本申請要求2014年5月29日提交的美國臨時專利申請?zhí)?2/004,502、2014年8月6日提交的美國臨時專利申請?zhí)?2/033,853和2014年12月10日提交的美國臨時專利申請?zhí)?2/090,169的優(yōu)先權(quán)的權(quán)益。序列表本申請含有序列表，其以ASCII格式電子提交且通過引用以其整體結(jié)合到本文中。2015年5月29日創(chuàng)建的所述ASCII副本命名為NGX-03225_SL.txt，大小為259,379字節(jié)。發(fā)明背景脂質(zhì)是食物和化妝品工業(yè)中必不可少的成分，并且它們是生物柴油和生化工業(yè)中的重要前體。許多產(chǎn)油微生物產(chǎn)生脂質(zhì)，包括充分表征的酵母解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)?？赏ㄟ^增量調(diào)節(jié)、減量調(diào)節(jié)或缺失涉及脂質(zhì)途徑的基因，來提高產(chǎn)油生物的脂質(zhì)生產(chǎn)。最新數(shù)據(jù)表明二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶蛋白DGA1的活性可能是在產(chǎn)油生物中積累高水平脂質(zhì)的重要因素。例如，據(jù)報告，解脂耶氏酵母中天然解脂耶氏酵母二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶蛋白DGA1的增量調(diào)節(jié)顯著提高其脂質(zhì)產(chǎn)量和產(chǎn)率(MetabolicEngineering15:1-9(2013))。解脂耶氏酵母DGA1蛋白是由解脂耶氏酵母二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因DGAT2編碼的2型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶。DGA1是脂質(zhì)途徑中的關(guān)鍵酶之一，參與三酰甘油(“TAG”)合成的最后步驟。三酰甘油是解脂耶氏酵母中貯存脂質(zhì)的主要形式。酵母還含有1型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因DGAT1，其編碼DGA2蛋白?？蓪⒍８视王；D(zhuǎn)移酶基因?qū)胨拗骰蚪M以影響脂質(zhì)生產(chǎn)和組成，包括來自其它生物的DGA1和DGA2基因。例如其它產(chǎn)油酵母，例如圓紅冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)和斯達氏油脂酵母(Lipomycesstarkeyi)能夠比野生型解脂耶氏酵母菌株積累顯著更多的脂質(zhì)，且與天然解脂耶氏酵母DGA1的過量表達相比，來自具有較高天然脂質(zhì)生產(chǎn)水平的生物的DGA1蛋白的表達對解脂耶氏酵母脂質(zhì)生產(chǎn)具有更大作用(USSN61/943,664和PCT專利申請?zhí)朠CT/US15/017227；通過引用結(jié)合到本文中)。此外，已缺失參與脂質(zhì)分解或參與從脂質(zhì)生物合成中流出的途徑的基因以提高細胞的脂質(zhì)含量。例如，Dulermo等人證實三酰甘油脂肪酶基因TGL3的缺失使由解脂耶氏酵母積累的總脂質(zhì)含量幾乎翻倍(BiochimicaBiophysicaActa1831:1486-95(2013))。然而，功能性酶的成功的增量調(diào)節(jié)大多是不可預(yù)測的。例如，其它實驗表明表達來自高山被孢霉(Mortierellaalpine)的DGA1對解脂耶氏酵母脂質(zhì)含量沒有顯著作用(美國專利7,198,937；通過引用結(jié)合到本文中)。同樣，已表明在不存在其它遺傳修飾時表達DGA2對酵母的脂質(zhì)含量沒有顯著作用。發(fā)明概述在一些實施方案中，本發(fā)明涉及包含第一遺傳修飾和第二遺傳修飾的轉(zhuǎn)化細胞，其中所述第一遺傳修飾提高天然1型二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶的活性或編碼至少一個拷貝的對細胞是天然的或來自不同物種的1型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因，且所述第二遺傳修飾提高天然2型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶的活性或編碼至少一個拷貝的對細胞是天然的或來自不同物種的2型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細胞包含第三遺傳修飾，其中所述第三遺傳修飾降低細胞中三酰甘油脂肪酶的活性。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及包含遺傳修飾的轉(zhuǎn)化細胞，其中所述遺傳修飾提高天然1型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶的活性或編碼至少一個拷貝的對細胞是天然的或來自不同物種的1型二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶基因。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及包含遺傳修飾的轉(zhuǎn)化細胞，其中所述遺傳修飾提高天然3型二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶的活性或編碼至少一個拷貝的對細胞是天然的或來自不同物種的3型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因。在某些方面，本發(fā)明提供增加細胞的脂質(zhì)含量的方法，所述方法包括用第一核苷酸序列和第二核苷酸序列轉(zhuǎn)化親本細胞，其中所述第一核苷酸序列提高天然1型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶的活性或編碼至少一個拷貝的1型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因，且所述第二核苷酸序列提高天然2型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶的活性或編碼至少一個拷貝的2型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因。在一些實施方案中，所述方法包括用第三核苷酸序列轉(zhuǎn)化親本細胞，其中所述第三核苷酸序列降低三酰甘油脂肪酶的活性。上述方法還可用來改變細胞的脂質(zhì)組成。在某些方面，本發(fā)明提供增加細胞的脂質(zhì)含量的方法，所述方法包括用核苷酸序列轉(zhuǎn)化親本細胞，其中所述核苷酸序列提高天然1型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶的活性或編碼至少一個拷貝的1型二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶基因。上述方法還可用來改變細胞的脂質(zhì)組成。在某些方面，本發(fā)明提供增加細胞的脂質(zhì)含量的方法，所述方法包括用核苷酸序列轉(zhuǎn)化親本細胞，其中所述核苷酸序列提高天然3型二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶的活性或編碼至少一個拷貝的3型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因。上述方法還可用來改變細胞的脂質(zhì)組成。在某些方面，本發(fā)明提供增加細胞的三酰甘油含量的方法，所述方法包括：(a)提供包含以下的細胞：(i)第一遺傳修飾，其中所述第一遺傳修飾提高天然1型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶的活性或編碼至少一個拷貝的對細胞是天然的或來自不同物種的1型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因；和(ii)第二遺傳修飾，其中所述第二遺傳修飾提高天然2型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶的活性或編碼至少一個拷貝的對細胞是天然的或來自不同物種的2型二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶基因；(b)使所述細胞在表達第一和第二遺傳修飾的條件下生長，從而產(chǎn)生三酰甘油；和(c)任選回收三酰甘油。在一些實施方案中，細胞包含第三遺傳修飾，其中所述第三遺傳修飾降低細胞中三酰甘油脂肪酶的活性。上述方法還可用來改變細胞的脂質(zhì)組成。在某些方面，本發(fā)明提供增加細胞的三酰甘油含量的方法，所述方法包括：(a)提供包含遺傳修飾的細胞，其中所述遺傳修飾提高天然1型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶的活性或編碼至少一個拷貝的對細胞是天然的或來自不同物種的1型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因；(b)使所述細胞在表達該遺傳修飾的條件下生長，從而產(chǎn)生三酰甘油；和(c)任選回收三酰甘油。在某些方面，本發(fā)明提供增加細胞的三酰甘油含量的方法，所述方法包括：(a)提供包含遺傳修飾的細胞，其中所述遺傳修飾提高天然3型二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶的活性或編碼至少一個拷貝的對細胞是天然的或來自不同物種的3型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因；(b)使所述細胞在表達該遺傳修飾的條件下生長，從而產(chǎn)生三酰甘油；和(c)任選回收三酰甘油。附圖簡述圖1表示用于在解脂耶氏酵母菌株NS18(獲自ARSCultureCollection，NRRL#YB392)中表達二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶DGA1基因NG66的pNC243構(gòu)建體的圖。在轉(zhuǎn)化前通過PacI/NotI限制酶切消化使載體pNC243線性化?！?uori”表示來自2μm圓形質(zhì)粒的釀酒酵母(S.cerevisiae)復(fù)制起點；“pMB1ori”表示來自pBR322質(zhì)粒的大腸桿菌(E.coli)pMB1復(fù)制起點；“AmpR”表示用作用氨芐西林選擇的標記的bla基因；“PR2”表示解脂耶氏酵母GPD1啟動子-931至-1；“NG66”表示通過GenScript合成的天然圓紅冬孢酵母DGA1cDNA；“TER1”表示在終止(stop)后的解脂耶氏酵母CYC1終止子300個堿基對；“PR22”表示釀酒酵母TEF1啟動子-412至-1；“NG3”表示用作用諾爾絲菌素選擇的標記的諾爾斯鏈霉菌(Streptomycesnoursei)Nat1基因；“TER2”表示在終止后的釀酒酵母CYC1終止子275個堿基對；“ScURA3”表示用于在酵母中選擇的釀酒酵母URA3營養(yǎng)缺陷型標記。圖2表示用于在解脂耶氏酵母菌株NS18中過量表達NG15基因(YlDga1)的pNC104構(gòu)建體的圖。在轉(zhuǎn)化前通過PacI/NotI限制酶切消化使載體pNC104線性化。“2uori”表示來自2μm圓形質(zhì)粒的釀酒酵母復(fù)制起點；“pMB1ori”表示來自pBR322質(zhì)粒的大腸桿菌pMB1復(fù)制起點；“AmpR”表示用作用氨芐西林選擇的標記的bla基因；“ScGPM1p”表示解脂耶氏酵母GPD1啟動子-764至-1；“hygR”表示用作用潮霉素B選擇的標記的大腸桿菌hph基因表達盒；“ScGPM1t”表示在終止密碼子后的釀酒酵母GPD1終止子406bp；“ARS68”和“CEN1-1”表示解脂耶氏酵母染色體復(fù)制起點；“YlTEF1p”表示解脂耶氏酵母TEF啟動子-406至+125；“YlDGA1”表示解脂耶氏酵母DGA1基因ORF(NG15)；“YlCYC1t”表示在終止后的解脂耶氏酵母CYC1終止子300個堿基對；“ScTEF1p”表示釀酒酵母TEF1啟動子-412至-1；“NAT”表示用作用諾爾絲菌素選擇的標記的諾爾斯鏈霉菌Nat1基因；“ScCYC1t”表示在終止后的釀酒酵母CYC1終止子275個堿基對；“URA3p-ScURA3-URA3t”表示用于在酵母中選擇的釀酒酵母URA3營養(yǎng)缺陷型標記。圖3表示用于在解脂耶氏酵母中表達NG112基因(麥角菌(C.purpurea)DGA2)的pNC327構(gòu)建體的圖。在轉(zhuǎn)化前通過PacI/AscI限制酶切消化使載體pNC327線性化?！?uori”表示來自2μm圓形質(zhì)粒的釀酒酵母復(fù)制起點；“pMB1ori”表示來自pBR322質(zhì)粒的大腸桿菌pMB1復(fù)制起點；“AmpR”表示用作用氨芐西林選擇的標記的bla基因；“PR3”表示解脂耶氏酵母TEF1啟動子-406至+125；“NG112”表示通過GenScript合成的麥角菌DGA2基因；“TER1”表示在終止后的解脂耶氏酵母CYC1終止子300bp；“PR1”表示解脂耶氏酵母TEF1啟動子-406至-1；“NG76”表示用作用Zeocin選擇的標記的印度斯坦鏈異壁菌(Streptoalloteichushindustanus)BLE基因；“TER7”表示在終止后的解脂耶氏酵母TEF1終止子400bp；和“ScURA3”表示用于在酵母中選擇的釀酒酵母URA3營養(yǎng)缺陷型標記。圖4包括標記為(A)、(B)和(C)的3個子圖。該圖表示針對解脂耶氏酵母菌株NS297、NS281、NS450、NS377和NS432通過基于熒光的測定法測量的脂質(zhì)蓄積或通過氣相色譜法測量的細胞干重百分比。NS297表達額外拷貝的解脂耶氏酵母DGA1；NS281表達圓紅冬孢酵母DGA1；NS450表達圓紅冬孢酵母DGA1和麥角菌DGA2；NS377表達圓紅冬孢酵母DGA1并攜帶解脂耶氏酵母TGL3的缺失；NS432表達圓紅冬孢酵母DGA1和麥角菌DGA2并攜帶解脂耶氏酵母TGL3的缺失。在子圖(A)中，在48孔板中發(fā)酵96小時后，通過熒光測定法分析菌株，其中分析各構(gòu)建體的2個或3個轉(zhuǎn)化株。在子圖(B)中，在50-mL長頸瓶中發(fā)酵96小時后，通過熒光測定法和氣相色譜法分析菌株。在子圖(C)中，在1-L生物反應(yīng)器中發(fā)酵140小時后，通過氣相色譜法分析菌株。NS281、NS377和NS432的數(shù)據(jù)是獲自一式兩份生物反應(yīng)器發(fā)酵的平均數(shù)。NS450的數(shù)據(jù)表示獲自單個生物反應(yīng)器發(fā)酵的值。圖5表示用于在A.adeninivorans菌株NS252(ATCC76597)中過量表達NG167基因(AaDga1)的pNC363構(gòu)建體的圖。在轉(zhuǎn)化前通過PmeI/AscI限制酶切消化使載體pNC363線性化?！?uori”表示來自2μm圓形質(zhì)粒的釀酒酵母復(fù)制起點；“pMB1ori”表示來自pBR322質(zhì)粒的大腸桿菌pMB1復(fù)制起點；“AmpR”表示用作用氨芐西林選擇的標記的bla基因；“ScURA3”表示用于在酵母中選擇的釀酒酵母URA3營養(yǎng)缺陷型標記；“PR26PGK1p”表示A.adeninivoransPGK1啟動子-524至-1；“NG3NatR”表示用作用諾爾絲菌素選擇的標記的諾爾斯鏈霉菌Nat1基因；“ScFBA1t”表示在終止后的釀酒酵母FBA1終止子205bp；“PR25AaADH1p”表示A.adeninivoransADH1啟動子-877至-1；“NG167AaDGA1”表示A.adeninivoransDGA1基因ORF(NG167)；“TER16CYC1t”表示在終止密碼子后的A.adeninivoransCYC1終止子301bp。圖6包括標示為“板1”、“板2”、“板3”和“板4”的4張圖。各圖顯示基于熒光的脂質(zhì)測定法的結(jié)果，其中485nm/510nm處的熒光/600nm處的吸光度與細胞的脂質(zhì)含量相關(guān)。x軸標記對應(yīng)于用于下表2中界定的轉(zhuǎn)化細胞的DGA表達構(gòu)建體。對于各表達構(gòu)建體，分析了8個轉(zhuǎn)化株。NG168，其相當(dāng)于A.adeninivoransDGA2基因，被作用陽性對照。來自解脂耶氏酵母(NG16)和球毛殼(Chaetomiumglobosum)(NG113)的DGA2顯示對脂質(zhì)含量的最顯著的作用。圖7是用于在解脂耶氏酵母菌株NS598中表達NG288基因的pNC507載體的圖。在轉(zhuǎn)化前通過PmeI/AscI限制酶切消化使載體pNC507線性化?！?uori”表示來自2μm圓形質(zhì)粒的釀酒酵母復(fù)制起點；“PR3”表示解脂耶氏酵母TEF1啟動子-406至+125；“NG102”表示編碼轉(zhuǎn)化酶的釀酒酵母SUC2基因；“TER2”表示在終止后的釀酒酵母CYC1終止子275bp；“PR4”表示解脂耶氏酵母EXP1啟動子-999至-1；“NG288”表示通過GenScript合成的禾柄銹菌(Pucciniagraminis)DGA1cDNA；“TER1”表示在終止后的解脂耶氏酵母CYC1終止子300bp；“pMB1ori”表示來自pBR322質(zhì)粒的大腸桿菌pMB1復(fù)制起點；“AmpR”表示用作用氨芐西林選擇的標記的bla基因。圖8包括標示為“板1”、“板2”和“板3”的3張圖。各圖顯示基于熒光的脂質(zhì)測定法的結(jié)果，其中485nm/510nm處的熒光/600nm處的吸光度與細胞的脂質(zhì)含量相關(guān)。x軸標記對應(yīng)于用于下表2中界定的轉(zhuǎn)化細胞的DGA表達構(gòu)建體。