本發(fā)明涉及一種用于控制酶預(yù)處理過程，例如糖化過程的方法和系統(tǒng)。這允許確定在酶預(yù)處理過程，例如糖化過程中實(shí)時(shí)精確地存在于溶液中的糖分子和糖鏈的平均長度。而且，例如溶解的碳水化合物(如蛋白質(zhì)和游離氨基酸)的信息也可作為關(guān)于糖鏈的平均長度的信息同時(shí)獲得。

背景技術(shù)：

當(dāng)進(jìn)行例如釀造時(shí)，在廣泛的谷物和其他含有淀粉和二-和多糖類的作物中天然存在的碳水化合物的微生物發(fā)酵之前，天然存在的碳水化合物通常需要酶預(yù)處理。該酶預(yù)處理稱為糖化?？赡苄枰M(jìn)行這種糖化程序的谷物和作物的實(shí)例是大麥、小麥、黑麥、燕麥、水稻、玉米、木材或馬鈴薯。

在某些情況下，谷物在糖化前被制成麥芽。在制麥芽過程中，天然酶在作物中生長。在其他情況下，酶在糖化開始之前被加入到谷物或農(nóng)作物中。在糖化過程中，水被加入到農(nóng)作物中并且溫度被升高且保持加入或天然存在的酶最活躍的一定溫度下。糖化通常包括幾個(gè)溫度步驟以刺激不同的酶。

糖化過程期間，由于天然存在的淀粉的酶轉(zhuǎn)化，形成不同類型的單、二和多糖化合物。較小的糖單元(諸如例如麥芽糖)在發(fā)酵過程中轉(zhuǎn)化為乙醇，而略微較長的鏈(諸如例如麥芽糖糊精)在整個(gè)發(fā)酵中保持并有助于最終釀造物中優(yōu)選的甜味。

糖化過程完成后，短鏈糖和長鏈糖的比例必須在非常窄的間隔內(nèi)以獲得想要的那種釀造?！斑^糖化”，其中所有淀粉完全轉(zhuǎn)化為麥芽糖，將產(chǎn)生具有高醇含量，但具有平淡的和不令人愉快的或苦的味道的釀造物。另一方面“糖化不足”，其中僅淀粉的小部分轉(zhuǎn)化為麥芽糖，將導(dǎo)致具有低醇含量的非常甜的釀造物。對于大多數(shù)類型的釀造物，使麥芽漿處于這兩個(gè)極端之間某處的糖化過程是優(yōu)選的。然而，糖化過程的控制是非常具有挑戰(zhàn)性的，并沒有很好的在線方法可用來測量短鏈和長鏈糖化合物之間的比例。

其他重要的酶過程包括在作物的蛋白質(zhì)中肽鍵的水解。水解蛋白的含量也影響最終釀造物的特性，并因此是在糖化過程中要控制的一個(gè)重要因素?？刂频鞍椎乃舛纫彩蔷哂刑魬?zhàn)性的。

整個(gè)釀造過程從科學(xué)的角度非常好地被理解-尤其詳細(xì)對發(fā)酵過程進(jìn)行了研究，并經(jīng)常作為復(fù)雜的和高度工程化的生化過程操作。

相比之下，糖化是為數(shù)不多的留在釀造業(yè)的“黑盒子”之一，且糖化仍然基本上通過使用“秘方”和試錯(cuò)的方法進(jìn)行。然而這在很多方面是有問題的。一個(gè)關(guān)注是，由于每批麥芽關(guān)于糖和蛋白質(zhì)底物以及活性淀粉酶和蛋白酶酶兩者均可具有不同組分，因此最優(yōu)的糖化程序從不完全相同。

缺乏對糖化過程的了解和控制的原因是由于沒有可用的提供糖化的在線監(jiān)測分析技術(shù)。HPLC(高效液相色譜法)或GPC(凝膠滲透色譜法)可用于分析在麥芽漿中的糖化合物，但運(yùn)行僅一個(gè)樣品的時(shí)間比糖化本身每個(gè)溫度步驟的時(shí)間尺度更長，因此其對于在線監(jiān)測是無用的。

因此，需要新的分析技術(shù)來優(yōu)化并允許更好地理解這一重要的生化過程類型。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

在本發(fā)明的第一個(gè)方面本文公開了一種用于控制酶預(yù)處理過程，例如糖化過程的方法。該方法包括以下動(dòng)作：

a)向具有罐的系統(tǒng)提供樣品；

b)通過如下獲得樣品混合物：

-如果樣品不含一種或多種酶，則將一種或多種酶加入到樣品中，或

-可能向已經(jīng)含有一種或多種酶的樣品中加入一種或多種酶；

c)連續(xù)地將一部分樣品混合物暴露于紅外(IR)光譜儀；

d)在酶預(yù)處理過程期間，使用紅外光譜儀在400-3500cm^-1之間的波長實(shí)時(shí)連續(xù)測量樣品混合物的衰減全反射(ATR)紅外光譜，以及

e)將測得的紅外光譜反饋至計(jì)算單元，其中：

-根據(jù)紅外光譜，計(jì)算在酶預(yù)處理過程期間與樣本混合物中存在的特定物質(zhì)

相關(guān)的信息，其中與樣本混合物中存在的特定物質(zhì)相關(guān)的信息為：

·不同特定物質(zhì)之間的比例，和/或

·一種或多種特定物質(zhì)的濃度，和/或

·一種或多種特定物質(zhì)的聚合度；和

-將與樣本混合物中存在的特定物質(zhì)相關(guān)的信息反饋至用戶和/或連接到罐

的罐控制系統(tǒng)。

在本發(fā)明的第二個(gè)方面本文公開了一種用于控制酶預(yù)處理過程，例如糖化過程的系統(tǒng)。該系統(tǒng)包括適于含有樣品混合物的罐，該樣品混合物包含待酶預(yù)處理的樣品和可能在酶預(yù)處理過程期間加入到樣品中的一種或多種酶。

該系統(tǒng)還包括連接到紅外光譜儀的分析單元，該分析單元適于使得樣品混合物與紅外光譜儀直接接觸，用于在酶預(yù)處理過程期間測量樣品混合物的衰減全反射(ATR)紅外光譜。

該系統(tǒng)還包括與紅外光譜儀連接的計(jì)算單元，該計(jì)算單元適于：

·基于樣品的紅外光譜，計(jì)算樣品混合物中特定物質(zhì)之間的比例，和/或

·基于樣品的紅外光譜，計(jì)算一種或多種特定物質(zhì)的濃度，和/或

·基于樣品的紅外光譜，計(jì)算一種或多種特定物質(zhì)的聚合度。

通過本發(fā)明的第一和第二方面從而得到了一種能夠在例如糖化過程期間精確地實(shí)時(shí)確定存在于溶液中的特定糖分子和糖鏈的平均長度的方法和系統(tǒng)。還能夠同時(shí)獲得例如溶解的蛋白質(zhì)和游離氨基酸的濃度的更多信息。

在制備例如用作燃料，溶劑或添加劑的商品級乙醇過程中，在作物發(fā)酵之前的預(yù)處理是與如上所述的用于生產(chǎn)用于人類消費(fèi)的飲料或蒸餾酒的糖化過程幾乎相同的過程。

用于制備乙醇的發(fā)酵過程的原料可包括與如上所述的用于糖化過程的相同的含淀粉作物，但也可包括非食用的作物或農(nóng)業(yè)廢棄物。一些非限制性的實(shí)例可以是柳樹、木材、甘蔗渣或玉米秸稈。在這些類型的農(nóng)作物，纖維素是糖化合物的重要部分。纖維素是具有與淀粉幾乎相同的化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，其中1,4-糖苷鍵(其將葡萄糖結(jié)合在一起)的構(gòu)象取向稍有不同，產(chǎn)生幾乎相等的化學(xué)和光譜性質(zhì)的溶解的纖維素，纖維素低聚物和類似的二聚物纖維二糖。因此，術(shù)語“糖化”也應(yīng)理解為包括對在生產(chǎn)商品級乙醇中用于發(fā)酵的含淀粉或木質(zhì)纖維素原料的類似的酶預(yù)處理。

附圖說明

圖1、2、3a-b和6a示出了集成有紅外光譜儀和計(jì)算機(jī)的糖化單元的的實(shí)施方案。

圖4和5示出了從外部(圖4)和內(nèi)部(圖5)觀察的的紅外光譜儀。

圖6b-d示出了糖化單元的實(shí)施方案。

圖7a-d示出了提取和/或回收探針的實(shí)施方案。

圖8a-b示出了分光單元，其中，圖8b是分解圖。

圖9a-c示出了分光光度計(jì)和ATR(衰減全反射)單元的特寫。

圖10a-b示出了分光光度計(jì)和ATR單元的特寫以及圖10c示出了僅與晶體組合的分光光度計(jì)的特寫。

圖11a-b示出了第一實(shí)施方案，其中圖8a-b的分光單元與罐相連，圖11c-d示出了第二實(shí)施方案，其中圖8a-b的分光單元與罐相連。

圖12示出了葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖和麥芽糊精的紅外光譜。

圖13顯示了糖苷鍵以及在與葡萄糖的二-和聚合物相關(guān)的淀粉中的縮醛基的特征振動(dòng)，以及在單體葡萄糖類似物中相關(guān)的模式。

圖14示出了對于葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖和麥芽糊精的紅外光譜，作為每個(gè)葡萄糖單元的糖苷鍵的函數(shù)，1026cm^-1處帶的積分吸光度。

圖15示出了在淀粉糖化過程中測量的紅外光譜。

圖16示出了在發(fā)芽大麥的糖化過程中1260-950cm^-1積分的紅外吸收和白利糖度％的關(guān)系。

圖17示出了糖化過程中經(jīng)過和不經(jīng)過濾的相同樣品等分的紅外光譜。

圖18示出了在圖17中觀察到的這種現(xiàn)象背后的機(jī)理。

圖19示出了肽鍵的水解。

圖20示出了阿米露(amylo)-淀粉的水解。

圖21a示出了在室溫下純異頭α-glycosyranose形成外消旋混合物的轉(zhuǎn)化。

圖21b中示出了純的溶解的D-吡喃葡萄糖與α-和β-形式D-吡喃葡萄糖平衡時(shí)的外消旋混合物的比較。

圖22示出了α-吡喃糖原位轉(zhuǎn)化后的IR光譜。

圖23示出了四個(gè)不同的碳水化合物的光譜和各光譜的去卷積。

圖24示出了圖23的幾個(gè)去卷積的帶面積針對獲得自DE值的RDP值的曲線，DE值來自可見光譜Cu(II)-Cu(I)-2,2-b喹啉羧酸酯。

圖25示出了不同的含α-(1,4)糖苷鍵的化合物的光譜。

圖26示出了校準(zhǔn)組的紅外光譜。

圖27-28示出了圖26中光譜的去卷積的帶面積和在不同波長下相對聚合度之間的相關(guān)性。

圖29示出了葡萄糖和麥芽糊精的紅外光譜。

圖30-33示出了圖29中光譜的去卷積的帶面積和在不同波長下相對聚合度之間的相關(guān)性。

圖34示出了不同樣品的ATR-IR光譜。

圖35示出了在糖化過程期間實(shí)時(shí)測量的紅外光譜的分析。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明使用中紅外(MIR)光譜儀。這些儀器在中紅外區(qū)(其通常定義為400直至4000cm^-1)操作。中紅外的吸收使得照射的樣品的分子鍵通過彎曲或拉伸變形振動(dòng)。各振動(dòng)類型對應(yīng)于一個(gè)特定波長的紅外光的吸收。所有這些振動(dòng)和中紅外光子在各波長的相應(yīng)吸收的總和產(chǎn)生中紅外光譜。

