專利名稱：利用BGIos244基因促進植物根的生長的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于促進植物根的生長的方法。特別地，本發(fā)明利用BGIOS244基因促 進植物根的生長。
背景技術(shù)：
水稻是我國重要的經(jīng)濟作物，其栽種面積為4. 5億畝左右。世界上約有60%的人 口以稻米作為日常主食。通過水稻的分子育種來提高產(chǎn)量，給全球的糧食生產(chǎn)帶來了巨大 收益。矮稈基因的利用和多分蘗水稻的育成，使我國的水稻產(chǎn)量取得了巨大飛躍。但在相 當長的一段時間里，我國的水稻單產(chǎn)出現(xiàn)了徘徊不前的局面。由此，許多育種工作者從育種 理論和方法上提出了新的思路和設想，希望使水稻單產(chǎn)取得新的突破。在水稻的高產(chǎn)育種 理論上，國際水稻研究所于20世紀90年代初就提出了基于新株型的超級稻理論，然而，到 目前為止，在水稻的育種科研與實踐中對水稻地下部分的形態(tài)和生理性狀的改良卻未能在 水稻的分子育種中得以具體體現(xiàn)。目前我國水稻的水肥利用率低，這不僅造成大量人力、物力和財力的浪費，而且大 量的化學肥料和農(nóng)藥通過地表徑流以及土壤滲透排入江河湖泊和地下水中，對地表和地下 水造成嚴重污染。這已經(jīng)成為環(huán)境污染的一個重要方面。另一方面，全世界近一半的水稻 種植面積處在缺水的狀態(tài)下，嚴重影響了水稻產(chǎn)量的提高。我國很多地區(qū)由于相對缺乏灌 溉用水，致使水稻生產(chǎn)難以發(fā)展，這在一定程度上影響了耕地資源的充分利用。因此，提高 水稻本身的水肥利用率，發(fā)展節(jié)水型水稻，是新時期可持續(xù)農(nóng)業(yè)發(fā)展的又一基本要求。而對 于提高水稻品種本身的肥料利用率來說，根系的相關(guān)形態(tài)和生理性狀的改良至關(guān)重要。隨 著環(huán)保和農(nóng)業(yè)的進一步發(fā)展，在經(jīng)濟發(fā)達的地區(qū)，解決水稻易發(fā)生根倒伏，提高水肥利用率 已成為提高水稻產(chǎn)量和發(fā)展的一個關(guān)鍵問題。從根系角度研究水稻抗根倒伏的生物學、力 學機制及其遺傳基礎，對于從栽培和育種角度減輕水稻根倒伏的危害，具有巨大的現(xiàn)實和 長遠意義。水稻根系既是吸收養(yǎng)分和水分的重要器官，也是一些物質(zhì)合成和運輸?shù)钠鞴?，?的形態(tài)發(fā)育對水稻產(chǎn)量和品質(zhì)的影響很早就引起人們的注意。育種學家主要關(guān)注于環(huán)境對 根系生長發(fā)育的影響(孫傳清等，中國農(nóng)業(yè)科學.1995，28(1) 42-48)以及根系與產(chǎn)量等因 素之間的相互關(guān)系(凌啟鴻等，中國農(nóng)業(yè)科學.1984，(4) :3-11)，然而，關(guān)于根系的分子育 種研究卻很少報道。與根系性狀表達相關(guān)的分子標記的開發(fā)表明，控制水稻根系發(fā)育的是 數(shù)量性狀(Yadav 等人，Theor ApplGenet. 1997，94 :619_632 ；徐吉臣等，遺傳學報· 2002， 29(3) :245-249)，但這并未引起足夠的重視。石慶華等(中國農(nóng)業(yè)科學.1997，30 (4) 61-67)研究了根系發(fā)育與地上部分的相關(guān)關(guān)系，并指出，在栽培上培育有利于塑造理想株 型的根型是水稻高產(chǎn)栽培的新要求，深根系更有利于高產(chǎn)。但是，育種工作者至今未能就什 么是理想的水稻根型提出具體明確的指標。目前，如何從思路和技術(shù)上提出一種嶄新的方法來定位水稻根系發(fā)育的基因已成 為水稻育種的關(guān)鍵。相關(guān)研究表明，檢測自然選擇信號可能是一條嶄新的、高通量的鑒定有 用基因的道路。由于人工選擇的時間短，遺傳重組事件少，受選擇的基因與其鄰近區(qū)域會緊密連鎖，因此，如果觀察到一個基因組區(qū)域的多態(tài)性分布很特別，具有統(tǒng)計學顯著性，那么 該區(qū)域含有的基因和突變位點即有可能與選擇的性狀相關(guān)。研究表明，水稻全基因組大約 6%的區(qū)域為SNP高變區(qū)，這些區(qū)域可能富集了與亞種分化和重要復雜農(nóng)藝性狀相關(guān)的基 因(Tang 等人，PLoS Genet. 