對于各表達構(gòu)建體，分析了8個轉(zhuǎn)化株。親本菌株NS598被用作陰性對照。發(fā)明詳述概述公開了用于產(chǎn)生其三酰甘油含量增加的轉(zhuǎn)化細胞的方法和組合物。表達2型二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶DGA1增加可合成三酰甘油的蛋白質(zhì)的量，并且在解脂耶氏酵母細胞中表達來自圓紅冬孢酵母的DGA1蛋白有效增加細胞的三酰甘油含量(USSN61/943,664和PCT專利申請?zhí)朠CT/US15/017227；通過引用結(jié)合到本文中)。1型二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶DGA2也可催化三酰甘油的合成，且相對于僅DGA1，仔細選擇的DGA1和DGA2轉(zhuǎn)基因的表達可進一步增加產(chǎn)油細胞的脂質(zhì)含量。具體地講，表達來自圓紅冬孢酵母的DGA1和來自麥角菌的DGA2的解脂耶氏酵母產(chǎn)生高的三酰甘油產(chǎn)量。最后，三酰甘油脂肪酶催化三酰甘油的降解，因此，三酰甘油脂肪酶的減量調(diào)節(jié)可增加細胞的三酰甘油含量。具體地講，含有TGL3敲除和表達來自圓紅冬孢酵母的DGA1的解脂耶氏酵母細胞產(chǎn)生比表達DGA1的對照高的三酰甘油產(chǎn)量(USSN61/987,098和PCT專利申請?zhí)朠CT/US15/28760；通過引用結(jié)合到本文中)。DGA1和DGA2表達與TGL3減量調(diào)節(jié)的組合可進一步提高三酰甘油產(chǎn)量。DGA1和DGA2的同時表達伴以TGL3的減量調(diào)節(jié)可能是增加細胞的三酰甘油含量的有吸引力的方法；然而，影響代謝途徑的蛋白質(zhì)的操作大多是不可預(yù)測的。例如，解脂耶氏酵母中僅天然DGA2的過量表達不提高細胞的脂質(zhì)生產(chǎn)效率，而DGA1增加脂質(zhì)產(chǎn)量。DGA2定位于ER中，并在新形成的脂質(zhì)小體中合成三酰甘油。相比之下，DGA1定位于脂質(zhì)小體膜上，并在這些脂質(zhì)小體內(nèi)合成三酰甘油。未充分了解這種區(qū)別或一些其它差異是否影響細胞抑制遺傳修飾的作用的能力。因此，不會預(yù)期與含有一種或兩種遺傳修飾的那些細胞相比，DGA1和DGA2表達與TGL3敲除的組合產(chǎn)生具有更高脂質(zhì)含量的細胞。公開了增加細胞的三酰甘油含量的DGA1和DGA2表達和TGL3減量調(diào)節(jié)的成功組合。例如，含有TGL3敲除并表達來自圓紅冬孢酵母的DGA1和來自麥角菌的DGA2的解脂耶氏酵母菌株產(chǎn)生高的三酰甘油產(chǎn)量。定義冠詞“a”和“an”在本文用來指冠詞的語法客體的一個或一個以上(即是指至少一個)。舉例來說，“一個要素”意指一個要素或超過一個要素。術(shù)語“活性”是指細胞執(zhí)行功能的總能力。例如，降低細胞中的三酰甘油脂肪酶的活性的遺傳修飾可減少細胞中三酰甘油脂肪酶的量或降低三酰甘油脂肪酶的效率。三酰甘油脂肪酶敲除減少細胞中三酰甘油脂肪酶的量?；蛘撸８视椭久富虻耐蛔兛山档推淙８视椭久傅鞍桩a(chǎn)物的效率，而對細胞三酰甘油脂肪酶的量幾乎沒有作用。降低三酰甘油脂肪酶的效率的突變，例如通過改變一個或多個活性部位殘基，可影響活性部位；例如通過在空間上封閉底物或產(chǎn)物，它們可損害酶的動力學(xué)；例如通過降低正確折疊的酶的比例，它們可影響蛋白質(zhì)折疊或動力學(xué)；例如通過防止脂肪酶定位于脂質(zhì)顆粒，它們可影響蛋白質(zhì)定位；或例如通過加入一個或多個蛋白質(zhì)切割位點或通過加入使蛋白質(zhì)以蛋白水解為目標的一個或多個殘基或氨基酸序列，它們可影響蛋白質(zhì)降解。這些突變影響編碼區(qū)。降低三酰甘油脂肪酶活性的突變可代替影響基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯。例如，三酰甘油脂肪酶增強子或啟動子的突變可通過降低其表達而降低三酰甘油脂肪酶活性。使三酰甘油脂肪酶基因的非編碼部分(例如其內(nèi)含子)突變或缺失也可降低轉(zhuǎn)錄或翻譯。此外，三酰甘油脂肪酶的上游調(diào)節(jié)子的突變可影響三酰甘油脂肪酶活性；例如，一個或多個阻遏物的過量表達可降低三酰甘油脂肪酶活性，而一個或多個激活物的敲除或突變同樣可降低三酰甘油脂肪酶活性。提高細胞中二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶的活性的遺傳修飾可增加細胞中三酰甘油?；D(zhuǎn)移酶的量或提高二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶的效率。例如，遺傳修飾可簡單地將額外拷貝的二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶插入細胞中，使得額外的拷貝轉(zhuǎn)錄并翻譯成額外的功能性二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶。所加入的二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因?qū)λ拗魃锟蔀樘烊坏幕騺碜圆煌纳??；蛘?，使天然二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因的非編碼部分(例如其內(nèi)含子)突變或缺失也可增加翻譯。可通過加入引起更多轉(zhuǎn)錄的新的啟動子，來改變天然二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因。同樣，可將增強子加入二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶基因中以增加轉(zhuǎn)錄，或可使沉默子突變或從二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因中缺失以增加轉(zhuǎn)錄。天然基因的編碼區(qū)的突變也可通過例如產(chǎn)生不與抑制性蛋白質(zhì)或分子相互作用的蛋白質(zhì)變體，來提高二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶活性。一個或多個激活物的過量表達可通過增加二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶蛋白的表達，來提高二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶活性，而一個或多個阻遏物的敲除或突變同樣可提高二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶活性。術(shù)語“生物活性部分”是指小于全長氨基酸序列、但顯示全長序列的至少一種活性的氨基酸序列。例如，二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶的生物活性部分可指具有將?；o酶A和二酰甘油轉(zhuǎn)化成三酰甘油的生物活性的DGA1或DGA2的一個或多個結(jié)構(gòu)域。DGA1蛋白的生物活性部分包括包含以下氨基酸序列的肽或多肽：充分類似于或來源于DGA1蛋白的氨基酸序列，例如SEQIDNO:15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、51、53、55、57、59、61、63、65、67和69所示氨基酸序列，其包括比全長DGA1少的氨基酸，并顯示DGA1蛋白的至少一種活性。同樣，DGA2蛋白的生物活性部分包括包含以下氨基酸序列的肽或多肽：充分類似于或來源于DGA2蛋白的氨基酸序列，例如SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、71、73、75、77、79、81和83所示氨基酸序列，其包括比全長DGA2少的氨基酸，并顯示DGA2蛋白的至少一種活性。同樣，DGA3蛋白的生物活性部分包括包含以下氨基酸序列的肽或多肽：充分類似于或來源于DGA3蛋白的氨基酸序列，例如SEQIDNO:87和89所示氨基酸序列，其包括比全長DGA3少的氨基酸，并顯示DGA3蛋白的至少一種活性。二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶的生物活性部分可包含例如100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695或696個氨基酸。通常，生物活性部分包含具有將?；o酶A和二酰甘油轉(zhuǎn)化為三酰甘油的催化活性的結(jié)構(gòu)域或基序。DGA1蛋白的生物活性部分可以是長為例如262個氨基酸的多肽。術(shù)語“DGAT1”是指編碼1型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶蛋白的基因，例如編碼DGA2蛋白的基因。術(shù)語“DGAT2”是指編碼2型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶蛋白的基因，例如編碼DGA1蛋白的基因。術(shù)語“DGAT3”是指編碼3型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶蛋白的基因，例如編碼DGA3蛋白的基因?！岸８视王ァ?、“二酰甘油”和“甘油二酯”是由甘油和2個脂肪酸組成的酯。術(shù)語“二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶”和“DGA”是指催化從二酰甘油形成三酰甘油酯的任何蛋白質(zhì)。二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶包括1型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(DGA2)、2型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(DGA1)和3型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(DGA3)和催化上述反應(yīng)的所有同系物。術(shù)語“二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶，1型”和“1型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶”是指DGA2和DGA2直向同源物(ortholog)。術(shù)語“二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶，2型”和“2型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶”是指DGA1和DGA1直向同源物。術(shù)語“二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶，3型”和“3型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶”是指DGA1和DGA1直向同源物。術(shù)語“結(jié)構(gòu)域”是指能夠折疊成獨立于蛋白質(zhì)其余部分的穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)氨基酸序列的一部分。術(shù)語“藥物”是指抑制細胞生長或增殖，從而提供對含有賦予藥物抗性的基因的細胞選擇優(yōu)勢的任何分子。藥物包括抗生素、抗微生物藥、毒素和殺蟲藥?！案芍亍焙汀案杉毎亓俊币庵冈谙鄬θ狈λ畷r測定的重量。例如，提及產(chǎn)油細胞為包含以干重計規(guī)定百分比的具體組分，意指百分比根據(jù)除去基本上全部水分后細胞的重量計算。術(shù)語“編碼”是指包含編碼區(qū)、編碼區(qū)的一部分或其互補序列的核酸。DNA和RNA兩者可編碼基因。DNA和RNA兩者可編碼蛋白質(zhì)。術(shù)語“外源的”是指導(dǎo)入細胞的任何東西?！巴庠春怂帷笔峭ㄟ^細胞膜進入細胞的核酸。外源核酸可含有存在于細胞的天然基因組的核苷酸序列和/或之前不存在于細胞基因組的核苷酸序列。外源核酸包括外源基因?！巴庠椿颉笔蔷幋a已導(dǎo)入細胞(例如通過轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染)的RNA和/或蛋白質(zhì)的表達的核酸，亦稱為“轉(zhuǎn)基因”。包含外源基因的細胞可稱為重組細胞，可向其中導(dǎo)入其它的外源基因。外源基因可來自相對于轉(zhuǎn)化的細胞是相同或不同的物種。因此，相對于內(nèi)源的基因拷貝，外源基因可包括占據(jù)細胞基因組中的不同位置或在不同控制下的天然基因。外源基因可以一個以上拷貝存在于細胞中。外源基因可作為基因組的插入物(核或質(zhì)體)或作為附加型分子保持在細胞中。術(shù)語“表達”是指細胞中核酸或氨基酸序列(例如肽、多肽或蛋白質(zhì))的量?；虻谋磉_增加是指該基因的轉(zhuǎn)錄增加。氨基酸序列、肽、多肽或蛋白質(zhì)的表達增加是指編碼氨基酸序列、肽、多肽或蛋白質(zhì)的核酸的翻譯增加。本文所用術(shù)語“基因”可包括含有外顯子，具體地說編碼參與特定活性的多肽序列的多核苷酸序列的基因組序列。該術(shù)語進一步包括非來源于基因組序列的合成核酸。在某些實施方案中，基因缺乏內(nèi)含子，因為它們根據(jù)cDNA和蛋白質(zhì)序列的已知DNA序列合成。在其它實施方案中，基因是合成的非天然cDNA，其中密碼子根據(jù)密碼子使用經(jīng)優(yōu)化以在解脂耶氏酵母中表達。該術(shù)語可進一步包括包含上游、下游和/或內(nèi)含子核苷酸序列的核酸分子。術(shù)語“遺傳修飾”是指轉(zhuǎn)化的結(jié)果。根據(jù)定義每次轉(zhuǎn)化引起遺傳修飾。本文所用術(shù)語“同系物”是指(a)相對于所討論的未修飾蛋白質(zhì)具有氨基酸取代、缺失和/或插入且具有與其來源于其中的未修飾蛋白質(zhì)類似的生物和功能活性的肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)和酶，和(b)編碼具有(a)中描述的相同特性的肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)和酶的核酸?！罢T導(dǎo)型啟動子”是介導(dǎo)有效連接的基因在響應(yīng)特定刺激時轉(zhuǎn)錄的啟動子。術(shù)語“整合”是指作為細胞的基因組的插入物(例如染色體的插入，包括質(zhì)體基因組的插入物)而在細胞中保持的核酸?！俺视行нB接”是指2個核酸序列，例如控制序列(通常為啟動子)和連接序列(通常為編碼蛋白質(zhì)的序列，亦稱編碼序列)之間的功能連接。啟動子如果可介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄，則它與基因有效連接。術(shù)語“敲除突變”或“敲除”是指防止天然基因轉(zhuǎn)錄和翻譯成功能蛋白質(zhì)的遺傳修飾。術(shù)語“天然”是指轉(zhuǎn)化事件前的細胞或親本細胞的組成?！疤烊换颉笔侵妇幋a不是通過轉(zhuǎn)化事件導(dǎo)入細胞的蛋白質(zhì)的核苷酸序列。“天然蛋白質(zhì)”是指由天然基因編碼的氨基酸序列。術(shù)語“核酸”是指任何長度的核苷酸(脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其類似物)的多聚形式。多核苷酸可具有任何三維結(jié)構(gòu)，并可執(zhí)行任何功能。以下是多核苷酸的非限制性實例：基因或基因片段的編碼或非編碼區(qū)、自連鎖分析界定的基因座(loci/locus)、外顯子、內(nèi)含子、信使RNA(mRNA)、轉(zhuǎn)移RNA、核糖體RNA、核酶、cDNA、重組多核苷酸、支鏈多核苷酸、質(zhì)粒、載體、任何序列的分離的DNA、任何序列的分離的RNA、核酸探針和引物。多核苷酸可包括修飾的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸類似物。核苷酸結(jié)構(gòu)的修飾如存在，則可在聚合物裝配之前或之后賦予。例如可通過與標記組分綴合，進一步修飾多核苷酸。在本文提供的所有核酸序列中，U核苷酸與T核苷酸可互換使用。術(shù)語“親本細胞”是指細胞從其中傳下來的每個細胞。細胞的基因組由親本細胞的基因組和對親本細胞基因組的任何后續(xù)遺傳修飾組成。本文所用術(shù)語“質(zhì)?！笔侵肝锢砩吓c生物基因組DNA分離的環(huán)狀DNA分子?？稍趯?dǎo)入宿主細胞之前使質(zhì)粒線性化(本文稱為線性化質(zhì)粒)。線性化質(zhì)粒可能不是自我復(fù)制的，但可整合至生物基因組DNA中并與之一起復(fù)制。術(shù)語“部分”是指肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域和蛋白質(zhì)。編碼“蛋白質(zhì)的部分”的核苷酸序列包括可轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的核苷酸序列和必須進行待轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的一個或多個重組事件的核苷酸序列兩者。例如，核酸可包含編碼選擇標記蛋白質(zhì)的一個或多個氨基酸的核苷酸序列。可對該核酸進行改造以與編碼該蛋白質(zhì)的其余部分的一個或多個不同的核苷酸序列重組。這類核酸可用于產(chǎn)生敲除突變，因為僅與靶序列重組可能重新構(gòu)成全長選擇標記基因，而隨機整合事件不可能導(dǎo)致可產(chǎn)生功能標志蛋白質(zhì)的核苷酸序列。多肽的“生物活性部分”是存在于小于全長氨基酸序列但可執(zhí)行與全長多肽相同的功能的多肽的氨基酸序列中的任何氨基酸序列。