各光子吸收的位置和強(qiáng)度以及相應(yīng)的振動(dòng)服從量子力學(xué)的規(guī)則，并因此可使用不同的近似值和模型可以預(yù)測和推理。由于中紅外光譜背后的這些機(jī)理，在實(shí)踐中沒有振動(dòng)超過4000cm^-1。此外，對于本發(fā)明的目的，感興趣的光譜部分遠(yuǎn)低于3600cm^-1。

本發(fā)明所用的真正的紅外光譜儀經(jīng)常與近紅外光譜儀混淆，它盡管名稱類似卻有很大的不同。近紅外NIR光譜儀在MIR波數(shù)之上，通常高達(dá)約10000cm^-1，或者在某些光譜儀一路攀升到可見光或紫外線波長操作。在近紅外光譜中沒有發(fā)現(xiàn)主要的“真實(shí)”振動(dòng)，只有實(shí)際振動(dòng)的泛音和組合帶。泛音通常被加密并且更難以分析地使用，并且與MIR相比，大多數(shù)情況下對于光譜儀本身應(yīng)用非常不同的技術(shù)。

在本發(fā)明的以下描述中，術(shù)語紅外(IR)將專指中紅外光譜，并且不應(yīng)與近紅外光譜混淆。對于本發(fā)明來說非常重要的是，其僅適用于MIR而不適用于NIR，即兩種類型的紅外光譜不被混淆。

在先前的工作中，對于MIR以及NIR的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，使用紅外光譜分析與釀造相關(guān)的樣品的可能性已經(jīng)被評估(J.Tehnhunen等人，J.Inst Brew.vol100(1994)第11-15頁)。本文測量葡萄糖、麥芽糖和麥芽三糖的樣品，發(fā)現(xiàn)特別是ATR-FTIR不適合用于實(shí)際的糖化/釀造分析。因此，本文關(guān)注NIR和透射FTIR。該工作的結(jié)果清楚地表明，NIR在區(qū)分它們樣品中的組分方面不是有用的，并且誤差顯著幅度的大于作者試圖在樣品中鑒定的因子。透射MIR在過程中在技術(shù)上不相關(guān)，因?yàn)樵谕干涑刂性试S在指紋區(qū)域中透射的高毒性窗口材料將溶解在樣品液體中。此外，所使用的池具有如此窄的路徑長度，使得在技術(shù)上不可能在真正的釀造過程中使用。

在US4913914中，提出了一種用于監(jiān)測“maromi糖化”的方法(用于例如醬油生產(chǎn))?！癕aromi糖化”是使用曲霉和乳酸菌持續(xù)數(shù)月至大約一年的大豆和大米的長發(fā)酵過程。盡管語言相似，“maromi糖化”的發(fā)酵過程與本發(fā)明中描述的糖化過程非常不同；作為相對快速的酶預(yù)處理。該專利描述了使用近紅外光譜儀和自動(dòng)采樣器系統(tǒng)來監(jiān)測麥芽發(fā)酵過程；不是真正的在線分析儀。定義的NIR光譜儀工作在完全不同的波長，其中沒有發(fā)現(xiàn)本發(fā)明中描述的任何分子振動(dòng)。如背景技術(shù)中關(guān)于MIR和NIR的描述，必須理解MIR和NIR光譜之間的差異。沒有提及在本發(fā)明中必需的單-，二-和多糖的區(qū)分。

DE4002108(A1)公開了淀粉分析中公知的破壞性方法的自動(dòng)化，其中淀粉螺旋結(jié)構(gòu)可以通過加入碘來識別。然后可以使用NIR-VIS光譜儀定量淀粉酶螺旋和碘之間的紫色復(fù)合物。該過程消耗碘，并且樣品不能返回到糖化單元。它基本上描述了一種熟知分析的自動(dòng)化，在與本發(fā)明不同的波長間隔中應(yīng)用VIS-NIR光譜。

WO2009/074650公開了一種方法，其中未發(fā)芽的谷物與加入的酶(主要是淀粉酶)組合用作釀造中發(fā)芽大麥和發(fā)芽谷物的替代物。本發(fā)明描述了釀造領(lǐng)域的任何技術(shù)人員公知的糖化或釀造的機(jī)理，但是沒有以任何方面描述如何使用紅外光譜來監(jiān)測該過程。

EP0851027A1公開了使用ATR-FTIR光譜學(xué)來控制發(fā)酵過程中乳酸菌的方法。該發(fā)明描述了如何通過監(jiān)測乳酸的兩種形式(質(zhì)子化和去質(zhì)子化)以及如何使用ATR來定量乳酸菌來控制乳酸菌，使得該方法可用于不同的pH值。該方法還描述了如何通過來自葡萄糖的“醇信號”的強(qiáng)度來控制乳酸菌。然而，沒有提及單糖和多糖的區(qū)分。僅使用ATR-FTIR對葡萄糖進(jìn)行定量是直接的，本身并不令人驚訝。該方法沒有描述用于在線分析的裝置或使用ATR-FTIR來控制酶預(yù)處理。

本發(fā)明包括一種方法，其中實(shí)時(shí)應(yīng)用衰減全反射(ATR)紅外(IR)光譜以監(jiān)測酶預(yù)處理過程，例如，糖化過程。ATR-IR光譜分析是指測量在400-3500cm^-1之間的IR光譜的光譜分析。與IR光譜的測量同時(shí)地，計(jì)算機(jī)計(jì)算溶液(即麥芽漿)中組分的精確組成，并將生物化學(xué)關(guān)鍵值返回給操作者或控制系統(tǒng)，這總體上允許更好的控制和優(yōu)化糖化程序。這些重要的關(guān)鍵值的實(shí)例是單糖，二糖和聚合糖化合物之間的比例，溶解的糖的總濃度，以及蛋白質(zhì)或重要調(diào)味化合物的濃度。還可以監(jiān)測其他參數(shù)。

在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括以下步驟：當(dāng)獲得樣品混合物中特定物質(zhì)之間的預(yù)定比例，和/或一種或多種特定物質(zhì)的濃度達(dá)到預(yù)定水平，和/或一種或多種特定物質(zhì)的聚合度達(dá)到預(yù)定水平時(shí)，停止酶預(yù)處理過程。酶預(yù)處理過程可以由用戶手動(dòng)停止或由系統(tǒng)基于從計(jì)算單元提供的信息自動(dòng)停止。

在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，在至少部分酶預(yù)處理過程中攪拌樣品混合物。

在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，在酶預(yù)處理過程中將水加入到樣品混合物中，例如，與可能加入的一種或多種酶一起。

在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，樣品和/或樣品混合物中的溫度在酶預(yù)處理過程開始之前，在酶預(yù)處理過程期間，和/或出于停止酶預(yù)處理過程的目的而增加和/或降低。

在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，酶預(yù)處理過程被系統(tǒng)自動(dòng)打開罐，或者替代地通過從罐中取出樣品混合物而停止。此外，可以增加罐中的溫度來停止酶預(yù)處理。當(dāng)獲得樣品混合物中的特定物質(zhì)之間的預(yù)定比例時(shí)，和/或當(dāng)一種或多種特定物質(zhì)的濃度達(dá)到預(yù)定水平時(shí)，和/或當(dāng)一種或多種特定種類的聚合達(dá)到預(yù)定水平時(shí)，通常停止酶預(yù)處理過程。

在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，樣品選自谷物和其他含有淀粉和二糖和多糖的作物中天然存在的碳水化合物，所述谷物和作物例如大麥、小麥、黑麥、燕麥、玉米、大米、馬鈴薯、稻草、木材、淀粉和玉米秸稈。

在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，酶預(yù)處理過程是在發(fā)酵過程例如釀造之前進(jìn)行的糖化過程。

在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，將多種酶在同一時(shí)間或在不同時(shí)間加入到樣品混合物中，并且其中在預(yù)處理過程中調(diào)節(jié)樣品混合物的溫度以計(jì)入多種酶各自最有活性的不同的溫度水平。

在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，在400-3000cm^-1、400-2000cm^-1、500-1500cm^-1、700-1400cm^-1或800-1300cm^-1的波長下測量紅外光譜。

在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，分析單元是適于在酶預(yù)處理過程期間在樣品混合物的ATR-IR光譜的測量期間包含小部分樣品混合物的ATR-IR池，其中ATR-IR池緊密地安裝至包括晶體的ATR-IR板，ATR-IR板是ATR-IR光譜儀的一部分，其中緊密安裝通過ATR-IR光譜儀上的夾具和定位在ATR-IR板和分析單元之間的O形環(huán)來獲得。

在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，系統(tǒng)還包括連接罐和分析單元的連接單元，連接單元適于將小部分樣品混合物從罐引導(dǎo)到分析單元，由此樣品混合物的ATR-IR光譜通過ATR-IR光譜儀測量。

在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，系統(tǒng)包括在罐內(nèi)突出的提取探針，用于在罐內(nèi)用戶確定的位置處提取用于紅外光譜測量的小樣品部分。

在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，分析單元是包括ATR-IR單元，用于測量紅外光譜的分光光度計(jì)和計(jì)算機(jī)的分光單元，其中ART-IR單元包括具有晶體的ATR-IR板。

在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，分光單元直接附接于罐的壁。

在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，分光單元通過連接裝置例如以一組軟管的形式連接至罐的壁。

在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，ATR板可繞其自身軸旋轉(zhuǎn)至90度。

圖1示出了包括糖化單元100的裝置，其中糖化單元100含有溶液102，溶液102含有待糖化的產(chǎn)品和可能的待加入到原料產(chǎn)品中的酶溶液/化合物。在圖1所示的實(shí)施方案中，使用波導(dǎo)原理106的ATR-FTIR(衰減全反射傅里葉變換紅外)探針直接插入到糖化單元100中。收集紅外光譜并將其發(fā)送到計(jì)算機(jī)單元110，其對每個(gè)紅外光譜去卷積?？梢詮乃龉庾V中提取對于總糖/淀粉含量的特征的譜帶面積以及對聚合糖化合物特定的帶。然后使用預(yù)先校準(zhǔn)曲線，使用相關(guān)的譜帶面積計(jì)算各個(gè)聚合糖化合物的濃度以及單體糖和聚合糖化合物之間的比例。還可以同時(shí)報(bào)告其他值如蛋白質(zhì)含量和游離氨基酸含量。

糖化單元100還包括攪拌單元104，其可以是如圖1所示的螺旋槳或類似物。紅外(IR)光譜測量裝置200，例如衰減全反射(ATR)紅外光譜儀經(jīng)由光學(xué)連接路徑106直接耦合到糖化單元100，光學(xué)連接路徑106例如，包括用于將來自紅外光譜儀200的紅外光引導(dǎo)到樣品102并用于引導(dǎo)來自樣品102和至光譜儀200的背反射光的反射鏡或類似光學(xué)部件的裝置。

