專利名稱：一種熒光定量pcr反應(yīng)液及熒光定量pcr方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)和實(shí)驗(yàn)方法領(lǐng)域，具體涉及一種熒光定量PCR反應(yīng)液及熒光定量PCR方法，特別是用于長核苷酸片段的定量PCR反應(yīng)液和方法。
背景技術(shù)：
熒光定量PCR (Real-time quantitative PCR，也稱為定量 PCR，簡稱為 QPCR)技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。熒光定量PCR根據(jù)化學(xué)原理的不同可分為探針法和染料法。其中Taqman熒光定量技術(shù)以Taqman熒光探針為基礎(chǔ)。Taqman熒光探針，也稱為水解探針，為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)熒光發(fā)射基團(tuán)和一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)。探針完整時(shí)，發(fā)射基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’ _3’外切酶活性將探針酶切降解，使熒光發(fā)射基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)分離，熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)就可以接收到熒光信號(hào)。具體地，當(dāng)探針與靶序列配對(duì)時(shí)，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光因與3’端的淬滅基團(tuán)接近而被淬滅；在進(jìn)行延伸反應(yīng)時(shí)，Taq聚合酶的5’_3’外切酶活性將探針切斷，使得熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，發(fā)出熒光。一分子產(chǎn)物生成伴隨一分子熒光信號(hào)產(chǎn)生，隨著擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，熒光增強(qiáng)(Heid，C.A.，J. Stevens, K. J. Livak, et al. Real time quantitative PCR[J]. Genome Res, 1996,6 :986-994.)。Taqman水解探針由于其特異性較高而廣范地應(yīng)用于熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。一般情況下，為了保證理想的擴(kuò)增效率(90% 110% )，要求熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增產(chǎn)物長度不宜超過400bp，更理想的最好能在50-150bp內(nèi)，擴(kuò)增片段越短，有效的擴(kuò)增反應(yīng)就越容易獲得。較短的擴(kuò)增片段也容易保證分析的一致性。而擴(kuò)增效率低會(huì)影響實(shí)驗(yàn)的精確性、重復(fù)性和靈敏度。正是由于實(shí)驗(yàn)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物大小這種特殊的要求，導(dǎo)致熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)用于長片段擴(kuò)增產(chǎn)物的定量受到很大的限制。舉個(gè)例子來說，按照illumina公司solexa測(cè)序平臺(tái)提供的《ft·印aring 2_5kb Samples for Mate Pair Library Sequencing)) (Part#1005363Rev. B)構(gòu)建 Pair End 文庫，在制備DNA簇(Clusters)前需要對(duì)I^ir End文庫進(jìn)行濃度測(cè)定，然后選擇合適的文庫上機(jī)濃度，期望得到預(yù)期的DNA簇密度(Meyer，Μ.，A. W. Briggs, Τ. Maricic, et al. From micrograms to picograms -quantitative PCR reduces the material demands of high-throughput sequencing[J]. Nucleic Acids Res,2008,36 :e5 ；Quail, MA., I.Kozarewa,F. Smith,et al. A large genome center' s improvements to the Illumina sequencing system [J]. Nat Methods, 2008, 5 (12) : 1005-1010· )。Pair End 文庫的片段長度為300 600bp,部分文庫達(dá)800bp。有文獻(xiàn)與參考資料報(bào)道(Smith S.