專利名稱：一種攜帶質粒pBIF10的兩歧雙歧桿菌菌株及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種新的兩歧雙歧桿菌菌株及其在乳制品和保健食品生產上應用。
背景技術：
雙歧桿菌屬中攜帶天然質粒的情況比較少見，1982年Sgorbat等人對雙歧桿菌屬的24個菌種1461株雙歧桿菌使用瓊脂糖凝膠電泳探討質粒情況，僅在4種雙歧桿菌中發(fā)現(xiàn)有質粒，它們分別是長雙歧桿菌(B.longum)，球雙歧桿菌(B.globosum)，星狀雙歧桿菌(B.asterides)，蜜蜂雙歧桿菌(B.indicum)。其中僅長雙歧桿菌來源于人。1989年Iwata等對分離不同人來源的42株雙歧桿菌進行了分析，發(fā)現(xiàn)18株短雙歧桿菌(B.breve)存在質粒，其中13株的質粒DNA電泳圖完全相同(康白主編，雙歧桿菌，第一版.大連海事大學出版社，1998.P3-41；p66-68；p99-166.)。上述兩個研究均沒有在兩歧雙歧桿菌中發(fā)現(xiàn)有天然的質粒存在。
關于兩歧雙歧桿菌天然質粒的報道就更少，黃耀堅等對國外保藏的6種20株的雙歧桿菌進行質粒檢測，只在4個種的6株菌中發(fā)現(xiàn)有質粒存在，其中短雙歧桿菌(B.breve)2株、嬰兒雙歧桿菌(B.infantis)2株、青春雙歧桿菌(B.adolescentis)1株和兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum)1株。該兩歧雙歧桿菌為ATCC29521標準株，攜帶有3.4Kb和5.7Kb的質粒各一個(參見雙歧桿菌質粒的檢測及其對抗生素敏感性.中國微生態(tài)學雜志，1997，9(3)10-12)。
丹麥JORGENSEN F等從兩歧雙歧桿菌DSM20215(Bifidobacteriumbifidum DSM20215)中分離出β-牛乳糖、BIF3氨基酸多肽等物質。其中分離到了攜帶3Kb天然多拷貝質粒(pBIF3)，以及以pBIF3構建成的雙歧桿菌表達載體系統(tǒng)。(見‘High-efficiency synthesis of oligosaccharides with atruncated beta-galactosidase from Bifidobacterium bifidum.’APPLIEDMICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY，2001，57(5-6)647-652)。
2003年6月20日在http//www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide中檢索到的有關雙歧桿菌質粒的基因接受號26個，(AE014781；AE014648；AF540971；AF538869；AF538868；AF359574；AF139129；AF085719；AY112722；AY112723；AY112724；AY066026；E05040；NC002133；NC004252；NC004253；NC002635；NC004307；NC004768；NC004769；NC004770；NC003527；NC002133；X84655；Y11549；U76614)；其中長雙歧桿菌質粒20個，短雙歧桿菌質粒4個，星狀雙歧桿菌質粒1個，擬鏈狀雙歧桿菌2個；沒有發(fā)現(xiàn)兩歧雙歧桿菌質粒核苷酸序列的相關資料。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是獲得攜帶天然質粒的新的兩岐雙岐桿菌。
本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是提供一種兩岐雙岐桿菌(Bifidobacterium bifidum)，其含有DNA大小為10kb的天然質粒pBIF10。
上述的兩岐雙岐桿菌攜帶的質粒是1種多拷貝質粒。
更具體的，本發(fā)明所述的兩岐雙岐桿菌(Bifidobacterium bifidum)是由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的保藏號為CCTCC NoM203049的兩岐雙岐桿菌SHQ004。
以上所述的兩岐雙岐桿菌可應用于乳制品和保健食品的生產。
本發(fā)明還提供一種質粒，它是來自兩歧雙歧桿菌(Bifidobacteriumbifidum)的DNA大小為10kb的質粒。