紅外光譜儀200又連接到計(jì)算機(jī)110或類似的數(shù)據(jù)處理設(shè)備，其實(shí)時(shí)計(jì)算各個(gè)糖化合物以及單體糖類化合物和聚合糖化合物之間的比例(可能連同蛋白質(zhì)和/或游離氨基酸含量)。

在如圖2中所示的另一個(gè)實(shí)施方案中，光纖116光學(xué)FTIR探針114被插入到糖化罐100的側(cè)通道108中，在此它連續(xù)地收集紅外光譜。在該實(shí)施方案的變型中，計(jì)算機(jī)110被集成到光譜儀200的機(jī)柜中，其對每個(gè)光譜執(zhí)行多元數(shù)據(jù)分析，并且直接在光譜儀200上的顯示器112上顯示相關(guān)值。

在類似于圖1中所示的實(shí)施方案的實(shí)施方案中，F(xiàn)TIR光譜儀200配備有直接安裝在糖化罐100上的ATR池。以這種方式，產(chǎn)品102被搗碎并且ATR池中的ATR晶體通過罐100中的孔118緊密地相互作用。紅外光譜儀200在罐100上的位置可以在罐的側(cè)面或底部，分別如圖3a和圖3b所示。

閥可用于允許從糖化罐100提取樣品102，即麥芽漿。通過使用泵送單元，或者通過糖化單元100內(nèi)部的壓力或重力，可以將樣品送至紅外光譜儀200，例如傅立葉變換(FT)紅外光譜儀，鄰近于ATR單元布置。裝備有ATR單元的FTIR光譜儀可以測量和記錄被搗碎的溶液102的紅外光譜。這樣的樣品提取可以作為連續(xù)流動(dòng)操作，或者可以在糖化過程期間的優(yōu)選時(shí)間處提取樣品等分試樣。圖4和圖5中示出了這種使用ATR池和特殊附加分析室的定制ATR單元的具體實(shí)施方案。

圖4示出了從“外部”看到的紅外光譜儀200，圖5示出了光譜儀200和其中導(dǎo)入樣品的分析室300的“內(nèi)部”部分視圖。紅外光譜儀包括其中產(chǎn)生紅外光的盒202和ART-IR單元203。入射紅外光204經(jīng)由一組光學(xué)部件206，例如反射鏡引導(dǎo)到晶體207，用于在分析室300內(nèi)獲得與樣品的緊密接觸。反射的紅外光210同樣被引導(dǎo)離開晶體207到達(dá)光譜儀200內(nèi)部的單元，用于分析光譜。

分析室300可例如是可能是附加裝置的ATR-IR單元，并且通常通過通常是光譜儀200的集成部分的夾具208固定到光譜儀200。通常通過使用O形環(huán)210獲得分析室300和光譜儀200之間的緊密密封，其確保液體樣品保持在分析室300內(nèi)部。樣品通過連接器入口302被引導(dǎo)到分析室300中，并且再次通過連接器出口304被引導(dǎo)離開。連接器入口302和出口304可以可釋放地連接到分析室300。

在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，分析室300由制造商與ATR單元203一起永久構(gòu)建。在其他實(shí)施方案中，ATR單元203，分析室300和光譜儀200都完全集成到一個(gè)組合單元中。

在由光譜儀200測量每個(gè)紅外光譜之后，分析室300中的樣品作為廢物丟棄或返回到糖化罐100中。

通過定制軟件分析紅外光譜，其從收集的光譜中提取譜帶面積，并將它們轉(zhuǎn)換為相關(guān)值，例如糖含量，糖聚合物的平均長度，溶解的蛋白質(zhì)含量和它的水解度，調(diào)味化合物(例如二乙酰基)、酯化合物或苦味化合物等的濃度。

與上述分析室300組合的光譜儀200的優(yōu)點(diǎn)在于，可以獨(dú)立于糖化罐100的操作來校準(zhǔn)。

在圖6a中，示出了罐100可具有位于糖化罐100的內(nèi)壁處的提取和再循環(huán)閥120以及廢物罐122，用于通過閥，在測量樣品的紅外光譜之后處理樣品。該裝置還可以配備有用于再循環(huán)樣品102的泵單元124。

在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，提取探針126和/或再循環(huán)探針127可以定位成靠近閥120或與其連接，如圖6b-6d所示。圖7a-d中示出了提取探針126的一些非限制性實(shí)例。

在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)糖化罐200不運(yùn)行時(shí)，可以使用自動(dòng)清潔系統(tǒng)來清潔分析室300。自動(dòng)清潔系統(tǒng)可以通過將清潔劑或化學(xué)品例如堿、酸或有機(jī)溶劑的流泵送通過分析室300，以及用水沖洗來起作用。當(dāng)糖化罐200不操作運(yùn)行校準(zhǔn)程序時(shí)，校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品可以進(jìn)一步自動(dòng)地泵入分析室300中。

提取探針126中的入口128(以及如圖7a所示的可能的出口130)的尺寸設(shè)置成允許大顆粒自由流動(dòng)通過探針126而不堵塞系統(tǒng)。在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，提取探針126裝配有過濾器132，以限制對于系統(tǒng)的其余部分而言太大的顆粒。在另一變型中，探針被設(shè)計(jì)具有可移除的過濾器，使得可以改變模板尺寸。如圖7c中所示，也可以省略過濾器。

在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，提取探針126的一部分134延伸到糖化單元100中，以從糖化罐100中的期望位置提取液體樣品。提取探針126通常通過容器安裝件136連接到罐100。

在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，提取探針126可以用作糖化罐的內(nèi)壁上的閥(非限制性實(shí)例在圖7d上示出)。

在圖7a-c中以不同形式示出的提取探針126可以從糖化罐100中的不同位置提取樣品。這可以通過使用連接到糖化罐100內(nèi)部的管的一系列閥來完成。在另一個(gè)變型中，提取探針126可以使用馬達(dá)來延伸和改變糖化罐100內(nèi)部的位置。

如圖7a中所示，探針可以包括兩個(gè)單獨(dú)的探針：提取探針126和再循環(huán)探針127，其中一個(gè)用于樣品的入口128，一個(gè)用于出口130以允許流回糖化罐100。使用應(yīng)用于系統(tǒng)的泵，可以改變系統(tǒng)中流動(dòng)的方向，以防止過濾器中的結(jié)塊。以這種方式，兩個(gè)單獨(dú)的探針(提取探針和再循環(huán)探針)可以組合到雙探針處理入口和出口。

可以使用糖化罐100內(nèi)的安裝件將提取探針126插入到糖化罐100中。糖化罐安裝件允許容易地安裝和維護(hù)探針126。安裝件可以利用三夾式連接件來將緊密密封件連接在探針126和糖化罐100之間。

安裝密封件還可以通過使用探針126和糖化罐100之間的真空來產(chǎn)生?；蛘?，安裝件可以焊接到糖化罐100的壁上。

圖8a示出了根據(jù)本發(fā)明的紅外分光單元/分析單元400，圖8b以分解圖示出了分光單元400。分光單元400包括具有板404的光譜室402，其中安裝有晶體407，晶體407必須與介質(zhì)接觸，以使分光單元400執(zhí)行紅外測量。使用紅外光譜星座來引導(dǎo)紅外光通過晶體407。在圖8a-b中所示的實(shí)施方案中，這通過使用具有分光光度計(jì)406的分光單元400和由反射鏡或光學(xué)器件組成的ATR-IR單元403來完成，鏡或光學(xué)器件將來自分光光度計(jì)406中的發(fā)射器的光引導(dǎo)通過晶體407并返回到分光光度計(jì)406中的接收器中。

發(fā)射器可以通過引導(dǎo)光學(xué)器件和/或反射鏡或光纖從外部光源接收紅外光?；蛘撸止夤舛扔?jì)406可以含有在分光光度計(jì)406內(nèi)發(fā)射紅外光的二極管陣列。接收器可以同樣將背反射光引導(dǎo)到外部光譜儀，或者本身包含二極管接收器。

在一個(gè)實(shí)施方案中，晶體407將僅使光通過介質(zhì)反射一次(單次反射)，如圖10a中所示，而在另一個(gè)實(shí)施方案中，晶體407將引起通過介質(zhì)的多次反射(多次反射)，如圖10b中所示。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，忽略ATR單元406，并且發(fā)射器和接收器成角度朝向晶體407，產(chǎn)生到和來自晶體407的直接路徑，如圖10c中所示。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，接收器由光傳感器和過濾器代替。

分光單元400還包括連接到分光光度計(jì)406的計(jì)算機(jī)408，用于在將數(shù)據(jù)發(fā)送回用戶或中央控制系統(tǒng)(例如，連接至罐的罐控制系統(tǒng))之前執(zhí)行必要的數(shù)據(jù)處理。計(jì)算機(jī)408可以連接到用于無線通信的天線410。作為替代或作為補(bǔ)充，計(jì)算機(jī)408可以連接到用于與用戶直接接口的顯示器409。分光單元400還包括蓋411。

為了在介質(zhì)上進(jìn)行光譜測量，光譜晶體407必須與介質(zhì)接觸。這可以例如是在線測量，其中分光單元400直接安裝在罐，容器或管道上。

圖11a-b示出了包括罐，例如糖化單元100的直列系統(tǒng)的實(shí)施方案，其中紅外分光單元400直接附接到糖化單元100的側(cè)面。分光單元400使用密封安裝單元401安裝到糖化罐100，以使晶體407與介質(zhì)保持接觸，同時(shí)防止任何泄漏。密封安裝單元401包括罐安裝件412，用于緊固分光單元400和罐安裝部件412之間的連接的夾具416以及用于密封分光單元400和罐安裝件412之間的連接的密封件414。

如圖11a中所示，安裝件412可以放置在容器/罐100的側(cè)面上，在容器/罐100的底部或頂部上。

當(dāng)分光單元400不使用時(shí)，當(dāng)樣品殘留物留在晶體407上時(shí)，殘留物固化，并且在新測量之前必須清潔ATR單元403。在圖9a-c中所示的實(shí)施方案中，其中嵌入晶體407的表面傾斜以允許樣品從晶體407排出。在圖9a-c中，相比于圖9a在圖9b中示出了45度傾斜，并且在圖9c中示出了90度傾斜。

在一個(gè)實(shí)施方案中，整個(gè)分光單元被排空以允許排水。在另一實(shí)施方案中，在光譜儀和ATR單元之間實(shí)現(xiàn)傾斜基座，允許ATR單元沿著紅外光束的軸傾斜。在一個(gè)實(shí)施方案中，傾斜基座是可調(diào)節(jié)的以傾斜到期望的程度。在一個(gè)實(shí)施方案中，傾斜基座是機(jī)動(dòng)的，從而允許其在測量之間額外地傾斜。

保持晶體407與介質(zhì)接觸的另一種方法是使用在線裝置，如圖11c-d中所示。在該實(shí)施方案中，分光單元400安裝到泵送單元500并且經(jīng)由軟管602連接到安裝在罐100上的過濾單元。兩個(gè)軟管602可以由管替換。

過濾單元600可以是簡單的過濾網(wǎng)?；蛘?，如圖11a-b中所示，過濾單元600可以由罐安裝件412代替。再或者，過濾單元600可以由到達(dá)罐或容器100中的探針組成。

