專利名稱：一種治療腫瘤的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥品，特別是治療腫瘤的組合物藥品。
背景技術(shù)：
沙棘為胡頹子科沙棘屬植物。沙棘總黃酮是從沙棘中提取出來的黃酮類化合物，黃酮類化合物存在于沙棘的各個部位當(dāng)中?？刹捎盟蛩?醇法從沙棘中提取沙棘總黃酮，另外超臨界法也可用于從沙棘中提取沙棘總黃酮。以往的研究表明沙棘總黃酮具有遏制粥樣動脈硬化、降低血液膽固醇的作用。沙棘總黃酮還具有增加心臟的收縮和舒張功能，有明顯的抗心肌缺血和抗心率失常作用。
中藥苦參是豆科植物苦參的根，苦參中含有的生物堿具有一定抗腫瘤作用和抗病毒作用等藥理作用。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于上述，本發(fā)明的目的在于提供一種治療腫瘤的新的組合物。
本發(fā)明的一種治療腫瘤的組合物，包含有治療有效劑量的沙棘總黃酮和苦參堿。
上述的沙棘總黃酮是從沙棘屬植物中提取出的黃酮總體。上述的沙棘總黃酮為按本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的提取方法，如水醇法，從各種沙棘中提取出來的所有黃酮類化合物的總體混合物。沙棘總黃酮中主要有異鼠李素，槲皮素、異鼠李素-3-O-鼠李半乳糖甙、異鼠李素-3-O-葡萄糖甙、異鼠李素-3-O-鼠李葡萄糖甙、異鼠李素-3-O-半乳糖甙、異鼠李素-7-O-鼠李糖甙、槲皮素-3-O-半乳糖甙、槲皮素-3-O-葡萄糖甙、槲皮素-7-O-鼠李糖甙等。
上述的苦參堿是苦參總生物堿、苦參堿單體、氧化苦參堿單體或氧化苦參堿單體與苦參堿單體的混合物。上述的苦參總生物堿是指從各種苦參中按本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的提取方法，從各種苦參中提取出來的所有生物堿類化合物的總體混合物?？鄥⒖偵飰A主要有苦參堿、氧化苦參堿、羥基苦參堿、去氫苦參堿、巴普葉堿、安那吉堿等。
本組合物中上述的沙棘總黃酮和苦參堿按重量份計量的含量是沙棘總黃酮1～10，苦參堿1～10。較好是沙棘總黃酮1～3，苦參堿1～3。最好是沙棘總黃酮3，苦參堿1。
本發(fā)明的組合物適用于治療腫瘤，特別是適用于治療宮頸癌、肝癌、舌鱗癌、肺腺癌等腫瘤。
本發(fā)明的組合物治療腫瘤的機理如下1、誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡和分化施以本組合物后的腫瘤細胞的形態(tài)和生長曲線測定，以及流式細胞儀檢測的結(jié)果來看。本組合物可以誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡和分化，從而產(chǎn)生治療腫瘤的作用。
2、抑制腫瘤細胞的增殖通過3H-TdR(3H標(biāo)記的脫氧胸腺嘧啶核苷酸)摻入實驗及流式細胞儀檢測的結(jié)果，本組合物可以抑制DNA的合成并且可以抑制腫瘤細胞的增殖。經(jīng)本組合物處理的腫瘤細胞被阻止于細胞周期中的G0/G1(細胞周期中的間期0期和1期)期，進入分裂期的腫瘤細胞比例下降。
3、影響腫瘤細胞基因的表達腫瘤細胞的基因表達在被施用本組合物前后有明顯的變化。通過流式細胞儀的檢測，施用本組合物后，腫瘤細胞的Bcl-2、c-myc和c-ha-ras的表達明顯降低，同時P-53、Bax的表達上升。c-myc和c-ha-ras的表達過量與腫瘤形成有密切關(guān)系，而bcl-2是抑制腫瘤細胞凋亡的基因。p53基因可促進腫瘤細胞凋亡；bax基因的表達上升也可以促進腫瘤細胞的凋亡。bcl-2、c-myc和c-ha-ras三個基因在本組合物處理過的腫瘤細胞中表達降低，同時p53、bax的表達上升說明了本組合物可使腫瘤細胞產(chǎn)生分化凋亡。
本發(fā)明的組合物中的沙棘總黃酮和苦參堿共同使用可以通過以上三種機理來達到治療腫瘤的作用。而且，沙棘總黃酮和苦參堿共同使用可以產(chǎn)生協(xié)同作用，與僅單獨使用沙棘總黃酮或僅單獨使用苦參堿相比，在相同的劑量下可以更有效的治療腫瘤。
為了方便治療使用，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，將本組合物制成適合使用的劑型。比如將本組合物溶于適當(dāng)溶劑如生理鹽水制備成靜脈輸注液；或?qū)⒈窘M合物制成粉末添加適當(dāng)賦形劑制備成口服劑型，如膠囊、片劑等。
為了更好地理解本發(fā)明，下面用藥效實驗和動物體內(nèi)抗腫瘤實驗來說明本組合物對腫瘤的治療作用。
一、本組合物對腫瘤治療的藥效實驗。以下的本組合物中按重量份計量的含量是沙棘總黃酮3，苦參堿1。
(一)本組合物對人宮頸癌細胞(Hela細胞)的藥效實驗。
接種細胞以2×105個/ml于25ml培養(yǎng)瓶中，第二天隨機分組加藥，治療組采用含濃度為20μg/ml本組合物的細胞培養(yǎng)液來處理Hela細胞，陰性對照組為采用不含本組合物的培養(yǎng)液處理Hela細胞。
1、細胞形態(tài)接種細胞以2×105個/ml于25ml培養(yǎng)瓶中，第二天隨機分組加藥，藥物處理兩天后在倒置顯微鏡下觀察。
對照組腫瘤細胞排列密集，細胞呈圓形，核大核仁多。
治療組腫瘤細胞排列稀疏，細胞呈長形或多邊形，部分細胞內(nèi)出現(xiàn)大小不等的空泡。
2、細胞生長測定采用MTT法(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑)測定Hela細胞對照組與治療組的生長情況。

