蛋白質(zhì)(TRT)的多聚核苷酸的分離 的和重組核酸，例如來源于Euplotes，Tetrahymena,粟酒裂殖酵母或人的重組TRT基 因。在附圖13 (Euplotes)；附圖15 (粟酒裂殖酵母)和附圖16 (人，GenBank入藏號(hào) AF015950)中提供了例舉的多聚核苷酸。本發(fā)明提供了具有TRT基因序列，包括探針， 引物，編碼TRT蛋白多聚核苷酸的質(zhì)等等的有義和反義多聚核苷酸。B)人 TRT本發(fā)明提供了具有來源于人的端粒酶催化亞單位的序列的(即hTRT)核酸。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了具有人TRT基因或RNA的序列或亞序列的多聚核苷 酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多聚核苷酸具有顯示于附圖16的SEQUENCE IDNO :
1的序列或其亞序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，多聚核苷酸具有SEQUENCEIDNO: 3(附圖18)，SEQUENCE ID NO 4 (附圖20)的序列，或其亞序列。本發(fā)明也提供了具有基本 上等同于本文公開的hTRT核酸序列的多聚核苷酸，包括但不限于SEQUENCE ID NO 1(附圖16)，4 (附圖20)，6 (附圖21)和7。因此，本發(fā)明提供了天然存在的人TRT基 因的等位基因和相對(duì)于本文公開的hTRT核酸序列具有一個(gè)或多個(gè)核苷酸缺失，插入或替 代的各種多聚核苷酸序列。如下文所述，利用下文描述的重組或合成方法或采用其它手 段可以產(chǎn)生變異的核酸。本發(fā)明也提供了具有人TRT基因的側(cè)接區(qū)域的序列的分離的和重組的多聚核苷 酸。這 樣的多聚核苷酸包括來源于hTRTmRNA的未轉(zhuǎn)譯的區(qū)域的基因組序列。例舉的基 因組序列顯示于附圖21 (SEQUENCE ID NO 6)。如實(shí)施例4所述，SEQUENCE ID NO
6是通過將從人基因組文庫分離的克隆λ φ5測(cè)序獲得的。XGtp5含有包括約13000堿 基5’到hTRT編碼序列的15千堿基對(duì)(kbp)插入物。該克隆含有hTRT啟動(dòng)子序列和 其它hTRT基因調(diào)節(jié)序列(例如加強(qiáng)子)。本發(fā)明也提供了具有來源于人TRT基因的內(nèi)含子區(qū)域的序列的分離的和重組多 聚核苷酸。例舉的內(nèi)含子序列顯示于附圖21 (SEQUENCE ID NO 7 ；參見實(shí)施例3)。 在某些實(shí)施方案中，hTRT內(nèi)含子包含于“微基因”以改善hTRT蛋白質(zhì)在真核細(xì)胞中的 表達(dá)。在相關(guān)的方面，本發(fā)明提供了編碼hTRT蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段，包括修飾的，改 變的和變異的hTRT多肽的多聚核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼的hTRT蛋白質(zhì)或片段 具有如附圖17提出的氨基酸序列(SEQUENCE ID NO 2)或具有保守替代的SEQUENCE ID NO: 2的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼的hTRT蛋白質(zhì)或片段具有改變蛋白質(zhì)的活 性(例如端粒酶催化活性)的替代。將會(huì)認(rèn)識(shí)到，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并，編碼hTRT蛋白質(zhì)的核酸不需要具有天然存 在的hTRT基因的序列，但是，多個(gè)多聚核苷酸可以編碼具有SEQUENCE ID NO: 2的氨 基酸序列的hTRT多肽。本發(fā)明提供了通過基于利用已知的三聯(lián)體遺傳密碼制備的可能 的密碼子選擇性選擇結(jié)合制備的各種和每一種核苷酸序列的變異，所有這樣的變異是本 發(fā)明特異性的。因此，雖然在某些情況下能夠與天然存在序列的核苷酸序列雜交(在合 適的選定的嚴(yán)格條件下)的編碼hTRT多肽的核苷酸序列是優(yōu)選的，但是在其它情況下產(chǎn) 生編碼hTRT核苷酸序列是優(yōu)選的，這些核苷酸使用基本上不同的密碼子選擇并且可能不 與具有天然存在序列的核酸雜交。