二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶的生物活性部分包括存在于可催化從二酰甘油和酰基輔酶A形成三酰甘油的全長二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶中的任何氨基酸序列。多肽的生物活性部分包括具有與全長肽相同活性的多肽的部分和具有比背景多的活性的每個部分。例如，相對于全長多肽，二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶的生物活性部分可具有0.1、0.5、1、2、3、4、5、10、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9、100、100.1、100.2、100.3、100.4、100.5、100.6、100.7、100.8、100.9、101、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、160、170、180、190、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400%活性或更高。多肽的生物活性部分可包括缺乏將多肽靶向細胞區(qū)室的結(jié)構(gòu)域的肽的部分?！皢幼印笔侵笇?dǎo)核酸轉(zhuǎn)錄的核酸控制序列。如本文所用，啟動子包括轉(zhuǎn)錄起始位點附近的必需核酸序列。啟動子還任選包括遠端增強子或阻遏物元件，其可位于距轉(zhuǎn)錄起始位點多達幾千個堿基對?！爸亟M”是指由于導(dǎo)入外源核酸或改變天然核酸而被修飾的細胞、核酸、蛋白質(zhì)或載體。因此，例如，重組細胞可表達不存在于天然(非重組)形式的細胞內(nèi)的基因或表達不同于由非重組細胞表達的那些基因的天然基因。重組細胞可包括而不限于編碼基因產(chǎn)物或編碼降低細胞中的活性基因產(chǎn)物水平的抑制元件(例如突變、敲除、反義、干擾RNA(RNAi)或dsRNA)的重組核酸?！爸亟M核酸”是一般而言使用例如聚合酶、連接酶、外切核酸酶和內(nèi)切核酸酶通過核酸操作最初在體外形成的核酸，或否則為正常不存在于自然界的形式。重組核酸可通過例如將兩個或更多個核酸置于有效連接中來產(chǎn)生。因此，通過連接在自然界通常不連接的DNA分子在體外形成的分離的核酸或表達載體均被視為重組用于本發(fā)明的目的。重組核酸一旦制備并導(dǎo)入宿主細胞或生物中，它便可利用宿主細胞的體內(nèi)細胞機器復(fù)制；然而，這類核酸一旦重組產(chǎn)生，雖然隨后在胞內(nèi)復(fù)制，但仍視為重組用于本發(fā)明的目的。同樣，“重組蛋白”是采用重組技術(shù)，即通過重組核酸的表達制備的蛋白質(zhì)。術(shù)語“調(diào)節(jié)區(qū)”是指影響基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯但不編碼氨基酸序列的核苷酸序列。調(diào)節(jié)區(qū)包括啟動子、操縱基因、增強子和沉默子?！稗D(zhuǎn)化”是指將核酸轉(zhuǎn)移到宿主生物或宿主生物的基因組中，導(dǎo)致遺傳學(xué)上穩(wěn)定的遺傳。含有轉(zhuǎn)化的核酸片段的宿主生物稱為“重組”、“轉(zhuǎn)基因的”或“轉(zhuǎn)化的”生物。因此，可將本發(fā)明的分離多核苷酸摻入到能夠?qū)胨拗骷毎胁⒃谄渲袕?fù)制的重組構(gòu)建體(通常為DNA構(gòu)建體)中。所述構(gòu)建體可以是包括能夠在指定宿主細胞中轉(zhuǎn)錄和翻譯多肽編碼序列的復(fù)制系統(tǒng)和序列的載體。通常，表達載體包括例如在5'和3'調(diào)節(jié)序列的轉(zhuǎn)錄控制下的一個或多個克隆基因和選擇標記。所述載體還可含有啟動子調(diào)節(jié)區(qū)(例如控制誘導(dǎo)型或構(gòu)成型的、環(huán)境或發(fā)育調(diào)節(jié)的或位點特異性表達的調(diào)節(jié)區(qū))、轉(zhuǎn)錄起始位點、核糖體結(jié)合位點、轉(zhuǎn)錄終止位點和/或多腺苷酸化信號。術(shù)語“轉(zhuǎn)化細胞”是指已進行轉(zhuǎn)化的細胞。因此，轉(zhuǎn)化細胞包含親本基因組和可遺傳的遺傳修飾。術(shù)語“三酰甘油酯”、“三酰甘油”、“甘油三酯”和“TAG”是由甘油和3個脂肪酸組成的酯。術(shù)語“三酰甘油脂肪酶”是指可催化從三酰甘油上脫去脂肪酸鏈的任何蛋白質(zhì)。三酰甘油脂肪酶包括TGL3、TGL4和TGL3/4。術(shù)語“載體”是指核酸可籍此增殖和/或在生物、細胞或細胞組分間轉(zhuǎn)移的工具。載體包括能夠或不能自主復(fù)制或整合到宿主細胞染色體中的質(zhì)粒、線性DNA片段、病毒、噬菌體、原病毒、噬菌粒、轉(zhuǎn)座子和人工染色體等。微生物工程改造A.概述在某些實施方案中，本發(fā)明涉及經(jīng)遺傳修飾以增加其三酰甘油含量或改變其脂質(zhì)概況的微生物。可將基因和基因產(chǎn)物導(dǎo)入微生物宿主細胞中。用于表達基因和核酸分子的合適的宿主細胞是廣泛存在于真菌或細菌科內(nèi)的微生物宿主。合適宿主菌株的實例包括但不限于真菌或酵母菌種，例如Arxula、曲霉屬(Aspergillus)、Aurantiochytrium、假絲酵母屬(Candida)、麥角菌屬(Claviceps)、隱球菌屬(Cryptococcus)、小克銀漢霉屬(Cunninghamella)、地霉屬(Geotrichum)、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、Kodamaea、白冬孢酵母屬(Leucosporidiella)、油脂酵母屬(Lipomyces)、被孢霉屬(Mortierella)、Ogataea、畢赤酵母屬(Pichia)、原壁菌屬(Prototheca)、根霉屬(Rhizopus)、紅冬孢酵母屬(Rhodosporidium)、紅酵母屬(Rhodotorula)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、銀耳屬(Tremella)、絲孢酵母屬(Trichosporon)、Wickerhamomyces、耶氏酵母屬(Yarrowia)或細菌菌種，例如變形菌和放線菌的成員以及以下屬：不動桿菌屬(Acinetobacter)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、短桿菌屬(Brevibacterium)、食酸菌屬(Acidovorax)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、梭菌屬(Clostridia)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、埃希氏菌屬(Escherichia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和棒桿菌屬(Cornyebacterium)。解脂耶氏酵母和Arxulaadeninivorans充分適合用作宿主微生物，因為它們可積累其重量的大部分作為三酰甘油。含有指導(dǎo)外源蛋白高水平表達的調(diào)節(jié)序列的微生物表達系統(tǒng)和表達載體為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。這些的任一種可用于構(gòu)建嵌合基因以產(chǎn)生本發(fā)明序列的基因產(chǎn)物的任一種。然后可通過轉(zhuǎn)化技術(shù)將這些嵌合基因?qū)牒线m的微生物中以產(chǎn)生高水平表達的酶。例如，可在合適的質(zhì)粒中克隆編碼酶的基因，且作為宿主的前述起始親本菌株可用所得質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。該方法可增加編碼酶的每個基因的拷貝數(shù)，因此，可提高酶的活性。質(zhì)粒不受特別限制，只要它賦予微生物子代所需的可遺傳的遺傳修飾?？捎糜谵D(zhuǎn)化合適宿主細胞的載體或盒是本領(lǐng)域眾所周知的。通常載體或盒含有指導(dǎo)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列、選擇標記和允許自主復(fù)制或染色體整合的序列。合適的載體包含帶有轉(zhuǎn)錄起始控制的基因的區(qū)域5'和控制轉(zhuǎn)錄終止的DNA片段的區(qū)域3'。2個控制區(qū)可來源于與轉(zhuǎn)化的宿主細胞同源的基因，雖然要了解所述控制區(qū)不一定來源于對選擇作為生產(chǎn)宿主的具體物種是天然的基因?？墒褂脧奶烊粊碓捶蛛x的片段，通過克隆技術(shù)產(chǎn)生啟動子、cDNA和3'UTR以及載體的其它元件(Greent和Sambrook，MolecularCloning:ALaboratoryManual，(第4版，2012)；美國專利號4,683,202；通過引用結(jié)合到本文中)?；蛘?，元件可采用已知方法經(jīng)合成產(chǎn)生(Gene164:49-53(1995))。B.同源重組同源重組是互補DNA序列與同源物的區(qū)域?qū)R并與之交換的能力。將含有與被靶向的基因組序列(“模板”)同源的序列的轉(zhuǎn)基因DNA(“供體”)導(dǎo)入生物中，然后在相應(yīng)的同源基因組序列的位點上進行重組進入基因組。在宿主生物中進行同源重組的能力具有許多可在分子遺傳水平上針對其進行的實用意義，并可用于形成生產(chǎn)所需產(chǎn)物的微生物。通過其特殊的性質(zhì)，同源重組是精確的基因打靶事件，因此，用相同的打靶序列產(chǎn)生的大多數(shù)轉(zhuǎn)基因系就其表型而言可基本上相同，需要篩選少得多的轉(zhuǎn)化事件。同源重組還將基因插入事件靶向宿主染色體，可能導(dǎo)致極好的遺傳穩(wěn)定性，甚至在缺乏遺傳選擇時。因為不同的染色體基因座可能影響基因表達，甚至來自外源啟動子/UTR的表達，所以同源重組可以是查詢不熟悉的基因組環(huán)境中的基因座并評價這些環(huán)境對基因表達的影響的方法。采用同源重組的一種特別有用的基因工程方法是接受特異性宿主調(diào)節(jié)元件例如啟動子/UTR以驅(qū)動高特異性方式的異源基因表達。因為同源重組是精確的基因打靶事件，所以可用來精確修飾基因或目標區(qū)內(nèi)的任何核苷酸，只要鑒定出足夠的側(cè)翼區(qū)。因此，同源重組可用作修飾影響RNA和/或蛋白質(zhì)的基因表達的調(diào)節(jié)序列的手段。它還可用來修飾蛋白質(zhì)編碼區(qū)，力求改進酶活性例如底物特異性、親和力和Km，由此影響宿主細胞代謝中所需的變化。同源重組提供操作宿主基因組的有力手段，導(dǎo)致基因打靶、基因轉(zhuǎn)換、基因缺失、基因重復(fù)、基因倒位，并交換基因表達調(diào)節(jié)元件例如啟動子、增強子和3'UTR。通過使用含有內(nèi)源序列段的打靶構(gòu)建體以“靶向”內(nèi)源宿主細胞基因組內(nèi)的基因或目標區(qū)，可實現(xiàn)同源重組。所述打靶序列可位于基因或目標區(qū)的5'、基因/目標區(qū)的3'或甚至位于基因/目標區(qū)側(cè)翼?？蓪⑺龃虬袠?gòu)建體作為具有額外載體骨架的超螺旋質(zhì)粒DNA、無載體骨架的PCR產(chǎn)物或作為線性化分子轉(zhuǎn)化到宿主細胞中。在某些情況下，通過用限制性內(nèi)切酶切割轉(zhuǎn)基因DNA，先將轉(zhuǎn)基因DNA(供體DNA)內(nèi)的同源序列暴露可能是有利的。該步驟可提高重組效率并減少非期望事件的出現(xiàn)。提高重組效率的其它方法包括采用PCR以產(chǎn)生含有與靶向的基因組序列同源的線性末端的轉(zhuǎn)化性轉(zhuǎn)基因DNA。C.載體和載體組分鑒于本文的公開內(nèi)容，用于轉(zhuǎn)化本發(fā)明的微生物的載體可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的已知技術(shù)制備。載體通常含有一個或多個基因，其中各基因編碼所需產(chǎn)物(基因產(chǎn)物)的表達，并與調(diào)節(jié)基因表達或使基因產(chǎn)物靶向重組細胞中的特定位置的一個或多個控制序列有效連接。1.控制序列控制序列是調(diào)節(jié)編碼序列表達或?qū)⒒虍a(chǎn)物引導(dǎo)至細胞內(nèi)或外的特定位置的核酸。調(diào)節(jié)表達的控制序列包括例如調(diào)節(jié)編碼序列轉(zhuǎn)錄的啟動子和終止編碼序列轉(zhuǎn)錄的終止子。另一個控制序列是位于編碼多腺苷酸化信號的編碼序列末端的3'非翻譯序列。將基因產(chǎn)物引導(dǎo)向特定位置的控制序列包括編碼信號肽的那些，所述信號肽引導(dǎo)其所連接的蛋白質(zhì)至細胞內(nèi)或外的特定位置。因此，用于基因在微生物中表達的示例性載體設(shè)計含有與在酵母中有活性的啟動子有效連接的所需基因產(chǎn)物(例如選擇標記、或酶)的編碼序列?；蛘?，如果載體不含與目標編碼序列有效連接的啟動子，則可將編碼序列轉(zhuǎn)化到細胞中，使得它在載體整合的點上與內(nèi)源啟動子有效連接。用于表達基因的啟動子可以是與該基因天然連接的啟動子或不同的啟動子。啟動子一般可表征為構(gòu)成型或誘導(dǎo)型。構(gòu)成型啟動子一般是有活性的或功能性的以在任何時候(或者在細胞生活周期的某些時間)以相同的水平驅(qū)動表達。相反地，誘導(dǎo)型啟動子只在響應(yīng)刺激時有活性(或者使之無活性)或顯著增量調(diào)節(jié)或減量調(diào)節(jié)。啟動子的兩個類型均適用于本發(fā)明的方法?？捎糜诒景l(fā)明的誘導(dǎo)型啟動子包括在響應(yīng)刺激時介導(dǎo)有效連接的基因轉(zhuǎn)錄的啟動子，所述刺激例如外源提供的小分子、溫度(熱或冷)、培養(yǎng)基中缺氮等。合適的啟動子可激活實質(zhì)上沉默的基因的轉(zhuǎn)錄或增量調(diào)節(jié)(優(yōu)選顯著地)以低水平轉(zhuǎn)錄的有效連接基因的轉(zhuǎn)錄。終止區(qū)控制序列的納入是任選的，如果采用，則方便是首選，因為終止區(qū)是相對可交換的。終止區(qū)可以對轉(zhuǎn)錄起始區(qū)(啟動子)是天然的，可以對目標DNA序列是天然的，或可以獲自另一來源(參見例如Chen和Orozco，NucleicAcidsResearch16:8411(1988))。2.基因和密碼子優(yōu)化通常，基因包括啟動子、編碼序列和終止控制序列。當(dāng)通過重組DNA技術(shù)裝配時，基因可稱為表達盒，并可側(cè)接限制位點用于方便地插入用來將重組基因?qū)胨拗骷毎妮d體中。表達盒可側(cè)接基因組的DNA序列或其它核酸靶以利于通過同源重組使表達盒穩(wěn)定整合到基因組中?；蛘?，載體和其表達盒可保持未整合的(例如附加體)，在此情況下，載體通常包括復(fù)制起點，其能夠為載體DNA提供復(fù)制。存在于載體上的常見基因是編碼蛋白質(zhì)的基因，其表達允許將含有該蛋白質(zhì)的重組細胞與不表達該蛋白質(zhì)的細胞區(qū)分開來。所述基因及其相應(yīng)的基因產(chǎn)物稱為可選擇標記或選擇標記。多種選擇標記的任一種可用于轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體，構(gòu)建體可用于轉(zhuǎn)化本發(fā)明的生物。對于重組蛋白的最佳表達，使用用最適被待轉(zhuǎn)化的宿主細胞使用的密碼子產(chǎn)生mRNA的編碼序列是有益的。因此，轉(zhuǎn)基因的適當(dāng)表達可能需要轉(zhuǎn)基因的密碼子使用匹配在其中表達轉(zhuǎn)基因的生物的特定的密碼子偏倚。在這種作用基礎(chǔ)上的確切機制有許多，但包括可獲得的氨基酰化tRNA庫與待在細胞中合成的蛋白質(zhì)的適當(dāng)平衡，在這種需要滿足時，再配合轉(zhuǎn)基因信使RNA(mRNA)更有效的翻譯。當(dāng)轉(zhuǎn)基因中的密碼子使用未被最優(yōu)化時，可獲得的tRNA庫不足以允許轉(zhuǎn)基因mRNA的有效翻譯，導(dǎo)致核糖體停頓和終止以及可能的轉(zhuǎn)基因mRNA不穩(wěn)定。C.轉(zhuǎn)化細胞可通過任何合適的技術(shù)轉(zhuǎn)化，包括例如生物射彈、電穿孔、玻璃珠轉(zhuǎn)化和碳化硅晶須轉(zhuǎn)化。用于將轉(zhuǎn)基因?qū)胛⑸锏娜魏畏奖愕募夹g(shù)可用于本發(fā)明?？赏ㄟ^例如D.M.Morrison(MethodsinEnzymology68:326(1979))的方法、通過用氯化鈣增加受體細胞對DNA的通透性的方法(Mandel和Higa，J.MolecularBiology，53:159(1970))等，實現(xiàn)轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)基因在產(chǎn)油酵母(例如解脂耶氏酵母)中表達的實例可見于文獻中(Bordes等，J.MicrobiologicalMethods，70:493(2007)；Chen等，AppliedMicrobiology&Biotechnology48:232(1997))。外源基因在細菌(例如大腸桿菌)中表達的實例是眾所周知的(Green和Sambrook，MolecularCloning:ALaboratoryManual，(第4版，2012))。用于本發(fā)明微生物的轉(zhuǎn)化的載體可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的已知技術(shù)制備。在一個實施方案中，用于基因在微生物中表達的示例性載體設(shè)計含有編碼與在微生物中有活性的啟動子有效連接的酶的基因?；蛘?，如果載體不含與目標基因有效連接的啟動子，則基因可轉(zhuǎn)化至細胞中，使得它在載體整合點上與天然啟動子有效連接。載體還可含有編碼蛋白質(zhì)的第二基因。任選一個或兩個基因之后是含有多腺苷酸化信號的3'非翻譯序列。