專(zhuān)利名稱(chēng)：嗜酸乳桿菌復(fù)合凍干保護(hù)劑及其制備和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物菌制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ー種制備高活性嗜酸乳桿菌菌粉的復(fù)合凍干保護(hù)劑及其制備和使用方法。
背景技術(shù)：
嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)為乳桿菌屬，革蘭氏陽(yáng)性,不產(chǎn)芽孢，無(wú)鞭毛、莢膜、芽孢的細(xì)長(zhǎng)桿菌，不運(yùn)動(dòng)，以單個(gè)、成雙或短鏈形式存在，可發(fā)酵糖產(chǎn)生乳酸、こ醇、過(guò)氧化氫等厭氧或兼性厭氧的微生物，能利用葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖進(jìn)行同型發(fā)酵，產(chǎn)生DL型乳酸。目前嗜酸乳桿菌菌粉的制備主要采用真空凍干技術(shù)，但嗜酸乳桿菌如果直接進(jìn)行 冷凍干燥，存活率極低，因此篩選合適的保護(hù)劑至關(guān)重要。保護(hù)劑的作用與其化學(xué)結(jié)構(gòu)有密切關(guān)系，應(yīng)具有3個(gè)以上的氫鍵或ー些離子基團(tuán)，它們能夠取代水與細(xì)菌蛋白質(zhì)結(jié)合，保證蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，防止凍干時(shí)細(xì)胞內(nèi)外冰晶的形成；保護(hù)劑的持水性可使凍干過(guò)程中細(xì)胞的水分不至于急劇下降，而使細(xì)胞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)免遭破壞；保護(hù)劑能將菌體包裹其中，減少菌體與氧接觸，降低細(xì)胞代謝。因此，開(kāi)發(fā)復(fù)合凍干保護(hù)劑是制備高活性嗜酸乳桿菌菌粉的關(guān)鍵。已有報(bào)道的一種嗜酸乳桿菌凍干保護(hù)劑，其組成為脫脂乳(16% )、麥芽糊精(10% )、海藻糖(10% )、L-谷氨酸、維生素C(2% )、甘油(2% )、MnSO4(0.8% )，用其制得嗜酸乳桿菌凍干菌粉的活菌數(shù)101(lCfU/g(徐麗萍.嗜酸乳桿菌凍干菌粉保護(hù)劑選擇的研究.食品エ業(yè)科技，2007，28 (5) =119-122) 中國(guó)專(zhuān)利(申請(qǐng)?zhí)?00910236172. 8)公開(kāi)了ー種嗜酸乳桿菌凍干復(fù)合保護(hù)劑及其應(yīng)用方法，其中的凍干保護(hù)劑的組成為脫脂奶粉、甘油、乳糖、谷氨酸鈉及維生素C。由于甘油的添加導(dǎo)致菌粉易吸水變潮濕，導(dǎo)致嗜酸乳桿菌在貯存過(guò)程中死亡速度加快，降低了產(chǎn)品中的活菌數(shù)；此外，益生菌制劑一般要求菌粉中無(wú)乳成分，因此脫脂乳(粉)的添加對(duì)嗜酸乳桿菌凍干菌粉在非乳制品中的應(yīng)用帶來(lái)不便。現(xiàn)有的保護(hù)劑中都含脫脂牛乳、血清、甘油、明膠、阿東糖、蔗糖、葡萄糖和乳糖等。有研究表明，大分子保護(hù)劑在単獨(dú)使用時(shí)對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用效果不明顯；若選擇合適的大分子與小分子混合的保護(hù)劑，在保存期間能維持較高的細(xì)胞存活率；但由于微生物形態(tài)的差異和對(duì)環(huán)境條件要求的不同往往凍干效果相差很大、穩(wěn)定性差，其凍干存活率為40%左右，菌粉活菌數(shù)在IO8 lO'fu/g ;由于其中加有甘油使得在貯存期間容易吸潮，造成菌種大量死亡、菌粉貯存期短，達(dá)不到商品要求的活菌數(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種嗜酸乳桿菌復(fù)合凍干保護(hù)劑及其制備和使用方法，該保護(hù)劑中無(wú)乳成分和甘油，解決嗜酸乳桿菌菌粉在凍干過(guò)程中的活菌數(shù)低、存活率不高、凍干菌粉容易吸水受潮以及不便在制劑中使用的問(wèn)題。