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了 hTRT寡聚-和多聚核苷酸，它包括本文公 開hTRT核酸的亞序列(例如SEQUENCE IDNO 1和6)。本發(fā)明的核酸通常包括例舉 的hTRT多聚核苷酸的至少10個(gè)，更常見的是至少約12個(gè)以上或約15的連續(xù)的堿基。 常見的是，例如當(dāng)計(jì)劃表達(dá)多肽或全長(zhǎng)的hTRT蛋白質(zhì)，本發(fā)明的核酸將會(huì)包括較長(zhǎng)的序 列，例如至少約25個(gè)，約50個(gè)，約100，約200，或至少約500-3000堿基的長(zhǎng)度。仍然在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有等同于或互補(bǔ)于天然存在或非天 然存在hTRT多聚核苷酸例如SEQUENCE ID NO 3或SEQUENCEID NO 4的序列的
“Δ 182hTRT"多聚核苷酸，它不含有存在于pGRN121(和在克隆712562中沒有)的182 個(gè)核苷酸序列(SEQUENCEIDNO: 9(附圖24))。這些多聚核苷酸不是需要的，部分是 因?yàn)樗鼈兙幋a含有不同于在“全長(zhǎng)” hTRT多肽(SEQUENCE ID NO: 2)例如由pGRN121編碼的TRT基序的結(jié)合或排列的多肽。如在下文討論的，涉及這些多肽在自然界中起著 生物學(xué)作用(例如，在調(diào)節(jié)細(xì)胞的端粒酶的表達(dá)中)和/或用作為治療劑(例如作為抑制 野生型蛋白質(zhì)的功能的顯性陰性的產(chǎn)物)，或具有其它作用和用途，例如如本文描述的。例如，與由pGRN121編碼的多肽相反，克隆712562編碼具有計(jì)算的分子量 約為30千道爾頓的259殘基的蛋白質(zhì)(下文的“712562hTRT”)。712562hTRT多肽 (SEQUENCE ID NO 10 (附圖19))含有基序T，1，2禾Π Α，但不含有基序B，，C，D 和E(參見附圖4)。類似地，可以從類似于pGRN121cDNA的核酸表達(dá)具有治療和其它 活性的變異的hTRT多肽，但是失去了在克隆712562中錯(cuò)配的182堿基對(duì)，例如具有顯 示于附圖20的序列(SEQUENCE ID NO 4)。該核酸(下文的“原90hTRT”)，可以 通過常規(guī)的合成或重組方法合成，如下文所述的，該核酸編碼807殘基的蛋白質(zhì)(計(jì)算的 分子量為約90千道爾頓)，它與由SEQUENCE ID NO 1編碼的hTRT蛋白質(zhì)共享有類 似的氨基末端序列，但是在羧基末端區(qū)域不同(開始的763個(gè)殘基是共同的，原90hTRT 的最后的44個(gè)殘基不同于“全長(zhǎng)” hTRT)。原90hTRT多肽含有基序T，1，2，和A， 但不含有基序B，C，D, E，并且所以它們具有一些，但不是全部端粒酶活性。C)人TRT核酸的生產(chǎn)本發(fā)明的多聚核苷酸具有許多用途，包括但不限于編碼hTRT或其片段的多肽的 表達(dá)，用作為有義或反義探針或引物用于天然存在的hTRT基因或RNA(例如診斷或預(yù)防 應(yīng)用)雜交和/或擴(kuò)增，用作為治療劑(例如在反義，三聯(lián)體，或核酶組合物中)。如 基于公開公開的觀點(diǎn)，這些用途將對(duì)與老化，癌癥和可育性相關(guān)的人疾病的診斷和治療 以及基于細(xì)胞的產(chǎn)物的生長(zhǎng)，再生產(chǎn)和制備具有巨大的影響是顯而易見的。如在 下面的 章節(jié)中描述的，利用本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的技術(shù)可以制備本發(fā)明的hTRT核酸(例如克 隆，合成或擴(kuò)增)。1)克隆，擴(kuò)增和重組生產(chǎn)在一個(gè)實(shí)施方案中，利用與hTRTmRNA，cDNA或基因組DNA特異性雜交的核
