產油酵母與芽孢桿菌混合發(fā)酵降解木質纖維素生產脂肪酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種產油酵母和芽孢桿菌混合發(fā)酵降解木質纖維素生產脂肪酸的方法：將秸稈或者木屑粉碎成較細顆粒，然后將粉碎后的木質纖維素原料用稀堿處理，使其完全溶解；將培養(yǎng)好的芽孢桿菌離心并用生理鹽水洗2次，完全除去碳源成分，轉接到含有木質纖維素的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，時間為96-144h；在培養(yǎng)96h后將產油酵母接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中繼續(xù)發(fā)酵96-144h；培養(yǎng)結束后離心收集細胞，破壁提取生物油脂。本發(fā)明的優(yōu)點在于，與其他工藝相比，本研究能夠在較低能耗下生產微生物油脂，并且擴大了原料來源。
【專利說明】產油酵母與芽孢桿菌混合發(fā)酵降解木質纖維素生產脂肪酸 的方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種微生物降解木質纖維素生產脂肪酸的方法，尤其是一種產油酵 母與芽孢桿菌混合發(fā)酵降解木質纖維素生產脂肪酸的方法。

【背景技術】
[0002] 木質纖維素是多種復雜高分子有機化合物組成的復合體，主要由纖維素、半纖維 素和木質素3種主要的聚集體以及一些可溶于極性或弱極性溶劑的提取物組成，木質素和 半纖維素以共價鍵形式結合將纖維素包圍起來，形成堅固的天然屏障，所以在直接水解過 程中木質纖維素很難降解。另外，對發(fā)酵和后續(xù)水解有害的抑制物將會在木質素的水解過 程中產生，而纖維素本身存在復雜的結晶結構，所以木質纖維素直接水解的效果較差，能夠 降解木質纖維素素的微生物主要是真菌如：白腐菌、褐腐菌、軟腐菌。還有一些細菌，如一些 放線菌及桿菌和梭菌等。
[0003] 微生物油脂是由酵母、霉菌、細菌和藻類等微生物在一定條件下利用碳水化合物、 碳氫化合物等碳源，在菌體內所產生的脂肪類化合物。微生物生產油脂具有油脂含量高、生 產周期短、不受季節(jié)影響、不占用耕地等優(yōu)點，而且可以通過各種人工方法，使微生物產生 高營養(yǎng)油脂或某些特定脂肪酸組成油脂，如二十碳五烯酸（EPA)、二十二碳六烯酸（DHA) 和類可可脂（CBE)等具有特殊功能的油脂。
[0004] 對于大多微生物來說，生長所需的最適碳源一般都為葡萄糖，因此利用葡萄糖作 為碳源對產油酵母進行的研究已經有很多，并且其菌體中油脂含量最高可達到80%，但大 規(guī)模的利用葡萄糖進行微生物油脂生產的成本較高，經濟可行性低。因此，為了實現(xiàn)微生物 油脂的工業(yè)化生產，利用農業(yè)秸桿以及林木廢棄物等富含木質纖維素的材料來生產油質是 一個可行的方法。本文發(fā)明人通過長期研究，發(fā)現(xiàn)產油酵母和芽孢桿菌混合發(fā)酵能夠高效 利用木質纖維素素作為碳、氮源來積累脂肪酸，這將是木質纖維素素資源利用的一條意義 重大的研究途徑。


【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種利用木質纖維素生產脂肪酸的方法，尤其是提供產 油酵母和芽孢桿菌混合發(fā)酵利用木質素生產脂肪酸的途徑。通過芽孢桿菌Bacillus Iigniniphilus對木質纖維素中的木質素進行降解，打破木質纖維素的結構，使纖維素和 半纖維素暴露出來，然后產油酵母可以利用纖維素和半纖維素作為碳源進行油脂合成。本 發(fā)明團隊人員長期進行產油酵母降解木質纖維素的研究，發(fā)現(xiàn)產油酵母對木質纖維素的降 解率可高達25%-37%，是一條行之有效的新能源開發(fā)途徑。