編碼2個基因的表達盒可在載體上物理連接或在不同的載體上。還可使用微生物的共轉(zhuǎn)化，其中同時使用不同的載體分子以轉(zhuǎn)化細胞(Protist155:381-93(2004))?？扇芜x根據(jù)在抗生素或其它選擇標記存在時在缺乏抗性盒的細胞在其中無法生長的條件下生長的能力來選擇轉(zhuǎn)化細胞。示例性的核酸、細胞和方法A.二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶核酸分子和載體在一些實施方案中，2型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶是DGA1。例如，二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶可以是由選自以下的DGAT2基因編碼的DGA1蛋白：Arxulaadeninivorans、土曲霉(Aspergillusterreus)、Aurantiochytriumlimacinum、麥角菌、密粘褶菌(Gloeophyllumtrabeum)、斯達氏油脂酵母、花藥黑粉菌(Microbotryumviolaceum)、季也蒙畢赤酵母(Pichiaguilliermondii)、三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)、禾柄銹菌、倒卵形紅冬孢酵母(Rhodosporidiumdiobovatum)、圓紅冬孢酵母、牧草紅酵母(Rhodotorulagraminis)和解脂耶氏酵母。DGAT2基因可具有SEQIDNO:16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、52、54、56、58、60、62、64、66、68或70所示核苷酸序列。在其它實施方案中，DGAT2基因基本上與SEQIDNO:16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、52、54、56、58、60、62、64、66、68或70相同，且核苷酸序列編碼保持由SEQIDNO:16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、52、54、56、58、60、62、64、66、68或70編碼的蛋白質(zhì)的功能活性，但由于天然等位基因變異或誘變所致核苷酸序列不同的蛋白質(zhì)。在另一個實施方案中，DGAT2基因包含與SEQIDNO:16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、52、54、56、58、60、62、64、66、68或70有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或更高同一性的核苷酸序列。DGA1蛋白可具有SEQIDNO:15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、51、53、55、57、59、61、63、65、67或69所示氨基酸序列。在其它實施方案中，DGA1蛋白基本上與SEQIDNO:15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、51、53、55、57、59、61、63、65、67或69相同，并保持SEQIDNO:15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、51、53、55、57、59、61、63、65、67或69的蛋白質(zhì)的功能活性，但由于天然等位基因變異或誘變所致氨基酸序列不同。在另一個實施方案中，DGA1蛋白包含與SEQIDNO:15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、51、53、55、57、59、61、63、65、67或69有至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或更高同一性的氨基酸序列。在一些實施方案中，1型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶是DGA2。例如，二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶可以是由存在于選自以下生物的DGAT1基因編碼的DGA2蛋白：Arxulaadeninivorans、土曲霉、球毛殼、麥角菌、斯達氏油脂酵母、Metarhiziumacridum、冬蟲夏草菌(Ophiocordycepssinensis)、三角褐指藻、季也蒙畢赤酵母、圓紅冬孢酵母、牧草紅酵母、綠木霉(Trichodermavirens)和解脂耶氏酵母。DGAT1基因可具有SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、72、74、76、78、80、82或84所示核苷酸序列。在其它實施方案中，DGAT1基因基本上與SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、72、74、76、78、80、82或84相同，且核苷酸序列編碼保持由SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、72、74、76、78、80、82或84編碼的蛋白質(zhì)的功能活性，但由于天然等位基因變異或誘變所致核苷酸序列上不同的蛋白質(zhì)。在另一個實施方案中，DGAT1基因包含與SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、72、74、76、78、80、82或84有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或更高同一性的核苷酸序列。DGA2蛋白可具有SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、71、73、75、77、79、81或83所示氨基酸序列。在其它實施方案中，DGA2蛋白基本上與SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、71、73、75、77、79、81或83相同，并保持SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、71、73、75、77、79、81或83的蛋白質(zhì)的功能活性，但由于天然等位基因變異或誘變所致在氨基酸序列上不同。在另一個實施方案中，DGA2蛋白包含與SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、71、73、75、77、79、81或83有至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或更高同一性的氨基酸序列。在一些實施方案中，3型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶是DGA3。例如，二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶可以是由存在于選自以下生物的DGAT3基因編碼的DGA3蛋白：蓖麻(Ricinuscommunis)和落花生(Arachishypogaea)。DGAT3基因可具有SEQIDNO:88或90所示核苷酸序列。在其它實施方案中，DGAT3基因基本上與SEQIDNO:88或90相同，且核苷酸序列編碼保持由SEQIDNO:87或89編碼的蛋白質(zhì)的功能活性，但由于天然等位基因變異或誘變所致核苷酸序列上不同的蛋白質(zhì)。在另一個實施方案中，DGAT3基因包含與SEQIDNO:88或90有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或更高同一性的核苷酸序列。DGA3蛋白可具有SEQIDNO:87或89所示氨基酸序列。在其它實施方案中，DGA3蛋白基本上與SEQIDNO:87或89相同，并保持SEQIDNO:87或89的蛋白質(zhì)的功能活性，但由于天然等位基因變異或誘變所致在氨基酸序列上不同。在另一個實施方案中，DGA3蛋白包含與SEQIDNO:87或89有至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或更高同一性的氨基酸序列。DGAT1、DGAT2或DGA3基因可包含保守取代、缺失和/或插入同時仍編碼具有功能性二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)。例如，可針對具體的宿主細胞使DGAT1、DGAT2或DGA3密碼子優(yōu)化，出于方便可置換不同的密碼子，以例如引入限制位點或產(chǎn)生最適PCR引物，或者可出于其它目的置換密碼子。同樣，可改變核苷酸序列以產(chǎn)生保守氨基酸取代、缺失和/或插入。DGA1、DGA2和DGA3多肽可包含保守取代、缺失和/或插入同時仍保持功能性二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶活性。保守取代表是本領(lǐng)域眾所周知的(Creighton，Proteins(第2版，1992))?？刹捎弥亟MDNA操作技術(shù)，容易地實現(xiàn)氨基酸取代、缺失和/或插入。用于操作DNA序列以產(chǎn)生蛋白質(zhì)的取代、插入或缺失變體的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。這些方法包括M13誘變、T7-Gen體外誘變(USB，Cleveland，OH)、QuickChange位點定向誘變(Stratagene，SanDiego，CA)、PCR介導(dǎo)的位點定向誘變和其它位點定向誘變方案。為了測定2個氨基酸序列或2個核酸序列的百分比同一性，可對序列進行比對用于最佳比較目的(例如可將空位引入第一和第二氨基酸或核酸序列的一個或兩個中用于最佳比對，且可忽略不相同的序列用于比較目的)。用于比較目的比對的參比序列的長度可為參比序列長度的至少95%。然后可比較相應(yīng)的氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸殘基或核苷酸。當(dāng)?shù)谝恍蛄猩系奈恢帽慌c第二序列上相應(yīng)位置的相同氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)時，則該位置上的分子相同(如本文所用，氨基酸或核酸“同一性”等同于氨基酸或核酸“同源性”)。考慮為了2個序列的最佳比對需要引入的空位的數(shù)目和空位的長度，2個序列間的百分比同一性隨序列所共有的相同位置的數(shù)目而變。2個序列間的序列比較和百分比同一性的測定可應(yīng)用數(shù)學(xué)算法完成。在一個實施方案中，使用Blosum62矩陣或PAM250矩陣，及16、14、12、10、8、6或4的空位權(quán)重和1、2、3、4、5或6長度權(quán)重，應(yīng)用Needleman和Wunsch(J.MolecularBiology48:444-453(1970))算法(其被整合至GCG軟件包的GAP程序(可獲自http://www.gcg.com))，測定2個氨基酸序列間的百分比同一性。在又一個實施方案中，可采用NWSgapdna.CMP矩陣和40、50、60、70或80的空位權(quán)重和1、2、3、4、5或6長度權(quán)重，應(yīng)用GCG軟件包中的GAP程序(可獲自http://www.gcg.com)測定2個核苷酸序列間的百分比同一性。在另一個實施方案中，可使用PAM120權(quán)重殘基表、12的空位長度罰分和4的空位罰分，應(yīng)用E.Meyers和W.Miller(ComputerApplicationsintheBiosciences4:11-17(1988))的算法(其被整合至ALIGN程序(2.0或2.0U版))，測定2個氨基酸或核苷酸序列間的百分比同一性?？捎脕頊y定2個序列間的同一性的示例性計算機程序包括但不限于BLAST程序的套件，例如BLASTN、MEGABLAST、BLASTX、TBLASTN、TBLASTX和BLASTP及Clustal程序，例如ClustalW、ClustalX和ClustalOmega。在對指定核酸序列相對于GenBankDNASequences和其它公共數(shù)據(jù)庫中的核酸序列進行評價時，通常應(yīng)用BLASTN程序進行序列檢索。BLASTX程序?qū)τ卺槍enBankProteinSequences和其它公共數(shù)據(jù)庫中的氨基酸序列，檢索在所有讀框中翻譯的核酸序列是有效的。應(yīng)用例如CLUSTAL-W程序，進行所選序列的比對以確定兩個或更多個序列間的“%同一性”?！熬幋a序列”或“編碼區(qū)”是指當(dāng)序列表達時，具有產(chǎn)生蛋白質(zhì)產(chǎn)物(例如氨基酸或多肽)所必需的序列信息的核酸分子。編碼序列可包含翻譯區(qū)內(nèi)的非翻譯序列(包括內(nèi)含子或5'或3'非翻譯區(qū))和/或由其組成，或可缺乏所述間插的非翻譯序列(例如cDNA中)。本說明書中提及包含核苷酸序列和/或由核苷酸序列組成的核酸所用的縮略語是常規(guī)一字母縮略語。因此當(dāng)包括在核酸中時，如下縮寫天然存在的編碼核苷酸：腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)。同樣，除非另有說明，否則本文提供的核酸序列為5'→3'方向。本文所用術(shù)語“互補的”及其衍生詞用于提及按照A與T或U配對而C與G配對的眾所周知的規(guī)則的核酸配對?；パa可以是“部分的”或“完全的”。在部分互補中，僅一些核酸堿基按照堿基配對規(guī)則匹配；而在完全或全部互補中，所有堿基按照配對規(guī)則匹配。如本文眾所周知的，核酸鏈之間的互補程度可對核酸鏈之間的雜交的效率和強度具有顯著作用。所述雜交的效率和強度取決于檢測方法。如本文所用，“DGA1”意指二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶2型(DGAT2)。DGA1是膜內(nèi)在蛋白質(zhì)，其催化油生物合成中最后的酶步驟和植物、真菌和哺乳動物中的三酰甘油產(chǎn)生。DGA1可在改變產(chǎn)油生物的油中所產(chǎn)生的長鏈多不飽和脂肪酸的數(shù)量中起關(guān)鍵作用。DGA1與乙酰輔酶A:膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶(“ACAT”)有關(guān)。該酶負責(zé)將酰基從?；o酶A轉(zhuǎn)移到1,2-二酰甘油(“DAG”)的sn-3位置形成三酰甘油(“TAG”)(由此參與TAG生物合成的最終步驟)。DGA1與植物和真菌(特別是有助于用作能源儲備的碳貯存的油料種子)中的膜和脂質(zhì)小體部分有關(guān)。TAG被認為是細胞中能量貯存的重要化學(xué)物質(zhì)。已知DGA1調(diào)節(jié)TAG結(jié)構(gòu)并指導(dǎo)TAG合成。DGA1多核苷酸和多肽序列可衍生于具有極高的天然脂質(zhì)蓄積水平的高產(chǎn)油生物(BioresourceTechnology144:360-69(2013)；ProgressLipidResearch52:395-408(2013)；AppliedMicrobiology&Biotechnology90:1219-27(2011)；EuropeanJournalLipidScience&Technology113:1031-51(2011)；FoodTechnology&Biotechnology47:215-20(2009)；AdvancesAppliedMicrobiology51:1-51(2002)；Lipids11:837-44(1976))。具有據(jù)報告約50%和更高脂質(zhì)含量的生物列表見表1。圓紅冬孢酵母和斯達氏油脂酵母具有最高的脂質(zhì)含量。在表1的生物中，5種具有可公開獲得的DGA1的序列：圓紅冬孢酵母、斯達氏油脂酵母、A.limacinum、土曲霉和麥角菌(表1中用黑體字)。表1.具有據(jù)報告約50%和以上脂質(zhì)含量的產(chǎn)油真菌列表。具有公開可獲得的DGA1基因的序列的生物用黑體字表示。用于提高DGA1的活性的核酸構(gòu)建體描述于USSN61/943,664和PCT專利申請?zhí)朠CT/US15/017227(通過引用結(jié)合到本文中)。圖1顯示用于在解脂耶氏酵母中表達圓紅冬孢酵母DGA1基因NG66(SEQIDNO:20)的表達構(gòu)建體pNC243。在轉(zhuǎn)化前通過PacI/NotI限制酶切消化使DGA1表達構(gòu)建體線性化。線性表達構(gòu)建體各包括用于DGA1和Nat1基因(用作用諾爾絲菌素(NAT)選擇的標記)的表達盒。用于提高DGA2和/或其它二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶的活性的核酸構(gòu)建體可采用上述方法和/或本領(lǐng)域已知的其它方法產(chǎn)生。圖3顯示用于在解脂耶氏酵母中表達麥角菌DGA2基因NG112(SEQIDNO:9)的表達構(gòu)建體pNC327。在轉(zhuǎn)化前通過PacI/AscI限制酶切消化使DGA2表達構(gòu)建體線性化。線性表達構(gòu)建體各包括用于DGA2和BLE基因(用作用Zeocin選擇的標記)的表達盒。用于提高DGA3和/或其它二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶的活性的核酸構(gòu)建體可采用上述方法和/或本領(lǐng)域已知的其它方法產(chǎn)生。B.三酰甘油脂肪酶核酸分子和載體三酰甘油脂肪酶通過脫去一個或多個脂肪酸鏈消耗細胞的三酰甘油。因此，降低細胞的凈三酰甘油脂肪酶活性可增加細胞的三酰甘油。這種降低可通過降低酶的效率(例如通過使其活性部位氨基酸突變)，或通過降低酶的表達來實現(xiàn)。例如，TGL3敲除突變可降低三酰甘油脂肪酶的活性，因為它防止細胞轉(zhuǎn)錄TGL3。