酸探針將hTRT基因或cDNA克隆。適用于該目的的探針是具有附圖16 (SEQUENCE ID NO 1)提供的整個(gè)序列或其一部分的多聚核苷酸，例如包括其亞序列的探針。通常， 將靶hTRT基因組DNA或cDNA連接到載體(例如質(zhì)粒，噬菌體，病毒，酵母人工染色 體等等)并且可以從基因組DNA或cDNA文庫分離(例如人胎盤cDNA文庫)。一旦 鑒別了 hTRT核酸，根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法可以分離。實(shí)施例1中提供 了篩選hTRT基因的人cDNA文庫的說明性實(shí)施例；類似地，在實(shí)施例3和4中發(fā)現(xiàn)了 篩選人基因組文庫的例子。克隆方法是本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的并且在例如Sambrook 等人，(1989)分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第2版，第1-3卷，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，下文稱之 為“Sambrook” ； Berger和Kimmel，(1987)酶學(xué)方法，第152卷分子克隆技術(shù)的指 導(dǎo)，SanDieg0:學(xué)術(shù)出版社，Ausubel等人，分子生物學(xué)的現(xiàn)行的方案，綠色出版社和 Wiley-Interscience，紐約(1997) ； Cashion 等人，美國(guó)專利 No.5017478 和 Carr，歐洲專利 No.0246864 中描述。本發(fā)明也提供了通過擴(kuò)增方法，例如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)分離了 hTRT基因 組或cDNA核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，利用引物5’ -GTGAAGGCACTGTTCAGCG -3，( “TCP 1.1”)禾口 5，-CGCGTGGGTGAGGTGAGGTG-3，( “TCP 1.15” )從RNA或cDNA樣品擴(kuò)增hTRT蛋白質(zhì)的編碼序列(例如雙鏈胎盤cDNA(Clontech，Palo AltoCA))。在某些實(shí)施方案中，使用了第三或第二引物對(duì)例如對(duì)于“嵌套式PCR”以 增加特異性。第二引物對(duì)的實(shí)施例是5，-CTGTGCTGGGCCTGGACGATA -3’ ( "bil 1TCP6，，)和 5，-AGCTTGTTCTCCATGTCGCCGTAG-3，( “TCP1.14”)。對(duì)本領(lǐng)域
內(nèi)技術(shù)人員將是顯而易見的是本發(fā)明提供了可用于擴(kuò)增hTRT核酸的許多其它引物和引物 的結(jié)合。而且，本發(fā)明提供了用于擴(kuò)增hTRT基因組DNA，cDNA或RNA的任何特定
的區(qū)域(例如編碼區(qū)，啟動(dòng)子區(qū)域，和/或內(nèi)含子)或亞序列的引物。例如，利用引物 TCP1.57和 TCP1.52(引物對(duì)1)或引物TCP1.49和 TCP1.50 (引物對(duì)2)可以擴(kuò)增(例如用 于檢測(cè)基因組克隆)SEQUENCE ID NO 1的274/275位置的hTRT的內(nèi)含子(參見實(shí)施例 3)。(引物名稱是指列于下文表2的引物)?？梢詥蝹€(gè)地使用引物對(duì)或當(dāng)首先使用第一 組引物時(shí)進(jìn)行嵌套式PCR。另一個(gè)舉例的實(shí)施例涉及特異性地?cái)U(kuò)增的引物并且可以檢測(cè) hTRTmRNA的5’末端或編碼hTRT基因的5’末端的外顯子(例如用于估測(cè)cDNA克隆 的大小或完整性)。下面的引物對(duì)可用于擴(kuò)增hTRT的5’末端引物K320和K321(引 物對(duì)3)；引物Κ320和TCP1.61(引物對(duì)4)；引物Κ320和Κ322 (引物對(duì)5)。可將引物 組按照第5組引物，然后第4組或第3組，或第4組或第5組，然后第3組的順序用于嵌 套式PCR。也在另一個(gè)說明性的實(shí)施例中涉及選擇以擴(kuò)增或特異性地檢測(cè)保守的hTRT TRT基序區(qū)域的引物，該區(qū)域包括約mRNA的中間的三分之一(例如，用作為雜交探針 以便從例如非人生物體鑒別TRT克隆)。