hsa-miR-381-3p在結(jié)核病治療中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種可抑制靶向結(jié)合⑶Ic3'非編碼末端 (3'UTR)的微小RNA(micorRNA)的抑制物，這種microRNA抑制物轉(zhuǎn)染得到的樹突狀細(xì)胞 及其在制備抗結(jié)核感染藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)核至今仍是全球范圍內(nèi)感染率最高的傳染病，病死率僅次于艾滋病。近年來，隨 著人口流動的增加、HIV與結(jié)核分枝桿菌伴發(fā)感染、以及多重耐藥菌株的流行，使全球結(jié)核 病死灰復(fù)燃，呈現(xiàn)卷土重來之勢。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，全球3. 5 %的新發(fā)病例和20. 5 %的以往治療 病例為耐多藥結(jié)核（MDR-TB)，其中9%為廣泛耐藥結(jié)核（XDR-TB);我國是全球耐多藥結(jié)核負(fù) 擔(dān)最重的國家，每年新發(fā)MDR-TB患者12萬、XDR-TB患者近1萬；前者治愈率不足50%，后者 則基本無藥可治。因此，尋找新治療靶點(diǎn)、開創(chuàng)新治療方法已成為當(dāng)務(wù)之急！ 結(jié)核桿菌屬于胞內(nèi)寄生菌，體液免疫難以對其發(fā)揮作用，抗結(jié)核感染的免疫機(jī)制是以T細(xì)胞為主的細(xì)胞免疫。T細(xì)胞識別的抗原包括I/II類MHC分子遞呈的抗原肽和CDl分子 遞呈的脂類抗原，MTB是脂類抗原含量最高的微生物，故CDl在抗結(jié)核免疫中的作用尤其重 要。⑶1是I類MHC樣非多態(tài)性第三類抗原遞呈分子，根據(jù)基因同源性分為I、II、III類， 其中I類CDl遞呈的菌類抗原均來源于以結(jié)核桿菌為代表的分枝桿菌，提示其在宿主與病 原性分枝桿菌的相互作用中占有重要地位。研究表明，I類CDl遞呈抗原誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫 反應(yīng)具有速度快、活化細(xì)胞數(shù)量大、可形成免疫記憶的特點(diǎn)，對抑制結(jié)核桿菌擴(kuò)增與播散、 減少病理損傷具有非常重要的意義。
[0003] I類⑶1分子包括⑶la、⑶Ib和⑶lc，其中⑶Ic因其廣泛的胞內(nèi)外分布特點(diǎn)和 所遞呈抗原的獨(dú)特性，在抗結(jié)核免疫中獨(dú)樹一幟。CDlc是內(nèi)吞系統(tǒng)中分布最廣的CDl分 子，表達(dá)于胞膜或穿梭于內(nèi)涵體與溶酶體之間，執(zhí)行全面巡查內(nèi)吞系統(tǒng)中脂類抗原的功能。 同時，CDlc遞呈抗原不依賴內(nèi)涵體的酸化，因此功能不受MTB抑制吞噬體成熟的免疫逃逸 機(jī)制影響。⑶Ic在脾臟邊緣區(qū)B細(xì)胞、活化B細(xì)胞、以及絕大部分樹突狀細(xì)胞（dendritic cell,DC)亞群表面組成性高表達(dá)，被認(rèn)為是介導(dǎo)抗原遞呈細(xì)胞（antigenpresenting cell，APC)與T細(xì)胞相互作用的重要分子。⑶Ic特異性遞呈的結(jié)核抗原為聚酮類脂質(zhì)抗 原mycoketide，僅在致病性分枝桿菌中生成，而在非致病性分枝桿菌中缺失，表明其與細(xì)菌 毒力密切相關(guān)。該抗原具有宿主脂質(zhì)分子所缺乏的結(jié)構(gòu)特征，對其免疫識別不會引發(fā)交叉 反應(yīng)而導(dǎo)致宿主組織損傷。此外，mycoketide的分子結(jié)構(gòu)與⑶Ic的抗原結(jié)合槽完美匹配， 盡管其在MTB菌體中的表達(dá)量低至nM級，仍可誘導(dǎo)出特異的CDlc限制性T細(xì)胞，并產(chǎn)生記 憶性免疫保護(hù)反應(yīng)。