泵送單元500包括具有殼體501的蠕動(dòng)泵系統(tǒng)，馬達(dá)502，利用介質(zhì)位移來將介質(zhì)移動(dòng)到容器100或移動(dòng)離開容器100的泵頭504，以及用于引導(dǎo)介質(zhì)通過晶體407的流動(dòng)池506。流動(dòng)單元506連接到泵504以確保穿過晶體407的表面的適當(dāng)流動(dòng)。泵送單元500還包括密封件414和夾具416，用于獲得分光單元400和泵送單元500之間的緊密密封。

在一個(gè)實(shí)施方案中，泵送單元500被放置在地板上。在另一個(gè)實(shí)施方案中，泵送單元500安裝到壁或容器本身。

本發(fā)明可以通過以下非限制性實(shí)施例解釋：

實(shí)施例1

制備分別為5％w/w的葡萄糖，麥芽糖，麥芽三糖和麥芽糖糊精的水溶液，并記錄所有溶液的紅外光譜。這些光譜可以在圖12中找到。圖12中的底線示出了用于比較的純水的光譜。紅外光譜源自每種化合物中的振動(dòng)模式。在化學(xué)上幾乎相同的四種化合物的紅外光譜的相對大的變化顯示變化主要源自聚合的1,4-糖苷鍵。圖23和25進(jìn)一步示出了如圖12中所示的相同物質(zhì)的測量。

糖苷鍵本身具有特征性的反對稱C-O-C拉伸模式，其在約1160cm^-1處給出譜帶。然而，由于葡萄糖中C4-O伸縮和聚合物上的末端C4-OH基團(tuán)的重疊，不適合區(qū)分單體和聚合物質(zhì)。

然而，作為糖苷鍵結(jié)果的縮醛基團(tuán)，在通過解聚時(shí)在1026cm^-1處的譜帶的強(qiáng)度顯著降低所觀察到的光譜中誘導(dǎo)更大的差異-參見圖13中的該過程的說明。因此，1026cm^-1譜帶的消失是解聚的良好指示器。

像其他形式的透射光譜，Lambert Beers定律適用于ATR-FTIR光譜，定律解讀：

A＝ε*l_穿透*c [1]

其中A是吸收，ε是消光系數(shù)，l_穿透是紅外光束的穿透深度，c是引起吸收的化合物的濃度。

當(dāng)對于具有相似折射率的樣品使用ATR-FTIR時(shí)，穿透深度是恒定的，這意味著每個(gè)譜帶的高度或面積與引起譜帶的化合物的濃度成比例。

縮醛基團(tuán)的特征振動(dòng)對于聚合物譜帶是如此特征，其可用于精確量化不同糖長度的混合物中每個(gè)葡萄糖單元的總糖苷譜帶。測量吸收的一種方法可以是從每個(gè)光譜中減去純水的光譜并讀取在約1020-1030cm^-1處的峰高，其中可觀察到來自縮醛基團(tuán)的振動(dòng)。然而，由于與相鄰譜帶的重疊，多元數(shù)據(jù)分析將顯著提高方法的準(zhǔn)確性。

因此，使用高斯去卷積提取1026cm^-1譜段的面積。作為替代，也已經(jīng)可以使用多元數(shù)據(jù)分析的變型。對于圖12所示的四個(gè)光譜，顯示作為每個(gè)葡萄糖單元的糖苷鍵的函數(shù)的在1026cm^-1處的積分吸光度的結(jié)果繪制在圖14中。圖14清楚地表明該方法如何精確地區(qū)分和識別糖苷鍵，即使在低濃度。

實(shí)施例2

制備3.5％w/w粉末狀淀粉在水中的漿液，并加熱至90℃保持5分鐘，得到均勻的凝膠狀溶液。然后將溶液注入直接連接在ATR板頂部的5mL容器中，以ATR晶體和溶液緊密接觸的方式設(shè)計(jì)容器。然后在室溫下通過外部攪拌裝置攪拌溶液，同時(shí)連續(xù)記錄光譜。為了模擬糖化過程，將α-淀粉酶的溶液加入到溶液中。此后，由于較短鏈淀粉分子的更好的溶解性，來自糖化合物的總吸收增加，但是強(qiáng)度在幾分鐘內(nèi)穩(wěn)定。在1200-900cm^-1區(qū)域中的光譜開始顯著變化，并且1030-1020譜帶的譜帶強(qiáng)度隨時(shí)間顯著降低，表明淀粉解聚，參見圖15的光譜，其中黑線表示早期時(shí)間，灰線表示隨著線變得越來越灰的越來越長的時(shí)間之后的光譜。圖15中的底部虛線示出了用于比較的純水的光譜。

約30分鐘后，光譜中沒有進(jìn)一步的變化，表明酶過程幾乎停止。比較所述光譜(淺灰色)與圖12中麥芽糖和麥芽三糖的光譜，清楚的是溶液現(xiàn)在由麥芽糖和麥芽三糖的混合物組成。

實(shí)施例3

將從大麥提取的0.1g蛋白質(zhì)與1克水混合，并在60℃溫和加熱15分鐘。將所得漿液在ATR-FTIR單元頂部的小容器中攪拌。這允許漿料和ATR單元的金剛石之間的緊密接觸，同時(shí)連續(xù)記錄IR光譜。該光譜顯示分別為1690cm^-1和1550cm^-1的酰胺基團(tuán)的特征吸收(略微重疊)，C＝O伸縮譜帶和N-H彎曲譜帶。一段時(shí)間后，將含有蛋白酶的0.1mL溶液注入容器中。酶注射后，在1690cm^-1的譜帶向上移動(dòng)到約1705cm^-1。雖然1690cm^-1處的譜帶是蛋白質(zhì)組中肽鍵處的羰基伸縮的特征，但是1705cm^-1譜帶是游離氨基酸二聚體或短蛋白片段中相應(yīng)的終止氨基酸基團(tuán)的特征。1690和1705cm^-1譜帶的單個(gè)面積可以使用光譜的去卷積清楚地確定，并且用于計(jì)算整個(gè)蛋白酶處理中的動(dòng)態(tài)比(溶解的蛋白質(zhì))/(游離氨基酸)。

實(shí)施例4

將60kg粗磨發(fā)芽大麥和200L水裝入配有用于加熱的鍋爐單元和機(jī)械攪拌裝置的250L不銹鋼容器中。在罐的底部，連接有電子控制閥用于樣品提取。在閥門是粗過濾器之前，防止較大的顆粒通過閥門。在操作期間，閥打開，使得蠕動(dòng)泵可以通過閥從罐中提取樣品。

將樣品液體泵送到附接在金門金剛石ATR單元頂部的室中(參見圖4-5的圖)。以30秒間隔不斷記錄紅外光譜。最初將大麥加熱至37℃并在該溫度下保持20分鐘。然后將麥芽漿加熱至60℃保持20分鐘，然后至65℃保持40分鐘。

首先，來自糖的總信號由于從麥芽溶解到麥芽漿中而增加，但是在升高的溫度下，1030-1020cm^-1區(qū)域中的譜帶的強(qiáng)度的面積開始顯著降低。光譜實(shí)時(shí)記錄的同時(shí)，對光譜去卷積，并且基于去卷積光譜中的特征譜帶的面積和預(yù)先獲得的校準(zhǔn)曲線，獲得可發(fā)酵糖和麥芽糖糊精之間的比例。當(dāng)麥芽漿含有可發(fā)酵糖之間的優(yōu)選比例時(shí)，將溫度快速升至75℃，使淀粉酶變性，從而在最佳組成時(shí)停止糖化。

實(shí)施例5

反應(yīng)器裝載有1000kg來自馬鈴薯的皮和2000L的水。然后將所得混合物加熱至100℃保持10分鐘，并冷卻至50℃。在該溫度下，在罐的底部和頂部打開閥，并且使混合物循環(huán)通過反應(yīng)器中的側(cè)通道108，產(chǎn)生類似于圖2中所示的環(huán)。

在其他探針中，基于纖維的ATR-FTIR金剛石探針位于該側(cè)通道中。探針連接到相鄰的FTIR單元，其在此時(shí)開始記錄通過側(cè)通道的液體的光譜。將溫度保持在50℃，將商業(yè)級直鏈淀粉粉末加入反應(yīng)器/糖化罐100中。

最初，光譜顯示淀粉和長鏈麥芽糖糊精的特征。但是在一小時(shí)的過程中，1020-1030cm^-1區(qū)域的強(qiáng)度增加，而觀察到在1200-900cm^-1區(qū)域的其余部分上的一般信號增加。

光譜變化表明馬鈴薯淀粉被水解，而溶液中的糖化合物由于短鏈淀粉衍生化合物相對于長鏈淀粉化合物的較高溶解度而增加。與光譜的實(shí)時(shí)記錄同時(shí)，每個(gè)光譜去卷積。使用1160-900cm^-1區(qū)域中的所有譜帶的強(qiáng)度來計(jì)算溶液中淀粉衍生化合物的總濃度。使用1030-1020cm^-1的譜帶來計(jì)算平均解聚度。一旦達(dá)到最佳組成，將反應(yīng)器的內(nèi)容物進(jìn)一步泵送到發(fā)酵單元上。

實(shí)施例6

在生產(chǎn)第二代生物乙醇燃料添加劑的設(shè)備上，含有粉碎的秸稈和玉米秸稈的原料最初在升高的溫度和壓力下用稀硫酸溶液預(yù)處理。在該處理期間，漿料被冷卻，結(jié)晶纖維素纖維全部轉(zhuǎn)化為無定形纖維素。提取無定形木質(zhì)纖維素，洗滌，并加入含有緩沖劑的水。然后加入粉末狀商業(yè)級纖維素酶，并調(diào)節(jié)溫度并保持在約50℃。

通過分析漿料的液體部分來監(jiān)測該過程，該液體部分被送到與糖化單元100相鄰的定制的ATR-FTIR儀器200,300。通過過濾最大顆粒以連續(xù)提取樣品以防止堵塞。將過濾的漿料轉(zhuǎn)移到FTIR儀器的ATR單元上的特別設(shè)計(jì)的室中。

對于糖化的第一操作時(shí)期，信號在1200-900cm^-1區(qū)域顯著增加，表明纖維素低聚物從漿料中的無定形木質(zhì)纖維素顆粒中溶解。隨后，該區(qū)域中的信號開始穩(wěn)定，同時(shí)由于低聚物水解成葡萄糖，觀察到1020-1030cm^-1區(qū)域的顯著降低。當(dāng)1020-1030cm^-1區(qū)域中的變化/每分鐘低于某一閾值極限值時(shí)，反饋觸發(fā)消息自動(dòng)從ATR-FTIR分析器發(fā)送到過程控制系統(tǒng)。在該閾值下，酶活性降低，并且漿料主要由木質(zhì)素顆粒和葡萄糖以及少部分纖維二糖和三糖和更高鏈長的低聚物組成。發(fā)送到過程控制系統(tǒng)的觸發(fā)消息激活具有過濾單元的泵，并且將濾液泵送到發(fā)酵單元中。