，L. Vigilant, P. A. Morin. The effects of sequence length and oligonucleotide mismatches on 5 ' exonuclease assay efficiency[J]. Nucleic Acids Res,2002,30 :elll ；Applied Biosystems, Primer Express Software Version3.OGetting Started Guide [EB/ OL]. 2005)在文庫定量的熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中擴(kuò)增效率會(huì)隨著擴(kuò)增產(chǎn)物長度的增加而降低，為保證較好的擴(kuò)增效率(90% 110% )，熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)Taqman水解探針法的擴(kuò)增產(chǎn)物大小最好保持在50bp 150bp。因此文庫的片段長度是影響擴(kuò)增效率的主要因素。例如，使用某iTaqman PCR反應(yīng)液對(duì)一定數(shù)量片段長度為300 600bp的I^air End文庫進(jìn)行定量，其擴(kuò)增效率在85%左右。根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物遵循理論方程Y = X(1+E)n(其中Y=擴(kuò)增產(chǎn)物，X =起始濃度，E =擴(kuò)增效率，n =循環(huán)數(shù))，對(duì)于同一個(gè)樣品，假設(shè)擴(kuò)增效率分別為85% 與90%，經(jīng)過20個(gè)循環(huán)后，Y1 = X1 (1+0. 85) 2°，Y2 = X2 (1+0. 90) 2°，由于其擴(kuò)增效率的不同， 結(jié)果相差1.7倍。因此，為了使熒光定量PCR能更好地應(yīng)用于長核苷酸片段的定量，需要解決擴(kuò)增效率偏低的問題。

發(fā)明內(nèi)容
為了提高熒光定量PCR Taqman水解探針法擴(kuò)增長核苷酸片段的效率，發(fā)明人進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)，針對(duì)可能的影響因素采取相應(yīng)的措施對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行了優(yōu)化，由此完成了本發(fā)明。本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種熒光定量PCR反應(yīng)液，其特征在于所述反應(yīng)液中包含 PCR反應(yīng)增強(qiáng)劑。所述PCR反應(yīng)增強(qiáng)劑包括但不限于二甲亞砜(DMSO)、甘油、牛血清白蛋白(BSA)、 甲酰胺、非離子去污劑、聚乙二醇6000、亞精胺、硫酸銨和甜菜堿(Betaine)中的一種或多種，例如二甲亞砜、牛血清白蛋白或甜菜堿中的一種或多種，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中， 所述PCR反應(yīng)增強(qiáng)劑為二甲亞砜、牛血清白蛋白和甜菜堿。二甲亞砜、甘油、牛血清白蛋白、甲酰胺、非離子去污劑、聚乙二醇6000、亞精胺、硫酸銨或甜菜堿等在熒光定量PCR中，作為反應(yīng)增強(qiáng)劑能夠促進(jìn)各種耐熱DNA聚合酶對(duì)許多復(fù)雜結(jié)構(gòu)DNA模板(如高GC含量)的有效擴(kuò)增，增加PCR反應(yīng)的靈敏度和特異性。其原理包括通過提高DNA聚合酶的熱穩(wěn)定性，降低模板DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)等機(jī)制提高目的片段的產(chǎn)量。其中，-10%二甲亞砜能改變引物模板配對(duì)反應(yīng)的熔解溫度，從而改善GC含量高的DNA的變性情況，使聚合酶更容易在二級(jí)結(jié)構(gòu)處延伸。5%-20%甘油可提高產(chǎn)量，增加酶的穩(wěn)定性。0. lyg/μ l-lyg/μ 1牛血清白蛋白能提高PCR反應(yīng)的效率，同時(shí)減少體系中PCR抑制物對(duì)反應(yīng)的影響。1.25% -10%甲酰胺可促進(jìn)某些“引物-模板”退火，降低帶有二級(jí)結(jié)構(gòu)的DNA的變性溫度。硫酸銨能增加反應(yīng)體系的離子強(qiáng)度，改變DNA的變性及退火溫度，調(diào)節(jié)酶活。0. 5-2Μ甜菜堿有助于高GC含量和長DNA片段的PCR反應(yīng)?？梢愿鶕?jù)實(shí)際需要，選擇其中的一種或多種。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，二甲亞砜的濃度為5%，BSA的濃度為0. 1 μ g/μ 1， 甜菜堿的濃度為1Μ。所述熒光定量PCR反應(yīng)液，其特征在于還包含耐熱DNA聚合酶，所述DNA聚合酶具有5' -3'聚合酶活性和5' -3'外切酶活性。優(yōu)選為所述DNA聚合酶還同時(shí)具有3' -5' 外切酶活性，以增加反應(yīng)的靈敏度和特異性等等，如Ex Taq DNA聚合酶，LA Taq DNA聚合酶。更優(yōu)選為所述DNA聚合酶為熱啟動(dòng)(hot start) DNA聚合酶。熱啟動(dòng)DNA聚合酶是指在高熱狀況下才會(huì)活化的聚合酶，以避免在未達(dá)到設(shè)定溫度前就開始反應(yīng)。