三酰甘油脂肪酶敲除描述于USSN61/987,098和PCT專利申請?zhí)朠CT/US15/28760(通過引用結(jié)合到本文中)。在一些實施方案中，三酰甘油脂肪酶是TGL3。在其它實施方案中，三酰甘油脂肪酶是TGL3/4或TGL4。解脂耶氏酵母中的TGL3基因編碼三酰甘油脂肪酶蛋白TGL3(SEQIDNO:41)，解脂耶氏酵母中的TGL4基因編碼三酰甘油脂肪酶蛋白TGL4(SEQIDNO:85)。SEQIDNO:42含有TGL3核苷酸序列、100個上游核苷酸和100個下游核苷酸。因此，SEQIDNO:42核苷酸序列可用來設(shè)計能夠與天然解脂耶氏酵母三酰甘油脂肪酶基因的核酸序列重組的核酸。同樣，SEQIDNO:86含有TGL4核苷酸序列。因此，SEQIDNO:86核苷酸序列可用來設(shè)計能夠與天然解脂耶氏酵母三酰甘油脂肪酶基因的核酸序列重組的核酸。敲除盒SEQIDNO:49和50能夠與解脂耶氏酵母中的天然TGL3基因重組。因此，在一些實施方案中，由SEQIDNO:49和50編碼的核酸可用來在解脂耶氏酵母中產(chǎn)生三酰甘油脂肪酶敲除突變。SEQIDNO:49和50各自含有潮霉素抗性基因hph的部分。兩個分離的序列均不編碼功能蛋白質(zhì)，但是2個序列在成功重組時能夠編碼賦予潮霉素抗性的功能性激酶。此外，SEQIDNO:49或SEQIDNO:50兩者都不含有啟動子或終止子，因此，它們依賴與解脂耶氏酵母TGL3基因的同源重組以用于hph基因轉(zhuǎn)錄和翻譯。這樣，可通過使細胞在含有潮霉素的培養(yǎng)基中生長，來選擇成功轉(zhuǎn)化的產(chǎn)油細胞。可通過用引物NP1798(SEQIDNO:47)和引物NP656(SEQIDNO:46)擴增潮霉素抗性基因hph(SEQIDNO:44)，來制備敲除盒SEQIDNO:49。可通過用引物NP655(SEQIDNO:45)和引物NP1799(SEQIDNO:48)擴增潮霉素抗性基因hph(SEQIDNO:44)，來制備敲除盒SEQIDNO:50?？刹捎貌煌姆椒▉碓O(shè)計降低解脂耶氏酵母中TGL3的活性的核酸(BiochimicaBiophysicaActa1831:1486-95(2013))。可采用本文公開的方法和本領(lǐng)域已知的其它方法降低其它物種中的三酰甘油脂肪酶活性。例如，可采用這些方法降低Arxulaadeninivorans的TGL3基因(SEQIDNO:36)、Arxulaadeninivorans的TGL3/4基因(SEQIDNO:38)或Arxulaadeninivorans的TGL4基因(SEQIDNO:40)的活性。C.轉(zhuǎn)化細胞在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細胞是原核細胞，例如細菌細胞。在一些實施方案中，細胞是真核細胞，例如哺乳動物細胞、酵母細胞、絲狀真菌細胞、原生生物細胞、藻類細胞、禽細胞、植物細胞或昆蟲細胞。細胞可選自Arxula、曲霉屬、Aurantiochytrium、假絲酵母屬、麥角菌屬、隱球菌屬、小克銀漢霉屬、地霉屬、漢遜酵母屬、克魯維酵母屬、Kodamaea、白冬孢酵母屬、油脂酵母屬、被孢霉屬、Ogataea、畢赤酵母屬、原壁菌屬、根霉屬、紅冬孢酵母屬、紅酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬、銀耳屬、絲孢酵母屬、Wickerhamomyces和耶氏酵母屬。在一些實施方案中，細胞選自Arxulaadeninivorans、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusorzyae)、土曲霉、Aurantiochytriumlimacinum、產(chǎn)朊念珠菌(Candidautilis)、麥角菌、淺白隱球菌、彎曲隱球菌、Cryptococcusramirezgomezianus、地生隱球菌、Cryptococcuswieringae、刺孢小克銀漢霉、日本小克銀漢霉、Geotrichumfermentans、多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)、馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)、Kodamaeaohmeri、Leucosporidiellacreatinivora、產(chǎn)油油脂酵母、斯達氏油脂酵母、子囊菌油脂酵母、深黃被孢霉、高山被孢霉(Mortierellaalpina)、Ogataeapolymorpha、Pichiaciferrii、季也蒙畢赤酵母、巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)、樹干畢赤酵母(Pichiastipites)、Protothecazopfii、少根根霉、Rhodosporidiumbabjevae、圓紅冬孢酵母、Rhodosporidiumpaludigenum、粘紅酵母、膠紅酵母、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、腦狀銀耳、皮狀絲孢酵母、發(fā)酵性絲孢酵母、Wickerhamomycesciferrii和解脂耶氏酵母。在某些實施方案中，轉(zhuǎn)化細胞是耐高溫酵母細胞。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化細胞是馬克斯克魯維酵母。在某些實施方案中，細胞是解脂耶氏酵母或Arxulaadeninivorans。D.提高細胞中的二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶的活性可通過過量表達蛋白質(zhì)，提高蛋白質(zhì)的活性。可使用各種遺傳修飾，在細胞中過量表達蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，遺傳修飾增加天然二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶的表達。通過修飾天然二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因的上游轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子，例如通過增加轉(zhuǎn)錄激活物的表達或降低轉(zhuǎn)錄阻遏物的表達，使天然二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶過量表達?；蛘撸烊欢８视王；D(zhuǎn)移酶基因的啟動子可通過與外源核酸重組而用構(gòu)成型活性或誘導(dǎo)型啟動子置換。在一些實施方案中，遺傳修飾編碼至少一個拷貝的1型二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶基因。1型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因可以是對細胞是天然的或來自不同物種的基因。在某些實施方案中，基因可遺傳給轉(zhuǎn)化細胞的子代。在一些實施方案中，基因是可遺傳的，因為它定居在質(zhì)粒上。在某些實施方案中，基因是可遺傳的，因為它整合至轉(zhuǎn)化細胞的基因組中。在某些實施方案中，DGAT1基因是來自Arxulaadeninivorans、土曲霉、球毛殼、麥角菌、斯達氏油脂酵母、Metarhiziumacridum、冬蟲夏草菌、三角褐指藻、季也蒙畢赤酵母、圓紅冬孢酵母、牧草紅酵母、綠木霉或解脂耶氏酵母的1型二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶基因。在某些實施方案中，通過用編碼二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶基因的基因轉(zhuǎn)化細胞，來表達二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶。遺傳修飾可編碼一個或一個以上拷貝的二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因。在某些實施方案中，遺傳修飾編碼至少一個拷貝的來自球毛殼、麥角菌、冬蟲夏草菌或解脂耶氏酵母的DGA2蛋白。在一些實施方案中，遺傳修飾編碼至少一個拷貝的來自球毛殼、麥角菌或冬蟲夏草菌的DGA2蛋白，且轉(zhuǎn)化細胞是解脂耶氏酵母。在一些實施方案中，遺傳修飾編碼至少一個拷貝的來自球毛殼、麥角菌或解脂耶氏酵母的DGA2蛋白，且轉(zhuǎn)化細胞是Arxulaadeninivorans。在一些實施方案中，遺傳修飾編碼至少一個拷貝的2型二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶基因。2型二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶基因可以是對細胞為天然的或來自不同物種的基因。在某些實施方案中，基因可遺傳給轉(zhuǎn)化細胞的子代。在一些實施方案中，基因是可遺傳的，因為它定居在質(zhì)粒上。在某些實施方案中，基因是可遺傳的，因為它整合至轉(zhuǎn)化細胞的基因組中。在某些實施方案中，DGAT2基因是來自Arxulaadeninivorans、土曲霉、Aurantiochytriumlimacinum、麥角菌、密粘褶菌、斯達氏油脂酵母、花藥黑粉菌、季也蒙畢赤酵母、三角褐指藻、禾柄銹菌、倒卵形紅冬孢酵母、圓紅冬孢酵母、牧草紅酵母或解脂耶氏酵母的2型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因。在某些實施方案中，通過用編碼二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶基因的基因轉(zhuǎn)化細胞，來表達二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶。遺傳修飾可編碼一個或一個以上拷貝的二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶基因。在某些實施方案中，遺傳修飾編碼至少一個拷貝的來自圓紅冬孢酵母的DGA1蛋白。在一些實施方案中，遺傳修飾編碼至少一個拷貝的來自圓紅冬孢酵母的DGA1蛋白，且轉(zhuǎn)化細胞是解脂耶氏酵母。在一些實施方案中，遺傳修飾編碼至少一個拷貝的來自圓紅冬孢酵母的DGA1蛋白，且轉(zhuǎn)化細胞是Arxulaadeninivorans。在一些實施方案中，DGA1蛋白來自圓紅冬孢酵母，DGA2蛋白來自球毛殼、麥角菌、冬蟲夏草菌或解脂耶氏酵母。在一些實施方案中，DGA1蛋白來自圓紅冬孢酵母，DGA2蛋白來自麥角菌、球毛殼或冬蟲夏草菌，且轉(zhuǎn)化細胞是解脂耶氏酵母。在一些實施方案中，DGA1蛋白來自圓紅冬孢酵母，DGA2蛋白來自麥角菌、球毛殼或解脂耶氏酵母，且轉(zhuǎn)化細胞是Arxulaadeninivorans。在一些實施方案中，遺傳修飾編碼至少一個拷貝的3型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因。3型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因可為對細胞是天然的或來自不同物種的基因。在某些實施方案中，基因可遺傳給轉(zhuǎn)化細胞的子代。在一些實施方案中，基因是可遺傳的，因為它定居在質(zhì)粒上。在某些實施方案中，基因是可遺傳的，因為它整合至轉(zhuǎn)化細胞的基因組中。在某些實施方案中，DGAT3基因是來自蓖麻或落花生的3型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因。在某些實施方案中，通過用編碼二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因的基因轉(zhuǎn)化細胞，來表達二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶。遺傳修飾可編碼一個或一個以上拷貝的二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因。在某些實施方案中，遺傳修飾編碼至少一個拷貝的來自蓖麻或落花生的DGA3蛋白。在一些實施方案中，遺傳修飾編碼至少一個拷貝的來自蓖麻或落花生的DGA3蛋白，且轉(zhuǎn)化細胞是解脂耶氏酵母。在一些實施方案中，遺傳修飾編碼至少一個拷貝的來自蓖麻或落花生的DGA1蛋白，且轉(zhuǎn)化細胞是Arxulaadeninivorans。在某些實施方案中，二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因可遺傳給轉(zhuǎn)化細胞的子代。在一些實施方案中，二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因是可遺傳的，因為它定居在質(zhì)粒上。在某些實施方案中，二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因是可遺傳的，因為它整合至轉(zhuǎn)化細胞的基因組中。E.降低細胞中的三酰甘油脂肪酶活性在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化的產(chǎn)油細胞包含降低天然三酰甘油脂肪酶的活性的遺傳修飾。所述遺傳修飾可影響調(diào)節(jié)三酰甘油脂肪酶基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)，包括降低轉(zhuǎn)錄激活物的表達和/或增加轉(zhuǎn)錄阻遏物的表達的修飾。影響調(diào)節(jié)物蛋白質(zhì)的修飾可同時降低三酰甘油脂肪酶的表達和改變使細胞平衡轉(zhuǎn)向脂質(zhì)蓄積增加或脂質(zhì)組成改進的其它基因表達概況?；蛘撸z傳修飾可以是引入小干擾RNA或編碼小干擾RNA的核酸。在其它實施方案中，遺傳修飾由天然三酰甘油脂肪酶基因的核酸和調(diào)節(jié)區(qū)(包括操縱基因、啟動子、來自啟動子上游的序列、增強子和基因下游的序列)的同源重組組成。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化的產(chǎn)油細胞包含由同源重組事件組成的遺傳修飾。在某些實施方案中，轉(zhuǎn)化細胞包含由天然三酰甘油脂肪酶基因和核酸間的同源重組事件組成的遺傳修飾。因此，遺傳修飾使三酰甘油脂肪酶基因缺失，防止其轉(zhuǎn)錄，或防止可轉(zhuǎn)錄成完全活性的蛋白質(zhì)的基因轉(zhuǎn)錄。同源重組事件可使天然三酰甘油脂肪酶基因的一部分突變或缺失。例如，同源重組事件可使天然三酰甘油脂肪酶活性部位中的一個或多個殘基突變，由此降低脂肪酶的效率或使其無活性?；蛘?，同源重組事件可影響翻譯后修飾、折疊、穩(wěn)定性或在細胞內(nèi)的定位。在一些實施方案中，同源重組事件使啟動子被驅(qū)動較少轉(zhuǎn)錄的啟動子置換。在其它實施方案中，同源重組事件使啟動子突變以損害其驅(qū)動轉(zhuǎn)錄的能力。在某些實施方案中，遺傳修飾是三酰甘油脂肪酶敲除突變。敲除突變是優(yōu)選的，因為它們消除消耗細胞的三酰甘油含量的途徑，由此增加細胞的三酰甘油含量。敲除突變可使一個或多個三酰甘油脂肪酶基因缺失。此外，敲除突變可使三酰甘油脂肪酶基因被編碼不同蛋白質(zhì)的基因置換?？蓪⒒蚺c外源啟動子有效連接。在某些實施方案中，基因不與外源啟動子連接，相反地，基因經(jīng)配置以與三酰甘油脂肪酶基因重組，使得三酰甘油脂肪酶基因的啟動子驅(qū)動基因的轉(zhuǎn)錄。因此，如果基因隨機整合至細胞的基因組中，則基因不太可能表達。用于產(chǎn)生敲除的方法是本領(lǐng)域眾所周知的(參見例如Fickers等,J.MicrobiologicalMethods55:727(2003))。在某些實施方案中，遺傳修飾包含2個同源重組事件。在第一個事件中，編碼基因的一部分的核酸與三酰甘油脂肪酶基因重組，而在第二個事件中，編碼基因的其余部分的核酸與三酰甘油脂肪酶基因重組?；虻?個部分經(jīng)設(shè)計，使得無一部分是有功能的，除非它們彼此重組。這2個事件進一步降低基因可在隨機整合事件后表達的可能性。在某些實施方案中，基因編碼顯性選擇標記。因此，敲除細胞可通過篩選標記來選擇。在一些實施方案中，顯性選擇標記是藥物抗性標記。藥物抗性標記是這樣的顯性選擇標記，其當(dāng)通過細胞表達時，允許細胞在通常抑制細胞生長和/或存活的藥物的存在下生長和/或存活?？赏ㄟ^使細胞在藥物存在下生長，來選擇表達藥物抗性標記的細胞。在一些實施方案中，藥物抗性標記是抗生素抗性標記。