經(jīng)本組合物處理后的腫瘤細胞與對照組細胞相比，細胞生長受到明顯抑制。
3、平板集落形成實驗接種細胞以2×105個/ml于25ml培養(yǎng)瓶中，第二天隨機分組加藥，藥物處理兩天后以每一平皿500個細胞換普通培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)7天后，經(jīng)甲醇固定、Giemsa染色(姬姆薩染色)。計數(shù)集落總數(shù)及集落形成率。

經(jīng)本組合物處理后的腫瘤細胞與對照組細胞相比，細胞集落形成率明顯降低，說明腫瘤細胞在沙棘總黃酮作用后增殖能力下降。
4、3H-TdR(3H標(biāo)記的脫氧胸腺嘧啶核苷酸)摻入實驗藥物處理24小時后加入3H-TdR(終濃度為0.5μCi/ml(μCi微居))，4小時后消化，離心后蒸餾水溶解細胞，采用紙片法在液體閃爍計數(shù)器上測定細胞的cpm(每分鐘脈沖數(shù))值

經(jīng)本組合物處理后的腫瘤細胞與對照組細胞相比，3H-TdR摻入明顯較少。說明腫瘤細胞經(jīng)本組合物作用后DNA合成下降，腫瘤細胞的生長受到抑制。
5、流式細胞儀檢測結(jié)果

注G0/G1細胞周期中的間期0期和1期。
S細胞周期中的DNA合成期。
G2+MG2是細胞周期中的間期2期，M是細胞周期中的分裂期。
經(jīng)本組合物處理后的腫瘤細胞與對照組細胞相比，腫瘤細胞處于細胞周期中的G0/G1期的比例上升，處于G2+M期的腫瘤細胞比例下降。分裂期的腫瘤細胞比例下降，表示本組合物降低了腫瘤的分裂增生速度。同時被本組合物作用后的腫瘤細胞凋亡率明顯上升，基因表達改變，分化程度升高。
6、結(jié)論Hela細胞(人宮頸癌細胞)在經(jīng)本組合物處理后，細胞形態(tài)改變、增殖變慢、集落形成率降低、3H-TdR摻入減少、細胞周期分布改變、基因表達率改變、凋亡率增加。說明本組合物使Hela細胞分化凋亡，并且降低Hela細胞的DNA合成速率和增殖能力，達到治療宮頸癌的作用。
(二)本組合物對人舌鱗癌細胞(Tca-8113細胞)的藥效實驗。
接種細胞以2×105個/ml于25ml培養(yǎng)瓶中，第二天隨機分組加藥，治療組采用含濃度為20μg/ml本組合物的細胞培養(yǎng)液來處理Tca-8113細胞，陰性對照組為采用不含本組合物的培養(yǎng)液處理Tca-8113細胞。
1、細胞形態(tài)接種細胞以2×105個/ml于25ml培養(yǎng)瓶中，第二天隨機分組加藥，藥物處理兩天后在倒置顯微鏡下觀察。
對照組腫瘤細胞排列密集，細胞呈圓形，核大核仁多。
治療組腫瘤細胞排列稀疏，細胞呈長形或多邊形，部分細胞內(nèi)出現(xiàn)大小不等的空泡。
2、細胞生長測定采用MTT法測定Tca-8113細胞對照組與治療組的生長情況。