利用熱啟動(dòng)DNA聚合酶可防止在PCR反應(yīng)第一步因引物錯(cuò)配或引物二聚體的形成而導(dǎo)致的非特異性擴(kuò)增，從而提高目的DNA片段的擴(kuò)增效率。所述熱啟動(dòng)DNA聚合酶可以為經(jīng)過化學(xué)分子修飾的聚合酶，高熱下結(jié)構(gòu)改變而啟動(dòng)；或者帶有針對(duì)聚合酶的免疫抗體，高熱下使抗體分離而啟動(dòng)；或者改良自抗體型，使用小分子的化合物，阻塞聚合酶作用位置，高溫下分離而啟動(dòng)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中， 所述熱啟動(dòng)DNA聚合酶為Ex Taq 熱啟動(dòng)DNA聚合酶(Ex Taq DNA Polymerase Hot Start Version)。本發(fā)明的另一方面涉及一種熒光定量PCR反應(yīng)液，其特征在于反應(yīng)液的成份包含 10-67mM ρΗ 8. 2-9. 0Tris-HCl、25-50mM KClU. 5-5. OmM Mg2+、0. 2-0. 4mM dNTP、 0. 05% -0· 1 % Tween 20、1% -10%二甲亞砜、0· 1 μ g/μ 1-1 μ g/μ 1 牛血清白蛋白、0· 5-2Μ 甜菜堿和0. 04-0. 2U/ μ 1熱啟動(dòng)DNA聚合酶。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，其中所述的Mg2+為2. 5_3mM，二甲亞砜為1.2% _5%，牛血清白蛋白為0. 1-0. 8 μ g/ μ 1，甜菜堿為1-1. 2Μ，熱啟動(dòng)DNA聚合酶為0. 05-0. 07U/ μ 1。本發(fā)明的還一方面涉及一種熒光定量PCR試劑盒，其包含本發(fā)明所述的熒光定量 PCR反應(yīng)液。本發(fā)明的還一方面涉及一種熒光定量PCR方法，其特征在于所述方法包含使用本發(fā)明所述的熒光定量PCR反應(yīng)液的步驟。發(fā)明的有益效果本發(fā)明優(yōu)化了熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)液，特別是在反應(yīng)液中加入PCR反應(yīng)增強(qiáng)齊U，選擇熱啟動(dòng)DNA聚合酶，解決了長片段定量PCR擴(kuò)增效率偏低的問題，把擴(kuò)增效率從 85%提高到95%以上。本方法既可以應(yīng)用于一般的長核苷酸片段的定量，也可以應(yīng)用于長片段文庫的定量。


圖1熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增曲線圖A 用商品化反應(yīng)體系進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增曲線B 優(yōu)化的反應(yīng)體系1的熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增曲線C 優(yōu)化的反應(yīng)體系2的熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增曲線D 優(yōu)化的反應(yīng)體系3的熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增曲線其中橫坐標(biāo)為循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度。圖2熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖A 用商品化反應(yīng)體系進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線B 優(yōu)化的反應(yīng)體系1的熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線C 優(yōu)化的反應(yīng)體系2的熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線D 優(yōu)化的反應(yīng)體系3的熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線其中橫坐標(biāo)為樣品起始濃度(單位是ρΜ)，縱坐標(biāo)為CT值。圖3標(biāo)準(zhǔn)差與CT的關(guān)系其中σ為標(biāo)準(zhǔn)差，X為樣品的某濃度，Y為X的1/10。標(biāo)準(zhǔn)差越小，反映出測(cè)量的準(zhǔn)確度越高。具體來說，如果定量PCR的擴(kuò)增效率是100%，那么10倍稀釋點(diǎn)(X與Y濃度)之間的平均CT間隔應(yīng)該恰為3. 32個(gè)CT值(見圖 3)。要以99. 7%的幾率分辨10倍稀釋的濃度，標(biāo)準(zhǔn)差就必須小于等于3. 32/6 = 0. 553。