在一些實施方案中，藥物抗性標記賦予對選自以下藥物的抗性：兩性霉素B、克念菌素、非律平、哈霉素、那他霉素、制霉菌素、龜裂殺菌素、聯(lián)苯芐唑、布康唑、克霉唑、益康唑、芬替康唑、異康唑、酮康唑、氯利康唑、咪康唑、奧莫康唑、奧昔康唑、舍他康唑、硫康唑、噻康唑、阿巴康唑、氟康唑、艾沙康唑(Isavuconazole)、伊曲康唑、泊沙康唑、雷夫康唑、特康唑、伏立康唑、阿巴芬凈、阿莫羅芬、布替萘芬、萘替芬、特比萘芬、阿尼芬凈、卡泊芬凈、米卡芬凈、苯甲酸、環(huán)吡酮、氟胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、灰黃霉素、鹵普羅近、水蓼二醛、托萘酯、結(jié)晶紫、阿米卡星、慶大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、妥布霉素、巴龍霉素、大觀霉素、格爾德霉素、除莠霉素、利福昔明、鏈霉素、氯碳頭孢、厄他培南、多利培南、亞胺培南、美羅培南、頭孢羥氨芐、頭孢唑啉、頭孢噻吩、頭孢氨芐、頭孢克洛、頭孢孟多、頭孢西丁、頭孢丙烯、頭孢呋辛、頭孢克肟、頭孢地尼、頭孢托侖、頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢泊肟、頭孢他啶、頭孢布烯、頭孢唑肟、頭孢曲松、頭孢吡肟、Ceftarolinefosamil、頭孢比羅、替考拉寧、萬古霉素、替拉凡星、克林霉素、林可霉素、達托霉素、阿奇霉素、克拉霉素、地紅霉素、紅霉素、羅紅霉素、醋竹桃霉素、泰利霉素、螺旋霉素、氨曲南、呋喃唑酮、呋喃妥英、利奈唑胺、泊西唑利德、Radezolid、Torezolid、阿莫西林、氨芐西林、阿洛西林、羧芐西林、氯唑西林、雙氯西林、氟氯西林、美洛西林、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、青霉素G、青霉素V、哌拉西林、青霉素G、替莫西林、替卡西林、克拉維酸鹽、舒巴坦、三唑巴坦、克拉維酸鹽、桿菌肽、多黏菌素E、多黏菌素B、環(huán)丙沙星、依諾沙星、加替沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、莫西沙星、萘啶酸、諾氟沙星、氧氟沙星、曲伐沙星、格帕沙星、司帕沙星、替馬沙星、磺胺米隆、磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺嘧啶銀、磺胺地索辛、磺胺甲二唑、磺胺甲噁唑、磺胺(Sulfanilimide)、柳氮磺吡啶、磺胺異噁唑、甲氧芐啶-磺胺甲噁唑復(fù)方、復(fù)方新諾明、Sulfonamidochrysoidine、地美環(huán)素、多西環(huán)素、米諾環(huán)素、土霉素、四環(huán)素、氯法齊明、氨苯砜、卷曲霉素、環(huán)絲氨酸、乙胺丁醇、乙硫異煙胺、異煙肼、吡嗪酰胺、利福平、利福布汀、利福噴汀、鏈霉素、胂凡納明、氯霉素、磷霉素、梭鏈孢酸、甲硝唑、莫匹羅星、Platensimycin、奎奴普丁、達福普汀、甲砜霉素、替吉環(huán)素、替硝唑、甲氧芐啶、遺傳霉素、諾爾絲菌素、潮霉素、博來霉素和嘌羅霉素。在一些實施方案中，顯性選擇標記是營養(yǎng)標記。營養(yǎng)標記是當(dāng)由細胞表達時，使細胞能夠利用一種或多種特定的營養(yǎng)源生長或存活的顯性選擇標記?？赏ㄟ^使細胞在其中表達營養(yǎng)標記的細胞可存活和/或生長、但缺乏營養(yǎng)標記的細胞不能存活和/或生長的限制性營養(yǎng)條件下生長，來選擇表達營養(yǎng)標記的細胞。在一些實施方案中，營養(yǎng)標記選自乳清酸核苷-5-磷酸脫羧酶、亞磷酸特異性氧化還原酶、α-酮戊二酸依賴性次磷酸雙加氧酶、堿性磷酸酶、氨腈水合酶、三聚氰胺脫氨酶、氰尿酸酰胺水解酶、縮二脲水解酶、脲酰胺水解酶(amidolyase)、三聚氰酸一酰胺氨基水解酶、鳥嘌呤脫氨酶、磷酸二酯酶、磷酸三酯酶、亞磷酸氫化酶、甘油磷酸二酯酶、對硫磷水解酶、亞磷酸脫氫酶、硫芴脫硫酶、芳族脫亞磺酸酶(Aromaticdesulfinase)、NADH依賴性FMN還原酶、氨基嘌呤轉(zhuǎn)運蛋白、羥胺氧化還原酶、轉(zhuǎn)化酶、β-葡糖苷酶、α-葡糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-半乳糖苷酶、淀粉酶、纖維素酶和支鏈淀粉酶?？刹捎貌煌姆椒ㄒ郧贸庵辖湍钢械腡GL3基因(參見例如Dulermo等,BiochimicaBiophysicaActa1831:1486(2013))。可采用本文公開的方法和本領(lǐng)域已知的其它方法以敲除其它物種中的不同的三酰甘油脂肪酶基因。例如，可采用這些方法敲除Arxulaadeninivorans的TGL3基因(SEQIDNO:36)、Arxulaadeninivorans的TGL3/4基因(SEQIDNO:38)或Arxulaadeninivorans的TGL4基因(SEQIDNO:40)。在一些實施方案中，遺傳修飾降低天然三酰甘油脂肪酶基因的表達達0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100%。在一些實施方案中，遺傳修飾降低天然三酰甘油脂肪酶基因的效率達0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100%。在一些實施方案中，遺傳修飾降低天然三酰甘油脂肪酶基因的活性達0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100%。F.降低細胞中的三酰甘油脂肪酶活性同時伴以表達二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶在一些實施方案中，轉(zhuǎn)化的產(chǎn)油細胞包含三酰甘油脂肪酶敲除突變和增加天然二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶的表達的遺傳修飾。在某些實施方案中，轉(zhuǎn)化的產(chǎn)油細胞包含三酰甘油脂肪酶敲除突變和編碼至少一個拷貝的對細胞是天然的或來自不同物種的細胞的二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因的遺傳修飾。在一些實施方案中，三酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因被破壞，且表達DGA1和DGA2蛋白。在一些實施方案中，一種核酸增加天然二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶的表達或編碼至少一個拷貝的二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶基因，第二種核酸降低細胞中三酰甘油脂肪酶的活性。在一些實施方案中，相同的核酸編碼至少一個拷貝的二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶基因且降低細胞中三酰甘油脂肪酶的活性。例如，經(jīng)設(shè)計敲除三酰甘油脂肪酶基因的核酸還可含有一個拷貝的二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因。G.三酰甘油產(chǎn)生在某些實施方案中，使轉(zhuǎn)化細胞在外源脂肪酸、葡萄糖、乙醇、木糖、蔗糖、淀粉、淀粉糊精、甘油、纖維素和/或乙酸存在下生長。在培養(yǎng)時可加入這些底物以增加脂質(zhì)產(chǎn)量。外源脂肪酸可包括硬脂酸酯、油酸、亞油酸、γ-亞麻酸、雙高-γ-亞麻酸、花生四烯酸、α-亞麻酸、十八碳四烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸、二十碳二烯酸和/或二十碳三烯酸。在某些實施方案中，本發(fā)明涉及由本文所述修飾的宿主細胞產(chǎn)生的產(chǎn)物。在某些實施方案中，產(chǎn)物是油、脂質(zhì)或三酰甘油。在一些實施方案中，產(chǎn)物是棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸或亞油酸。在某些實施方案中，產(chǎn)物是飽和脂肪酸。因此，產(chǎn)物可以是辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、花生酸、二十二碳酸、木蠟酸或蠟酸。在一些實施方案中，產(chǎn)物是不飽和脂肪酸。因此，產(chǎn)物可以是肉豆蔻腦酸、棕櫚油酸、杉皮酸(sapienicacid)、油酸、反油酸、異油酸、亞油酸、反亞油酸、α-亞麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、芥酸或二十二碳六烯酸。產(chǎn)物可選自脂質(zhì)、三酰甘油酯、脂肪醇、脂肪酸、烷烴、烯烴、類異戊二烯、異戊二烯、角鯊烯、法呢烯、醇、異丙醇、正丙醇、正丁醇、異丁醇、2-丁醇、丁二烯、二醇、1,3丙二醇、1,4丙二醇、琥珀酸、己二酸、尼龍前體、檸檬酸、蘋果酸、多元醇和赤蘚糖醇。與DGA1和DGA2有關(guān)的遺傳修飾在一些實施方案中，本發(fā)明涉及包含第一遺傳修飾和第二遺傳修飾的轉(zhuǎn)化細胞，其中所述第一遺傳修飾提高天然1型二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶的活性或編碼至少一個拷貝的對細胞是天然的或來自不同物種的1型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因，且所述第二遺傳修飾提高天然2型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶的活性或編碼至少一個拷貝的對細胞是天然的或來自不同物種的2型二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶基因。在一些實施方案中，細胞包含第三遺傳修飾，其中所述第三遺傳修飾降低細胞中三酰甘油脂肪酶的活性。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)化細胞，其中第一遺傳修飾編碼至少一個拷貝的對細胞是天然的或來自不同物種的1型二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶基因。在一些實施方案中，至少一個拷貝的1型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因整合至所述細胞的基因組中。1型二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶基因可以是來自Arxulaadeninivorans、土曲霉、球毛殼、麥角菌、斯達氏油脂酵母、Metarhiziumacridum、冬蟲夏草菌、三角褐指藻、季也蒙畢赤酵母、圓紅冬孢酵母、牧草紅酵母、綠木霉或解脂耶氏酵母的1型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因。在一些實施方案中，1型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因是來自麥角菌、球毛殼、冬蟲夏草菌或解脂耶氏酵母的1型二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶基因。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)化細胞，其中第二遺傳修飾編碼至少一個拷貝的對細胞是天然的或來自不同物種的2型二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶基因。在一些實施方案中，至少一個拷貝的2型二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶基因整合至所述細胞的基因組中。2型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因可以是來自Arxulaadeninivorans、土曲霉、Aurantiochytriumlimacinum、麥角菌、密粘褶菌、斯達氏油脂酵母、花藥黑粉菌、季也蒙畢赤酵母、三角褐指藻、禾柄銹菌、倒卵形紅冬孢酵母、圓紅冬孢酵母、牧草紅酵母或解脂耶氏酵母的2型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因。在一些實施方案中，2型二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶基因是來自斯達氏油脂酵母或圓紅冬孢酵母的2型二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶基因。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)化細胞，其中第三遺傳修飾是三酰甘油脂肪酶敲除突變。三酰甘油脂肪酶可由TGL3、TGL3/4或TGL4基因編碼。在一些實施方案中，細胞是Arxulaadeninivorans；且所述三酰甘油脂肪酶包含SEQIDNO:35、SEQIDNO:37或SEQIDNO:39所示氨基酸序列。在一些實施方案中，細胞是Arxulaadeninivorans；且所述三酰甘油脂肪酶由SEQIDNO:36、SEQIDNO:38或SEQIDNO:40所示核苷酸序列編碼。在其它實施方案中，細胞是解脂耶氏酵母；且所述三酰甘油脂肪酶包含SEQIDNO:41或SEQIDNO:85所示氨基酸序列。在一些實施方案中，細胞是解脂耶氏酵母；且所述三酰甘油脂肪酶由SEQIDNO:42或SEQIDNO:86所示核苷酸序列編碼。與DGA2有關(guān)的遺傳修飾在一些實施方案中，本發(fā)明涉及包含遺傳修飾的轉(zhuǎn)化細胞，其中所述遺傳修飾提高天然1型二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶的活性或編碼至少一個拷貝的對細胞是天然的或來自不同物種的1型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因。例如，遺傳修飾可編碼至少一個拷貝的對細胞是天然的或來自不同物種的1型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因。在一些實施方案中，至少一個拷貝的1型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因整合至所述細胞的基因組中。與DGA3有關(guān)的遺傳修飾在一些實施方案中，本發(fā)明涉及包含遺傳修飾的轉(zhuǎn)化細胞，其中所述遺傳修飾提高天然3型二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶的活性或編碼至少一個拷貝的對細胞是天然的或來自不同物種的3型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因。例如，遺傳修飾可編碼至少一個拷貝的對細胞是天然的或來自不同物種的3型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因。在一些實施方案中，至少一個拷貝的3型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因整合至所述細胞的基因組中。3型二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶基因可以是來自蓖麻或落花生的3型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因。轉(zhuǎn)化細胞的物種在一些實施方案中，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)化細胞，其中所述細胞選自藻類、細菌、霉菌、真菌、植物和酵母。細胞可以是酵母。細胞可選自Arxula、曲霉屬、Aurantiochytrium、假絲酵母屬、麥角菌屬、隱球菌屬、小克銀漢霉屬、地霉屬、漢遜酵母屬、克魯維酵母屬、Kodamaea、白冬孢酵母屬、油脂酵母屬、被孢霉屬、Ogataea、畢赤酵母屬、原壁菌屬、根霉屬、紅冬孢酵母屬、紅酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬、銀耳屬、絲孢酵母屬、Wickerhamomyces和耶氏酵母屬。例如，細胞可選自Arxulaadeninivorans、黑曲霉、米曲霉、土曲霉、Aurantiochytriumlimacinum、產(chǎn)朊念珠菌、麥角菌、淺白隱球菌、彎曲隱球菌、Cryptococcusramirezgomezianus、地生隱球菌、Cryptococcuswieringae、刺孢小克銀漢霉、日本小克銀漢霉、Geotrichumfermentans、多形漢遜酵母、乳酸克魯維酵母、馬克斯克魯維酵母、Kodamaeaohmeri、Leucosporidiellacreatinivora、產(chǎn)油油脂酵母、斯達氏油脂酵母、子囊菌油脂酵母、深黃被孢霉、高山被孢霉、Ogataeapolymorpha、Pichiaciferrii、季也蒙畢赤酵母、巴斯德畢赤酵母、樹干畢赤酵母、Protothecazopfii、少根根霉、Rhodosporidiumbabjevae、圓紅冬孢酵母、Rhodosporidiumpaludigenum、粘紅酵母、膠紅酵母、釀酒酵母、粟酒裂殖酵母、腦狀銀耳、皮狀絲孢酵母、發(fā)酵性絲孢酵母、Wickerhamomycesciferrii和解脂耶氏酵母。產(chǎn)物在某些方面，本發(fā)明涉及來源于上述細胞的產(chǎn)物。在一些實施方案中，產(chǎn)物是油、脂質(zhì)或三酰甘油。產(chǎn)物可以是棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸或亞油酸。與DGA1和DGA2有關(guān)的方法在某些方面，本發(fā)明提供增加細胞的三酰甘油含量的方法，所述方法包括：(a)提供包含以下的細胞：(i)第一遺傳修飾，其中所述第一遺傳修飾提高天然1型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶的活性或編碼至少一個拷貝的對細胞是天然的或來自不同物種的1型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因；和(ii)第二遺傳修飾，其中所述第二遺傳修飾提高天然2型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶的活性或編碼至少一個拷貝的對細胞是天然的或來自不同物種的2型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因；(b)使所述細胞在表達第一和第二遺傳修飾的條件下生長，從而產(chǎn)生三酰甘油；和(c)任選回收三酰甘油。上述方法還可用來改進細胞的脂質(zhì)組成。細胞可另包含第三遺傳修飾，其中所述第三遺傳修飾降低細胞中三酰甘油脂肪酶的活性。在某些方面，本發(fā)明提供增加細胞的脂質(zhì)含量的方法，所述方法包括將親本細胞用第一核苷酸序列和第二核苷酸序列轉(zhuǎn)化，其中所述第一核苷酸序列提高天然1型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶的活性或編碼至少一個拷貝的1型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因，且所述第二核苷酸序列提高天然2型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶的活性或編碼至少一個拷貝的2型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因。