下面的引物對(duì)可用于擴(kuò)增hTRT核酸的TRT基 序區(qū)域引物K304和TCP1.8(引物對(duì)6)，或引物L(fēng)Tl和TCP1.15 (引物對(duì)7)。按照組 6，然后組7的引物可將順序組可用于嵌套式PCR實(shí)驗(yàn)。合適的PCR擴(kuò)增條件是本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的并且包括(但不限于)1單位 的 Taq 聚合酶(Perkin Elmer, Norwalk CT)，各 100 微摩爾濃度的 dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), IXPCR緩沖液(50毫摩爾濃度氯化鉀，10毫摩爾濃度Tris，phH8.3,
在室溫下，1.5毫摩爾濃度氯化鎂，0.01%明膠)和0.5微摩爾濃度引物，包括在94°C，45 秒；在55°C 45秒；在72°C 90秒的過程進(jìn)行30個(gè)擴(kuò)增循環(huán)。本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員將會(huì)認(rèn) 識(shí)到其它熱穩(wěn)定的DNA聚合酶，反應(yīng)條件，和循環(huán)參數(shù)也將提供合適的擴(kuò)增。用于獲得 hTRT合適的其它合適的體外擴(kuò)增方法包括但不限于下文描述的那些。一旦擴(kuò)增，如果需 要，利用常規(guī)的分子生物學(xué)方法可以將hTRT核酸克隆到各種各樣的載體或根據(jù)本發(fā)明的 方法進(jìn)行檢測(cè)或其它利用。本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到利用其它方法可以制備或繁殖如上所述獲得的克 隆的或擴(kuò)增的hTRT核酸，例如化學(xué)合成或通過轉(zhuǎn)化到細(xì)菌系統(tǒng)，例如大腸桿菌(參見例 如Ausubel等人，參見上文)，或真核，例如哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)復(fù)制。類似地，利用例如 含有由RNA聚合酶例如T7，T3或SP6識(shí)別的啟動(dòng)子的商品載體，采用體外方法，或細(xì) 菌系統(tǒng)例如大腸桿菌可以表達(dá)hTRT RNA,或轉(zhuǎn)譯利用含有RNA聚合酶啟動(dòng)子的引物通 過PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的DNA。本發(fā)明進(jìn)一步提供了改變的或修飾的hTRT核酸。本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí) 到采用本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的方法(例如位點(diǎn)特異性誘變)可以修飾(例如，截短的， 衍生的，改變的)所獲得的克隆的或擴(kuò)增的hTRT核酸或如下所述簡(jiǎn)單地從頭開始合成。改變的或修飾的hTRT核酸可用于各種各樣的應(yīng)用，包括但不限于有助于hTRT基因或基 因產(chǎn)物的克隆或操作，或表達(dá)變異的hTRT基因產(chǎn)物。例如在一個(gè)實(shí)施方案中，將hTRT 基因序列改變以致于它編碼具有改變的特性或活性的hTRT多肽，如在下文詳細(xì)討論的， 例如通過在保守的hTRT基序進(jìn)行突變獲得的特性。在另一個(gè)說明性實(shí)施例中，可以在 hTRT核酸的蛋白質(zhì)編碼區(qū)域?qū)胝T變以改變糖基化模式，以改變密碼子優(yōu)先，以產(chǎn)生拼 接變異體，去除蛋白酶敏感性位點(diǎn)，制備抗原區(qū)域，修飾特異性活性等等。在其它實(shí)施 方案中，將編碼hTRT的核苷酸序列和其衍生物進(jìn)行改變，沒有改變所編碼的氨基酸序 列，例如具有更令人滿意的特性的RNA轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生，例如與從天然存在的序列產(chǎn)生的 轉(zhuǎn)錄物相比，具有增加的轉(zhuǎn)譯效力或較大或較短的半壽期。也在另一個(gè)實(shí)施方案，根據(jù) 由宿主利用的特定密碼子的頻率，選擇改變的密碼子，以增加在特定的原核表達(dá)宿主或 真核表達(dá)宿主出現(xiàn)的肽的表達(dá)速率?？捎糜谥苽浔景l(fā) 明的變異的hTRT多聚核苷酸的用 于體外和體內(nèi)重組技術(shù)存在于Sambrook等人，和Ausubel等人，參見上文。