[0004] 綜上所述，⑶Ic在抗結(jié)核免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。然而研究發(fā)現(xiàn)，⑶Ic在DC分 化過程中受MTB顯著抑制。MTB感染健康志愿者PBMC來源的APC，24h后APC表面⑶Ic表 達(dá)開始減少，且表達(dá)水平隨感染復(fù)數(shù)的增加而降低，48h后完全檢測不到，導(dǎo)致對CDlc限 制性T細(xì)胞株的抗原遞呈能力完全被抑制。此外，MTB感染的單核細(xì)胞雖能分化為成熟DC， 但其CDlc分子表達(dá)選擇性缺失，將該DC與同種異體臍帶血初始T細(xì)胞共孵育，T細(xì)胞增殖 水平顯著降低，無法表達(dá)IFN-y，不能有效協(xié)助巨噬細(xì)胞對胞內(nèi)MTB的殺傷，提示⑶Ic表達(dá) 低下與結(jié)核病密切相關(guān)。同時，研究顯示，對CDlc表達(dá)/功能的調(diào)節(jié)，將直接影響CDlc限 制性T細(xì)胞的反應(yīng)水平。在結(jié)核潛伏感染者外周血中，可檢測到具有免疫保護(hù)效應(yīng)的CDlc 限制性T細(xì)胞，其活性可被CDlc阻斷抗體顯著抑制，增殖水平降低約90%，IFN-y表達(dá)水平 降低70%以上。用MTB脂類抗原免疫⑶Ic轉(zhuǎn)基因小鼠，可誘導(dǎo)出抗原特異性⑶Ic限制的 Thl型細(xì)胞免疫反應(yīng)；采用MTB標(biāo)準(zhǔn)毒株H37Rv氣溶膠或BCG靜脈注射感染該小鼠，3-4周 后出現(xiàn)CDlc特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)，8周后肺部荷菌量低于野生型小鼠。上述研究表明， MTB通過下調(diào)⑶Ic表達(dá)抑制抗原遞呈，調(diào)控⑶Ic表達(dá)，可調(diào)變宿主抗MTB感染免疫反應(yīng)，有 望成為結(jié)核病治療的新靶點(diǎn)。
[0005] 目前，文獻(xiàn)所報(bào)道的MTB感染后CDlc下調(diào)多源于其mRNA水平降低的現(xiàn)象，恰與微 小RNA(microRNA)調(diào)芐基因表達(dá)的機(jī)制之一一通過降解mRNApoly(A)尾從而降低革巴標(biāo) mRNA穩(wěn)定性相吻合。microRNA是一類在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮極其重要作用的小分子RNA， 于轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)mRNA穩(wěn)定性與蛋白質(zhì)翻譯效率，在結(jié)核免疫中的效應(yīng)受到越來越廣泛 的關(guān)注。有研究報(bào)道，H37Rv感染改變了巨噬細(xì)胞（macrophage,MO)的microRNA表達(dá)譜， 其中顯著上調(diào)的miR-132和miR-26a靶向抑制IFN-y信號級聯(lián)途徑中的轉(zhuǎn)錄共激活因子 P300,從而降低M(i>對IFN-y的反應(yīng)性；抑制miR-132和miR-26a后，p300表達(dá)上調(diào)，提高 了M(i>對IFN-y的反應(yīng)性，M(i>表面HLA-DR、CD86、FeyRI、CXCL10等表達(dá)增加，吞噬能力 顯著增強(qiáng)。此外，miR-29可降解IFN-y的mRNA，MTB感染后，miR-29被抑制的轉(zhuǎn)基因小鼠 比野生型對照分泌更多的IFN-Y，產(chǎn)生較強(qiáng)的Thl免疫應(yīng)答，肺病理損傷較輕，肺脾荷菌量 也較少，表明通過靶向抑制miR-29,可上調(diào)IFN-y表達(dá)水平，從而調(diào)控抗結(jié)核免疫應(yīng)答。上 述研究表明，microRNA在結(jié)核菌與宿主相互作用中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，但其對⑶Ic表達(dá) 調(diào)控的研究尚未見報(bào)道。
[0006] 在DC中發(fā)現(xiàn)并抑制結(jié)核感染過程中下調(diào)⑶Ic表達(dá)的microRNA，并通過輸注 microRNA抑制物或過繼輸注經(jīng)microRNA抑制物修飾的DC給免疫低下或免疫缺陷的患者， 可將保護(hù)性免疫傳遞給受者。直接輸注microRNA抑制物，可促進(jìn)結(jié)核患者體內(nèi)抗原遞呈細(xì) 胞表面CDlc表達(dá)水平上調(diào)，與過繼輸注樹突狀細(xì)胞類似，均可增強(qiáng)受者體內(nèi)CDlc限制性T 細(xì)胞對靶抗原的特異性識別及殺傷能力并改善患者的免疫狀態(tài)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供hsa-miR-381_3p在結(jié)核病治療中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的目的在于提供hsa-miR-381_3p在免疫增強(qiáng)劑制備中的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是： hsa-miR-381-3p作為結(jié)核病治療靶點(diǎn)的應(yīng)用。