所述方法可進一步包括將所述細胞用第三核苷酸序列轉(zhuǎn)化，其中所述第三核苷酸序列降低三酰甘油脂肪酶的活性。第一核苷酸序列可包含1型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因。在某些實施方案中，第一核苷酸序列編碼與SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:71、SEQIDNO:73、SEQIDNO:75、SEQIDNO:77、SEQIDNO:79、SEQIDNO:81或SEQIDNO:83所示氨基酸序列或其任一個的生物活性部分具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列同源性的氨基酸序列。在一些實施方案中，第一核苷酸序列編碼與SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:71、SEQIDNO:73、SEQIDNO:75、SEQIDNO:77、SEQIDNO:79、SEQIDNO:81或SEQIDNO:83所示氨基酸序列或其任一個的生物活性部分具有至少80%序列同源性的氨基酸序列。在一些實施方案中，第一核苷酸序列編碼與SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:71、SEQIDNO:73、SEQIDNO:75、SEQIDNO:77、SEQIDNO:79、SEQIDNO:81或SEQIDNO:83所示氨基酸序列或其任一個的生物活性部分具有至少95%序列同源性的氨基酸序列。在一些實施方案中，第一核苷酸序列編碼SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:71、SEQIDNO:73、SEQIDNO:75、SEQIDNO:77、SEQIDNO:79、SEQIDNO:81或SEQIDNO:83所示氨基酸序列或其任一個的生物活性部分。在一些實施方案中，第一核苷酸序列編碼SEQIDNO:1、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11或SEQIDNO:81所示氨基酸序列或其任一個的生物活性部分。在一些實施方案中，第一核苷酸序列與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:72、SEQIDNO:74、SEQIDNO:76、SEQIDNO:78、SEQIDNO:80、SEQIDNO:82或SEQIDNO:84所示核苷酸序列具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列同源性。在一些實施方案中，第一核苷酸序列與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:72、SEQIDNO:74、SEQIDNO:76、SEQIDNO:78、SEQIDNO:80、SEQIDNO:82或SEQIDNO:84所示核苷酸序列具有至少70%序列同源性。在一些實施方案中，第一核苷酸序列與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:72、SEQIDNO:74、SEQIDNO:76、SEQIDNO:78、SEQIDNO:80、SEQIDNO:82或SEQIDNO:84所示核苷酸序列具有至少95%序列同源性。在一些實施方案中，第一核苷酸序列包含SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:72、SEQIDNO:74、SEQIDNO:76、SEQIDNO:78、SEQIDNO:80、SEQIDNO:82或SEQIDNO:84所示核苷酸序列。在一些實施方案中，第一核苷酸序列包含SEQIDNO:2、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12或SEQIDNO:82所示核苷酸序列。第二核苷酸序列可包含2型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因。在一些實施方案中，第一核苷酸序列與SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33、SEQIDNO:51、SEQIDNO:53、SEQIDNO:55、SEQIDNO:57、SEQIDNO:59、SEQIDNO:61、SEQIDNO:63、SEQIDNO:65、SEQIDNO:67或SEQIDNO:69所示核苷酸序列或其任一個的生物活性部分具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列同源性。在一些實施方案中，第二核苷酸序列編碼與SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33、SEQIDNO:51、SEQIDNO:53、SEQIDNO:55、SEQIDNO:57、SEQIDNO:59、SEQIDNO:61、SEQIDNO:63、SEQIDNO:65、SEQIDNO:67或SEQIDNO:69所示氨基酸序列或其任一個的生物活性部分具有至少80%序列同源性的氨基酸序列。在一些實施方案中，第二核苷酸序列編碼與SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33、SEQIDNO:51、SEQIDNO:53、SEQIDNO:55、SEQIDNO:57、SEQIDNO:59、SEQIDNO:61、SEQIDNO:63、SEQIDNO:65、SEQIDNO:67或SEQIDNO:69所示氨基酸序列或其任一個的生物活性部分具有至少95%序列同源性的氨基酸序列。在一些實施方案中，第二核苷酸序列編碼SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33、SEQIDNO:51、SEQIDNO:53、SEQIDNO:55、SEQIDNO:57、SEQIDNO:59、SEQIDNO:61、SEQIDNO:63、SEQIDNO:65、SEQIDNO:67或SEQIDNO:69所示氨基酸序列或其任一個的生物活性部分。在一些實施方案中，第二核苷酸序列編碼SEQIDNO:19、SEQIDNO:21或SEQIDNO:23所示氨基酸序列或其任一個的生物活性部分。在一些實施方案中，第二核苷酸序列編碼SEQIDNO:19所示氨基酸序列或其生物活性部分。在一些實施方案中，第二核苷酸序列與SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34、SEQIDNO:52、SEQIDNO:54、SEQIDNO:56、SEQIDNO:58、SEQIDNO:60、SEQIDNO:62、SEQIDNO:64、SEQIDNO:66、SEQIDNO:68或SEQIDNO:70所示核苷酸序列具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列同源性。在一些實施方案中，第二核苷酸序列與SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34、SEQIDNO:52、SEQIDNO:54、SEQIDNO:56、SEQIDNO:58、SEQIDNO:60、SEQIDNO:62、SEQIDNO:64、SEQIDNO:66、SEQIDNO:68或SEQIDNO:70所示核苷酸序列具有至少70%序列同源性。在一些實施方案中，第二核苷酸序列與SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34、SEQIDNO:52、SEQIDNO:54、SEQIDNO:56、SEQIDNO:58、SEQIDNO:60、SEQIDNO:62、SEQIDNO:64、SEQIDNO:66、SEQIDNO:68或SEQIDNO:70所示核苷酸序列具有至少95%序列同源性。在一些實施方案中，第二核苷酸序列包含SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34、SEQIDNO:52、SEQIDNO:54、SEQIDNO:56、SEQIDNO:58、SEQIDNO:60、SEQIDNO:62、SEQIDNO:64、SEQIDNO:66、SEQIDNO:68或SEQIDNO:70所示核苷酸序列。在一些實施方案中，第二核苷酸序列包含SEQIDNO:20、SEQIDNO:22或SEQIDNO:24所示核苷酸序列。在一些實施方案中，第二核苷酸序列包含SEQIDNO:20所示核苷酸序列。在某些實施方案中，第三核苷酸序列能夠與三酰甘油脂肪酶基因中的核苷酸序列和/或三酰甘油脂肪酶基因調(diào)節(jié)區(qū)中的核苷酸序列重組。例如，三酰甘油脂肪酶可由TGL3、TGL3/4或TGL4基因編碼。在一些實施方案中，細胞是Arxulaadeninivorans；且所述三酰甘油脂肪酶包含SEQIDNO:35、SEQIDNO:37或SEQIDNO:39所示氨基酸序列。在一些實施方案中，細胞是Arxulaadeninivorans；且所述三酰甘油脂肪酶由SEQIDNO:36、SEQIDNO:38或SEQIDNO:40所示核苷酸序列編碼。在其它實施方案中，細胞是解脂耶氏酵母；且所述三酰甘油脂肪酶包含SEQIDNO:41或SEQIDNO:85所示氨基酸序列。在一些實施方案中，細胞是解脂耶氏酵母；且所述三酰甘油脂肪酶由SEQIDNO:42或SEQIDNO:86所示核苷酸序列編碼。在一些實施方案中，第三核苷酸序列包含編碼蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的一部分的基因。蛋白質(zhì)可賦予對藥物的抗性。蛋白質(zhì)可使細胞能夠比不表達該蛋白質(zhì)的相同物種的細胞更快地在營養(yǎng)源中生長或增殖。在一些實施方案中，將親本細胞用編碼第一核苷酸序列的第一核酸和編碼第二核苷酸序列的第二核酸轉(zhuǎn)化。在其它實施方案中，將親本細胞用編碼第一核苷酸序列和第二核苷酸序列的第一核酸轉(zhuǎn)化。可將細胞用編碼第三核苷酸序列的第三核酸轉(zhuǎn)化，或者第一核酸或第二核酸可編碼第三核苷酸序列。然而，在其它實施方案中，將親本細胞用編碼第一核苷酸序列、第二核苷酸序列和第三核苷酸序列的核酸轉(zhuǎn)化。與DGA2有關(guān)的方法在某些方面，本發(fā)明提供增加細胞的三酰甘油含量的方法，所述方法包括：(a)提供包含遺傳修飾的細胞，其中所述遺傳修飾提高天然1型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶的活性或編碼至少一個拷貝的對細胞是天然的或來自不同物種的1型二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶基因；(b)使所述細胞在表達該遺傳修飾的條件下生長，從而產(chǎn)生三酰甘油；和(c)任選回收三酰甘油。上述方法還可用來改進細胞的脂質(zhì)組成。在某些方面，本發(fā)明提供增加細胞的脂質(zhì)含量的方法，所述方法包括用核苷酸序列轉(zhuǎn)化親本細胞，其中所述核苷酸序列提高天然1型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶的活性或編碼至少一個拷貝的1型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因。核苷酸序列可包含1型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因。在某些實施方案中，核苷酸序列編碼與SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:71、SEQIDNO:73、SEQIDNO:75、SEQIDNO:77、SEQIDNO:79、SEQIDNO:81或SEQIDNO:83所示氨基酸序列或其任一個的生物活性部分具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列同源性的氨基酸序列。在一些實施方案中，核苷酸序列編碼與SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:71、SEQIDNO:73、SEQIDNO:75、SEQIDNO:77、SEQIDNO:79、SEQIDNO:81或SEQIDNO:83所示氨基酸序列或其任一個的生物活性部分具有至少80%序列同源性的氨基酸序列。在一些實施方案中，核苷酸序列編碼與SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:71、SEQIDNO:73、SEQIDNO:75、SEQIDNO:77、SEQIDNO:79、SEQIDNO:81或SEQIDNO:83所示氨基酸序列或其任一個的生物活性部分具有至少95%序列同源性的氨基酸序列。在一些實施方案中，核苷酸序列編碼SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:71、SEQIDNO:73、SEQIDNO:75、SEQIDNO:77、SEQIDNO:79、SEQIDNO:81或SEQIDNO:83所示氨基酸序列或其任一個的生物活性部分。在一些實施方案中，核苷酸序列編碼SEQIDNO:1、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11或SEQIDNO:81所示氨基酸序列或其任一個的生物活性部分。在一些實施方案中，核苷酸序列與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:72、SEQIDNO:74、SEQIDNO:76、SEQIDNO:78、SEQIDNO:80、SEQIDNO:82或SEQIDNO:84所示核苷酸序列具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列同源性。在一些實施方案中，第一核苷酸序列與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:72、SEQIDNO:74、SEQIDNO:76、SEQIDNO:78、SEQIDNO:80、SEQIDNO:82或SEQIDNO:84所示核苷酸序列具有至少70%序列同源性。在一些實施方案中，核苷酸序列與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:72、SEQIDNO:74、SEQIDNO:76、SEQIDNO:78、SEQIDNO:80、SEQIDNO:82或SEQIDNO:84所示核苷酸序列具有至少95%序列同源性。在一些實施方案中，核苷酸序列包含SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:72、SEQIDNO:74、SEQIDNO:76、SEQIDNO:78、SEQIDNO:80、SEQIDNO:82或SEQIDNO:84所示核苷酸序列。在一些實施方案中，核苷酸序列包含SEQIDNO:2、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12或SEQIDNO:82所示核苷酸序列。與DGA3有關(guān)的方法在某些方面，本發(fā)明提供增加細胞的三酰甘油含量的方法，所述方法包括：(a)提供包含遺傳修飾的細胞，其中所述遺傳修飾提高天然3型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶的活性或編碼至少一個拷貝的對細胞是天然的或來自不同物種的3型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因；(b)使所述細胞在表達該遺傳修飾的條件下生長，從而產(chǎn)生三酰甘油；和(c)任選回收三酰甘油。上述方法還可用來改進細胞的脂質(zhì)組成。在某些方面，本發(fā)明提供增加細胞的脂質(zhì)含量的方法，所述方法包括用核苷酸序列轉(zhuǎn)化親本細胞，其中所述核苷酸序列提高天然3型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶的活性或編碼至少一個拷貝的3型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因。核苷酸序列可包含3型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因。在某些實施方案中，核苷酸序列編碼與SEQIDNO:87或SEQIDNO:89所示氨基酸序列或其任一個的生物活性部分具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列同源性的氨基酸序列。在一些實施方案中，核苷酸序列編碼與SEQIDNO:87或SEQIDNO:89所示氨基酸序列或其任一個的生物活性部分具有至少80%序列同源性的氨基酸序列。在一些實施方案中，核苷酸序列編碼與SEQIDNO:87或SEQIDNO:89所示氨基酸序列或其任一個的生物活性部分具有至少95%序列同源性的氨基酸序列。在一些實施方案中，核苷酸序列編碼SEQIDNO:87或SEQIDNO:89所示氨基酸序列或其任一個的生物活性部分。在一些實施方案中，核苷酸序列與SEQIDNO:88或SEQIDNO:90所示核苷酸序列具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%序列同源性。在一些實施方案中，第一核苷酸序列與SEQIDNO:88或SEQIDNO:90所示核苷酸序列具有至少70%序列同源性。在一些實施方案中，核苷酸序列與SEQIDNO:88或SEQIDNO:90所示核苷酸序列具有至少95%序列同源性。在一些實施方案中，核苷酸序列包含SEQIDNO:88或SEQIDNO:90所示核苷酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地認識到，本發(fā)明非常適于實現(xiàn)目標，并達到提及的目標和優(yōu)勢以及其中固有的目標和優(yōu)勢。