2006,2 :el99)。Gao LZ 等(BMC Evolutionary Biology. 2008, 8 11)通過對栽培稻和普通野生稻進行對比分析，建立了理論群體遺傳學數(shù)學模型，檢測 了 60個微衛(wèi)星位點所受的人工選擇，發(fā)現(xiàn)了一些留有顯著選擇痕跡的位點以及其近鄰的 可能的功能基因。但這些研究離從全基因組水平全面分析人工選擇的基因依然遙遠，這 主要是因為數(shù)據(jù)量遠遠不夠，模型和方法也有待提高。迄今為止識別出的水稻性狀基因 如 qSHl、Re、sh4、hdl (Kovach 等人，Trends in Genetics. 2007,23(11) :578_587)，以及 PROGl (Jin 等人，Nature Genetics. 2008,40(11) 1365-1369)和 GIFl (Wang 等人，Nature Genetics. 2008,40(11) 1370-1374)仍然是通過傳統(tǒng)的圖位克隆手段獲得的。新一代測序技術(shù)(如Solexa、Solid測序儀)的出現(xiàn)，為廉價高效地獲得水稻根系 發(fā)育基因和基因家族提供了前所未有的機會。利用野生稻與栽培稻的基因組重測序數(shù)據(jù)和 技術(shù)，能夠比較各栽培種及野生種的基因組結(jié)構(gòu)的異同，這使運用進化基因組學的理論和 方法來獲得根系發(fā)育相關(guān)的基因或基因組功能元件成為可能。長期以來，對水稻根系發(fā)育形態(tài)、生理性狀的遺傳改良一直未能在水稻的分子育 種中得以體現(xiàn)。雖然雜交水稻的根系比常規(guī)品種在形態(tài)和生理上占有優(yōu)勢，使育種家看到 了根系改良的重要性和實際效果，但是迄今為止未能提出一套具體的改良指標。因此，需要 進一步研究和開發(fā)水稻根系發(fā)育相關(guān)基因，以進一步提高根系對營養(yǎng)的吸收和對水肥的利 用率，減少農(nóng)藥的施用，增加地上部分的分蘗和收獲等。隨著水稻分子育種理論與技術(shù)的不斷成熟和完善，以及遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立和優(yōu) 化，利用新型測序技術(shù)結(jié)合基因組學方法來鑒定受人工選擇的基因資源，使得利用基因組 重測序技術(shù)發(fā)掘根系發(fā)育相關(guān)基因和遺傳轉(zhuǎn)化成為可能。水稻地下部分發(fā)育的改良將進一 步提高水稻的產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性等。水稻根系發(fā)育相關(guān)基因的開發(fā)和遺傳轉(zhuǎn)化對于提高水 稻地上部分的產(chǎn)量、降低農(nóng)業(yè)投入、緩解環(huán)境污染、實現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要的意義， 其有利于增強我國農(nóng)業(yè)在國際上的競等力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過實驗證實，基因BGIos244(其序列可以是SEQ ID NO 7)具有促進植物 根系生長的功能。因此，在一個方面，本發(fā)明提供了含有基因BGIOS244的載體。在一個實施方案中， 所述載體優(yōu)選是表達載體，更優(yōu)選是在植物中高效表達基因BGIos244的載體，例如包含基 因BGIos244的重組載體p6，如本發(fā)明的重組載體p6+BGIos244。在另一個方面，本發(fā)明提供了含有基因BGIos244或根據(jù)本發(fā)明的載體的宿主細 胞。在一個實施方案中，所述宿主細胞優(yōu)選是根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens), 例如根癌農(nóng)桿菌EHA105-p6+BGIos244。在另一個方面，本發(fā)明提供了基因BGIos244和/或根據(jù)本發(fā)明的載體和/或宿主 細胞用于促進植物根系生長或用于制備轉(zhuǎn)基因植物或用于植物育種的用途。在一個實施方 案中，所述轉(zhuǎn)基因植物與未進行轉(zhuǎn)基因的植物相比，展示更優(yōu)良的植物根系生長。