實(shí)施例7

通過在磁力攪拌期間在錐形燒瓶中在54℃下將225g研磨的發(fā)芽大麥與1L水混合來進(jìn)行微量調(diào)漿。通過加入0.25g檸檬酸調(diào)節(jié)pH。溫度在54℃保持15分鐘。然后將溫度升至65℃保持1小時(shí)，最后至75℃保持25分鐘。在所有三個(gè)溫度步驟期間，在糖化期間使用移液管提取幾mL的等分試樣，并轉(zhuǎn)移到沸水浴上的試管中保持5分鐘以確保酶的變性。然后通過離心除去沉淀，并獲得剩余的澄清液相的ATR-IR光譜，并且使用折射計(jì)測定折射率(以白利糖度％計(jì))。白利糖度標(biāo)度通常用于食品和釀造工業(yè)中，并且是描述折射率的方便方式，因此它們直接與溶液中溶解的碳水化合物的總量相關(guān)。

使用Thermofisher OMNIC軟件假設(shè)折射率為1.36對所有光譜進(jìn)行ATR校準(zhǔn)，并且從麥芽漿的每個(gè)光譜中減去純水的光譜。然后測定950cm^-1至1260cm-1的積分吸光度，并繪制為相同樣品的白利糖度％值的函數(shù)。曲線如圖16中所示。

兩者之間的關(guān)系表明，差值中的求和的積分紅外吸收顯示與糖化過程中溶解的碳水化合物的總量非常精確的關(guān)系。因此，可以使用ATR-IR光譜實(shí)時(shí)精確監(jiān)測糖化過程中溶解的碳水化合物的總量。

實(shí)施例8

在文獻(xiàn)中，已經(jīng)描述了糖化的顆粒將在ATR-IR光譜的應(yīng)用中引起問題，因?yàn)榈矸垲w粒和殼顆粒將影響溶液相的光譜。這似乎是在本領(lǐng)域的技術(shù)科學(xué)家的一個(gè)普遍的看法。

雖然觀察到在實(shí)驗(yàn)的非常早期時(shí)間部分是真實(shí)的，其中一些超小淀粉顆粒確實(shí)似乎對光譜有微小貢獻(xiàn)，但是這對本發(fā)明幾乎沒有技術(shù)影響。因?yàn)楣虘B(tài)顆粒僅在實(shí)驗(yàn)的非常早期時(shí)間才發(fā)現(xiàn)影響監(jiān)測；即在糖化的感興趣階段(在最初幾分鐘之后)過程中，顆粒沒有影響。

在實(shí)驗(yàn)室中，進(jìn)行根據(jù)前述實(shí)施例7中的程序的糖化。在糖化過程中約20分鐘，將約2mL的樣品轉(zhuǎn)移到冰浴中的試管中以猝滅酶水解反應(yīng)。由于細(xì)淀粉顆粒和細(xì)的殼顆粒，此時(shí)樣品非常漿狀并且顯示乳狀和不透明。然后將一些微黃色漿料用移液管轉(zhuǎn)移到具有金剛石ATR裝置的FTIR-光譜儀，并記錄紅外光譜，同時(shí)使用移液管使樣品恒定保持運(yùn)動(dòng)，即使用移液管攪拌。獲取靜態(tài)樣品的光譜而不使其保持運(yùn)動(dòng)。最后，用濕潤組織徹底清潔晶體，并將一些更多的相同樣品轉(zhuǎn)移到ATR晶體。

最后一次使用裝備有0.22μm注射器過濾器的注射器將樣品轉(zhuǎn)移到ATR晶體。該澄清液體的光譜與漿料樣品的先前光譜相同，表明麥芽漿中的顆粒不影響記錄的光譜。比較在圖17中顯示在糖化過程中在有和沒有過濾的情況下相同的樣品等分試樣的三個(gè)光譜。在未過濾的樣品的情況下，研究在記錄時(shí)攪拌樣品的效果。

圖18中的圖示示出了在圖17中觀察到的現(xiàn)象背后的機(jī)理。只要漿料中的顆粒顯著大于消散波的穿透深度，它們對記錄光譜的貢獻(xiàn)可以忽略不計(jì)。也就是說記錄的光譜實(shí)際上不依賴于顆粒，并且只記錄漿料的溶劑化部分。聚焦的消散波將僅穿透非常薄的液體膜。消散波的穿透深度小于漿料中典型的淀粉顆粒和殼顆粒的尺寸，實(shí)踐中從光譜中排除顆粒，并獲得純液體的光譜。

實(shí)施例9

基于指紋區(qū)域模型中的紅外光譜的化學(xué)計(jì)量模型必須依賴于所有可能的細(xì)節(jié)來以合理的精度區(qū)分非常相似的化合物，特別是關(guān)于本發(fā)明，其中生物分子的結(jié)構(gòu)的小變化必須使用ATR-FTIR量化。首先，自然值得考慮由于主要結(jié)構(gòu)變化的光譜變化。在生物聚合物的酶水解中，這將是與聚合物鍵的斷裂直接相關(guān)的變化。這里，直接光譜變化將分別與蛋白質(zhì)中的肽鍵或碳水化合物中的糖苷鍵的主基團(tuán)譜帶的消失相關(guān)。

然而，由于次要結(jié)構(gòu)的新光譜特征考慮可能是至關(guān)重要的。次要結(jié)構(gòu)變化在這里應(yīng)理解為作為主要結(jié)構(gòu)變化的間接結(jié)果而發(fā)生或變得可能的變化，例如在糖化過程中糖苷或肽鍵的斷裂。

該實(shí)施例顯示了本發(fā)明如何依賴于較通常僅僅依賴盲統(tǒng)計(jì)分析的基于光譜的化學(xué)計(jì)量學(xué)中通常使用的更為復(fù)雜的方法。在這種方法中，重要的是：1)識別，2)理解，然后3)合理地量化和利用次要結(jié)構(gòu)變化突然變得可能或由主要酶過程間接誘導(dǎo)。例如，肽鍵的斷裂將不僅導(dǎo)致肽鍵的特征振動(dòng)模式的損失，而且導(dǎo)致胺基團(tuán)和羧酸兩者的產(chǎn)生。

在這種情況下，最重要的鑒別器很可能是這些次要的變化。在該實(shí)施例中，特別地，由于對稱性的顯著變化，特別是如果產(chǎn)物是離子的，則顯著不同的模式的出現(xiàn)至少與主要結(jié)構(gòu)變化一樣有用。這在圖19中示出，顯示了肽鍵的水解允許形成幾種新物質(zhì)，具有非常不同的對稱和光譜性質(zhì)。然而，新的所示光譜特征的單邊統(tǒng)計(jì)使用將需要非常大的校準(zhǔn)集。但是進(jìn)一步使這種方法在技術(shù)意義上非常有限的是，其僅在非常窄的pH范圍內(nèi)有效。下面提出的方法應(yīng)用定性解釋以及量化和結(jié)果在預(yù)測中更豐富和多樣的模型。

如圖20中所示，阿米露-淀粉的水解促進(jìn)次要結(jié)構(gòu)改變，因?yàn)檫€原末端不會保留在α-吡喃糖形式中，而是與β形式進(jìn)行平衡。在水溶液中，D-葡萄糖作為α-和β-吡喃葡萄糖形式之間的平衡存在，比例分別為約34％:66％。這種平衡是非常動(dòng)態(tài)的，并且這兩種形式可以通過變旋互換。

在原始直鏈淀粉片段形式中，所有異頭C-O基團(tuán)都是α-構(gòu)型(參見(a)中的虛線圓圈)。在水解過程中，形成“還原端”。在還原端，碳水化合物可以轉(zhuǎn)化為β異頭物，其比α-異頭物稍微更穩(wěn)定。對于也可以進(jìn)行變旋光的二糖、三糖、低糖和多糖的還原端也是如此。

在α-和β-吡喃葡萄糖的光譜特征之間存在顯著差異，如圖21a和圖21b中所示。

圖21a示出了在室溫下純異頭α-glycosyranose形成外消旋混合物的轉(zhuǎn)化。虛線顯示純α-形式。光譜中的較淺色調(diào)對應(yīng)于實(shí)驗(yàn)中的較早時(shí)間戳，而較暗色調(diào)對應(yīng)于較晚時(shí)間戳。

圖21b中示出了純的溶解的D-吡喃葡萄糖與α和β-形式D-吡喃葡萄糖平衡時(shí)的外消旋混合物的比較。

通過在水中快速溶解12.5w/v的純結(jié)晶α-D-吡喃葡萄糖(Sigma-Aldrich)獲得光譜，并使用鍺ATR池在室溫下連續(xù)記錄溶液的光譜90分鐘(第一記錄的光譜從混合開始小于1分鐘)。然后蓋住樣品以避免蒸發(fā)。在實(shí)驗(yàn)期間，可以原位觀察到純α-D-吡喃葡萄糖形式的葡萄糖到α和β形式的混合物的變化。90分鐘后，沒有觀察到光譜特征的變化，因此α和β形式已經(jīng)達(dá)到平衡。

光譜與存儲超過24小時(shí)的樣品相同。兩個(gè)有意義的光譜處理是1080cm^-1譜帶的強(qiáng)度在β形式中非常強(qiáng)，而1055cm^-1和1150cm^-1譜帶在α-形式中強(qiáng)得多。由于指紋區(qū)域中的紅外活動(dòng)模式在大多數(shù)情況下具有非常復(fù)雜且混合的起源，每個(gè)包括與多種CO伸縮模式組合的若干OH和CH彎曲模式，單個(gè)CO基團(tuán)的重新取向可以獲得幾種變化的光譜模式。

除了測量糖苷鍵本身的基團(tuán)振動(dòng)之外，這也是水解的良好量度，因?yàn)槠湓试S定量“還原端”的濃度。

然而，實(shí)時(shí)使用β形式的光譜特征作為水解的量度，將需要變旋速率顯著快于淀粉水解速率。如果異頭物平衡中的動(dòng)力學(xué)比水解速率慢，這將使得該方法的實(shí)時(shí)化學(xué)計(jì)量建模非常具有挑戰(zhàn)性。

如圖20中所示，平衡時(shí)的動(dòng)力學(xué)在室溫下相對較慢。通常對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，的確不可能對平衡與水解的動(dòng)力學(xué)如何處于提高的和更實(shí)際的過程溫度進(jìn)行最終判斷。

因此，在60℃下進(jìn)行原位變旋，這對于大多數(shù)酶水解過程，例如發(fā)芽谷物的糖化更典型，因?yàn)樵摐囟冉咏矸鄣哪z化溫度。加熱通過放置在鍺ATR裝置頂部的可以維持等溫條件的自制電加熱裝置引入。通過非常接近鍺晶體的熱電偶進(jìn)一步監(jiān)測溫度。然后將α-D-吡喃葡萄糖與水在室溫下混合，然后迅速轉(zhuǎn)移到加熱塊覆蓋的60℃熱鍺晶體，同時(shí)連續(xù)記錄紅外光譜。紅外光譜示于圖22中，顯示了α-吡喃葡萄糖，即在60℃下α和β形式的外消旋混合物的原位轉(zhuǎn)化。虛線是在t＝0時(shí)純α形式的光譜。光譜中的較淺色調(diào)對應(yīng)于實(shí)驗(yàn)中較早的時(shí)間戳，而較暗的色調(diào)對應(yīng)于較晚的時(shí)間戳。

實(shí)驗(yàn)清楚地表明，在典型的糖化條件下動(dòng)力學(xué)非常快，并且與在較短的低聚糖鏈中增加量的β-吡喃葡萄糖形式相關(guān)的譜帶是淀粉總體水解的良好替代測量。