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實(shí)施例中涉及的各實(shí)驗(yàn)材料1)模板、探針和引物模板的制備從一名男性黃種人的血液中提取基因組DNA，按照《ft·印aring 2_5kb Samples for Mate Pair Library Sequencing Part#1005363Rev. B》(Part#1005363Rev. B)構(gòu)建文庫，其中含有不同片段大小的DNA經(jīng)Agilent 2100Bioanalyzer測(cè)定濃度，濃度為18. 7nM，脫氧核糖核酸片段大小平均為557bp，其脫氧核糖核酸片段大小范圍為391bp-637bp。以此構(gòu)建好的DNA文庫作為標(biāo)準(zhǔn)品，用去離子水將 InM標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為5個(gè)濃度0. 1ρΜ、1ρΜ、10ρΜ、100ρΜ和ΙΟΟΟρΜ，作為反應(yīng)模板。其中InM = l(T9mol/L，IpM = l(T12mol/L。7jC解探針序列5，CCCTACACGACGCTCTTCCGATCT 3，(SEQID NO :1)，在其 5，端帶有熒光基團(tuán)5-FAM(5-羧基熒光素)，3’端帶有淬滅基團(tuán)6-TAMRA(6-羧基四甲基羅丹明)。引物 1. 1 :5，AATGATACGGCGACCACCGAGATC 3，(SEQ IDNO 2)引物 2. 1 :5，CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT 3，(SEQ IDNO 3)2)試劑其中10XPCR Buffer (Takara公司)含 IOOmM Tris_HCl、500mMKCl 和 15mM MgCl2, Ex Taq hot start version DNA 聚合酶為 5U/μ L，購自 Takara，dNTP 購自 Takara，MgS04 禾口 BSA 購自 New EnglandBiolabs，DMSO 購自上海生工，Betaine 購自 Sigma，50 X ROX 參比染料 (6-carboxyl-X-rhodamine)購自Invitrogen，引物和探針由上海生工合成。商品化試劑的反應(yīng)預(yù)混液,購自Applied Biosystems，貨號(hào)為4304473，成分為AmpliTaq Gold DNA聚合酶、AmpErase UNG、dNTPs, Rox參比熒光及優(yōu)化的緩沖液組分(具體可參見產(chǎn)品說明書)。實(shí)施例1反應(yīng)體系優(yōu)化和商品化反應(yīng)體系的熒光定量PCR比較1.優(yōu)化的反應(yīng)體系為1)優(yōu)化的反應(yīng)體系1 10XPCR Buffer2. 5 μ L2. 5mM dNTP2 μ LIOOmM MgSO40. 25 μ L10mg/mL BSA0. 25 μ L10% Tween-200. 25 μ L100% DMSO1· 25 μ L5Μ Betaine (甜菜堿)5 μ L10 μ M 引物 1.10· 75 μ L
10 μ M 引物 2.10.75 μ L10 μ M 水解探針0. 625 μ L50 X ROX 參比染料0. 5 μ LDNA 聚合酶0. 25 μ L模板1 μ L去離子水9. 625 μ L合計(jì)25 μ L5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品濃度均參與反應(yīng)，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品濃度重復(fù)2次。2)優(yōu)化的反應(yīng)體系2 10XPCR Buffer2. 5 μ L2. 5mM dNTP2 μ LIOOmM MgSO40. 25 μ L10mg/mL BSA2 μ L10% Tween-200. 25 μ L100% DMSO0. 3 μ L5Μ Betaine (甜菜堿)6 μ L10 μ M 引物 1.1O. 75 μ L10 μ M 引物 2.1O. 75 μ L10 μ M 水解探針O. 625 μ L50 X ROX 參比染料O. 5 μ LDNA 聚合酶O. 25 μ L模板1 μ L去離子水7. 825 μ L合計(jì)25 μ L5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品濃度均參與反應(yīng)，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品濃度重復(fù)2次。3)優(yōu)化的反應(yīng)體系3 IOXPCR Buffer2. 5 μ L2. 5mM dNTP2 μ LIOOmM MgSO40. 375 μ L10mg/mL BSA0. 25 μ L10% Tween-200. 25 μ L100% DMSO1· 25 μ L5Μ Betaine (甜菜堿)5 μ L10 μ M 引物 1.1O. 75 μ L10 μ M 引物 2.1O. 75 μ L10 μ M 水解探針O. 625 μ L50 X ROX 參比染料O. 5 μ LDNA 聚合酶O. 35 μ L模板1 μ L