在另一個方面，本發(fā)明提供了促進植物根系生長的方法，其包括將基因BGIos244 和/或根據(jù)本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化入植物，或用根據(jù)本發(fā)明的宿主細胞感染植物。在一個實施方案中，通過本領(lǐng)域公知的方法，例如根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法來將基因 BGIos244或根據(jù)本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化入植物。在一個實施方案中，基因BGIos244可操作地連接至在植物中有效的表達調(diào)控元 件，例如啟動子和/或終止子，優(yōu)選玉米泛素啟動子和/或NOS終止子。在另一個方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括以下步驟1)將基因BGIos244和/或根據(jù)本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化入植物愈傷組織，或用根據(jù)本發(fā) 明的宿主細胞感染植物愈傷組織；2)從所述愈傷組織再生轉(zhuǎn)基因植物。在一個實施方案中，通過上述方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物與未進行轉(zhuǎn)基因的植物相 比，展示更優(yōu)良的植物根系生長。特別地，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物的根系與對照植物的根系相 比，在淺層分布生長，并且根系短且密。在一個實施方案中，通過本領(lǐng)域公知的方法，例如根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法來將基因 BGIos244和/或根據(jù)本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化入植物愈傷組織。在一個實施方案中，基因BGIos244可操作地連接至在植物中有效的表達調(diào)控元 件，例如啟動子和/或終止子，優(yōu)選玉米泛素啟動子和/或NOS終止子。在另一個方面，本發(fā)明提供了通過上述方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物。在另一個方面，本發(fā)明提供了被導入了基因BGIos244或本發(fā)明的載體或被本發(fā) 明的宿主細胞感染的植物愈傷組織。在另一個方面，本發(fā)明提供了上文所述的植物愈傷組織用于制備轉(zhuǎn)基因植物或用 于植物育種的用途。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)基因植物，其被導入了基因BGIos244和/或 根據(jù)本發(fā)明的載體和/或根據(jù)本發(fā)明的宿主細胞。在一個實施方案中，所述轉(zhuǎn)基因植物，與未導入基因BGIos244或根據(jù)本發(fā)明的載 體或根據(jù)本發(fā)明的宿主細胞的對照植物相比，展示更優(yōu)良的植物根系生長，例如轉(zhuǎn)基因植 物的根系在淺層分布生長，并且根系短且密。在一個實施方案中，基因BGIos244可操作地連接至在植物中有效的表達調(diào)控元 件，所述表達調(diào)控元件例如啟動子和/或終止子，優(yōu)選玉米泛素啟動子和/或NOS終止子。在本發(fā)明中，重組載體p6是指，包含玉米泛素啟動子和NOS終止子的 pCAMB IA-1301 載體。在本發(fā)明中，植物優(yōu)選是單子葉植物，更優(yōu)選為水稻、谷子(Setaria italica), 小麥、高粱、玉米，特別優(yōu)選為水稻，例如日本晴(Oryza sativa L. japonica. cv. Nipponbare)。發(fā)明的有益效果本發(fā)明通過實驗證實，基因BGIos244具有促進植物根系生長的功能。從而，與現(xiàn) 有技術(shù)相比，本發(fā)明的技術(shù)方案將進一步提高根系對營養(yǎng)的吸收和對水肥的利用率，減少 農(nóng)藥的施用，增加地上部分的分蘗和收獲，進一步提高水稻的產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性。