專利名稱：：一種提高植物抗性促進植物生長的蛋白質(zhì)及其編碼基因的制作方法一種提高植物抗性促進植物生長的蛋白質(zhì)及其編碼基因
技術領域：
-本發(fā)明屬于生物
技術領域：
，涉及一種促進植物生長和提高植物抗病性的來自鏈格孢菌"/fem";^菌的蛋白。本發(fā)明還涉及編碼此蛋白的核苷酸序列，以及包含此核苷酸序列構(gòu)建的表達載體和轉(zhuǎn)化子。技術背景-鏈格孢菌(J/^77"ha具有寄生和腐生性，是一類重要的植物病原真菌，引起多種植物病害，對于鏈格孢菌產(chǎn)生引起的植物病害，已有人做過許多研究。中國專利ZLOl128666.0(邱德文"植物用多功能真菌蛋白制品及其制備方法")中公開了從多種植物病原真菌中提取的具有促進植物生長和提高植物抗病性作用的一類蛋白。在中國申請專利號CN200510011580.5(邱德文等"促進植物生長和提高植物抗病性的蛋白質(zhì)及其人工合成基因")中公開了從稻瘟菌中分離純化的蛋白及其相關信息。但至今未明確從鏈格孢菌"/^72flWfl中分離純化的蛋白具有促進植物生長和提高植物抗病性的功能及其相關信息。在GenBank中未發(fā)現(xiàn)具有促進植物生長和提高植物抗病性功能的鏈格孢菌蛋白及核苷酸序列的信息。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是尋找具有促進植物生長和提高植物抗病性的功能蛋白；本發(fā)明的另一目的是依據(jù)此蛋白的氨基酸序列，通過RT-PCR的方法獲得編碼此蛋白的基因，用其構(gòu)建表達載體和轉(zhuǎn)化子，以制備用于促進植物生長和提高植物抗病性的蛋白。本發(fā)明從細極鏈格孢菌"/to""aWa^"w'm^")中分離純化出了一種蛋白質(zhì)，編碼此蛋白的基因為624bp，由207個氨基酸組成，分子量為22590Da。通過Genbank基因庫比對，獲知此種蛋白與是在鏈格孢菌Utem。Wa)中未發(fā)現(xiàn)的一種蛋白。此蛋白氨基酸組成與i^aeoJ7/wm'a"ot/w,SN15的初生多肽復合酶(nascentpolypeptide-associatedcomplex(NAC)GenBankaccessionnumberCH445335)蛋白的氨基酸組成相似性為91.98%。由于此種蛋白來源于鏈格孢菌，具有促進植物生長和提高植物抗病性的作用，將此蛋白命名為PEAtl。為證實上述分離的PEAtl蛋白的功能，本發(fā)明人對其對植物根系生長的促進作用和對煙草花葉病毒病的抑制作用進行了實驗研究。證實本發(fā)明分離的PEAtl蛋白具有促進植物生長和提高植物抗病性的功能。此蛋白可用于制備促進植物生長和提高植物抗病性的制品。以編碼此蛋白的基因與載體質(zhì)粒連接獲得的重組質(zhì)粒導入宿主微生物細胞，可得到含此重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子；通過培養(yǎng)此轉(zhuǎn)化子，誘導培養(yǎng)獲得的表達蛋白具有促進植物生長和提高植物抗病性作用，可用于制備促進植物生長和提高植物抗病性的制品。所述轉(zhuǎn)化子，宿主微生物細胞均可選自大腸桿菌和畢赤酵母菌。具體實施方式-實施例1PEAtl蛋白的分離與純化用PDA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)鏈格孢菌，在28'C下，180r.mirT1，恒溫振蕩培養(yǎng)2d，抽濾獲得的菌絲體，取菌絲塊于研缽中用液氮研磨成細粉，迅速加入磷酸提取緩沖液，于沸水浴煮沸20min后，置冰水混合物中降溫，在4'C條件下12000rmin"離心15min，上清液用微孔過濾器(O=0.22ym)過濾，獲得提取液。在蛋白提取液中直接加硫酸銨至終濃度為85%,繼續(xù)用磁力攪拌器攪拌30min后5000rpm離心30min取沉淀，將沉淀重新用提取緩沖液溶解，按照樣品與乙醇體積之比為4:1加入-20。