如上文所解釋的，本發(fā)明提供了具有hTRT基因的側(cè)接(5’或3’)和內(nèi)含子序 列的核酸。由于它們含有參與hTRT調(diào)節(jié)和用于表達(dá)hTRT和其它重組蛋白質(zhì)或RNA基 因產(chǎn)物的啟動(dòng)子和其它調(diào)節(jié)元件。除了 SEQUENCEID NO 6和7提供的核酸序列，利 用常規(guī)的分子生物學(xué)技術(shù)易于獲得另外的hTRT內(nèi)含子和側(cè)接序列是顯而易見的。例如， 可以從AG0 5(ATCC 209024)，如上文和實(shí)施例4描述的獲得其它的hTRT基因組序列。 通過利用具有SEQUENCEID NO 1的序列或亞序列的hTRT核酸探針篩選人基因組文庫 可以獲得仍然其它的hTRT基因組克隆和序列。通過利用來源于λΟΦ5的標(biāo)記的序列 或亞克隆以探測(cè)合適的文庫可以獲得其它的克隆和序列(例如更進(jìn)一步的上游)。用于 hTRT側(cè)接序列的進(jìn)一步的定性的其它有用的方法包括由Gobinda等人，1993，PCR方法 應(yīng)用 2 318 ； Triglia 等人，I988，核酸研究 I6 8186 ； Iagerstrom 等人，1"1，PCR 方 法應(yīng)用1 111，和Parker等人，1991，核酸研究19 3055描述的常規(guī)方法。
通過常規(guī)手段例如將hTRT基因組序列與hTRT cDNA序列(參見例如實(shí)施例3) 進(jìn)行比較，通過Sl分析(參見Ausubel等人，見上文，第4章)，或各種其它本領(lǐng)域內(nèi) 技術(shù)人員已知的手段可以鑒別內(nèi)含子序列。內(nèi)含子序列也存在于前_mRNA(即未拼接的 或不完全拼接的mRNA前體)，前-mRNA可以在細(xì)胞RNA逆轉(zhuǎn)錄之后，進(jìn)行克隆或擴(kuò)
+飽
+曰ο當(dāng)需要時(shí)，利用本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的DNA測(cè)序方法可以測(cè)定或驗(yàn)證克隆 的，擴(kuò)增的或其它的合成的hTRT或其它的TRT核酸序列(參見，例如Ausubel等人，見 上文)。有用的測(cè)序方法使用了例如DNA聚合酶I的Klen0w片段，測(cè)序酶(美國(guó)生物化 學(xué)公司，Cleveland OH)，TaqDNA 聚合酶(Perkin Elmer, Norwalk CT)，熱穩(wěn)定 T7 聚合 酶(Amersham，ChicagoIL)，或重組聚合酶與校對(duì)核酸外切酶的結(jié)合例如由Gibco BRL銷 售的EL0NGASE擴(kuò)增系統(tǒng)(Gaithersburg MD)這樣的酶。當(dāng)測(cè)序或驗(yàn)證寡聚核苷酸的序 列時(shí)(例如通過化學(xué)合成方法從頭開始合成的寡聚核苷酸)，Maxam和Gilbert的方法是優(yōu) 選的(Maxam和Gilbert，1980，酶學(xué)方法65 499 ； Ausubel等人，見上文，第7章)。通過利用標(biāo)準(zhǔn)方法例如mRNA的逆轉(zhuǎn)錄將“全長(zhǎng)” hTRT或其它c(diǎn)DNA克隆， 隨后通過將獲得的cDNA克隆和測(cè)序直接測(cè)定hTRT或其它TRTmRNA的5’未轉(zhuǎn)譯序 列。優(yōu)選地用于篩選或擴(kuò)增全長(zhǎng)cDNA的寡聚(dT)引物引導(dǎo)的文庫是優(yōu)選的，其中全長(zhǎng)cDNA已經(jīng)進(jìn)行了大小篩選以包含了較大的cDNA。隨機(jī)引物引導(dǎo)的文庫也是合適的 并且經(jīng)常包括含有基因的5’區(qū)域的克隆的較大部分。也可以使用獲得5’ RNA序列的 其它已知的方法例如由Frohman等人，1988，美國(guó)科學(xué)院年報(bào)85 8998描述的RACE方 案。