一種基于ppv病毒樣顆粒的納米遞藥系統(tǒng)及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種基于PPV病毒樣顆粒的納米遞藥系統(tǒng)，具體涉及靶向多肽（TK肽） 修飾的PPV衣殼蛋白VP2形成的病毒樣顆粒所構(gòu)成的主動靶向納米遞藥系統(tǒng)及其制備方 法，該主動靶向納米遞藥系統(tǒng)包載小分子抗腫瘤藥物后，可用于靶向治療結(jié)腸癌。本發(fā)明屬 于多肽、生物技術(shù)和藥劑學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 中國腫瘤生物治療協(xié)會2013腫瘤發(fā)展報告統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，惡性腫瘤占所有死亡 人數(shù)的20%左右；每年腫瘤疾病的發(fā)病率和死亡率都在急劇增加著，《2012中國腫瘤登記 年報》發(fā)布的最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，中國每年新發(fā)癌癥病例約350萬，因癌癥死亡約250萬， 全國每6分鐘就有1人被確診為癌癥，惡性腫瘤已經(jīng)成為危害人類生命和健康的頭號殺手。 結(jié)直腸癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，在男性和女性惡性腫瘤中分別居第三位和第二 位，2008年新發(fā)癌癥患者超過120萬，有60. 87萬癌癥患者死于結(jié)直腸癌。在我國，結(jié)直腸 癌死亡率已位于惡性腫瘤死亡率的第五位，嚴重危害人類健康。因此，如何有效治療結(jié)直腸 癌已成為全球健康領(lǐng)域亟待解決的難題。相關(guān)研究表明，靶向性給藥可以增強藥物在靶部 位的活性并減少其在非靶部位的毒副作用，提高藥物的治療指數(shù)，給藥系統(tǒng)是靶向治療的 關(guān)鍵。近年來本領(lǐng)域的研究重點之一是尋找與可特異性與腫瘤細胞或腫瘤新生血管結(jié)合的 物質(zhì)，以及將藥物遞送到腫瘤的新型遞藥系統(tǒng)。
[0003] 病毒樣顆粒（virus-likeparticles，VLPs)是含有某種病毒一個或多個結(jié)構(gòu)蛋白 的空心顆粒，因為VLPs不含有病毒核酸物質(zhì)，不能自主復(fù)制，因此也不具有感染性。豬細小 病毒（Porcineparvovirus，PPV)是細小病毒科細小病毒屬成員，PPV基因組編碼兩條結(jié)構(gòu) 多肽VPl和VP2,三條非結(jié)構(gòu)多肽NS1、NS2和NS3。VP2分子質(zhì)量為64ku，約占病毒衣殼蛋 白總量的80 %，在一定的環(huán)境下，VP2能自組裝成VLPs，其形態(tài)與PPV相似。病毒樣顆粒雖 然是安全、有效的納米載體，但是VLPs選擇性相對較差，缺乏對腫瘤細胞的特異性。因此， 通過靶向分子介導(dǎo)VLPs對腫瘤細胞的選擇性，是一種有效的主動靶向方式。目前尚無靶向 分子修飾的PPV-VLPs的相關(guān)報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有抗癌化學(xué)藥物的毒性及非特異性問題，提供一種新型的 主動靶向納米遞藥系統(tǒng)。
[0005] 為了達到以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：
[0006] -種基于PPV病毒樣顆粒的納米遞藥系統(tǒng)，其特征在于，是由納米載體材料和藥 物組成，所述的納米載體材料為TK肽修飾的PPV病毒樣顆粒，采用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng) 制備得到；所述的藥物為小分子抗腫瘤藥物；所述藥物以包裹或共價連接的方式包載在納 米載體材料內(nèi)。
[0007] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的TK肽為靶向多肽，其氨基酸序列為：TWYKIAFQRNRK; 所述的PPV病毒樣顆粒為PPV的衣殼蛋白VP2形成的病毒樣顆粒；TK肽與PPV病毒樣顆粒 的摩爾比為1:1~20:1。
[0008] 在本發(fā)明中通過控制AVP2基因中TK肽的基因與VP2基因的拷貝數(shù)來調(diào)節(jié)TK肽 與PPV病毒樣顆粒的摩爾比。
[0009] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的TK肽修飾的PPV病毒樣顆粒通過以下方法制備得到： 將TK肽的基因插入PPV的VP2基因中，得到AVP2基因，克隆到桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBac HA中，所得的重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOBac感受態(tài)細胞，得到重組桿粒，重 組桿粒轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細胞，使其表達AVP2蛋白并組裝成TK肽修飾的PPV病毒樣顆粒。
[0010] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的方法包括以下步驟：
[0011] ⑴以提取的PPVDNA為模板，利用擴增引物通過PCR擴增獲得VP2基因，將VP2 基因插入PMD18-T載體中，得到重組載體pMD18-T-vp2 ;
[0012] (2)以重組載體pMD18-T-vp2為模板，應(yīng)用SOE-PCR擴增獲得AVP2基因，將AVP2 基因插入桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBacHA中，得到pFD-AVP2供體質(zhì)粒；