這對于降 低農(nóng)業(yè)投入、緩解環(huán)境污染、實現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和增強我國農(nóng)業(yè)在國際上的競爭力具有重要的意義。關(guān)于牛物材料保藏的說明本發(fā)明涉及以下生物材料1.普通野生稻元江種子，其于2010年9月6日保藏于湖北省武漢市武昌珞珈山武 漢大學保藏中心，即中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCC NO :P201011 ；2.根癌農(nóng)桿菌EHA105，其于2009年12月24日保藏于湖北省武漢市武昌珞珈山武 漢大學保藏中心，即中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCC NO =M 209315 ；3.水稻日本晴種子，其于2009年12月18日保藏于湖北省武漢市武昌珞珈山武漢 大學保藏中心，即中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCC NO :P200910。下面將結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人 員將理解，下列附圖和實施例僅用于說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明的范圍的限定。根據(jù)附圖 和優(yōu)選實施方案的下列詳細描述，本發(fā)明的各種目的和有利方面對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說 將變得顯然。附圖概述

圖1是顯示愈傷組織GUS染色的檢測結(jié)果的照片。左邊的愈傷組織為未轉(zhuǎn)化 BGIos244基因的對照愈傷組織，右邊的愈傷組織為轉(zhuǎn)化了 BGIos244基因的轉(zhuǎn)基因愈傷組織。圖2是顯示水稻幼苗⑶S染色的檢測結(jié)果的照片。其中，上圖顯示根的⑶S染色 的檢測結(jié)果，下圖顯示葉的GUS染色的檢測結(jié)果。在圖2中，左邊的根和葉均來自未轉(zhuǎn)化 BGIos244基因的對照水稻幼苗，右邊的根和葉均來自轉(zhuǎn)化了 BGIos244基因的轉(zhuǎn)基因水稻 幼苗。圖3是顯示水稻苗的根系性狀觀察結(jié)果的照片。其中，圖的左側(cè)為轉(zhuǎn)化了 BGIos244基因的轉(zhuǎn)基因水稻苗，圖的右側(cè)為未轉(zhuǎn)化BGIos244基因的對照水稻苗。
具體實施例方式實施例1 :BGIos244基因的PCR擴增和pMD18_T+BGIos244重組載體的構(gòu)建LPCR 擴增使用植物基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN新型植物基因組DNA提取試劑盒，目 錄號DP320-02)提取普通野生稻元江(Oryza. rifupongon Yuanjiang)(其由中國科學院 昆明動物研究所董楊提供)的基因組DNA(gDNA)。根據(jù)BGIos244基因的堿基序列，設計一 對PCR特異性擴增引物上游引物Fl (SEQ ID NO 1)包含限制性酶切位點BamHI，下游引物 Rl (SEQ ID NO :2)包含限制性酶切位點Xba I。以上述提取的元江gDNA為模板，利用上游 引物F1、下游引物Rl和高保真Ex Taq (TaKaRa,DRR100B)聚合酶進行PCR擴增。PCR擴增 體系如表1所示。表1 :BGIos244基因的PCR擴增體系
權(quán)利要求
含有基因BGIos244的載體，所述載體優(yōu)選是表達載體，更優(yōu)選是在植物中高效表達基因BGIos244的載體，例如包含基因BGIos244的重組載體p6。
2.含有基因BGIos244或權(quán)利要求1的載體的宿主細胞，所述宿主細胞優(yōu)選是根癌農(nóng)桿 菌,例如根癌農(nóng)桿菌EHA105-p6+BGIos244。
3.基因BGIos244和/或權(quán)利要求1的載體和/或權(quán)利要求2的宿主細胞用于促進植 物根系生長或用于制備轉(zhuǎn)基因植物或用于植物育種的用途。