經(jīng)本組合物處理后的腫瘤細胞與對照組細胞相比，細胞生長受到明顯抑制。
3、平板集落形成實驗接種細胞以2×105個/ml于25ml培養(yǎng)瓶中，第二天隨機分組加藥，藥物處理兩天后以每一平皿500個細胞換普通培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)7天后，經(jīng)甲醇固定、Giemsa染色(姬姆薩染色)。計集落總數(shù)及集落形成率。

經(jīng)本組合物處理后的腫瘤細胞與對照組細胞相比，細胞集落形成率明顯降低，說明腫瘤細胞在本組合物作用后增殖能力下降。
4、3H-TdR摻入實驗藥物處理24小時后加入3H-TdR(終濃度為0.5gCi/ml)，4小時后消化，離心后蒸餾水溶解細胞，采用紙片法在液體閃爍計數(shù)器上測定細胞的cpm值

經(jīng)本組合物處理后的腫瘤細胞與對照組細胞相比，3H-TdR摻入明顯較少。說明腫瘤細胞經(jīng)本組合物作用后DNA合成下降，腫瘤細胞的生長受到抑制。
5、流式細胞儀檢測結(jié)果

本組合物處理后的腫瘤細胞與對照組細胞相比，腫瘤細胞處于細胞周期中的G0/G1期比例上升，處于G2+M期的腫瘤細胞比例下降。分裂期的腫瘤細胞比例下降，表示本組合物降低了腫瘤的分裂增生速度。同時被本組合物作用后的腫瘤細胞凋亡率明顯上升，基因表達改變，分化程度升高。
6、結(jié)論Tea-8113細胞(人舌鱗癌細胞)在經(jīng)本組合物處理后，細胞形態(tài)改變、增殖變慢、集落形成率降低、3H-TdR摻入減少、細胞周期分布改變、基因表達率改變、凋亡率增加。說明本組合物使Tea-8113細胞分化凋亡，并且降低Tca-8113細胞的DNA合成速率和增殖能力，達到治療舌鱗癌的作用。
(三)本組合物對人肝癌細胞(SMMC-7721細胞)的藥效實驗。
接種細胞以2×105個/ml于25ml培養(yǎng)瓶中，第二天隨機分組加藥，治療組采用含濃度為20μg/ml本組合物的細胞培養(yǎng)液來處理SMMC-7721細胞，陰性對照組為采用不含本組合物的培養(yǎng)液處理SMMC-7721細胞。
1、細胞形態(tài)接種細胞以2×105個/ml于25ml培養(yǎng)瓶中，第二天隨機分組加藥，藥物處理兩天后在倒置顯微鏡下觀察。
對照組腫瘤細胞排列密集，細胞呈圓形，核大核仁多。
治療組腫瘤細胞排列稀疏，細胞呈長形或多邊形，部分細胞內(nèi)出現(xiàn)大小不等的空泡。
2、細胞生長測定采用MTT法測定SMMC-7721細胞對照組與治療組的生長情況。

經(jīng)本組合物處理后的腫瘤細胞與對照組細胞相比，細胞生長受到明顯抑制。
3、平板集落形成實驗接種細胞以2×105個/ml于25ml培養(yǎng)瓶中，第二天隨機分組加藥，藥物處理兩天后以每一平皿500個細胞換普通培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)7天后，經(jīng)甲醇固定、Giemsa染色(姬姆薩染色)。計數(shù)集落總數(shù)及集落形成率。

經(jīng)本組合物處理后的腫瘤細胞與對照組細胞相比，細胞集落形成率明顯降低，說明腫瘤細胞在本組合物作用后增殖能力下降。
4、3H-TdR摻入實驗藥物處理24小時后加入3H-TdR(終濃度為0.5μCi/ml)，4小時后消化，離心后蒸餾水溶解細胞，采用紙片法在液體閃爍計數(shù)器上測定細胞的cpm值

經(jīng)本組合物處理后的腫瘤細胞與對照組細胞相比，3H-TdR摻入明顯較少。說明腫瘤細胞經(jīng)本組合物作用后DNA合成下降，腫瘤細胞的生長受到抑制。
5、流式細胞儀檢測結(jié)果