[0010] 對hsa-miR-381-3p具有抑制作用的物質(zhì)在制備免疫增強(qiáng)劑中的應(yīng)用。
[0011] 進(jìn)一步的，上述對hsa-miR-381_3p具有抑制作用的物質(zhì)選自抑制 hsa-miR-381_3p表達(dá)的物質(zhì)、促進(jìn)hsa-miR-381_3p降解的物質(zhì)、抑制hsa-miR-381_3p發(fā)揮 正常作用的物質(zhì)中的至少一種。
[0012] 進(jìn)一步的，上述抑制hsa-miR-381_3p發(fā)揮正常作用的物質(zhì)選自hsa-miR-381_3p inhibitor、hsa-miR-381_3pantagomir中的至少一種。
[0013] 對hsa-miR-381-3p具有抑制作用的物質(zhì)在制備治療結(jié)核病藥物中的應(yīng)用。
[0014] 進(jìn)一步的，上述對hsa-miR-381_3p具有抑制作用的物質(zhì)選自抑制 hsa-miR-381_3p表達(dá)的物質(zhì)、促進(jìn)hsa-miR-381_3p降解的物質(zhì)、抑制hsa-miR-381_3p發(fā)揮 正常作用的物質(zhì)中的至少一種。
[0015] 進(jìn)一步的，上述抑制hsa-miR-381_3p發(fā)揮正常作用的物質(zhì)選自hsa-miR-381_3p inhibitor、hsa-miR-381_3pantagomir中的至少一種。
[0016] 本發(fā)明的有益效果是： 本發(fā)明預(yù)測并驗(yàn)證了靶向⑶Ic3'UTR的microRNA，并鑒定其抑制物對BCG感染 的DC中CDlc的表達(dá)以及對T細(xì)胞活化水平的影響。結(jié)果表明，microRNA抑制物可下調(diào) microRNA，并逆轉(zhuǎn)BCG感染對DC中⑶Ic表達(dá)的抑制，促進(jìn)DC對T細(xì)胞的活化，T細(xì)胞增殖、 IFN-y分泌及其殺傷活性均顯著增高。
【附圖說明】
[0017] 圖1為抑制基因⑶7c表達(dá)的microRNA(a)及熒光素酶報(bào)告基因法驗(yàn)證microRNA 對CDlc3'UTR的靶向結(jié)合（b);其中WT表示pMIR-r印ort-CDlc3'UTR-wt，Mutant表示 pMIR-report-CDlc3'UTR-mut;RLU表示熒光素酶的活性強(qiáng)度； 圖2為hsa-miR-381-3p對原代DC中⑶Ic表達(dá)的調(diào)節(jié)作用；a為實(shí)時熒光定量PCR的 檢測結(jié)果，b為Westernblot的檢測結(jié)果，c為流式細(xì)胞儀檢測的結(jié)果，d是對c圖中各組 數(shù)據(jù)的柱形統(tǒng)計(jì)圖； 圖3為hsa-miR-381-3p對⑶Ic+細(xì)胞系中⑶Ic表達(dá)的調(diào)節(jié)作用； 圖4為結(jié)核患者PBMC中hsa-miR-381-3p和⑶Ic的表達(dá)情況；a為⑶IcmRNA的相對 表達(dá)水平；b為hsa-miR-381-3p的相對表達(dá)水平；N為健康志愿者的PBMC;TB為肺結(jié)核患 者的PBMC; 圖5為分化過程中的DC中⑶Ic mRNA與hsa-miR-381-3p的表達(dá)情況； 圖6為感染了BCG的DC中⑶Ic與hsa-miR-381-3p的表達(dá)情況；a為流式細(xì)胞儀檢測 的結(jié)果，b是對a圖中表面帶CDlc蛋白的細(xì)胞數(shù)的柱形統(tǒng)計(jì)圖；c是對a圖中細(xì)胞表面CDlc 蛋白所結(jié)合抗體的平均熒光強(qiáng)度的柱形統(tǒng)計(jì)圖，體現(xiàn)CDlc蛋白的平均表達(dá)量；d為實(shí)時熒 光定量PCR的檢測結(jié)果； 圖7為hsa-miR-381-3p抑制劑對BCG感染的DC中CDlc表達(dá)的調(diào)節(jié)作用； 圖8為hsa-miR-381-3p抑制劑對感染了BCG的DC活化T細(xì)胞效應(yīng)的調(diào)節(jié)作用；a為 淋巴細(xì)胞的增殖水平；b為IFN-y分泌水平的檢測結(jié)果，SFC :spot-for