本文所述實施方案無意限制本發(fā)明的范圍。參照隨附的描述、附圖和權(quán)利要求書，將更好地理解本發(fā)明的這些和其它特征、方面和優(yōu)勢。通過下列實施例進一步說明本說明書，所述實施例不應(yīng)解釋為以任何方式加以限制。所有引述的參考文獻(包括本申請書全文中引述的參考文獻書目、授權(quán)專利、公開的專利申請和GenBank登記號)的內(nèi)容均通過引用明確結(jié)合到本文中。當(dāng)通過引用予以結(jié)合的文件中的術(shù)語定義與本文所用術(shù)語抵觸時，以本文使用的術(shù)語為準。實施例實施例1：提高DGA1蛋白(DGAT2基因)的活性的方法用于表達DGA1的核酸構(gòu)建體描述于USSN61/943,664和PCT專利申請?zhí)朠CT/US15/017227(通過引用結(jié)合到本文中)。圖1顯示用于在解脂耶氏酵母中表達圓紅冬孢酵母DGA1基因NG66(SEQIDNO:20)的表達構(gòu)建體pNC243。在轉(zhuǎn)化前通過PacI/NotI限制酶切消化使DGA1表達構(gòu)建體線性化。線性表達構(gòu)建體各包括用于DGAT2基因和Nat1基因(用作用諾爾絲菌素選擇的標記的(NAT))的表達盒。采用描述于Chen(AppliedMicrobiology&Biotechnology48:232-35(1997))的轉(zhuǎn)化方案，將DGA1表達構(gòu)建體隨機整合至解脂耶氏酵母菌株NS18(獲自ARSCultureCollection，NRRL#YB392)的基因組中。在含500μg/mLNAT的YPD板中選擇轉(zhuǎn)化株，并按下文實施例2所述通過熒光染色脂質(zhì)測定法篩選蓄積脂質(zhì)的能力。對于各表達構(gòu)建體，分析了8個轉(zhuǎn)化株。對于大多數(shù)構(gòu)建體，可能由于在只獲得功能性Nat1盒的細胞中缺乏功能性DGA1表達盒所致，或由于DGA1整合的位點對DGA1表達的負面作用所致，在轉(zhuǎn)化株之間有明顯的菌落變異。盡管如此，所有轉(zhuǎn)化株的脂質(zhì)含量都顯著增加。如通過實施例2所述熒光測定法測量的，與親本菌株NS18相比，天然解脂耶氏酵母DGA1(NG15)在強啟動子下的過量表達增加轉(zhuǎn)化株的脂質(zhì)含量達約2倍。通過圓紅冬孢酵母DGA1(NG66，NG67)和斯達氏油脂酵母DGA1(NG68)的表達，產(chǎn)生顯示最強熒光(是NS18的約3倍)的轉(zhuǎn)化株。在某些實驗中，天然圓紅冬孢酵母DGA1(NG49)表達對解脂耶氏酵母中脂質(zhì)生產(chǎn)的作用不如不含內(nèi)含子的圓紅冬孢酵母DGAT2基因的合成形式的作用的大。這種結(jié)果可能表明解脂耶氏酵母中圓紅冬孢酵母DGAT2基因的基因剪接不是非常有效。在某些實驗中，用于在解脂耶氏酵母中表達的圓紅冬孢酵母DGA1基因的密碼子優(yōu)化對脂質(zhì)生產(chǎn)沒有積極作用。實施例2：脂質(zhì)測定法將高壓滅菌的多孔板的各孔充入含有0.5g/L脲、1.5g/L酵母提取物、0.85g/L酪蛋白氨基酸、1.7g/LYNB(無氨基酸和硫酸銨)、100g/L葡萄糖和5.11g/L鄰苯二甲酸氫鉀(25mM)的過濾除菌的培養(yǎng)基。使用在YPD瓊脂板中在30℃下孵育1-2天的酵母菌株接種多孔板的各孔。24孔板的各孔使用1.5mL培養(yǎng)基，96孔板的各孔使用300μL培養(yǎng)基。或者，使用酵母培養(yǎng)物接種高壓滅菌的250mL長頸瓶中的50mL滅菌培養(yǎng)基。多孔板用透氣蓋蓋上，并在30℃、70-90%濕度和900rpm下在InforsMultitronATR振蕩器中孵育。或者，長頸瓶用鋁箔覆蓋，并在30℃、70-90%濕度和900rpm下在NewBrunswickScientific振蕩器中孵育。96小時后，將20μL100%乙醇加入分析微量板中的20μl細胞中，并在4℃下孵育30分鐘。然后將20μL細胞/乙醇混合物加入Costar96孔黑色透明底板中的80μl預(yù)先混合的溶液中，該溶液含有50μL1M碘化鉀、1mMμLBodipy493/503、0.5μL100%DMSO、1.5μL60%PEG4000和27μL水，將板用透明封條覆蓋。在30℃下，用SpectraMaxM2分光光度計(MolecularDevices)動力學(xué)測定法監(jiān)測Bodipy熒光，并通過將熒光除以600nm處的吸光度歸一化。數(shù)據(jù)對一式三份生長實驗取平均。實施例3：表達DGA1的解脂耶氏酵母菌株的分析和篩選為了選擇具有最高脂質(zhì)生產(chǎn)水平的菌株，對表達NG15(解脂耶氏酵母DGA1)或NG66(圓紅冬孢酵母DGA1)的解脂耶氏酵母菌株NS18轉(zhuǎn)化株進行篩選。對于NG15，通過實施例2所述脂質(zhì)測定法，針對最高脂質(zhì)蓄積篩選出約50個菌落，最佳轉(zhuǎn)化株命名為NS249。對于NG66，篩選出80個菌落，并選出8個最佳菌落用于進一步分析。使菌株NS249和8個所選的NG66轉(zhuǎn)化株在搖瓶中生長，并針對脂質(zhì)含量通過脂質(zhì)測定法和針對葡萄糖消耗通過HPLC進行分析。與具有在與圓紅冬孢酵母DGAT2相同的啟動子下表達的天然解脂耶氏酵母DGAT2基因的解脂耶氏酵母菌株相比，表達圓紅冬孢酵母DGA1的解脂耶氏酵母菌株具有顯著高的脂質(zhì)含量。同時，NG66轉(zhuǎn)化株比NS249利用顯著多的葡萄糖，表明了NG66在將葡萄糖轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)方面更有效。2種DGAT2基因間效率的差異可歸因于圓紅冬孢酵母DGA1在解脂耶氏酵母中更高的表達水平或圓紅冬孢酵母DGA1的更高水平的比活性，或兩者。菌株NS125是用來自pNC104載體的解脂耶氏酵母DGA1表達盒轉(zhuǎn)化的解脂耶氏酵母菌株NS18(獲自ARSCultureCollection，NRRL#YB392)的衍生株(圖2)。在轉(zhuǎn)化前通過PacI/NotI限制酶切消化使pNC104構(gòu)建體線性化。線性表達構(gòu)建體包括用于解脂耶氏酵母DGAT2基因和Nat1基因(用作用諾爾絲菌素選擇的標記(NAT))的表達盒。采用Chen(AppliedMicrobiology&Biotechnology48:232-35(1997))所述轉(zhuǎn)化方案，將表達構(gòu)建體隨機整合至解脂耶氏酵母菌株NS18的基因組中。在含500μg/mLNAT的YPD板上選擇轉(zhuǎn)化株，并通過實施例2所述熒光染色脂質(zhì)測定法篩選蓄積脂質(zhì)的能力。約100個轉(zhuǎn)化株中篩選出的最佳轉(zhuǎn)化株命名為NS125。NS281菌株采用與菌株NS125類似的方法獲得，不同的是使用pNC243構(gòu)建體用于NS18菌株的轉(zhuǎn)化(圖1)。pNC243構(gòu)建體含有圓紅冬孢酵母DGAT2基因(NG66)而不是用于制備NS125的解脂耶氏酵母DGAT2基因。NS281菌株含有整合至解脂耶氏酵母基因組中的圓紅冬孢酵母DGAT2基因。實施例4：敲除解脂耶氏酵母中的三酰甘油脂肪酶敲除基因的方法用于敲除解脂耶氏酵母TGL3基因同時表達DGAT2基因的核酸構(gòu)建體描述于USSN61/987,098和PCT專利申請?zhí)朠CT/US15/28760(兩者通過引用結(jié)合到本文中)。敲除解脂耶氏酵母野生型菌株NS18(獲自NRLL#YB-392)及其表達DGA1的衍生物NS281中的TGL3基因。如上所述，NS281表達來自圓紅冬孢酵母的DGA1基因。如下除去解脂耶氏酵母TGL3基因(YALI0D17534g，SEQIDNO:42)：使用引物對NP1798-NP656和NP655-NP1799(SEQIDNO:45-48)，通過PCR從含有潮霉素抗性基因(“hph,”SEQIDNO:44)的質(zhì)粒擴增2片段缺失盒。按照USSN61/819,746和PCT專利申請公布號WO14/182657(兩者通過引用結(jié)合到本文中)研發(fā)的方案，將所得PCR片段(SEQIDNO:49和50)共轉(zhuǎn)化至NS18和NS281。hph盒中啟動子和終止子的省略和將hph編碼序列剪切成2個PCR片段降低這些片段的隨機整合將賦予潮霉素抗性的可能性。如果通過同源重組在TGL3基因座處整合使得TGL3啟動子和終止子可指導(dǎo)其轉(zhuǎn)錄，則hph基因才可表達。通過PCR篩選潮霉素抗性菌落，以證實TGL3不存在和tgl3::hyg特定產(chǎn)物的存在。NS18中TGL3的缺失產(chǎn)生菌株NS421。NS281中TGL3的缺失產(chǎn)生菌株NS377。實施例5：過量表達DGA1和DGA2兩者和含有TGL3缺失的細胞比不過量表達DGA2的細胞蓄積更多TAG為了測試將DGA1和DGA2表達與TGL3缺失結(jié)合導(dǎo)致解脂耶氏酵母中更高脂質(zhì)蓄積的構(gòu)思，使麥角菌的DGA2在菌株NS377中表達。如實施例4和USSN61/987,098和PCT專利申請?zhí)朠CT/US15/28760(兩者通過引用結(jié)合到本文中)所述，菌株NS377含有TGL3的缺失并表達來自圓紅冬孢酵母的DGA1。根據(jù)證實來自麥角菌的DGA2與來自圓紅冬孢酵母的DGA1組合提高解脂耶氏酵母的脂質(zhì)含量的實驗，選擇來自麥角菌的DGA2。圖3顯示用于在NS377中表達麥角菌DGA2的表達構(gòu)建體pNC327的圖。在轉(zhuǎn)化前用PacI/AscI限制酶切消化使構(gòu)建體線性化。線性表達構(gòu)建體包括用于麥角菌DGA2基因和BLE基因(用作用Zeocin選擇的標記(ZEO))的表達盒。轉(zhuǎn)化株通過實施例2所述熒光脂質(zhì)測定法分析，最高脂質(zhì)生產(chǎn)株命名為NS432。比較了菌株NS297、NS281、NS412、NS450、NS377和NS432的脂質(zhì)生產(chǎn)。采用整批葡萄糖方法(在48孔板或50-ml長頸瓶中)或采用高細胞密度分批補料葡萄糖方法(在1-L生物反應(yīng)器中)，使這一組菌株生長。通過熒光測定法或氣相色譜法分析脂質(zhì)含量，發(fā)現(xiàn)菌株NS432具有比其親本菌株NS377和無TGL3敲除的菌株更高的脂質(zhì)含量(圖4)。這些結(jié)果表明TGL3敲除中DGA1和DGA2表達的優(yōu)勢。實施例6：提高Arxulaadeninivorans中DGA1、DGA2或DGA3的活性針對在Arxulaadeninivorans菌株NS252中的表達，選出29個編碼來自不同供體的二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶(DGA)1型(DGA2)、2型(DGA1)和3型(DGA3)的基因(表2)。用于在A.adeninivorans中表達DGA的表達構(gòu)建體的圖見圖5，其中NG167靶為實例。所有其它DGA的構(gòu)建體都相同，只是靶標可讀框(ORF)除外。陰性對照包含代替DGA的大腸桿菌hph基因，其編碼賦予對潮霉素B的抗性的磷酸轉(zhuǎn)移酶。表2.用于在Arxulaadeninivorans和解脂耶氏酵母中表達的二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶基因基因ID供體生物基因SEQIDNONG15解脂耶氏酵母DGA116NG16解脂耶氏酵母DGA22NG66圓紅冬孢酵母DGA220NG69斯達氏油脂酵母DGA126NG70土曲霉DGA128NG71麥角菌DGA130NG72AurantiochytriumlimacinumDGA132NG109圓紅冬孢酵母DGA24NG110斯達氏油脂酵母DGA26NG111土曲霉DGA28NG112麥角菌DGA210NG113球毛殼DGA212NG167ArxulaadeninivoransDGA134NG168ArxulaadeninivoransDGA214NG286牧草紅酵母DGA152NG287花藥黑粉菌DGA156NG288禾柄銹菌DGA158NG289密粘褶菌DGA160NG290倒卵形紅冬孢酵母DGA162NG291三角褐指藻DGA1A64NG292三角褐指藻DGA1B66NG293三角褐指藻DGA1C68NG294三角褐指藻DGA1D70NG295三角褐指藻DGA278NG296MetarhiziumacridumDGA280NG297冬蟲夏草菌DGA282NG298綠木霉DGA284NG299蓖麻DGA388NG300落花生DGA390通過酵母介導(dǎo)的連接裝配表達構(gòu)建體。接下來，在轉(zhuǎn)化前通過PmeI/AscI限制酶切消化使全長構(gòu)建體線性化。線性表達構(gòu)建體包括DGA的表達盒和用于諾爾斯鏈霉菌Nat1基因(用作用諾爾絲菌素(NAT)選擇的標記)的表達盒。采用特別適于A.adeninivorans的方案，將表達構(gòu)建體隨機整合到A.adeninivoransNS252(ATCC#76597)的基因組中。簡單地說，2mLYPD用親本A.adeninivorans培養(yǎng)物接種，并在旋轉(zhuǎn)振蕩器中在37°C下生長過夜。然后將0.5mL過夜培養(yǎng)物接種到250長頸瓶中25mL的新鮮YPD中，然后使其在37°C下生長3.5-4小時。將細胞以3000rpm離心2分鐘，棄去上清液。將細胞在無菌水中洗滌，并再次以3000rpm離心2分鐘。將沉淀懸浮于2mL包含40μM二硫蘇糖醇的100mM乙酸鋰中，并轉(zhuǎn)移到微量離心管中。使懸液在旋轉(zhuǎn)振蕩器中在37℃下孵育1小時。將細胞以10,000rpm沉淀10秒鐘，棄去上清液。用輕輕吸放將細胞重新懸浮于1mL水中，再次以10,000rpm離心10秒鐘，并棄去水。細胞通過用1M冷的山梨糖醇吸放洗滌，然后再次以10,000rpm離心10秒鐘，棄去清液。將2mL冷的1M山梨糖醇加入沉淀中，并將管置于冰上。然后將40μL細胞連同5μLDNA一起加入預(yù)冷卻的0.2cm電穿孔杯中。以25μF、200ohms、1.5kV對細胞進行電穿孔，時間常數(shù)為~4.9-5.0ms。將細胞加入1mLYPD中，在37℃下孵育過夜，將100μL-500μL細胞置于YPD瓊脂上。在含50μg/mLNAT的YPD板上選擇A.adeninivorans轉(zhuǎn)化株。通過實施例2所述熒光染色脂質(zhì)測定法，針對蓄積脂質(zhì)的能力篩選轉(zhuǎn)化株。脂質(zhì)測定法的結(jié)果見圖6。對于各表達構(gòu)建體，分析了8個轉(zhuǎn)化株。表達磷酸轉(zhuǎn)移酶而非DGA的轉(zhuǎn)化株用作陰性對照(“NegCont”)。在各板中具有相同的陰性對照和用作陽性對照的NG168的4個板中進行測定，以扣除板間的測定變化性。圖6表明大多數(shù)所測的DGA顯示對A.adeninivorans中的脂質(zhì)含量的積極作用。相對于DGA1和DGA3，DGA2顯示對A.adeninivorans中的脂質(zhì)含量更顯著的積極作用。來自解脂耶氏酵母(NG16)和球毛殼(NG113)的DGA2顯示對A.adeninivorans中的脂質(zhì)含量的最顯著作用。實施例7：提高解脂耶氏酵母中的DGA1、DGA2或DGA3的活性在解脂耶氏酵母菌株NS598中表達編碼來自表2所列不同供體的二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶1型、2型和3型的18個基因。菌株NS598是具有以下2種遺傳修飾的解脂耶氏酵母菌株NS18(獲自ARSCultureCollection，NRRL#YB392)的衍生株：1)天然Δ9去飽和酶基因被來自A.adeninivorans的Δ9去飽和酶基因置換；和2)天然Δ12去飽和酶基因缺失并被大腸桿菌磷酸轉(zhuǎn)移酶(其賦予潮霉素B抗性)和單純皰疹病毒胸苷激酶(其賦予對5-氟-2′-脫氧尿苷敏感性)的表達盒置換(參見美國臨時專利申請?zhí)?2/090,169，通過引用結(jié)合到本文中)。用于在解脂耶氏酵母中表達DGA的表達構(gòu)建體的圖見圖7，以NG288靶作為實例。所有其它DGA的構(gòu)建體(NG112除外)都相同，不同的是靶標可讀框。用于在NS589中表達NG112的表達構(gòu)建體見圖3。如下所述通過酵母介導(dǎo)的連接裝配表達構(gòu)建體，NG112基因除外，其描述于上文的實施例3。在轉(zhuǎn)化前通過PmeI/AscI限制酶切消化使構(gòu)建體線性化。各線性表達構(gòu)建體包括DGA基因和編碼轉(zhuǎn)化酶的釀酒酵母SUC2基因(用作用蔗糖選擇的標記)的表達盒。采用Chen等(AppliedMicrobiology&Biotechnology48:232-35(1997))描述的轉(zhuǎn)化方案，將表達構(gòu)建體隨機整合到NS598的基因組中。在含2%蔗糖的YNB板上選擇解脂耶氏酵母轉(zhuǎn)化株。通過實施例2所述熒光染色脂質(zhì)測定法針對蓄積脂質(zhì)的能力篩選轉(zhuǎn)化株。脂質(zhì)測定法的結(jié)果見圖8。對于各表達構(gòu)建體，分析了8個轉(zhuǎn)化株。親本菌株NS598用作陰性對照。測定在3個板中進行。圖8中的數(shù)據(jù)表明所測的各DGA1和DGA3顯示對解脂耶氏酵母的脂質(zhì)含量的顯著積極作用。一些DGA2也顯示對解脂耶氏酵母的脂質(zhì)含量的積極作用，其中麥角菌DGA2(NG112)顯示了最大增加。這些結(jié)果不同于上文實施例6中針對A.adeninivorans所述的DGA篩選，這表明了不同DGA對脂質(zhì)含量的作用是宿主生物特異性的。通過引用結(jié)合所有專利、公開的專利申請和本文引述的其它參考文獻均通過引用結(jié)合到本文中。等同內(nèi)容本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認識到，或能夠只是采用常規(guī)實驗便確定本文所述本發(fā)明的具體實施方案的許多等同內(nèi)容。隨附權(quán)利要求書中欲包括這類等同內(nèi)容。當(dāng)前第1頁1 2 3