本發(fā)明的嗜酸乳桿菌復(fù)合凍干保護(hù)劑，其特征在于，所述復(fù)合凍干保護(hù)劑的組成為乳糖3 6g,半乳糖5 8g,海藻糖4 6g, Na2HPO4 0. 5 0. 8g,抗壞血酸鈉0. 7 I. 3g 和 MgSO4 0. 2 0. 4g，及 IOOmL 無(wú)菌水。本發(fā)明復(fù)合凍干保護(hù)劑的組成還可以為乳糖3. 5 5. 5g，半乳糖5. 5 7. 5g，海藻糖 4 6g, Na2HPO4 0. 5 0. 75g,抗壞血酸鈉 0. 8 I. 25g 和 MgSO4O. 2 0. 4g,及 IOOmL無(wú)菌水。本發(fā)明的嗜酸乳桿菌復(fù)合凍干保護(hù)劑的制備方法為將抗壞血酸鈉溶解于適量的無(wú)菌生理鹽水中，過(guò)濾除菌得溶液A ;再用余量的蒸餾水加熱溶解乳糖、半乳糖、海藻糖、Na2HPO4和MgSO4混合均勻；110°C滅菌15min，冷卻后得溶液B ;將溶液A與溶液B混合均勻，即得復(fù)合凍干保護(hù)劑產(chǎn)品。本發(fā)明的嗜酸乳桿菌復(fù)合凍干保護(hù)劑的使用方法為，將離心收集的嗜酸乳桿菌菌泥與所述的保護(hù)劑按I : 2的體積比混合均勻，于-40°c預(yù)凍3 8h，再于4 6Pa條件下冷凍干燥18 24h，得嗜酸乳桿菌菌粉。
本發(fā)明凍干保護(hù)劑的組分分為滲透型和非滲透型兩類(lèi)，海藻糖屬于非滲透型，其不能進(jìn)入細(xì)胞，能使溶液呈過(guò)冷狀態(tài)，在低溫條件下降低溶質(zhì)濃度，從而起到保護(hù)作用；乳糖、半乳糖、Na2HPO4、抗壞血酸鈉和MgSO4屬于滲透型，其在溶液中易結(jié)合水分子發(fā)生水合作用，使溶液的粘性増加，從而弱化水的結(jié)晶過(guò)程，達(dá)到保護(hù)目的，但各組分的使用濃度、滲入細(xì)胞的能力、對(duì)水分子活性的影響等各不相同。此外，保護(hù)劑中的糖類(lèi)具有多個(gè)羥基，在凍干過(guò)程中可取代水分子與菌體細(xì)胞膜磷脂中的磷酸基團(tuán)或與菌體蛋白質(zhì)極性基團(tuán)形成氫鍵，保護(hù)細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的完整性。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明保護(hù)劑由乳糖、半乳糖、海藻糖，Na2HPO4，抗壞血酸鈉和MgSO4組成，不含有甘油成分，提高了嗜酸乳桿菌冷凍干燥保藏的存活率(存活率在85%以上)和穩(wěn)定性，延長(zhǎng)了嗜酸乳桿菌粉的保藏期(保存期I年，菌粉活菌數(shù)大于10ncfU/g)；并由于不含乳成分，可以廣泛應(yīng)用于非乳制品中；本發(fā)明的制備方法和使用方法簡(jiǎn)單、易操作、成本低。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)施方式和使用效果。實(shí)施例I、先稱(chēng)取7g乳糖、IIg半乳糖、8. 5g海藻糖、I. 3g Na2HPO4和0.4g MgSO4,加熱溶解于180mL蒸餾水中，經(jīng)110°C滅菌15min，冷卻至室溫；再將2g抗壞血酸鈉溶解于20mL無(wú)菌生理鹽水中，用0. 22 pm無(wú)菌濾膜過(guò)濾除菌；再將濾液與冷卻后的溶液按無(wú)菌操作要求混合均勻，即得復(fù)合凍干保護(hù)劑。將嗜酸乳桿菌經(jīng)活化檢查無(wú)雜菌，形態(tài)無(wú)異常后，將其按4% (v/v)的接種量接入MRS培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度為37°C，兼性厭氧發(fā)酵培養(yǎng)18h后，6000r/min離心lOmin，獲得嗜酸乳桿菌菌泥；按體積比I : 2加入上述凍干保護(hù)劑，搖勻靜置30min，在-40°C低溫冰箱中預(yù)凍4h后，置入凍干機(jī)在4 6Pa下冷凍干燥20h，即得加有保護(hù)劑的嗜酸乳桿菌菌粉。經(jīng)檢測(cè)，凍干存活率為85. 21%，菌粉活菌數(shù)為3. 69X10ncfu/g。實(shí)施例2、先將8. 