去離子水9. 4 μ L合計(jì)25 μ L5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品濃度均參與反應(yīng)，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品濃度重復(fù)2次。2.商品化的反應(yīng)體系為反應(yīng)預(yù)混液12. 5yL10 μ M 引物 1.10.75 μ L10 μ M 引物 2.10· 75 μ L10 μ M 水解探針0.625 μ L模板1 μ L去離子水9. 375 μ L合計(jì)25 μ L5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品濃度均參與反應(yīng)，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品濃度重復(fù)2次。3.反應(yīng)條件將以上四種反應(yīng)體系在熒光定量PCR儀M^3One Plus (ABI公司)中進(jìn)行反應(yīng)。本發(fā)明優(yōu)化的反應(yīng)體系的反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性 IOS ；95°C變性 30S、60°C退火 30S、72°C延伸 45S，共 40 個(gè)循環(huán)。商品化試劑體系的反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性 IOmin ；95°C變性 30S、60°C退火 30S、72°C延伸 45S，共 40 個(gè)循環(huán)。4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)乂印01^ v2.0軟件分析，本發(fā)明優(yōu)化反應(yīng)體系1的擴(kuò)增效率為 99. 31%，優(yōu)化反應(yīng)體系2的擴(kuò)增效率為97. 96%，優(yōu)化反應(yīng)體系3的擴(kuò)增效率為99. 49%, 而商品化體系的擴(kuò)增效率為86. 73%。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1-表4，以及圖1、圖2和圖3。表1使用商品化反應(yīng)體系的熒光定量PCR結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種熒光定量PCR反應(yīng)液，其特征在于所述反應(yīng)液中包含二甲亞砜、甘油、牛血清白蛋白、甲酰胺、聚乙二醇6000、亞精胺、硫酸銨和甜菜堿中的一種或多種。
2.權(quán)利要求1的反應(yīng)液，其特征在于所述反應(yīng)液中包含二甲亞砜、牛血清白蛋白和甜菜堿。
3.權(quán)利要求1的反應(yīng)液，其還包含耐熱DNA聚合酶，所述DNA聚合酶具有5'-3'聚合酶活性和5' -3'外切酶活性，優(yōu)選地，所述DNA聚合酶具有3' -5'外切酶活性，更優(yōu)選為Ex Taq DNA聚合酶。
4.權(quán)利要求3的反應(yīng)液，其中所述DNA聚合酶為熱啟動(dòng)DNA聚合酶，優(yōu)選為ExTaq 熱啟動(dòng)DNA聚合酶。
5.—種熒光定量PCR反應(yīng)液，其特征在于反應(yīng)液的成份包含10-67mM pH8. 2-9. OTris-HCl、25-50mM KC1、1. 5-5. OmM Mg2+、0. 2-0. 4mM dNTP、0. 05% -0. 1% Tween 20、1%-10%二甲亞砜、0. lyg/μ l-lyg/μ 1 牛血清白蛋白、0. 5-2M甜菜堿和 0. 04-0. 2U/ μ 1熱啟動(dòng)DNA聚合酶。
6.權(quán)利要求5的反應(yīng)液，其中所述的Mg2+為2.5-3mM，二甲亞砜為1.2% _5%，牛血清白蛋白為0. 1-0. 8 μ g/μ 1，甜菜堿為1-1. 2Μ，熱啟動(dòng)DNA聚合酶為0. 05-0. 07U/y L·
7.一種熒光定量PCR試劑盒，其包含權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的反應(yīng)液。
8.一種熒光定量PCR方法，其特征在于所述方法包含使用權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的反應(yīng)液的步驟。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)和實(shí)驗(yàn)方法領(lǐng)域，具體涉及一種熒光定量PCR反應(yīng)液，其特征在于包含PCR反應(yīng)增強(qiáng)劑，所述PCR反應(yīng)增強(qiáng)劑選自二甲亞砜、甘油、牛血清白蛋白、甲酰胺、聚乙二醇6000、亞精胺、硫酸銨和甜菜堿中的一種或多種，例如二甲亞砜、牛血清白蛋白和甜菜堿。本發(fā)明的熒光定量PCR反應(yīng)液還包含具有5′-3′聚合酶活性和5′-3′外切酶活性的耐熱DNA聚合酶，優(yōu)選為同時(shí)具有3′-5′外切酶活性的耐熱DNA聚合酶和熱啟動(dòng)耐熱DNA聚合酶。本發(fā)明還涉及包含所述反應(yīng)液的試劑盒以及利用所述反應(yīng)液進(jìn)行熒光定量PCR的方法。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102465120SQ20101053826
公開日2012年5月23日 申請(qǐng)日期2010年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月10日
發(fā)明者孫勇, 張慶輝, 張秀清, 楊煥明, 陳城超, 陳敏峰, 黃業(yè)博 申請(qǐng)人:深圳華大基因研究院, 深圳華大基因科技有限公司