該實(shí)驗(yàn)在α-吡喃葡萄糖溶解之前在有和沒有向水中加入0.25w/v％檸檬酸的情況下進(jìn)行，并且觀察到變旋速率不依賴于少量檸檬酸的存在。該實(shí)施例清楚地證明了在水解期間這種意想不到的和間接光譜處理的重要性。類似地，這將適用于相關(guān)系統(tǒng)。一個(gè)實(shí)例是在纖維素(β-(聚-(1,4)-吡喃葡萄糖)水解的情況下，其中由于上述機(jī)理，水解形式將導(dǎo)致更高量的α-吡喃葡萄糖。

實(shí)施例10

各種類型的麥芽糖糊精可商購獲得，其特征在于它們在葡萄糖當(dāng)量(DE)中的還原能力。DE值通過將Cu(II)還原為Cu(I)的糖能力來測量，并且是測量碳水化合物的DE值的工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法。其中純葡萄糖定義為DE＝100，而麥芽糖和麥芽三糖例如分別具有50和33的DE值，平均聚合度(ADP)8的麥芽糖糊精將具有如下的DE值：

DE＝1/8＝12.5 [2]

對于淀粉衍生的低聚糖，平均聚合度是互逆的DE值。

DE＝1/(ADP) [3]

還原是在大量過剩的Cu(II)中進(jìn)行的。由于Cu(II)比淺淡藍(lán)綠色Cu(I)著色多，所以測定還原后Cu(I)濃度的傳統(tǒng)方法是Lane-Eynon滴定或通過重量分析法，其均是相當(dāng)費(fèi)力的方法。此外，這些方法本質(zhì)上不可能實(shí)時(shí)進(jìn)行。

這里適用了更新的和完善的方法，當(dāng)添加2,2-b喹啉羧酸陰離子時(shí)，其允許Cu(I)濃度作為強(qiáng)紫色復(fù)合物比色測定。此外，通過在105℃下加熱所有糖1至2小時(shí)，通過重量分析法測定所有麥芽糖糊精的水分含量，并且相對于麥芽糖糊精的干部分計(jì)算DE和ADP值。

發(fā)現(xiàn)使用這種良好建立的正交技術(shù)是一種驗(yàn)證由本發(fā)明應(yīng)用的方法的準(zhǔn)確性的好方法。根據(jù)已知技術(shù)(Zhang，Y.-H.P.；Lynd，L.R.Biomacromolecules2005,6,1510-1515。)制備試劑。在75℃的反應(yīng)時(shí)間從30分鐘增加到恰好60分鐘。對于每種碳水化合物使用5種不同的稀釋度，并且通過在560nm處的吸光度測量2,2-喹啉羧酸酯-Cu(I)復(fù)合物的濃度。通過與葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)比較，通過線性回歸的斜率確定DE值，所有R²值大于0.999。DE值在表1中給出。

表1商業(yè)淀粉水解產(chǎn)物的ADP值通過使用相對于葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)的Cu(II)的糖還原能力的比色測定獲得。

由于ATR-IR光譜是進(jìn)行透射紅外光譜的方法，并且由于在某一波長處的穿透深度對于具有相似折射率的樣品將總是恒定的，所以如式1中所示的Lambert Beers定律是直接適用的。

為了進(jìn)一步使得在糖化期間所有濃度底物濃度的ADP值的分析是通用的，引入表示相對聚合度(RDP)的術(shù)語。在合成或生物聚合物的一般情況下，RDP將是：

RDP＝n_聚合物鍵/n_{總單體單元} [4]

在特殊情況下，來自淀粉的水解產(chǎn)物或纖維素RDP定義為：

RDP＝n_葡糖苷鍵/n_{總葡萄糖單元}＝(n_{總葡萄糖單元}-1)/n_{總葡萄糖單元} [5]

例如，單體將具有等于零的RDP值，二聚體將具有0.5的值，而七聚體具有6/7，依此類推。通過引入RDP的概念，創(chuàng)建通用校準(zhǔn)以確定平均聚合度，而不考慮絕對碳水化合物濃度成為可能。

制備15重量％碳水化合物的溶液，每種碳水化合物在表1中示出。使用45°金剛石ATR裝置記錄圖23中所示的所有樣品的光譜。用于對光譜去卷積的模型在光譜中指示。

圖23中的所有光譜以以下方式分析：將光譜進(jìn)行ATR校準(zhǔn)以近似相應(yīng)的真實(shí)透射光譜，然后從每個(gè)光譜中減去水的背景。最后，使用包括pseudo-voigt函數(shù)的模型對每個(gè)經(jīng)ATR校準(zhǔn)的差光譜去卷積。在去卷積期間，分布曲線的位置和帶寬受到約束，并且僅優(yōu)化振幅，以確保譜帶在去卷積期間不隨機(jī)遷移。為了適應(yīng)由于譜帶的輕微移動(dòng)而產(chǎn)生的一些彈性，在一些情況下，一些譜帶被分成具有彼此非常接近的位置的兩個(gè)譜帶。例如，在1080和1152cm^-1附近的譜帶分別由1078+1081cm^-1和1148+1154cm^-1處的譜帶的總和表示。每個(gè)所獲得的譜帶面積通過除以來自去卷積的所有譜帶的和而標(biāo)準(zhǔn)化。除以總面積等于用總?cè)芙獾奶妓衔餄舛冗M(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。這顯然是非常好的近似，如實(shí)施例8中所證明的，清楚地顯示總?cè)芙獾奶妓衔餄舛扰c所有這些譜帶的積分面積成比例。

通過繪制若干去卷積帶面積對從如圖24所示的Vis光譜Cu(II)-Cu(I)-2,2-喹啉-羧酸酯的DE值獲得的RDP值，顯示通過應(yīng)用新方法，可以從IR實(shí)時(shí)獲得相同的值，而不必加入試劑。這在方法的簡單性和易于實(shí)施的方面以及在成本方面都是巨大的優(yōu)點(diǎn)。

圖24顯示了來自圖23中所示的四個(gè)光譜的去卷積的積分譜帶面積，顯示了與碳水化合物的RDP值非常好的統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性。

實(shí)施例8表明紅外光譜可用于建立糖化期間溶解的碳水化合物的總量的良好值。除此之外，本實(shí)施例10表明本發(fā)明可用于精確測定總?cè)芙獾奶堑钠骄酆隙?，其是不能通過任何其它方法快速獲得的值。

實(shí)施例11

如上文實(shí)施例10中所討論的，麥芽糖糊精通常通過其DE值來表征。然而，單獨(dú)的DE值不能完全描述麥芽糖糊精，因?yàn)棣?(1-4)和α-(1-6)糖苷鍵的比例可以獨(dú)立于DE值而變化。例如校準(zhǔn)研究中使用的麥芽糖糊精必須具有α-(1-4)和α-(1-6)糖苷鍵的現(xiàn)實(shí)分布。淀粉主要由與α-(1-4)糖苷鍵連接的葡萄糖組成，這使得大多數(shù)葡萄糖苷鍵為α-(1-4)型。然而，特別是淀粉的支鏈淀粉部分由于較小量的α-(1-6)糖苷鍵而支化。由于這種分支，典型淀粉中大約5％的糖苷鍵是α-(1-6)，而其余的是α-(1-4)。由于大多數(shù)淀粉酶只能水解α-(1-4)糖苷，淀粉中的大部分天然α-(1-6)-糖苷鍵在水解過程中保持完整，因?yàn)樗鼈儗Υ蠖鄶?shù)淀粉酶攻擊更耐受。因此，在大多數(shù)淀粉的最終水解中α-(1-6)糖苷鍵殘基的量對未水解的低聚糖的糖苷鍵有顯著貢獻(xiàn)，并且從光譜的觀點(diǎn)不能忽略。

因此，使用異麥芽三糖(α-D-吡喃葡萄糖-(1,6)-α-D-吡喃葡萄糖-(1,6)-D-葡萄糖，Sigma-Aldrich)的溶液作為α-1,6-糖苷鍵的純光譜特征的參照。此外，商業(yè)和食品批準(zhǔn)的α-(1,6)-葡萄糖-低聚糖VitaFiber購自不同的分銷商。雖然Vitafiber主要由α-(1,6)-葡萄糖-低聚糖和較小部分的混合α-(1,6)/α-(1,4)葡萄糖-低聚糖組成。然后將這兩種α-(1,6)糖苷化合物與商業(yè)麥芽糖糊精(ADP＝5,54，sigma)和純麥芽三糖進(jìn)行比較。

圖25顯示異麥芽三糖，VitaFiber低聚糖，SigmaAldrich麥芽糖糊精，麥芽三糖和水的12.5w/v％溶液的光譜。在約1000-1030cm^-1處的吸收的差異顯示α-(1,4)和α-(1,6)糖苷鍵的光譜特征之間的顯著不同。

很顯然，分離的α-(1,6)鍵是完全不同的，α-(1,4)-麥芽三糖和異麥芽三糖顯示出顯著的差異。特別是在約1025cm^-1處，縮醛振動(dòng)模式的吸收在α-(1,6)異構(gòu)體中顯著更強(qiáng)。此外，反對稱糖苷C-O-C伸縮模式的1155cm^-1模式稍微移動(dòng)到約1160cm^-1。

發(fā)現(xiàn)Vitafiber和短的商業(yè)麥芽糖糊精都存在于兩種純樣品(異麥芽三糖和麥芽三糖)之間，表明它們都含有顯著量的兩種類型的糖苷鍵。特別是由于麥芽糖糊精通過天然淀粉的部分水解制備，因此它是在真實(shí)糖化過程中麥芽糖糊精開發(fā)的非常現(xiàn)實(shí)的模型。因此，得出結(jié)論，從Sigma-Aldrich購買的低ADP麥芽糖糊精將作為具有α-(1,6)/α-(1,4)糖苷鍵的現(xiàn)實(shí)比例的現(xiàn)實(shí)模型。此外，該實(shí)施例表明，在正確的情況下，本發(fā)明能夠區(qū)分和定量混合物中不同類型的糖苷。特別考慮到實(shí)施例9，結(jié)合去卷積和/或統(tǒng)計(jì)分析，上述結(jié)果可用于構(gòu)建多元化模型，其在糖化過程期間可以實(shí)時(shí)區(qū)分和定量除了ADP值之外的糖苷鍵的類型。

實(shí)施例12

在過去的50年期間，在聚合碳水化合物中糖苷振動(dòng)的確切位置已經(jīng)被大大地討論。多年來，基于論點(diǎn)和指標(biāo)提出了幾個(gè)爭議，關(guān)于在何處定位糖苷鍵的特征頻率，沒有來自實(shí)驗(yàn)的任何堅(jiān)實(shí)證據(jù)。因此，顯然不可能對碳水化合物的紅外光譜的指紋區(qū)域進(jìn)行深入分析，甚至對于同時(shí)是光譜學(xué)和化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員也是如此。這對于與聚合度相關(guān)的特征尤其如此。