5g乳糖、12g半乳糖、IOg海藻糖、1.2g Na2HPO4和0.6g MgSO4，加熱溶解于185mL蒸懼水中，經(jīng)110°C滅菌15min,冷卻至室溫；再將I. 7g抗壞血酸鈉溶解于15mL無(wú)菌生理鹽水，用0. 22 無(wú)菌濾膜過(guò)濾除菌；再將濾液與冷卻后的溶液按無(wú)菌操作要求混合均勻，即得復(fù)合凍干保護(hù)劑。按實(shí)施例I方法獲得嗜酸乳桿菌菌泥，按體積比I : 2加入上述凍干保護(hù)劑，搖勻靜置30min，在_40°C低溫冰箱中預(yù)凍6h后，置入凍干機(jī)在4 6Pa下冷凍干燥18h，即得加有保護(hù)劑的嗜酸乳桿菌菌粉。經(jīng)檢測(cè)，凍干存活率為87. 68%，菌粉活菌數(shù)為3. 21 X 10ncfu/g。實(shí)施例3、先將Ilg乳糖、15g半乳糖、12g海藻糖、1.5g Na2HPO4和0.8g MgSO4，加熱溶解于180mL蒸餾水中，經(jīng)110°C滅菌15min，冷卻至室溫；再將2. 5g抗壞血酸鈉溶解于20mL無(wú)菌生理鹽水中，用0. 22 pm無(wú)菌濾膜過(guò)濾除菌；再將濾液與冷卻后的溶液按無(wú)菌操作要求混合均勻，即得復(fù)合凍干保護(hù)劑。按實(shí)施例I方法獲得嗜酸乳桿菌菌泥；按體積比I : 2加入上述凍干保護(hù)劑，搖勻靜置30min，在_40°C低溫冰箱中預(yù)凍8h后，置入凍干機(jī)在4 6Pa下冷凍干燥24h，即得加有保護(hù)劑的嗜酸乳桿菌菌粉。 經(jīng)檢測(cè)，凍干存活率為92. 68%，菌粉活菌數(shù)為3. 81 X 10ncfu/g。
權(quán)利要求
1.一種嗜酸乳桿菌復(fù)合凍干保護(hù)劑，其特征在于，所述復(fù)合凍干保護(hù)劑的組成為乳糖3 6g,半乳糖5 8g,海藻糖4 6g, Na2HPO4 0. 5 0. 8g,抗壞血酸鈉0. 7 I. 3g和MgSO4 0. 2 0. 4g,及 IOOmL 無(wú)菌水。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的復(fù)合凍干保護(hù)劑，其特征在干，復(fù)合凍干保護(hù)劑的組成為乳糖3. 5 5. 5g,半乳糖5. 5 7. 5g,海藻糖4 6g, Na2HPO4O. 5 0. 75g,抗壞血酸鈉0. 8 1.25g 和 MgSO4 0. 2 0. 4g，及 IOOmL 無(wú)菌水。
3.制備權(quán)利要求I所述的嗜酸乳桿菌復(fù)合凍干保護(hù)劑的方法，其特征在于，是將抗壞血酸鈉溶解于適量的無(wú)菌生理鹽水，過(guò)濾除菌得溶液A ;再用余量的蒸餾水加熱溶解乳糖、半乳糖、海藻糖、Na2HPO4和MgSCV混合均勻；110°C滅菌15min，冷卻后得溶液B ;將溶液A與溶液B混合均勻，即得嗜酸乳桿菌復(fù)合凍干保護(hù)劑產(chǎn)品。
4.按照權(quán)利要求I所述的嗜酸乳桿菌復(fù)合凍干保護(hù)劑的使用方法，其特征在于，將離心收集的嗜酸乳桿菌菌泥與所述的凍干保護(hù)劑按I : 2的體積比混合均勻，于-40°C預(yù)凍3 8h，再于4 6Pa條件下冷凍干燥18 24h，得嗜酸乳桿菌菌粉。
全文摘要
一種嗜酸乳桿菌復(fù)合凍干保護(hù)劑及其制備和使用方法，本發(fā)明保護(hù)劑的組成為乳糖、半乳糖、海藻糖、Na2HPO4、抗壞血酸鈉、MgSO4。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明保護(hù)劑不含有甘油，提高了嗜酸乳桿菌冷凍干燥保藏的存活率(存活率在85％以上)和穩(wěn)定性，延長(zhǎng)了嗜酸乳桿菌粉的保藏期(保存期1年，菌粉活菌數(shù)大于1011cfu/g)；并由于不含乳成分，可以廣泛應(yīng)用于非乳制品中；本發(fā)明的制備方法和使用方法簡(jiǎn)單、易操作、成本低。
文檔編號(hào)C12N1/04GK102757922SQ201210266368
公開(kāi)日2012年10月31日 申請(qǐng)日期2012年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月30日
發(fā)明者付博, 秦濤, 舒國(guó)偉, 陳合, 馬齊 申請(qǐng)人:陜西省科學(xué)院酶工程研究所