進一步的，上述的質粒是一種多拷貝質粒。
本發(fā)明的兩岐雙岐桿菌(Bifidobacterium bifidum)SHQ004是從上百份健康青年糞便樣本，經多批次從100多個平板近1200多個菌落中分離到的攜帶有多個10Kb質粒(記作pBIF10)的兩歧雙歧桿菌(B.bifidum)，其特征如下(1)菌落特征該菌種接種在牛奶液體培養(yǎng)基中，在有氧條件下不生長，而在嚴格厭氧條件下生長良好。平板菌落為圓形、隆起、邊緣較整齊；菌苔乳白色，可見粘液狀，未見色素產生。
(2)菌體形態(tài)特征在光學顯微鏡下觀察，該菌體為桿狀，多變性，在一定的生長時期出現(xiàn)明顯的分叉、棍棒型、甚至大的圓點型，菌體變化較大；未見內生孢子形成，不運動，菌體內含有兩個或兩個以上明顯的顆粒，革蘭氏陽性。
(3)生理生化特性接觸酶陰性。能利用乳糖、半乳糖、果糖和蔗糖，不能利用海藻糖、麥芽糖、木糖、淀粉、山梨糖、棉子糖、松三糖、纖維二糖、菊糖、阿拉伯糖和核糖；也不能利用甘露醇、水楊苷和山梨醇。
(4)pBIF10質粒的特征pBIF10質粒為雙鏈環(huán)狀DNA分子，大小約10Kb，在1％瓊脂糖凝膠中電泳時出現(xiàn)單一的條帶。
(5)pBIF10質粒DNA提取操作方法a、取細菌沉淀0.5克，用1.0ml pH6.5的生理鹽水將細菌懸浮混勻，3500轉/分離心5-8分鐘，棄上清，沉淀用1.0ml的溶菌酶(40mg/ml，用pH8.0的生理鹽水現(xiàn)配)重懸，再加入300U的變溶菌素(mutanolysin，pH6.5)，混勻后37℃酶解30-60分鐘(30分鐘后取少許菌液在顯微鏡下觀察，有50％的原生質體出現(xiàn)即可)。
b、4000轉/分離心8-10分鐘，棄上清，沉淀用堿法裂解法操作(J.薩姆布魯克等著，金冬雁等譯，分子克隆實驗指南，第二版，科學出版社，1999年，P19-22)，方法同大腸桿菌。
c、將DNA樣品最后一步用75％冷酒精沉淀，倒置試管，流出殘余液體，自然空氣干燥10-15分鐘。
(6)質粒鑒定在自然干燥后的DNA樣品(沉淀)中加入40μl TE緩沖液溶解，溶解質粒DNA10-15分鐘，取10μl質粒DNA樣品，按照上述的《分子克隆實驗指南》所述的電泳方法，在1.0％瓊脂糖凝膠的加樣孔中分別加入λDNA(HindIII)分子量標準(大連寶生物工程公司產品)、未用RNA酶處理的人兩岐雙岐桿菌質粒DNA樣品、經RNA酶處理的人兩岐雙岐桿菌質粒DNA樣品。電泳30-60分鐘，經溴化乙錠(EB)染色在紫外燈下觀察。可見質粒樣品均有一條單一的DNA帶，位置在標準DNA分子的9.4Kb條帶之上，經凝膠成像系統(tǒng)分析，該質粒DNA的大小在10Kb左右。同時，沒有用RNA酶處理的質粒樣品，在質粒條帶之后近凝膠下邊緣處可見一拖尾的RNA降解物，證明細菌完全破裂，質粒提取是成功的。
本發(fā)明人在提取質粒時發(fā)現(xiàn)，質粒DNA的提取量可與相同細菌濃度的大腸桿菌DH5α質粒的量相當(EB染色后，紫外燈下與標準DNA濃度比較定量法)，因此本發(fā)明人認為pBIF10是多拷貝質粒。如果是單拷貝型質粒，其提取產量與相同細菌濃度的大腸桿菌DH5α質粒的量相比就低很多。
上述特征表明，該菌株為雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)的兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum)。它與現(xiàn)有的菌種有明顯區(qū)別，其主要不同點在于本發(fā)明的兩歧雙歧桿菌是攜帶1種多拷貝10kb天然質粒的人兩歧雙歧桿菌，其攜帶的多拷貝10kb質粒經過分子生物學手段改造，可以構建新的表達載體系統(tǒng)。
本發(fā)明的有益效果雙岐桿菌作為人體腸道正常微生物，具有抗衰老、防癌化、維持健康的作用。它通過細胞表面的磷壁酸吸附在小腸上皮細胞表面的受體上，雙歧桿菌的定植，使腸道菌相的構成發(fā)生改變，雙歧桿菌(死菌和活菌)及其代謝產物能抑制某些對人體有害的腸道菌的滋生，并降解由這些有害菌產生的毒素物質和食物中帶來的有致癌物如亞硝酸鹽等，同時，雙歧桿菌的大量繁殖，還有利于促進人體腸道的蠕動和消化液的分泌，發(fā)揮潤腸通便的功能，因此，可用于腸道疾病如腹瀉、便秘等的輔助治療和乳制品生產，本發(fā)明提供了一株新的符合衛(wèi)生部規(guī)定的雙岐桿菌益生菌菌株，為保健食品生產擴大了生產菌株的來源；同時還為構建新的質粒表達載體系統(tǒng)提供了可能。