如果需要，通過利用本文提供的核酸(例如具有SEQUENCE ID NO 1的序列)， 采用常規(guī)方法可以測(cè)定hTRT或其它TRTmRNA的轉(zhuǎn)譯起始位點(diǎn)。一種方法是利用具有 SEQUENCE IDNO 1的5，區(qū)域的序列標(biāo)記的DNA進(jìn)行的Sl核酸外切酶分析(Ausubel 等人，見上文)。2)核酸的化學(xué)合成本發(fā)明也提供了采用直接的化學(xué)合成方法生產(chǎn)的hTRT多聚核苷酸(RNA，DNA 或修飾的)。通?；瘜W(xué)合成方法優(yōu)選地用于生產(chǎn)寡聚核苷酸或用于生產(chǎn)寡聚核苷酸和含有 非鏈的核苷酸的多聚核苷酸(例如探針，引物和反義寡聚核苷酸)。采用本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù) 人員已知的方法可以完成核酸的直接化學(xué)合成，例如Nanmg等人，1979，酶學(xué)方法68 : 90的磷酸三酯方法，Brown等人，敏學(xué)方法68 109(1979)的磷酸二酯方法，Beaucage 等人的亞磷酰胺二酯方法，四面體通信22: 1859(1981)；美國(guó)專利4458066的固相支撐 的合成方法。通?；瘜W(xué)合成產(chǎn)生單鏈寡聚核苷酸，通過與互補(bǔ)序列雜交，或通過用DNA 聚合酶聚合和利用單鏈作為模板利用寡聚核苷酸引物可以將單鏈轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈DNA。本領(lǐng) 域內(nèi)技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到當(dāng)化學(xué)合成的DNA經(jīng)常限制于約100或150堿基的序列，通過 連接較短的序列或采用更復(fù)雜的合成方法可以獲得更長(zhǎng)的序列。 將會(huì)認(rèn)識(shí)到利用非標(biāo)準(zhǔn)的堿基(例如除了腺嘌呤，胞嘧啶，鳥嘌呤，胸腺嘧啶 和尿嘧啶以外)或非標(biāo)準(zhǔn)的主架結(jié)構(gòu)以提供需要的特性(例如增加的核酸酶抗性，較緊的 結(jié)合，穩(wěn)定性或需要的Tm)可以制備本發(fā)明的hTRT (或hTR或其它)多聚核苷酸和寡聚 核苷酸。用于呈現(xiàn)寡聚核苷酸核酸酶抗性的技術(shù)包括描述于PCT公開W094/12633中的 那些?？梢陨a(chǎn)各種各樣的有用的修飾的寡聚核苷酸，包括具有肽-核酸(PNA)主架的 寡聚核苷酸(Nielsen等人，1991，科學(xué)254: 1497)或摻入2’ _0_甲基核糖核苷酸，硫代 磷酸酯核苷酸，甲基磷酸核苷酸，磷酸三酯核苷酸，硫代磷酸酯核苷酸，亞磷酰胺的寡 聚核苷酸。還有其它的有用的寡聚核苷酸可以含有烷基和鹵原子替代的糖成分，包括在 2，位置含有下面之一 OH，SH, SCH3, F，OCN, OCH3OCH3, OCH3O (CH2)nCH3. O (CH2)nNH2或O (CH2)nCH3，其中η是從1_約10; C1到Cltl的低級(jí)烷基，取代的低級(jí)烷 基，烷芳基，或芳烷基；Cl; Br； CN; CF3 ； OCF3 ； 0_，S-，或 N-烷基；0_，S-， 或N-烯基；SOCH3，S02CH3 ； 0Ν02 ； Ν02 ； Ν3 ； ΝΗ2 ；雜環(huán)烷基；雜環(huán)烷芳基， 氨基烷基氨基；多烷基氨基；取代的甲硅烷基；RNA裂解的基團(tuán)；膽留烯基；葉酸基 團(tuán)；報(bào)道基團(tuán)；嵌入劑；用于改善寡聚核苷酸的藥物動(dòng)力學(xué)特性的基團(tuán)；或用于改善寡 聚核苷酸的藥物動(dòng)態(tài)學(xué)特性的基團(tuán)和具有類似的特性的其它取代可以直接偶合到，或借 助于接頭在任何核苷的2’部分或在3’末端或5’末端的核苷的3’或5’部分將有助 于寡聚核苷酸攝取的葉酸，膽留醇或其它基團(tuán)例如脂類類似物。可以使用一個(gè)或多個(gè)這 樣的偶合物。寡聚核苷酸也具有模擬糖例如環(huán)丁基取代戊糖呋喃糖基。其它實(shí)施方案包 括至少一個(gè)修飾的堿基形式或“通用的堿基”例如次黃苷，或包含其它的非標(biāo)準(zhǔn)堿基例 如queosine和wybutosine以及乙?；?，甲基，硫代和類似的修飾的腺嘌呤，胞嘧啶，鳥嘌 呤，胸腺嘧啶和尿嘧啶形式，這些修飾形式不易于被內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶識(shí)別。