專利名稱：一種制備高活菌數(shù)兩歧雙歧桿菌菌粉的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物菌劑制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ー種提高兩歧雙歧桿菌凍干存活率的制備方法。
背景技術(shù)：
益生菌(Probiotics)是指當(dāng)攝入足夠的數(shù)量，能對宿主產(chǎn)生ー種或多種特殊且經(jīng)驗證的功能性健康益處的微生物，這些健康益處主要包括增加營養(yǎng)價值(促進(jìn)維生素、礦物質(zhì)的吸收)，治療輪狀病毒引起的腹瀉、旅游者腹瀉和抗生素引起的腹瀉，降低血清膽固醇含量，緩解乳糖不耐癥、過敏性皮炎、緩解腸易激綜合癥，以及調(diào)節(jié)人體免疫功能和腸道微生態(tài)平衡等。益生菌主要包括雙歧桿菌屬、乳酸桿菌、鏈球菌及酵母等，益生菌產(chǎn)品中常用的菌株為嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌(Bifidobateria)及干酪乳桿菌等。目前我國衛(wèi)生部批準(zhǔn)的可用于保健食品的益生菌菌種有嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、兩歧雙歧桿菌、嬰兒雙·歧桿菌、短雙歧桿菌、長雙歧桿菌、青青雙歧桿菌、保加利亞桿菌、嗜熱乳鏈球菌、羅伊氏乳桿菌、鼠李糖乳桿菌等。目前益生菌大部分應(yīng)用于乳制品中，包括發(fā)酵乳、乳酸菌飲料、干酪、酸奶、冷凍酸奶、乳飲料、奶粉、冰淇淋、豆奶及發(fā)酵豆奶等產(chǎn)品，也有用于點心、糖果、糕餅、蔬果汁等。近年來，為防止菌體飛散，取食便利及延長保質(zhì)期等因素，產(chǎn)品形式擴(kuò)展為以膠囊、粉包、顆粒狀包裝的菌體和發(fā)酵(乳)制品的干燥或凍干粉末。各國都開發(fā)了大量的益生菌產(chǎn)品，如日本含益生菌的制品非常盛行，所有大的乳品企業(yè)都有這樣的產(chǎn)品(如Yakult及Lola等)；法國所銷售酸奶的11%都含有雙歧桿菌，如達(dá)能的含有雙歧桿菌的Yoplait和Dannon兩大品牌廣為人知；歐盟的益生菌產(chǎn)品有Naturebifidus及Natural bio yoghurt等；美國的產(chǎn)品有Future biotic及LosArgeles等。我國也有一些益生菌制劑和益生菌乳制品，益生菌制劑如金雙歧、麗珠腸樂和貝飛達(dá)，乳制品如蒙牛的“冠益乳”、光明的“ AB100”、三元的“益菌多”、伊利的“輕果激揚”、龍丹的“益加菌酸牛奶”等。與國外相比，國內(nèi)的益生菌制劑品種少，且使用的菌株少，主要原因是高活性益生菌菌粉的制備存在一定難度。益生菌乳制品主要為酸奶等液態(tài)乳制品，奶粉中含益生菌的產(chǎn)品各企業(yè)尚未商品化，原因是益生菌非常嬌氣，對高溫、熱干燥過程等的抵抗性差、易死亡。因此，高活性益生菌菌粉是益生菌產(chǎn)品生產(chǎn)的關(guān)鍵，所以制備常用的兩歧雙歧桿菌菌粉很有必要。目前兩歧雙歧桿菌(Bifidobateria bifidum)菌粉的制備主要采用真空冷凍干燥的方法。而冷凍干燥和噴霧干燥對微生物都具有破壞作用，尤其是細(xì)菌細(xì)胞膜。益生菌若直接進(jìn)行冷凍干燥，死亡率將達(dá)90%以上。凍干過程中影響益生菌存活率及菌粉活菌數(shù)的主要因素有菌株種類、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、菌齡、預(yù)凍條件、菌懸液濃度、凍干保護(hù)劑、細(xì)胞膜成分、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)種類、水分含量及亞致死處理等。目前提高雙歧桿菌菌粉凍干存活率的方法多集中在凍干保護(hù)劑的篩選，主要從糖類、鹽類、蛋白質(zhì)、氨基酸等物質(zhì)中得到各種復(fù)合保護(hù)劑。