[0013] (3)將pFD-Avp2供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOBac感受態(tài)細胞，與Bacmid進行重 組，得到重組桿粒Bacmid-Avp2 ;
[0014] (4)將重組桿粒Bacmid-AVP2轉(zhuǎn)染Sf9細胞，待細胞病變達到70%以上收集上清 培養(yǎng)液，即第一代重組桿狀病毒，連續(xù)傳代后，以第三代重組桿狀病毒作為種毒；
[0015] (5)將得到的第三代重組桿狀病毒接種Sf9細胞，使其表達AVP2蛋白并組裝成 TK肽修飾的PPV病毒樣顆粒。
[0016] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟（1)中所述的引物的核苷酸序列為SEQIDNO: 1和SEQ IDNO: 2所示；步驟（2)中SOE-PCR擴增AVP2基因的具體步驟為：第一輪擴增使用引物 P1/P2,模板為pMD18-T-vp2,獲得的目的片段命名P1-P2 ;引物P3/P4,模板為pMD18-T-vp2， 獲得的目的片段命名P3-P4 ;引物P5/P6,模板為pMD18-T-vp2,獲得的目的片段命名P5-P6 ; 第二輪擴增使用引物P1/P4,模板為P1-P2和P3-P4,獲得目的基因片段P1-P4 ;使用引物 P3/P6,模板為P3-P4和P5-P6,獲得目的基因片段P3-P6 ;第三輪擴增使用引物P1/P6,模板 為P1-P4和P3-P6,獲得目的基因片段P1-P6,即AVP2基因；引物P1-P6的核苷酸序列為 SEQIDNO:3-SEQIDNO:8 所示。
[0017] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的納米遞藥系統(tǒng)的平均粒徑為10-100nm。
[0018] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的小分子抗腫瘤藥物選自阿霉素、表阿霉素、喜樹堿、羥 基喜樹堿、紫杉醇或多系紫杉醇中的一種。
[0019] 進一步的，本發(fā)明提供了一種制備所述的納米遞藥系統(tǒng)的方法，采用昆蟲桿狀病 毒表達系統(tǒng)制備TK肽修飾的PPV病毒樣顆粒，將小分子抗腫瘤藥物通過包裹或共價連接的 方式包載在TK肽修飾的PPV病毒樣顆粒內(nèi)。
[0020] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，采用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)制備TK肽修飾的PPV病毒樣顆 粒，將TK肽修飾的PPV病毒樣顆粒、N-羥基丁二酰亞胺，1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳 二亞胺和小分子抗腫瘤藥物按照質(zhì)量比1:5:2:10~1:5:2:40的比例放入離心管中，4°C反 應(yīng)48h，反應(yīng)后的樣品裝入透析膜中進行透析，透析液為pH7. 4的磷酸鹽緩沖液，4°C透析 48h，期間每隔12h換液一次，即得。
[0021] 更進一步的，本發(fā)明提供了所述的納米遞藥系統(tǒng)在制備靶向治療結(jié)腸癌細胞藥物 中的用途。
[0022] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的結(jié)腸癌細胞為人結(jié)直腸腺癌HRT-18細胞或人結(jié)腸癌 Cao-2細胞。
[0023] 本發(fā)明同時還提供了所述TK肽的合成方法與親和性評價，及其修飾的納米遞藥 系統(tǒng)的制備方法、靶向性評價及抑瘤效果等，其包括：
[0024] (1)合成TK肽
[0025] 采用固相合成的方法合成TK肽（TWYKIAFQRNRK)，并進一步通過化學(xué)合成的方法 獲得熒光素標(biāo)記的TK肽（FITC-TK)，HPLC及MS表征其結(jié)構(gòu)。
[0026] (2)TK肽的親和性評價
[0027] 通過與受體蛋白結(jié)合能力及結(jié)腸癌腫瘤的結(jié)合能力兩方面進行TK肽性質(zhì)考察， 采用表面等離子共振方法（SPR)測定TK肽與受體蛋白的結(jié)合常數(shù)Kd值。比較FITC與 FITC-TK對結(jié)腸癌細胞的靶向性。
[0028] (3)TK-VLPs納米載體的制備
[0029] 通過提取PPV病毒基因組，進一步通過SOE-PCR擴增獲得AVP2基因，從而獲得 pFD-Avp2供體質(zhì)粒，進而構(gòu)建重組桿狀病毒Bacmid質(zhì)粒，重組桿狀病毒Bacmid質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 Sf9細胞，得到重組桿狀病毒，重組桿狀病毒接種Sf9細胞，制備TK肽修飾的PPV病毒樣顆 粒，用于TK-VLPs納米載體的制備。
[0030] (4)載藥TK-VLPs納米遞藥系統(tǒng)的制備與表征
[0031] 以阿霉素為模型藥物，與一定比例的VLPs或TK-VLPs納米載體通過化學(xué)反應(yīng)，形 成載藥的TK-VLPs-DOX納米遞藥系統(tǒng)。激光散射法測定粒徑及粒徑分布；負染色電鏡法觀 察TK-VLPs-DOX的形態(tài)。
[0032] (4)載藥TK-VLPs納米遞藥系統(tǒng)的腫瘤靶向性評價
[0033] 考察Cao-2及HRT-18細胞對VLPs-DOX和TK-VLPs-DOX納米遞藥系統(tǒng)攝取情況， 比較上述兩種遞藥系統(tǒng)對腫瘤細胞的親和能力。
[0034] (5)載藥TK-VLPs納米遞藥系統(tǒng)的抗腫瘤效果評價
[0035] 以MTT法研究VLPs-DOX和TK-VLPs-DOX納米遞藥系統(tǒng)對Cao-2及HRT-18細胞體 外生長抑制效果。
[0036] 實驗結(jié)果表明，所述的TK肽與受體蛋白和腫瘤新生血管及結(jié)腸癌腫瘤均具有較 高的親和活性；