本發(fā)明進(jìn)一步提供了具有主架類似物例如磷酸二酯，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，甲基磷酸酯， 氨基磷酸酯，烷基磷酸三酯，硫酸，3，-硫代乙酰，亞甲基(methylimino)，3，_N_氨基 甲酸酯，嗎啉氨基甲酸酯，和手性的甲基磷酸酯，具有短鏈烷基或環(huán)烷基的糖間鍵合， 短鏈雜原子或雜環(huán)糖間(“主架”)鍵合，或CH2-NH-O-CH2, CH2-N(CH3)-OCH2, CH2-O-N (CH3) - (CH2)，CH-N (CH3) —N (CH3) -CH2，禾口 0_N (CH3) -CH2-CH2 主架(其中 磷酸二酯是O-P-O-CH2)，或類似的混合物的核苷。具有嗎啉主架結(jié)構(gòu)的寡聚核苷酸也 可用(美國(guó)專利5034506)。有用的參考包括寡聚核苷酸，和類似物，由REckstein編輯的，牛津大學(xué)出 版社IRL出版(1991)的實(shí)踐手冊(cè)；反義方案，紐約科學(xué)院年報(bào)，第600期，Baserga 禾口 Denhardt (NYAS 1992) ； Milligan 等人，1"3 年7 月 9 日，醫(yī)學(xué)化學(xué)雜志 36 (14) 1923-1937 ；反義研究和應(yīng)用(1993，CRC出版社)，整個(gè)文獻(xiàn)，特別是第15章，由 Sanghvi發(fā)表的名稱為“核酸中的雜環(huán)堿基修飾和在反義寡聚核苷酸中的應(yīng)用”，反義治 療，SudhirAgrawal 編輯(Humana 出版社，Totowa，新澤西州，1996)。

D)標(biāo)記的核酸例如當(dāng)hTRT或其它寡聚核苷酸或多聚核苷酸可用作為核酸探針，標(biāo)記本發(fā)明的 核酸經(jīng)常是有用的。采用本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的任何手段可用將標(biāo)記物(參見下文)摻 入。在一個(gè)實(shí)施方案中，標(biāo)記了未擴(kuò)增的核酸(例如，mRNA，多AmRNA，cDNA)。 生產(chǎn)標(biāo)記的核酸的手段是本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的并且包括例如缺口轉(zhuǎn)譯，隨機(jī)引物標(biāo) 記，末端標(biāo)記(例如利用激酶)和化學(xué)偶合(例如光生物素化)或合成。在另一個(gè)實(shí)施方 案中，可以在制備核酸樣品的擴(kuò)增過程中同時(shí)摻入標(biāo)記物。因此，例如用標(biāo)記的引物或 標(biāo)記的核苷酸進(jìn)行的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或其它核酸擴(kuò)增方法將提供標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，利用標(biāo)記的核苷酸(例如熒光素標(biāo)記的UTP和/或CTP)的轉(zhuǎn)錄擴(kuò) 增將標(biāo)記物摻入到轉(zhuǎn)錄的核酸。也可以或另一種可選的方法在擴(kuò)增完成之后，標(biāo)記擴(kuò)增 產(chǎn)物。E)說明性的寡聚核苷酸如上文說明的和下文詳細(xì)討論的，將寡聚核苷酸用于各種各樣的用途，包括用 作為引物，探針，治療劑或其它反義寡聚核苷酸，三聯(lián)體寡聚核苷酸和許多其它的用 途，這從本文的公開是顯而易見的。表2提供了可用于實(shí)施本發(fā)明的說明性的特定的寡 聚核苷酸。將會(huì)認(rèn)識(shí)到通過下面提供的指導(dǎo)，本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員可以合成本發(fā)明的許多 其它有用的寡聚核苷酸。表2中，“seq”是指引物已經(jīng)使用，或可用于測(cè)序；“PCR”是指引物已 經(jīng)被使用或可用于PCR; “AS”是指引物已經(jīng)被使用或可用于反義抑制端粒酶活性；