以下通過實施例形式的具體實施方式
，對本發(fā)明的上述內容再作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。
具體實施例方式
實施例1雙岐奶的制備(1)人兩岐雙岐桿菌SHQ004母液的制備以厭氧菌增菌培養(yǎng)基PYG接種人兩岐雙岐桿菌SHQ004培養(yǎng)24小時，使兩岐雙歧桿菌SHQ004的細菌濃度達到109-1011個/ml。
(2)雙歧奶的制備取奶粉1.5g，水蘇糖(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院生產)2g，蔗糖5g，食用香精適量，冷無菌水溶解后，加熱水至100ml，調pH6.0，攪拌至完全溶解，裝瓶；將溶液在8磅下高壓滅菌30min，取出后冷至45℃，接種人兩岐雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum)SHQ004菌種母液1.0ml混勻；在37℃條件下厭氧發(fā)酵24小時即可。質量控制參考國家相關標準執(zhí)行。
實施例2潤腸通便、止腹瀉口服輔助治療制劑的制備以厭氧菌增菌培養(yǎng)基(如PYG或MRS等)培養(yǎng)24小時，使兩岐雙歧桿菌SHQ004的菌種濃度達到109-1011個/ml。取上述濃度菌液30％-40％(體積百分比)，加30％-40％(體積百分比)脫脂牛乳、20％-10％(體積百分比)蔗糖、5％-10％(體積百分比)海藻糖做分散劑和保護劑，充分混合后，于-80℃低溫冰箱預凍60分鐘，22-24小時內-30℃--70℃冷凍干燥。如果條件允許，可在真空干燥器內放置適量的無毒無嗅的干燥劑如硅膠等以縮短干燥時間，增加活菌數(shù)量，最后分裝成活菌粉膠囊或壓片，使每?；蛎科幒p歧桿菌活菌大于或等于0.5億。用于便秘、腹瀉等的輔助治療。
顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更，凡基于本發(fā)明上述內容所實現(xiàn)的技術均屬于本發(fā)明的范圍。
權利要求
1.一種兩岐雙岐桿菌(Bifidobacterium bifidum)，其特征在于其含有DNA大小為10kb的天然質粒pBIF10。
2.根據(jù)權利要求1所述的兩岐雙岐桿菌(Bifidobacterium bifidum)，其特征在于所述的質粒是1種多拷貝質粒。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的兩岐雙岐桿菌(Bifidobacterium bifidum)，其特征在于它是由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的保藏號為CCTCC NoM203049的兩岐雙岐桿菌SHQ004。
4.上述權利要求所述的兩岐雙岐桿菌在乳制品和保健食品生產上的應用。
5.一種質粒，其特征是來自兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum)的DNA大小為10kb的質粒。
6.根據(jù)權利要求5所述的質粒，其特征是它是一種多拷貝質粒。
全文摘要
一種攜帶質粒pBIF10的兩歧雙歧桿菌菌株及其應用。本發(fā)明公開了一種新的兩歧雙歧桿菌菌株及其在乳制品和保健食品生產上應用。解決其技術問題所采用的技術方案是提供一種兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum)，其含有1種DNA大小為10kb的多拷貝天然質粒pBIF10。更具體的，所述的兩岐雙岐桿菌是由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的保藏號為CCTCC NoM203049的兩岐雙岐桿菌SHQ004。本發(fā)明還提供一種質粒，它是來自本發(fā)明兩歧雙歧桿菌的一種DNA大小為10kb的多拷貝質粒。所述的兩岐雙岐桿菌可應用于乳制品和保健食品的生產。本發(fā)明的有益效果是提供了一株新的符合衛(wèi)生部規(guī)定的雙岐桿菌益生菌菌株，為保健食品生產擴大了生產菌株的來源；同時還為構建新的質粒表達載體系統(tǒng)提供了可能。
文檔編號A61K35/74GK1513984SQ03135638
公開日2004年7月21日 申請日期2003年8月21日 優(yōu)先權日2003年8月21日
發(fā)明者馬永平, 宋方洲, 邱宗蔭 申請人:馬永平