文獻(xiàn)中的先前實(shí)例未能使用諸如偏最小二乘(PLS)分析的統(tǒng)計(jì)分析，以基于實(shí)驗(yàn)紅外數(shù)據(jù)區(qū)分相似的二糖和三糖如麥芽糖和麥芽三糖。當(dāng)以前的研究的其他公認(rèn)的統(tǒng)計(jì)技術(shù)，以區(qū)分非常簡單的碳水化合物的混合物，已經(jīng)失敗時(shí)，產(chǎn)生了不可能使用紅外以區(qū)分糖類型和它們的聚合程度的假設(shè)。

從電子結(jié)構(gòu)可以計(jì)算分子的量子力學(xué)一般模式，以及作為一般模式的函數(shù)的振蕩偶極子的良好估計(jì)。這意味著可以從電子結(jié)構(gòu)產(chǎn)生非常現(xiàn)實(shí)的紅外光譜。這允許對實(shí)驗(yàn)光譜的更多合格的解釋，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)光譜中的每個(gè)譜帶可以用量子機(jī)械充分描述的正常模式分配。

使用對葡萄糖，麥芽糖和麥芽四糖的密度泛函理論，對直鏈淀粉的一般模式進(jìn)行量子力學(xué)研究。首先，通過使用B3LYP功能和使用市售軟件包的6-31G(d)基組來最小化每種碳水化合物的電子結(jié)構(gòu)的能量。然后計(jì)算紅外光譜，并且根據(jù)文獻(xiàn)中的常規(guī)實(shí)踐，以0.98的比例因子對所計(jì)算的光譜進(jìn)行協(xié)調(diào)校準(zhǔn)。

理論光譜與實(shí)驗(yàn)譜帶良好一致，并揭示了糖苷鍵涉及幾種特征振動(dòng)模式。在1155cm^-1處的中強(qiáng)譜帶歸屬于糖苷譜帶的反對稱C-O-C振動(dòng)。盡管葡萄糖和非還原性端在相同區(qū)域也具有吸收，由但是于C4-O伸縮，這些振動(dòng)發(fā)生在稍低的波數(shù)和顯著更低的強(qiáng)度處。在約1035-1000cm^-1處的強(qiáng)譜帶可以與包括在吡喃糖環(huán)的縮醛基周圍的O-C-O伸縮模式的強(qiáng)振動(dòng)的模式相關(guān)。α-(1,4)糖苷鍵產(chǎn)生中等強(qiáng)的吸收，而在α-(1,6)糖苷鍵的情況下的類似模式具有甚至更強(qiáng)的吸收，這再次解釋了如圖25中所示的對于麥芽三糖和異麥芽三糖所呈現(xiàn)的光譜的差異。

實(shí)施例13

制備三種莖溶液：15％w/v葡萄糖(無水，含水量<1％)，麥芽糖(相對于麥芽糖一水合物的質(zhì)量為15％w/v，Sigma Aldrich)和麥芽糖糊精(ADP＝5.54，購自Sigma-Aldrich)。然后通過用高精度自動(dòng)移液管混合，制備根據(jù)表2的這些的混合物。使用水平10反射鍺45°ATR單元和Nicolet iS5光譜儀記錄21個(gè)校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)中的每一個(gè)的FTIR光譜。對于所有樣品，使用1.36的折射率對所有光譜進(jìn)行ATR校準(zhǔn)。所有21個(gè)樣品的去卷積分析類似于實(shí)施例10中所述的方法進(jìn)行，但使用稍微調(diào)整的參數(shù)。此外，用于生成差譜的水背景是通過更高次多項(xiàng)式的解析近似。此外，通過分析來自碳水化合物特征的總吸收較低的較高和較低波長處的幾個(gè)吸收，應(yīng)用校準(zhǔn)來自漂移的光譜的算法。

表2

在實(shí)施例10中，顯示IR可以確定純二糖和低聚糖的ADP值。然而，在大多數(shù)糖化的技術(shù)情況下，ADP值的差異要小得多。

在圖27和28中，10個(gè)譜帶或譜帶面積的組合以混合物的RDP的函數(shù)表述。

圖27-28示出了圖26中光譜的去卷積的帶面積和在不同波長下相對聚合度之間的相關(guān)性。不同的回歸圖比較了去除了分別含有葡萄糖或麥芽糖糊精的樣品的全數(shù)據(jù)集。

選擇所給出的圖，因?yàn)樗鼈兌硷@示與RDP值的公平到良好的相關(guān)性，而僅顯示非常差的統(tǒng)計(jì)相關(guān)性的圖沒有顯示。特別是對于顯示RDP和1078+1081cm^-1，1110cm^-1和1078+1081+1110+1130cm^-1總和譜帶面積之間的相關(guān)性的曲線圖分別都顯示非常好的相關(guān)性；所有的R²值接近或高于0.98。這些譜帶在實(shí)施例9中顯示與對α或β-D-吡喃葡萄糖-主鏈特異性的C-O伸縮+OH/CH彎曲相關(guān)。在這種情況下，這些譜帶似乎是通用描述符的總體優(yōu)選，以確定在某一時(shí)間的糖化期間的RDP，而不考慮具體的碳水化合物組成。在該實(shí)施例中，1036cm^-1處的譜帶也表現(xiàn)出與RDP非常好的相關(guān)性，但稍后將顯示，這僅在特定情況下是真實(shí)的。稍后將示出如何利用1036cm^-1譜帶來提供關(guān)于樣品組成的另外的化合物特定信息。

數(shù)據(jù)集的不同部分用于統(tǒng)計(jì)分析，以與RPD值的特定化合物相關(guān)性進(jìn)行比較。RDP和上述譜帶(1078+1081cm^-1，1110cm^-1，1078+1081+1110+1130cm^-1和1036cm^-1)之間的相關(guān)性在包括在數(shù)據(jù)集中的樣品的變化方面沒有顯示出顯著的變化。這進(jìn)一步表明，在葡萄糖，麥芽糖和麥芽糖糊精的混合物的情況下，它們是RDP的良好通用描述符，而不考慮具體的樣品組成如何。

然而，它大大增加了本發(fā)明的有用性，上述普遍趨勢不適用于所有積分譜帶和RDP相關(guān)性。對于1003cm^-1，1022cm^-1譜帶的RDP和譜帶面積的相關(guān)性以及兩者的和的情況，與上述譜帶(1078+1081cm-1，1110cm-1，1078+1081+1110+1130cm-1和1036cm-1)相比，整體相關(guān)性首先似乎較差并且噪雜。

然而，當(dāng)只有部分?jǐn)?shù)據(jù)集被考慮到時(shí)，圖片是非常不同的。特別是在回歸之前所有含有葡萄糖的樣品被除去的情況下，相關(guān)性變得明顯更好(R²從0.85增加到約0.975)，并且描述相關(guān)性的方程以顯著不同的斜率變化。類似地，當(dāng)除去含有麥芽糖糊精的所有樣品時(shí)，相關(guān)性提高。這清楚地表明，這些譜帶的數(shù)據(jù)的表觀分散不是噪聲。這些譜帶在某種程度上與總體RDP相關(guān)之外，非常依賴于樣品的特定碳水化合物組成。從這個(gè)表示的分析，顯然這些譜帶在含淀粉原料的糖化過程中的多元校準(zhǔn)中發(fā)揮特殊作用，其中除裸平均聚合度之外，它在葡萄糖濃度的估計(jì)中似乎特別強(qiáng)大。

在多元校準(zhǔn)中利用嵌入在1003cm^-1和1022cm^-1譜段中的化合物特定信息的實(shí)例可以是比較用1003-1022cm^-1譜段和上述使用的1078-1130cm^-1譜段獲得的RDP值的差異：1078-1130cm^-1譜帶似乎在其淀粉糖化中的RDP值的可預(yù)測性方面更加通用。

雖然葡萄糖和麥芽糖都是可發(fā)酵的糖，但是葡萄糖以高濃度(總碳水化合物的10-30％)存在于最終麥芽漿中，并且通常是麥芽糖之后麥芽漿中第二豐富的碳水化合物。在不存在大量的麥芽糖糊精情況下，低葡萄糖與麥芽糖的比例將導(dǎo)致相對高的RDP值，而反之亦然。因此，能夠估計(jì)混合物中的葡萄糖濃度的多元建模的上述原理在糖化過程中，特別是在釀造工業(yè)中具有很大的技術(shù)重要性。RDP的精確值以及葡萄糖濃度的良好估計(jì)將有助于糖化期間實(shí)際發(fā)酵度的實(shí)時(shí)計(jì)算，這對于釀造者具有很大的技術(shù)價(jià)值。

最后，將所有樣品分別稀釋至11％w/v和7％w/v，所有樣品以其稀釋狀態(tài)記錄。以與上述相同的方式處理數(shù)據(jù)，并且發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)與上述呈現(xiàn)的相關(guān)性接近相同，這表明RDP校準(zhǔn)方法確實(shí)提供了濃度獨(dú)立校準(zhǔn)。

實(shí)施例14

前面的實(shí)施例13顯示了本發(fā)明如何能夠給出RDP值以及葡萄糖濃度的估計(jì)，其可以用于估計(jì)發(fā)酵度。相關(guān)的挑戰(zhàn)來自出現(xiàn)麥芽三糖，從光譜的角度來看，與麥芽糖相似。在大多數(shù)基于淀粉的原料的糖化過程中，顯著量的麥芽三糖作為副產(chǎn)物產(chǎn)生(高達(dá)總碳水化合物的5-20％)。特別是在釀造工業(yè)的糖化過程的情況下，估計(jì)麥芽三糖的濃度將具有很大的技術(shù)重要性。這是特別相關(guān)的，因?yàn)閷τ谟纱蠖鄶?shù)類型的酵母它是不可發(fā)酵的，因此有助于最終產(chǎn)品的味道，并且通常在釀造工業(yè)中被稱為一般麥芽糖糊精。

因此，根據(jù)實(shí)施例13中所述的程序進(jìn)行另一個(gè)校準(zhǔn)集，此時(shí)包括不同濃度的麥芽三糖，使得四種混合的碳水化合物成為用于實(shí)際淀粉糖化的非?，F(xiàn)實(shí)的模型系統(tǒng)。樣品組成可以在表3中看到，記錄的光譜在圖29中顯示。

表3

對所有去卷積和標(biāo)準(zhǔn)化的譜帶面積進(jìn)行相同的統(tǒng)計(jì)分析，如實(shí)施例13中所述?；貧w分析的結(jié)果可以在圖30-33中看出。圖30-31類似于圖27-28中所呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)，并且顯示了與RDP不同的譜帶面積相關(guān)性，分別排除了含有葡萄糖，麥芽糖糊精和麥芽三糖的樣品。去卷積模型參數(shù)已經(jīng)相對于先前呈現(xiàn)的稍微調(diào)整。對于漂移校正算法以及水減法程序也是這樣，其現(xiàn)在使用實(shí)驗(yàn)背景而不是分析近似。

使用新數(shù)據(jù)集非常好地再現(xiàn)了前一實(shí)施例中呈現(xiàn)的統(tǒng)計(jì)趨勢。在圖30-31中可以看到關(guān)于1078+1081cm^-1，1110cm^-1和1078+1081+1110+1130cm^-1譜帶之間的相關(guān)性的趨勢，這次由于更大尺寸的數(shù)據(jù)集具有非常好的統(tǒng)計(jì)學(xué)證據(jù)。所有這些相關(guān)性非常好，并且當(dāng)將全數(shù)據(jù)集與其中排除部分?jǐn)?shù)據(jù)集的情況進(jìn)行比較時(shí)，所得到的方程幾乎相同。1148+1153cm^-1譜帶也與前面的實(shí)施例表現(xiàn)相同，并且對于RDP看起來仍然是良好的描述符，盡管它稍微有些噪聲。似乎所述數(shù)據(jù)集也揭示了該譜帶可以包括一些更多的化合物特定細(xì)節(jié)，在所得等式中有一些變化，然而分析的樣品的數(shù)量太小，以至于分析對于1148+1153cm^-1譜帶是決定性的。