復(fù)合保護(hù)劑的添加量越多，導(dǎo)致單位質(zhì)量菌粉活菌數(shù)越低。因此，從改變菌株自身抗凍能力來減少保護(hù)劑的添加量很有必要。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)所存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種高活菌數(shù)兩歧雙歧桿菌菌粉的制備方法，能顯著提高兩歧雙歧桿菌的凍干存活率及菌粉活菌數(shù)。本發(fā)明提供的高活菌數(shù)兩歧雙歧桿菌菌粉的制備方法，具體方法如下先將兩歧雙歧桿菌在含有0. 5g/L半胱氨酸鹽酸鹽的MRS肉湯中37°C培養(yǎng)18 24h，再將培養(yǎng)液在8 10°C靜置2 4h，然后以5000 7000rpm離心10 15min，棄去上清液，獲得兩歧雙歧桿菌菌泥；加入2倍菌泥重量的含有l(wèi)g/L蛋白胨的無菌生理鹽水，調(diào)菌懸液pH至3. 5 5，靜置0. 5 Ih后，以5000 6000rpm離心10 15min，棄上清液獲得兩歧雙歧桿菌菌泥；按菌泥等重量加入含有100 200g/L脫脂乳粉的pH為6. 8的磷酸緩沖液，混合均勻后在_40°C下預(yù)凍8 12h，最后在4 6Pa下冷凍干燥18 24h，即獲得兩歧雙歧桿菌菌粉。本發(fā)明方法中所加入的脫脂乳粉可以通過穩(wěn)定細(xì)胞膜的組成來防止細(xì)胞損傷，在 冷凍干燥過程中形成多孔結(jié)構(gòu)，使脫水更容易，而且脫脂乳粉本身所含蛋白質(zhì)可為細(xì)胞提供保護(hù)層的作用；磷酸緩沖液可防止細(xì)胞蛋白質(zhì)凝結(jié)和改變細(xì)胞膜的物理性質(zhì)，從而減少其在的冷凍干燥中死亡率。本發(fā)明將兩歧雙歧桿菌先置于低溫環(huán)境中冷休克，再置于酸性環(huán)境中酸休克處理，前者誘導(dǎo)菌體內(nèi)產(chǎn)生抗凍蛋白并改變其細(xì)胞脂肪酸的組成，后者使其在不利條件下合成蛋白，這種亞致死處理能增強(qiáng)兩歧雙歧桿菌的抗逆能力，從而顯著提高兩歧雙歧桿菌的凍干存活率及菌粉活菌數(shù)。實驗結(jié)果表明采用本發(fā)明方法的兩歧雙歧桿菌凍干存活率為75%以上、菌粉活菌數(shù)大于2X10ncfU/g，未經(jīng)亞致死處理的兩歧雙歧桿菌凍干存活率為48%左右，菌粉活菌數(shù)為lO'fu/g左右。本發(fā)明具有方法簡單、操作容易、成本低廉、容易實現(xiàn)規(guī)模產(chǎn)業(yè)化的優(yōu)點。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實例詳細(xì)說明本發(fā)明技術(shù)方案的實施方式和效果。實施例I、將MRS肉湯在118°C下滅菌后冷卻至室溫，按無菌操作加入過濾除菌的半胱氨酸鹽酸鹽溶液，使半胱氨酸鹽酸鹽的終濃度為0.5g/L;按5% (V/V)接種量接入兩歧雙歧桿菌，37°C培養(yǎng)22h后，將培養(yǎng)液在9°C靜置2. 5h，再以6500rpm離心lOmin，棄去上清液，獲得兩歧雙歧桿菌菌泥；稱重菌泥，加入2倍菌泥重量的含有l(wèi)g/L蛋白胨的無菌生理鹽水，混勻后用硫酸溶液調(diào)菌懸液pH至5. 0，靜置0. 5h，以5500rpm離心lOmin，棄上清液獲得兩歧雙歧桿菌菌泥；再加入菌泥等重量的含有200g/L脫脂乳粉的pH為6. 8的磷酸緩沖液，混合均勻后在_40°C下預(yù)凍8h，再置入冷凍干燥機(jī)在4 6Pa下凍干18h，即獲得兩歧雙歧桿菌菌粉。經(jīng)檢測，兩歧雙歧桿菌凍干存活率為89. 28%，菌粉活菌數(shù)為2. 71X10ncfu/g ;以未經(jīng)休克處理為對照，對照組的存活率為48. 11%，菌粉活菌數(shù)為I. 24X101(lCfu/g。