4.權(quán)利要求3的用途，其中，所述植物優(yōu)選是單子葉植物，更優(yōu)選是水稻、谷子、小麥、高粱、玉米，特別優(yōu)選是水稻；優(yōu)選，所述轉(zhuǎn)基因植物與未進行轉(zhuǎn)基因的植物相比，展示更優(yōu)良的植物根系生長。
5.一種促進植物根系生長的方法，所述方法包括將基因BGIos244和/或權(quán)利要求1的 載體轉(zhuǎn)化入植物，或用權(quán)利要求2的宿主細胞感染植物，其中，優(yōu)選，通過根癌 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法來將所述基因和/或所述載體轉(zhuǎn)化入植物； 優(yōu)選，所述基因可操作地連接至在植物中有效的表達調(diào)控元件，所述表達調(diào)控元件例 如啟動子和/或終止子，優(yōu)選玉米泛素啟動子和/或NOS終止子；所述植物優(yōu)選是單子葉植物，更優(yōu)選是水稻、谷子、小麥、高粱、玉米，特別優(yōu)選是水稻。
6.一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括以下步驟1)將基因BGIos244和/或權(quán)利要求1的載體轉(zhuǎn)化入植物愈傷組織，或用權(quán)利要求2的 宿主細胞感染植物愈傷組織；2)從所述愈傷組織再生轉(zhuǎn)基因植物；其中，所述植物優(yōu)選是單子葉植物，更優(yōu)選為水稻、谷子、小麥、高粱、玉米，特別優(yōu)選為 水稻；優(yōu)選，通過根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法來將所述基因和/或所述載體轉(zhuǎn)化入植物愈傷組織； 優(yōu)選，所述基因可操作地連接至在植物中有效的表達調(diào)控元件，所述表達調(diào)控元件例 如啟動子和/或終止子，優(yōu)選玉米泛素啟動子和/或NOS終止子；優(yōu)選，所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物與未進行轉(zhuǎn)基因的植物相比，展示更優(yōu)良的植物根系生長。
7.通過權(quán)利要求6的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物，所述植物優(yōu)選是單子葉植物，更優(yōu)選為 水稻、谷子、小麥、高粱、玉米，特別優(yōu)選為水稻。
8.導入了基因BGIos244或權(quán)利要求1的載體或被權(quán)利要求2的宿主細胞感染的植物 愈傷組織，其中，所述植物優(yōu)選是單子葉植物，更優(yōu)選是水稻、谷子、小麥、高粱、玉米，特別 優(yōu)選是水稻。
9.權(quán)利要求8的植物愈傷組織用于制備轉(zhuǎn)基因植物或用于植物育種的用途。
10.一種轉(zhuǎn)基因植物，其被導入了基因BGIos244和/或權(quán)利要求1的載體和/或權(quán)利 要求2的宿主細胞，其中所述植物優(yōu)選是單子葉植物，更優(yōu)選為水稻、谷子、小麥、高粱、玉米，特別優(yōu)選為水稻；優(yōu)選，所述基因可操作地連接至在植物中有效的表達調(diào)控元件，所述表達調(diào)控元件例 如啟動子和/或終止子，優(yōu)選玉米泛素啟動子和/或NOS終止子；優(yōu)選，所述轉(zhuǎn)基因植物與未導入基因BGIos244或權(quán)利要求1的載體或權(quán)利要求2的宿主細胞的植物相比，展示更優(yōu)良的植物根系生長。
全文摘要
本發(fā)明提供了促進植物根的生長的方法。特別地，本發(fā)明提供了利用BGIos244基因促進植物根的生長的方法。本發(fā)明還提供了BGIos244基因用于促進植物根的生長的用途。本發(fā)明還提供了具有導入的BGIos244基因的轉(zhuǎn)基因植物，以及產(chǎn)生此類轉(zhuǎn)基因植物的方法。
文檔編號C12N5/10GK101979599SQ201010538180
公開日2011年2月23日 申請日期2010年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月10日
發(fā)明者倪雪梅, 孫紅正, 張耕耘, 李寧 申請人:深圳華大基因科技有限公司