本組合物處理后的腫瘤細胞與對照組細胞相比，腫瘤細胞處于細胞周期中的G0/G1期比例上升，處于G2+M期的腫瘤細胞比例下降。分裂期的腫瘤細胞比例下降，表示本組合物降低了腫瘤的分裂增生速度。同時被本組合物作用后的腫瘤細胞基因表達改變，分化程度升高。
6、結(jié)論SMMC-7721細胞(人肝癌細胞)在經(jīng)本組合物處理后，細胞形態(tài)改變、增殖變慢、3H-TdR摻入減少、基因表達率改變。說明本組合物使SMMC-7721細胞分化程度上升，并且降低SMMC-7721細胞的DNA合成速率和增殖能力，達到治療肝癌的作用。
(四)本組合物對人肺腺癌細胞(YTMLC-90細胞)的藥效實驗。
接種細胞以2×105個/ml于25ml培養(yǎng)瓶中，第二天隨機分組加藥，治療組采用含濃度為20μg/ml本組合物的細胞培養(yǎng)液來處理YTMLC-90細胞，陰性對照組為采用不含本組合物的培養(yǎng)液處理YTMLC-90細胞。
1、細胞形態(tài)接種細胞以2×105個/ml于25ml培養(yǎng)瓶中，第二天隨機分組加藥，藥物處理兩天后在倒置顯微鏡下觀察。
對照組腫瘤細胞排列密集，細胞呈圓形，核大核仁多。
治療組腫瘤細胞排列稀疏，細胞呈長形或多邊形，部分細胞內(nèi)出現(xiàn)大小不等的空泡。
2、細胞生長測定采用MTT法測定YTMLC-90細胞對照組與冶療組的生長情況。

經(jīng)本組合物處理后的腫瘤細胞與對照組細胞相比，細胞生長受到明顯抑制。
3、平板集落形成實驗接種細胞以2×105個/ml于25ml培養(yǎng)瓶中，第二天隨機分組加藥，藥物處理兩天后以每一平皿500個細胞換普通培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)7天后，經(jīng)甲醇固定、Giemsa染色(姬姆薩染色)。計集落總數(shù)及集落形成率。

經(jīng)本組合物處理后的腫瘤細胞與對照組細胞相比，細胞集落形成率明顯降低，說明腫瘤細胞在本組合物作用后增殖能力下降。
4、3H-TdR摻入實驗藥物處理24小時后加入3H-TdR(終濃度為0.5gCi/ml)，4小時后消化，離心后蒸餾水溶解細胞，采用紙片法在液體閃爍計數(shù)器上測定細胞的cpm值

經(jīng)本組合物處理后的腫瘤細胞與對照組細胞相比，3H-TdR摻入明顯較少。說明腫瘤細胞經(jīng)本組合物作用后DNA合成下降，腫瘤細胞的生長受到抑制。
5、流式細胞儀檢測結(jié)果

被本組合物作用后的腫瘤細胞凋亡率明顯上升，基因表達改變，分化程度升高。
6、結(jié)論YTMLC-90細胞(人肺腺癌細胞)在經(jīng)本組合物處理后，細胞形態(tài)改變、增殖變慢、集落形成率降低、3H-TdR摻入減少、基因表達率改變、凋亡率增加。說明本組合物使YTMLC-90細胞分化凋亡，達到治療肺腺癌的作用。
二、本組合物對腫瘤治療的動物體內(nèi)抗腫瘤實驗。以下的本組合物中按重量份計量的含量是沙棘總黃酮3，苦參堿1。
體重18～22克小鼠，雌雄各半。每組動物20只，各組只數(shù)與性別比例相同。小鼠肝癌H22細胞稀釋成1×107/ml，每只鼠皮下注射瘤細胞液0.2ml。次日將小鼠分為兩組。空白對照組皮下注射等體積的生理鹽水，實驗組皮下注射20mg/kg的本組合物。給藥5天后，處死小鼠，稱量小鼠體重及瘤重。結(jié)果見下表。