實施例2、將MRS肉湯在118°C下滅菌后冷卻至室溫，按無菌操作加入過濾除菌的半胱氨酸鹽酸鹽溶液，使半胱氨酸鹽酸鹽的終濃度為0.5g/L;按5% (V/V)接種量接入兩歧雙歧桿菌，37°C培養(yǎng)20h后，將培養(yǎng)液在10°C靜置3h，再以5500rpm離心lOmin，棄去上清液，獲得兩歧雙歧桿菌菌泥；稱重菌泥，加入2倍菌泥重量的含有l(wèi)g/L蛋白胨的無菌生理鹽水，混勻后用硫酸溶液調(diào)菌懸液pH至4. O，靜置0. 75h，以5000rpm離心12min，棄上清液獲得兩歧雙歧桿菌菌泥；再加入菌泥等重量的含有150g/L脫脂乳粉的pH為6. 8的磷酸緩沖液，混合均勻后在-40°C下預(yù)凍12h，再置入冷凍干燥機(jī)在4 6Pa下凍干21h，即獲得兩歧雙歧桿菌菌粉。經(jīng)檢測，兩歧雙歧桿菌凍干存活率為78. 53%，菌粉活菌數(shù)為2. 42X10ncfu/g ;以未經(jīng)休克處理為對照，對照組的存活率為48. 27%，菌粉活菌數(shù)為I. 13X101(lCfu/g。實施例3、將MRS肉湯在118°C下滅菌后冷卻至室溫，按無菌操作加入過濾除菌的半胱氨酸鹽酸鹽溶液，使半胱氨酸鹽酸鹽的終濃度為0. 5g/L ;按5% (V/V)接種量接入兩歧雙歧桿菌，37°C培養(yǎng)18h后，將培養(yǎng)液在8°C靜置2h，再以6000rpm離心lOmin，棄去上清液，獲得兩歧雙歧桿菌菌泥；稱重菌泥，加入2倍菌泥重量的含有l(wèi)g/L蛋白胨的無菌生理鹽水，混勻后用硫酸溶液調(diào)菌懸液pH至4. O，靜置0. 85h，以6000rpm離心15min，棄上清液獲得兩歧雙歧 桿菌菌泥；再加入菌泥等重量的含有100g/L脫脂乳粉的pH為6. 8的磷酸緩沖液，混合均勻后在_40°C下預(yù)凍12h，再置入冷凍干燥機(jī)在4 6Pa下凍干20h，即獲得兩歧雙歧桿菌菌粉。經(jīng)檢測，兩歧雙歧桿菌凍干存活率為78. 13%，菌粉活菌數(shù)為2. 37X10ncfu/g ;以未經(jīng)休克處理為對照，對照組的存活率為47. 32%，菌粉活菌數(shù)為I. 18X101(lCfu/g。
權(quán)利要求
1.一種高活菌數(shù)兩歧雙歧桿菌菌粉的制備方法，其特征在于，具體方法為先將兩歧雙歧桿菌在含有0. 5g/L半胱氨酸鹽酸鹽的MRS肉湯中37°C培養(yǎng)18 24h，再將培養(yǎng)液在8 10°C靜置2 4h，經(jīng)離心棄去上清液，獲得兩歧雙歧桿菌菌泥；加入2倍菌泥重量的含有l(wèi)g/L蛋白胨的無菌生理鹽水，調(diào)菌懸液pH至3. 5 5，靜置0. 5 Ih后，離心棄上清液，獲得兩歧雙歧桿菌菌泥；按菌泥等重量加入含有100 200g/L脫脂乳粉的pH為6. 8的磷酸緩沖液，混合均勻后在_40°C下預(yù)凍8 12h，最后在4 6Pa下冷凍干燥18 24h，即獲得兩歧雙歧桿菌菌粉。
全文摘要
一種高活菌數(shù)兩歧雙歧桿菌菌粉的制備方法，本發(fā)明采用先于低溫環(huán)境中冷休克、再于酸性環(huán)境中酸休克處理，前者誘導(dǎo)菌體內(nèi)產(chǎn)生抗凍蛋白并改變其細(xì)胞脂肪酸的組成，后者使其在不利條件下合成蛋白，這種亞致死處理能增強(qiáng)兩歧雙歧桿菌的抗逆能力，從而顯著提高兩歧雙歧桿菌的凍干存活率及菌粉活菌數(shù)。實驗結(jié)果表明采用本發(fā)明方法的兩歧雙歧桿菌凍干存活率為75％以上、菌粉活菌數(shù)大于2×1011cfu/g，未經(jīng)亞致死處理的兩歧雙歧桿菌凍干存活率為48％左右，菌粉活菌數(shù)為1010cfu/g左右。本發(fā)明具有方法簡單、操作容易、成本低廉、容易實現(xiàn)規(guī)模產(chǎn)業(yè)化的優(yōu)點。
文檔編號C12R1/01GK102757923SQ201210266369
公開日2012年10月31日 申請日期2012年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月30日
發(fā)明者徐升運, 秦濤, 舒國偉, 陳合, 馬齊 申請人:陜西省科學(xué)院酶工程研究所