C預冷無水乙醇，-2(TC沉淀30min，4'C5000rpm離心lOmin，取沉淀，冰浴干燥至無酒精氣味，用陰離子交換初始緩沖液溶解后，4'C13000r/min離心30rain，獲得蛋白粗提液。采用陰離子交換低鹽緩沖液透析過夜，獲得粗蛋白溶液。然后通過離子交換層析和分子篩凝膠層析獲得純化蛋白。實施例2PEAtl蛋白對植物根系生長的促進作用將小麥種子分別浸種在純化蛋白稀釋至3叫mr1、2叫mr1、l叫ml"的水溶液中，以蒸餾水浸種作為陰性對照。浸種8小時后將種子平鋪在培養(yǎng)皿中于28'C光照培養(yǎng)箱光照培養(yǎng)，并加適量蒸餾水以保持濕度。培養(yǎng)7天后隨機測量各處理小麥的主根長度，每個處理測量30個平行并取平均值。從表1看出，在蛋白濃度為lpg/ml時對小麥根系生長仍有促進作用。根長在在激活蛋白濃度為3ng.ml—1、2嗎.mr1、l嗎.mr1時，小麥根長比對照組分別提高了12.29%、11.7%、8.06%。表1不同濃度蛋白溶液對小麥根長的變化對照3嗎.mr'i嗎.mr110.17士0.85A11.42士0.325BU.36士0.552B10.99士0.4327AB實施例3PEAtl蛋白對煙草花葉病毒的抑制作用珊西煙在防蟲溫室中培養(yǎng)(2027'C)，植株長至8葉期時，采用半葉法，用PEAtl蛋白2嗎.ml—1浸葉片10min，以清水作對照，每處理6片葉，每處理重復3次。處理后的葉片置于直徑為15cm的培養(yǎng)皿中，于25'C下保濕2天后接種病毒。采用常規(guī)汁液摩擦接種法接種，取毒源煙草病葉加0.01mol/L磷酸緩沖液(pH7.2)研磨(病毒汁液濃度為每克病葉加50mL0.01moL/L磷酸緩沖液)。處理后的葉片采用半葉法等量接種TMV病毒，3天后記錄枯斑數(shù)并按下式計算枯斑抑制率。PEAtl蛋白對TMV在離體葉片上的枯斑數(shù)有較高的抑制作用，PEAtl蛋白與清水處理間的單葉枯斑數(shù)具有顯著差異，枯斑抑制率達45~58%。用PEAtl蛋白和水分別處理珊西煙葉片的左右兩片葉，等量接種病毒后3天后測量枯斑大小，然后將葉片置于37。C下24h后轉(zhuǎn)于25。C下溫育3天，再次測量枯斑大小，記錄兩次枯斑大小的差異，計算枯斑面積增加率。從測量結(jié)果顯示，PEAtl蛋白不僅能抑制枯斑大小，同時對TMV在葉片上的擴展有一定影響，清水處理枯斑直徑增加2.33mm，而PEAtl蛋白處理的枯斑直徑增加1.51mm,枯斑擴展抑制率為54.3%,說明PEAtl蛋白能抑制枯斑的進一步擴大，有效控制煙草病毒病病情的進一步發(fā)展。實施例4PEAtl蛋白的氨基酸序列分析純化的PEAtl蛋白經(jīng)SDS—PAGE檢測，切取單帶經(jīng)胰蛋白酶酶解后，用基質(zhì)輔助激光電離一飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)測定蛋白質(zhì)的肽指紋圖譜。用胰蛋白酶、凝乳蛋白酶、V8酶分別酶解后做液質(zhì)連用(nanolc-ESI-IT-ms/ms)獲得PEAtl蛋白部分肽段氨基酸序列(表2)。表2PEAtl蛋白部分肽段氨基酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>實施例5編碼PEAtl蛋白的基因克隆利用Trizol試劑(Invitrogen)從新鮮培養(yǎng)的鏈格孢菌中提取總RNA，用M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶獲得含有oligo(dT)尾巴的cDNA第一鏈，首先利用質(zhì)譜測序獲得的氨基酸序列設計正向引物5'-CCYAAGAACATYCTCTTYGTC-3，和反向引物5，陽GTTGACg/tATATCRTTATCGTT-3，，利用RT-PCR的方法獲得一段長度為373bp的居中序列；利用獲得的序列重新設計引物進行3'RACE,利用反向引物5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC(T)16^3'合成cDNA第一鏈，然后利用GSP15，-AGGGCAAGGGCAAGGCTGTCG-3，和Al做單側(cè)PCR，最后以單側(cè)PCR的產(chǎn)物為模板，用GSP2:5'-GGACGAGGAGGAGGAGGATGACG-3'和A25'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3'進行巢式PCR;利用獲得的居中序列重新設計引物進行5'RACE。利用RT-primer5'-CCTCGGCCTGAGCAAGCTGCTG-3'合成cDNA第一鏈，5，完整序列采用InvitrogenGeneRacerkit的方法獲得；將上述循環(huán)獲得的核苷酸片段進行拼接后獲得一個大小為624bp的完整閱讀框的核苷酸序列，將其命名為peaf/基因(SEQIDNOl)，其推測的氨基酸序列(SEQIDN01)中包含實施例4中獲得的4個肽段，確認獲得的/^"/7基因正確。通過Genbank基因庫比對，獲知此種蛋白與是在鏈格孢菌"temaha)中未發(fā)現(xiàn)的一種蛋白。此蛋白氮基酸組成與尸/weoy/7;weria"o^n^SN15的初生多肽復合酶(nascentpolypeptide-associatedcomplex(NAC)Gen已ankaccessionnumberCH445335)蛋白的相似性為91.98%。實施例6編碼PEAtl蛋白的pea"基因大腸桿菌表達系統(tǒng)的構(gòu)建及表達設計引物包含完整閱讀框并引入酶切位點和酶切保護堿基，正向引物5'-CCGGAATTCATGGCCAACCCCCGCATTGAA-3'(下劃線為EcoRI的酶切位點)反向引物5'-CCGCTCGAGCTATATGCTCAGCGCCATGAT-3，(下劃線為XhoI的酶切位點)，以鏈格孢菌cDNA為模板，以上述引物進行RT-PCR擴增，擴增獲得的片段膠回收后連接到PMD18-T克隆載體上進行測序，測序驗證是否獲得獲得完整的基因序列且正確引入酶切位點，將此質(zhì)粒命名為PMD18-T-peatl。將PMD18-T-peatl質(zhì)粒和表達載體PET-28-a分別進行EcoRI和XhoI的雙酶切，酶切后的片段進行膠回收并在16。C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化BL21(DE3)表達菌株中，在含有Kana的固體培養(yǎng)基上篩選陽性克隆并提取質(zhì)粒進行酶切鑒定，同時進行測序確定讀碼框正確，將獲得的連接有正確網(wǎng)af/基因的陽性克隆在含有Kana的液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；待表達菌株生長到對數(shù)期后用化學誘導劑IPTG進行誘導，誘導濃度為lmraol/ml,誘導表達12小時后離心收集菌體，將菌體用純化緩沖液BindingBuffer懸浮后采用超聲破碎的方法提取總蛋白，進行SDS-PAGE電泳檢測表達蛋白。利用GE公司的ChealtingColumn柱在AKTAExplorer蛋白純化儀上進行純化獲得純化重組蛋白的純化樣品。重組表達蛋白的純化方法按照ChealtingColumn說明書進行操作。