“Cl”是指引物已經(jīng)使用的，或可用于hTRT基因或RNA克隆區(qū)域，“mut”是是引物 已經(jīng)使用，或可用于構(gòu)建hTRT基因或基因產(chǎn)物的突變體?！癠C”是指“上面的情況” 和“l(fā)c”是指“下面的情況”。錯(cuò)配和插入(相對(duì)于SEQUENCE ID NO: 1)由底下劃 線處表明；缺失由“_”表示。將會(huì)認(rèn)識(shí)到在表2中沒有任何指示計(jì)劃用于將特定的寡 聚核苷酸限制到單一的用途或幾種用途。X uliDVuOWouVOVOUDOuV 9ε·δ-ι
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權(quán)利要求
1.人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶6EQID NO:幻的分離的免疫原性肽，其可以引起對(duì)人端粒酶 逆轉(zhuǎn)錄酶的適應(yīng)性免疫應(yīng)答。
2.權(quán)利要求1的分離的免疫原性肽，其中所述肽由SEQIDNO: 2的至少8個(gè)、優(yōu)選 至少10個(gè)氨基酸組成。
3.人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶6EQIDN0:2)的分離的肽，其包含至少10個(gè)氨基酸。
4.一種組合物，其包含前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的分離的肽和佐劑。
5.—種分離或重組的多核苷酸，其包含hTRT核酸序列的亞序列，所述亞序列包含與 人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTRT) (SEQ ID NO 1)相同或互補(bǔ)的至少12個(gè)、至少25個(gè)、優(yōu)選 至少50個(gè)連續(xù)堿基，條件是所述核酸序列不是SEQ IDNO 8或SEQ ID NO 3。
6.—種分離或重組的多核苷酸，其包含hTRT核酸序列的亞序列，所述亞序列包含a)與質(zhì)粒pGRN121(ATCC 209016)中第1625至M58位核苷酸的人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶 (hTRT)插入序列的序列相同或互補(bǔ)的至少100個(gè)堿基，或b)與質(zhì)粒pGRN121(ATCC 209016)中第782至1636位核苷酸的人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶 (hTRT)插入序列的序列相同或互補(bǔ)的至少12個(gè)堿基、至少25個(gè)堿基。
7.權(quán)利要求5或6中限定的分離或重組的多核苷酸，其與啟動(dòng)子可操作地連接。
8.—種藥物，其包含權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的肽或權(quán)利要求5-7任一項(xiàng)的多核苷酸以及 藥物可接受的載體。
9.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的肽或權(quán)利要求5-7任一項(xiàng)的多核苷酸在制備用于治療癌癥的 藥物中的應(yīng)用。
10.一種分離的重組細(xì)胞，其包含權(quán)利要求5-7任一項(xiàng)的分離的多核苷酸或權(quán)利要求 1-3任一項(xiàng)的肽。
全文摘要
本發(fā)明提供了與人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTRT)，人類端粒酶的催化蛋白質(zhì)亞單位相關(guān)的組合物和方法。本發(fā)明的聚核苷酸和多肽可用于人類疾病的診斷、預(yù)測(cè)和治療，用于改變細(xì)胞和生物體的增殖能力，和用于鑒定和篩選用于治療疾病例如癌癥的化合物和治療藥物。
文檔編號(hào)C12N1/19GK102021153SQ20101015049
公開日2011年4月20日 申請(qǐng)日期1997年10月1日 優(yōu)先權(quán)日1996年10月1日
發(fā)明者卡倫·B·查普曼, 卡爾文·B·哈利, 威廉·H·安德魯斯, 托馬斯·R·切赫, 托魯·納卡穆拉, 格雷格·B·莫林, 約阿希姆·林納 申請(qǐng)人:杰龍公司, 科羅拉多大學(xué)董事會(huì)