實驗證明，本組合物具有抑制動物體內(nèi)腫瘤生長的作用。
綜上所述從以上實驗結(jié)果，說明本組合物可以使腫瘤細胞的形態(tài)改變、基因表達率改變分化程度上升，還可以使腫瘤細胞的凋亡率增加，并且降低腫瘤細胞的生長增殖速度。因此，可以得出本發(fā)明具有如下的優(yōu)點。
一、本發(fā)明對沙棘總黃酮和苦參堿開拓了新的應(yīng)用領(lǐng)域，用作制備治療腫瘤的藥物。
二、本發(fā)明的藥物治療腫瘤效果好，對多種腫瘤細胞都有效。在治療腫瘤時的副作用很小，治療劑量的本組合物對正常細胞形態(tài)功能沒有影響。而且沙棘總黃酮和苦參堿可以產(chǎn)生協(xié)同作用，兩者合用比單獨使用相同的劑量沙棘總黃酮更有效的治療腫瘤，也比單獨使用相同的劑量苦參堿更有效的治療腫瘤。
三、沙棘總黃酮和苦參堿原料來源廣泛，價格低廉，本組合物可制成靜脈輸注劑、口服劑等多種劑型，口服劑型可以是片劑、膠囊等。
下面，再用實施例對本發(fā)明作進一步說明。本發(fā)明可以用以下實施例來予以說明，但并不僅限于以下實施例。
具體實施例方式
實施例1.
本發(fā)明的一種治療腫瘤的組合藥物的各實施例如表一。按表一稱取本組合物中的各組份用量，加入1000ml生理鹽水，30℃水浴加熱，使各組份完全溶解于生理鹽水中。溶液消毒過濾后灌裝，制成本組合物靜脈輸注液。使用時按為5mg/kg/天的劑量靜脈輸注。
表一


實施例2本發(fā)明的一種治療腫瘤的組合藥物的各實施例如表二。按表二稱取本組合物中的各組份用量，與250g干燥淀粉混合均勻。粉末過120目篩兩次，充分混合均勻。然后分別填充于空膠囊中。制成1000個沙棘總黃酮和苦參堿組合物膠囊，每個含沙棘總黃酮和苦參堿組合物50mg。
表二


實施例3本發(fā)明的一種治療腫瘤的組合藥物的各實施例如表三。按表三稱取本組合物中的各組份用量，與干燥淀粉按等量遞加法混合，過篩混合均勻。然后與糊精混合均勻。加入適量乙醇，通過16目篩制粒，50℃干燥。干粒過16目篩，加入硬脂酸鎂，混勻后壓片。壓制成1000片，每片含沙棘總黃酮和苦參堿組合物50mg。
表三


權(quán)利要求
1.一種治療腫瘤的組合物，其特征在于包含沙棘總黃酮和苦參堿。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中所說的一種治療腫瘤的組合物，其特征在于所說的沙棘總黃酮是從沙棘屬植物中提取出的黃酮總體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1中所說的一種治療腫瘤的組合物，其特征在于所說的苦參堿是苦參總生物堿、苦參堿單體、氧化苦參堿單體或氧化苦參堿單體與苦參堿單體的混合物中的一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3中所說的一種治療腫瘤的組合物，其特征在于按重量份計量的含量沙棘總黃酮1～10，苦參堿1～10。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3中所說的一種治療腫瘤的組合物，其特征在于按重量份計量的含量沙棘總黃酮1～3，苦參堿1～3。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3中所說的一種治療腫瘤的組合物，其特征在于按重量份計量的含量沙棘總黃酮3，苦參堿1。
7.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的一種治療腫瘤的組合物，其特征在于是靜脈輸注劑或口服劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種治療腫瘤的組合物，其特征在于是靜脈輸注劑或口服劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種治療腫瘤的組合物，其特征在于是靜脈輸注劑或口服劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種治療腫瘤的組合物，其特征在于是靜脈輸注劑或口服劑。
全文摘要
本發(fā)明的一種治療腫瘤的組合物，涉及藥品，特別是治療腫瘤的組合物藥品。本組合物包含沙棘總黃酮和苦參堿。沙棘總黃酮是從沙棘屬植物中提取出的黃酮總體。苦參堿是苦參總生物堿、苦參堿單體、氧化苦參堿單體或氧化苦參堿單體與苦參堿單體的混合物中的一種。按重量份計量的含量為沙棘總黃酮1～10，苦參堿1～10。本組合物可以是靜脈輸注劑或口服劑等劑型。本組合物適用于治療腫瘤，特別是適用于治療宮頸癌、肝癌、舌鱗癌、肺腺癌等腫瘤。治療副作用小，效果好。沙棘總黃酮和苦參堿原料價格便宜，來源廣泛。
文檔編號A61K31/7048GK1589805SQ0313566
公開日2005年3月9日 申請日期2003年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月25日
發(fā)明者王正榮, 王躍锜 申請人:王正榮