【具體實施方式】
[0006] 本
【發(fā)明內容】
可通過以下實施例來具體說明。
[0007] 實施例I 種子罐培養(yǎng) 本實施例所用的種子罐培養(yǎng)基配方如下： 采用5L發(fā)酵罐作為種子罐，配制3L發(fā)酵液。
[0008] 葡萄糖 l〇g/L，酵母提取物 5g/L，尿素 lg/L，（NH4 )2S04 I. 5g/L， MgSO4 · 7H20 I. 5g/L，Na2HPCM · 12H20 9g/L，KH2PCM I. 5g/L。除葡萄糖外將培養(yǎng)基其 他成分于121°C條件下滅菌20min，葡萄糖單獨于115°C滅菌20min。接種量為10%，產油酵 母培養(yǎng)條件：初始 ρΗ7· 0±0· 02, 30°C，200rpm，培養(yǎng) 24h。
[0009] 芽孢桿菌培養(yǎng)條件：初始ρΗ9· 0±0· 02, 30°C，200rpm，培養(yǎng)24h。
[0010] 擴大培養(yǎng) 本實施例采用的發(fā)酵培養(yǎng)基各組分含量如下： 木質纖維素 15g/L，尿素 lg/L，MgSO4 · 7H20 lg/L，CaCl2 · 2H20 0· 02g/L，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0· 5g/L，ZnSO4 · 7H20 0· 4g/L，MnSO4 · 5H20 0· 02g/L，H3BO3 0· 015g/L，NiCl2 · 2H20 0· Olg/ L，EDTA 0· 25g/L，CoCl2 · 6H20 0· 05g/L，CuCl2 · 2H20 0· 005g/L，Stock A 溶液 lml/L, I. OM 的磷酸緩沖溶液35. 2ml/L Stock A 溶液配方：NaMoO4 · 2H20 2g/L，F(xiàn)eNa · EDTA 5g/L I. OM 的磷酸緩沖溶液配方=KH2PO4 47g/L，K2HPO4 113g/L 將種子罐發(fā)酵所得的培養(yǎng)液離心收集到的芽孢桿菌菌體轉入配制好的培養(yǎng)基中進行 擴大培養(yǎng)。培養(yǎng)參數(shù)設定：301：，200印111，？!19.0±0.02，通氣量0.5-111，培養(yǎng)9611，然后調整 PH到7.0,接種產油酵母， 培養(yǎng)過程中實時測定木質纖維素含量，用紫外分光光度計測定在波長205nm吸收值， 用3%硫酸做參比。
[0011] 公式：OD值/110*木素溶液的稀釋倍數(shù)當木質纖維素濃度低于3g/L時，及時向 發(fā)酵罐中補料使得濃度維持在15g/L。
[0012] 實施例2 (測定產油酵母細胞干重）取上述實施例2結束后的發(fā)酵液lml，在 IOOOOrpm下離心lOmin，用水洗滌生物質沉淀兩次，并在40°C下恒溫干燥24h，通過重量分 析確定生物質。
[0013] 實施例3 (酸熱法提取酵母細胞內油脂） 取上述實施例3制得的干菌體lg，加入IOmL濃度為4mol/L的鹽酸 震蕩混勻 20°C條件下靜置Ih 沸水水浴8-10min 室溫冷卻30min 溶液加入分液漏斗，加入5ml無水乙醇 加25ml氯仿：甲醇（2:1)混合液萃取酵母胞內油脂 收集下相的有機層，氮氣流氛圍下在旋轉蒸發(fā)器中蒸發(fā)含有脂質的下相，回收油脂，稱 重。
[0014] 實施例4 將實施例1中木質纖維素濃度改變?yōu)?g/L、15g/L、20g/L，培養(yǎng)基其他組分均不作改 變，分別進行實施例1到實施例3的操作，記錄并分析數(shù)據(jù)。
[0015] 下面表1為不同木質纖維素濃度下發(fā)酵，產油酵母的細胞干重、油脂重量及菌體 含油量。
[0016] 表 1 不同濃度木質素條件下產油酵母菌體干重，油脂重量及菌體含油量

【權利要求】
1. 一種產油酵母和芽孢桿菌混合發(fā)酵降解木質纖維素的生產油脂的方法，其特征在于 產油酵母和能夠降解木質素的芽孢桿菌混合發(fā)酵。
2. 根據(jù)權利要求1所述利用木質纖維素生產脂肪酸的產油酵母為海洋酵母（ Kodamaea ohmeri )、類絲抱酵母（Trichosporonoides spathulata),皮狀絲抱酵 母（Trichosporon cutaneum)等油脂產量較高的酵母，所用芽孢桿菌為能夠降解木質素的 嗜木質素芽孢桿菌（Bacillus ligninphilus)。
3. 根據(jù)權利要求1和2所述的產油酵母和芽孢桿菌混合發(fā)酵利用木質纖維素生產脂肪 酸的方法，其特征在于，具體步驟為： 將結桿或者木屑粉碎成較細顆粒； 將粉碎后的木質纖維素原料用稀堿處理，使其完全溶解； 將嗜木質素芽孢桿菌用ph為9的LB培養(yǎng)基試管活化，接入種子培養(yǎng)基，種子培養(yǎng)基為 葡萄糖培養(yǎng)基； 將芽孢桿菌離心并用生理鹽水洗2次，完全除去碳源成分，轉接到含有木質纖維素的 發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，時間為96-144h ; (5)在培養(yǎng)96h后將產油酵母接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中繼續(xù)發(fā)酵96-144h，培養(yǎng)結束后離心 收集細胞，破壁提取生物油脂。
4. 根據(jù)權利要求3步驟1所述，木質纖維素的原料為農業(yè)秸桿以及木屑，其中農業(yè)秸桿 包括小麥，水稻，高粱、玉米等，其中以高粱玉米等秸桿為佳，所述木屑以軟木屑為佳。
5. 根據(jù)權利要求3步驟1所述，秸桿或者木屑顆粒要求40-80目，以80目以上為佳。
6. 根據(jù)權利要求3步驟2所述，所用稀堿以NaOH為佳，其濃度在1-5%。
【文檔編號】C12R1/645GK104372062SQ201410589034
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年10月29日 優(yōu)先權日:2014年10月29日
【發(fā)明者】朱道辰, 謝長校, 陳焱 申請人:鎮(zhèn)江拜因諾生物科技有限公司