實施例7編碼PEAtl蛋白的peaW基因畢赤酵母表達系統(tǒng)的構(gòu)建及蛋白表達用EcoRI和XhoI分別雙酶切PMD18-T-peatl和pPIC-9K載體，用T4連接酶將人工合成基因重組連接在pPIC-9K構(gòu)建重組載體pPIC-9K—peatl,熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a細胞，篩選陽性克隆，PCR法鑒定陽性克隆，將經(jīng)鑒定含正確插入片段的重組載體pPIC-9K—peatl線性化，電擊法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115細胞，涂布于組氨酸缺陷培養(yǎng)基(RDB)，挑取轉(zhuǎn)化子分別點接MM和MD培養(yǎng)基，篩選甲醇敏感型重組轉(zhuǎn)化子，將陽性轉(zhuǎn)化子接種于5mlBMG培養(yǎng)基中，3(TC220rmin"培養(yǎng)48h，離心收集菌體，加入10mlBMM培養(yǎng)基重懸菌體，30°C220rmin"繼續(xù)培養(yǎng)，每24h補加甲醇lX，誘導表達3—4d，離心收集上清用ELISA方法鑒定表達蛋白，并作SDS-PAGE檢測。實施例8重組激活蛋白對小麥種子幼根生長的促進作用將小麥種子浸種在純化重組表達蛋白2嗎.ml—1的水溶液中，以蒸餾水浸種作為陰性對照。浸種8小時后將種子平鋪在培養(yǎng)皿中于28r光照培養(yǎng)箱光照培養(yǎng)，并加適量蒸餾水以保持濕度。培養(yǎng)7天后隨機測量各處理小麥的主根長度，每個處理測量30個平行并取平均值。結(jié)果表明純化重組表達蛋白對小麥根系生長具有有促進作用。根長在在激活蛋白濃度為2嗎.ml"時，小麥根長比對照組提高了10~15%。實施例9重組激活蛋白對番茄灰霉病的控制作用番茄灰霉病菌(^otr/t^"'/7erea)在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)79d，收集孢子制成孢子懸浮液。用2嗎nnl"重組表達蛋白提取液噴霧處理番茄幼苗，以清水作對照，每處理30株苗。處理5d后，將番茄灰霉病菌孢子懸浮液(IO、mr')用噴霧法挑戰(zhàn)接種，48h保濕,一周后進行病級調(diào)査，計算防治效果。結(jié)果顯示，PEAtl蛋白處理番茄能增強其對灰霉病的抗性，防治效果達到65%-70%。序列表〈110>中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所<120〉一種提高植物抗性促進植物生長的蛋白質(zhì)及其編碼基因<130〉05-01〈160〉1〈170>Patentlnversion3.1<210〉1<211〉624〈212>DNA<213〉細極鏈格孢菌(Alternariatenuissima)<400〉1ATGGCCAACCCCCGCATTGAAGAGCTCCCCGACGAGCCCGAGAAGAAGAACGTCCAGATC60GAGGAGGATGAGTCCAGCGACGAGTCTGAGGGCGAGGAGGGCGAGGTCAGCGTACCCGCG120GGCTCCTCCGTCGCTGTCCACTCCCGCAACGAGAAGAAGGCTCGCAAGGCCATCGCCAAG180CTCGGCCTGAAGCACATCGACGGCATCACACGCGTCACCCTCCGCCGACCCAAGAACATC240CTCTTTGTCATCAACCAGCCCGACGTCTACAAGTCCCCTTCAAGCAACACCTGGATCATC300TTCGGTGAGGCCAAGATCGAGGACCTCAACTCCCAGGCTCAGGCTTCCGCCGCCCAGCAG360CTTGCTCAGGCCGAGGCCGCATCCCACGACCACGCCGGCCACGACCACGGCGACGAGGCC420AGCAAGGGCAAGGGCAAGGCTGTCGAGGACAAGAAGGACGAGGAGGAGGAGGATGACGAT480GAGGAGATTGACGACTCTGGCCTTGAGGCCAAGGACATCGAGCTCGTCATGCAGCAGGCC540AGCGTTTCGCGGAAGAAGGCCGTCAAGGCCCTCAAGGAGAACGATAACGATATAGTCAAC600TCCATCATGGCGCTGAGCATATAG624MetAlaAsnProArglieGluGluLeu15AsnValGinlieGluGluAspGluGluGlyHis65LeuThrAlaHisGly145GluMetGluAsn50liePheTrpGinAsp130lysGlu35GluAspVallielie20ValLysGlylielie100SerSerLyslieAsn85PheAlalieValGlulieAspGinAsnGinAsp195Ala180AsnAlaGlyGluAsp165SerAspValAlaThr70GinGlyAlaAla115HisAlaGlyHisAsp150SerVallieGluAspProArg55ArgProGluGinAsp135LysGlySerValAla40LysValAspAlaGin120HisLysLeuArgAsn200Ser25GlyAlaThrValLys105LeuGlyAspGluLys185SerPro10SerSerlieLeuTyr90lieAlaAspGluAla170LyslieAspGluProGluAspGluSerSerVslAlaLys15GlyLysGluArg75LysGluAspLeuGinGluGlu155LysAlaMetLys60i\rgSerAspAlaAla140GluAspValAlaAla45LeuProProGlu125SerGlulieLysLeu205Glu30ValHisSerGlyLysSerAsn110AlaLysAspGluAla190SerLeuAsnSer95SerAlaGlyAspLeu175LeulieLyslie80AsnGinSerLysAsp160Val權利要求1、一種提高植物抗病性和促進植物生長的蛋白質(zhì)，其序列如SEQIDNO1所示，此蛋白質(zhì)來源于鏈格孢菌(Alternaria)。2、根據(jù)權利要求1所述的提高植物抗病性和促進植物生長的蛋白質(zhì)用于制備促進植物生長和提高植物抗性的粗制品或精制品。3、根據(jù)權利要求2所述的提高植物抗病性和促進植物生長的蛋白質(zhì)，所述制品用于提高植物抗性和促進植物生長的用途。4、根據(jù)權利要求l中的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，從鏈格孢菌中獲得編碼此蛋白質(zhì)的核苷酸序列，其序列如SEQIDNOl所示。5、一種重組質(zhì)粒，含有權利要求4所述的核苷酸序列。6、一種轉(zhuǎn)化子，含有導入權利要求5所述的重組質(zhì)粒的宿主微生物細胞。7、權利要求6中的轉(zhuǎn)化子，宿主微生物細胞可選自大腸桿菌和畢赤酵母菌。8、用權利要求6所述的轉(zhuǎn)化子制備的重組蛋白制品，包括粗制品或精制品。9、根據(jù)權利要求8中的重組蛋白制品用于提高植物抗病性和促進植物生長的用途。全文摘要本發(fā)明涉及一種提高植物抗病性和促進植物生長的蛋白質(zhì)及其編碼基因。本發(fā)明從鏈格孢菌(Alternaria)中分離出一種蛋白質(zhì)PEAt1，具有提高植物抗病性和促進植物生長的功能。本發(fā)明還涉及此蛋白及其多核苷酸的制備方法和用途，以及包含此多核苷酸基因構(gòu)建的表達載體和轉(zhuǎn)化子。文檔編號C07K14/37GK101153057SQ200610152700公開日2008年4月2日申請日期2006年9月27日優(yōu)先權日2006年9月27日發(fā)明者崢劉,寧張,李承雷,楊秀芬,董健伸,袁京京,趙明治,邱德文,龍承祖申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所