1003cm^-1，022cm^-1和1003+1022cm^-1譜帶面積與RDP的相關(guān)性的分析顯示了實(shí)施例13中給出的結(jié)果的非常精確的再現(xiàn)，并且證實(shí)這些譜帶在樣品中的葡萄糖的辨別中是非常有用的。然而，有趣的是注意到麥芽三糖的排除導(dǎo)致幾乎相同的方程作為1003cm^-1,1022cm^-1和1003+1022cm^-1譜帶面積與RDP相關(guān)的整個(gè)數(shù)據(jù)集。

與RDP相關(guān)的1036cm^-1譜帶面積與前面實(shí)施例中呈現(xiàn)的麥芽三糖游離研究非常不同。在前面的實(shí)施例中，對于整個(gè)數(shù)據(jù)集，以及在排除葡萄糖和麥芽糖糊精的兩種情況下，1036cm^-1譜帶面積與RDP非常好地相關(guān)。這里，整個(gè)數(shù)據(jù)集的相關(guān)性最初似乎總體上差且噪雜，R²＝0.82。然而，通過排除富含麥芽三糖的樣品(設(shè)定點(diǎn)5％)，趨勢顯著變化；表觀噪聲減少，其余數(shù)據(jù)現(xiàn)在與RDP很好地相關(guān)，R²＝0.943。

為了詳細(xì)研究麥芽三糖對所述數(shù)據(jù)集的影響，通過排除麥芽三糖少的樣品，還通過研究RDP與譜帶面積的相關(guān)性，進(jìn)一步詳細(xì)研究了富含麥芽三糖的樣品。這些曲線圖如圖32-33中所示。

譜帶面積992cm^-1，1003cm^-1，1022cm^-1，1003+1022cm^-1，1078+1081cm^-1，1110cm^-1，1130cm^-1，(1078+1081+1110+1130cm^-1)，1148+1153cm^-1相關(guān)性是恒定的，不管數(shù)據(jù)集是否包括所有樣品，麥芽三糖少的樣品或富含麥芽三糖的樣品。然而，與RDP相關(guān)的1036cm^-1譜帶面積顯示對麥芽三糖的濃度非常敏感。甚至包括含有低至碳水化合物總量的10和15％麥芽三糖的所有樣品，顯示改善相關(guān)性的統(tǒng)計(jì)以及改變所得方程的斜率。

圖32-33示出了表3中光譜的去卷積的帶面積和在不同波長下相對聚合度之間的相關(guān)性。不同的回歸曲線圖比較全數(shù)據(jù)集的譜帶面積對RDP，譜帶面積其中只包括富含麥芽三糖的樣品。

實(shí)施例15

在該實(shí)施例中，通過混合12％v/w水溶液葡萄糖，麥芽糖，麥芽三糖和麥芽糖糊精來使用150個(gè)樣品。實(shí)驗(yàn)的目的是增強(qiáng)多元校準(zhǔn)的準(zhǔn)確性，其允許更好地估計(jì)每種特定的碳水化合物。以允許一定范圍的不同RDP值的方式混合樣品。校準(zhǔn)集包括每30個(gè)樣品的5個(gè)子集；第一子集包含所有四種碳水化合物組分(葡萄糖，麥芽糖，麥芽三糖和麥芽糖糊精)。在隨后的四個(gè)子集中，僅包括每個(gè)子集中的三種化合物，排除最后的碳水化合物組分。即5個(gè)子集包括30個(gè)樣品，其具有導(dǎo)致一定范圍的RDP值的單個(gè)化合物的一系列不同組合：

1)葡萄糖，麥芽糖，麥芽三糖和麥芽糖糊精

2)麥芽糖，麥芽三糖和麥芽糖糊精

3)葡萄糖，麥芽三糖和麥芽糖糊精

4)葡萄糖，麥芽糖和麥芽糖糊精

5)葡萄糖，麥芽糖和麥芽三糖

對于每個(gè)樣品獲得ATR-IR光譜，并且其ATR校準(zhǔn)的差光譜根據(jù)實(shí)施例14進(jìn)行處理和去卷積。然而，與實(shí)施例13和14相比，進(jìn)行部分最小二乘回歸(PLS)代替手動(dòng)比較線性回歸分析。隨著PLS的改進(jìn)的統(tǒng)計(jì)，建立多元模型是可能的，其可以應(yīng)用于在各種淀粉的糖化期間的在線/實(shí)時(shí)監(jiān)測。多元模型實(shí)時(shí)應(yīng)用于糖化液體以提供總?cè)芙馓妓衔锖蚏DP的準(zhǔn)確估計(jì)以及來自上述的四種單獨(dú)碳水化合物(葡萄糖，麥芽糖，麥芽三糖和麥芽糖糊精)的估計(jì)。這些值還用于計(jì)算麥芽漿的可發(fā)酵度的精確實(shí)時(shí)估計(jì)。

實(shí)施例16

根據(jù)實(shí)施例13-15中的程序產(chǎn)生包括280個(gè)樣品溶液的另一個(gè)校準(zhǔn)。然而，加入麥芽四糖作為第五組分，以及長鏈麥芽糖糊精(低DE值)作為第六組分。麥芽四糖從商業(yè)高麥芽四糖玉米糖漿獲得，其具有非常高的麥芽四糖含量，含有少量麥芽三糖和麥芽糖五糖，并且?guī)缀醪缓咸烟呛望溠刻恰Ｊ褂弥圃焐烫峁┑腍PLC證書，可以計(jì)算每個(gè)樣品中麥芽四糖和麥芽三糖的精確量。校準(zhǔn)集被分成七個(gè)子集，每個(gè)子集包括具有六個(gè)組分的不同混合物的40個(gè)單獨(dú)樣品：

1)葡萄糖，麥芽糖，麥芽三糖，高麥芽三糖漿，麥芽糖糊精(DE≈18)和麥芽糖糊精(DE≈5)

2)麥芽糖，麥芽三糖，高麥芽三糖漿，麥芽糖糊精(DE≈18)和麥芽糖糊精(DE≈5)

3)葡萄糖，麥芽三糖，高麥芽三糖漿，麥芽糖糊精(DE≈18)和麥芽糖糊精(DE≈5)

4)葡萄糖，麥芽糖，高麥芽三糖漿，麥芽糖糊精(DE≈18)和麥芽糖糊精(DE≈5)

5)葡萄糖，麥芽糖，麥芽三糖，麥芽糖糊精(DE≈18)和麥芽糖糊精(DE≈5)

6)葡萄糖，麥芽糖，麥芽三糖，高麥芽三糖漿和麥芽糖糊精(DE≈5)

7)葡萄糖，麥芽糖，麥芽三糖，高麥芽三糖漿，麥芽糖糊精(DE≈18)

再次，將光譜數(shù)據(jù)去卷積并進(jìn)行PLS分析，以建立多元模型。多元模型可以再次實(shí)時(shí)應(yīng)用以提供總?cè)芙獾奶妓衔锖蚏DP的準(zhǔn)確評估以及來自上面的四種單獨(dú)碳水化合物(葡萄糖，麥芽糖，麥芽三糖和麥芽糖糊精)的評估。這些值還用于計(jì)算麥芽漿的可發(fā)酵度的精確實(shí)時(shí)評估。此外，該多元模型可以對麥芽糖糊精的分?jǐn)?shù)進(jìn)行一些合理的評估。麥芽糖糊精的長度在釀造工業(yè)中通常是重要的，因?yàn)槎帖溠亢琨溠咳呛望溠克奶潜染哂懈呔酆隙鹊柠溠刻呛@著更甜。

實(shí)施例17

制備10.0％w/v的果糖，葡萄糖，蔗糖和1：1葡萄糖-果糖混合物的溶液，并使其平衡。記錄使用金門ATR裝置的樣品的ATR-IR光譜并顯示在圖34中。所述3種糖的光譜顯示非常不同的光譜特征。有趣的是葡萄糖-果糖的1：1混合物與蔗糖明顯不同。該實(shí)施例與上述實(shí)施例結(jié)合，清楚地表明了本發(fā)明如何可以明顯地應(yīng)用于在轉(zhuǎn)化糖漿的生產(chǎn)中或在從葡萄糖漿酶生產(chǎn)果糖糖漿中監(jiān)測蔗糖水解。

實(shí)施例18

構(gòu)造類似于圖11C所示的糖化分析器的版本。糖化分析器連接到實(shí)際尺寸的糖化罐。通過回路，將糖化單元中的漿液連續(xù)泵送到分析儀中嵌入的ATR-IR分光單元上，每分鐘記錄一次光譜。ATR-IR單元中的ATR池傾斜到足夠大的角度，以允許取樣區(qū)域在非操作期間通過重力自動(dòng)排出。糖漿罐填充有水，通過加入約0.25重量％檸檬酸調(diào)節(jié)pH，然后將水加熱至57℃。在機(jī)械攪拌下將發(fā)芽大麥加入糖化罐中加熱的水中。根據(jù)前述實(shí)施例中描述的方法和校準(zhǔn)，實(shí)時(shí)分析紅外光譜。根據(jù)分析，如圖35所示，實(shí)時(shí)地給出了白利糖度中的ADP和總糖，其中三角形顯示了從紅外光譜獲得的糖化期間產(chǎn)生的總碳水化合物(右側(cè)標(biāo)度)，圓圈顯示基于紅外譜帶的分析的ADP值(左側(cè)標(biāo)度)。虛線示出了糖化中使用的溫度曲線。

標(biāo)號

100 糖化單元

102 溶液/麥芽漿

104 攪拌單元

106 波導(dǎo)/光學(xué)連接路徑

108 糖化罐中的側(cè)通道

110 計(jì)算機(jī)

112 顯示器

114 光學(xué)探針

116 連接到光學(xué)探針的纖維

118 罐中的孔

120 提取和/或再循環(huán)閥

122 廢物罐

124 泵單元(任選的)

126 提取探針

127 再循環(huán)探針

128 入口

130 出口

132 過濾器

134 提取探針的一部分

136 容器安裝件

200 紅外光譜儀

202 盒

203 ATR-IR單元

204 入射紅外光

206 光學(xué)部件/反射鏡

207 ATR-IR板中的晶體

208 夾具

210 背向反射紅外光

212 O形環(huán)

300 分析室/ATR-IR池

302 連接器入口

304 連接器出口

400 分光單元

401 密封安裝件單元

402 分光附件

403 ATR-IR單元

404 板

406 分光光度計(jì)

407 晶體

409 顯示器

408 計(jì)算機(jī)

410 天線

411 蓋

412 罐安裝件

414 密封件

416 夾具

500 泵送單元

501 殼

502 發(fā)動(dòng)機(jī)

504 泵頭

506 流動(dòng)池

602 過濾單元

602 軟管