PBMC，免疫磁珠分選出CD14+單核細(xì)胞，同上誘導(dǎo)其向DC分化； 3) 分別在誘導(dǎo)分化0h、2h、4h、24h和72h時(shí)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)⑶Ic mRNA與hsa-miR-381_3p的表達(dá)情況。
[0038] 結(jié)果： 檢測(cè)結(jié)果如圖5所示，從中可以看出，在第0~4h內(nèi)hsa-miR-381-3p的表達(dá)水平低， 尤其是在4h時(shí)，而此時(shí)⑶IcmRNA表達(dá)水平逐漸升高，在第4~72h內(nèi)，hsa-miR-381-3p 的表達(dá)水平逐漸升高時(shí)，伴隨著⑶IcmRNA表達(dá)水平的逐漸降低。
[0039] 上述結(jié)果說明，在DC細(xì)胞的分化過程中，⑶Ic和hsa-miR-381_3p的表達(dá)水平呈 負(fù)相關(guān)。
[0040] 7、感染了BCG的DC細(xì)胞中CDlc與hsa-miR-381-3p的表達(dá)情況 方法： 1) 同上分離健康志愿者單核細(xì)胞，誘導(dǎo)其向DC分化； 2) 誘導(dǎo)DC分化的同時(shí)感染卡介苗（BCG)，BCG的終濃度為20yg/mL; 3) 72h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面⑶Ic的表達(dá)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)⑶IcmRNA 與hsa-miR-381_3p的表達(dá)。
[0041] 結(jié)果： 檢測(cè)結(jié)果如圖6所示，圖6a和b為流式細(xì)胞術(shù)儀檢測(cè)的結(jié)果，可以看出BCG感染組中 細(xì)胞表面帶⑶Ic蛋白的細(xì)胞數(shù)明顯降低（為1. 47%)，無BCG感染組為7. 88% ;圖6d為實(shí)時(shí) 熒光定量PCR的檢測(cè)結(jié)果，BCG感染組中，hsa-miR-381-3p表達(dá)水平顯著上調(diào)，而CDlcmRNA 表達(dá)水平顯著下調(diào)。
[0042] 上述結(jié)果說明，BCG感染會(huì)引起DC細(xì)胞中hsa-miR-381-3p表達(dá)上調(diào)，CDlc mRNA 表達(dá)下調(diào)。
[0043] 8、hsa-miR-381_3p抑制劑對(duì)BCG感染的DC中CDlc表達(dá)的調(diào)節(jié)作用 方法： 1) 同上分離健康志愿者單核細(xì)胞，誘導(dǎo)其向DC分化； 2) 誘導(dǎo)DC分化的同時(shí)感染卡介苗（BCG)，BCG的終濃度為20yg/mL; 3) 同一時(shí)間，采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染hsa-miR-381-3p-I。
[0044] 4) 72h后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)CDlcmRNA與hsa-miR-381-3p的表達(dá)情況。
[0045] 結(jié)果： 檢測(cè)結(jié)果如圖7所示，從中可以看出，加入hsa-miR-381-3p-I后，hsa-miR-381-3p表 達(dá)水平降低，同時(shí)⑶IcmRNA表達(dá)水平上升，說明下調(diào)hsa-miR-38l-3p表達(dá)水平可減弱BCG 感染對(duì)CDlc表達(dá)的抑制。
[0046] 9、hsa-miR-381-3p抑制劑對(duì)感染了BCG的DC活化T細(xì)胞效應(yīng)的調(diào)節(jié)作用 方法： 1) 分離健康志愿者CD14+單核細(xì)胞，誘導(dǎo)其向DC分化，同時(shí)感染BCG(或不感染BCG作 為對(duì)照組)，并轉(zhuǎn)染hsa-miR-38l-3p-I或miR-NC-I(作為對(duì)照組）； 2) 分離健康志愿者外周血淋巴細(xì)胞（peripheralbloodlymphocyte,PBL)，凍存3天 后復(fù)蘇。
[0047] 3) 3d后將DC與外周血淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)； 4) 分別用EdU摻入法檢測(cè)上述各組細(xì)胞中淋巴細(xì)胞的增殖水平；用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn) 法（TheEnzyme-LinkedImmunoSpot,ELISpot)檢測(cè)淋巴細(xì)胞IFN-y的分泌水；用 免疫焚光染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志；用時(shí)間分辨焚光免疫分析技術(shù) (time-resolvedfluoroimmuno-assay，TRFIA)檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞中CD8+T細(xì)胞（具有 殺傷活性的CDlc限制性T細(xì)胞均是CD8+T細(xì)胞）對(duì)DC的殺傷活性。
[0048] 上述實(shí)驗(yàn)共設(shè)置了以下4組： BCG-AiiR-NC-I組：未經(jīng)BCG感染的DC轉(zhuǎn)染miR-NC-I陰性對(duì)照； BCG-/miR-381-3p-I組：未經(jīng)BCG感染的DC轉(zhuǎn)染hsa-miR-381-3p-I; BCG+/miR-NC-I組：經(jīng)BCG感染的DC轉(zhuǎn)染miR-NC-I陰性對(duì)照； BCG+/miR-381-3p-I組：經(jīng)BCG感染的DC轉(zhuǎn)染hsa-miR-381-3p-I。
[0049] 結(jié)果： 檢測(cè)結(jié)果如圖8所示，圖8a為淋巴細(xì)胞增殖水平的檢測(cè)結(jié)果，當(dāng)存在BCG感染時(shí)，BCG能夠抑制DC表面CDlc的表達(dá)，使DC對(duì)淋巴細(xì)胞的活化水平降低，表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞增殖水 平降低，然而，當(dāng)加入hsa-miR-381-3p-I后，DC細(xì)胞表面⑶Ic表達(dá)水平上調(diào)，從而對(duì)淋巴 細(xì)胞的活化水平將不受BCG的抑制；圖8b為IFN-Y分泌水平的檢測(cè)結(jié)果，不管有沒有BCG 存在，hsa-miR-381-3p-I均能提高淋巴細(xì)胞分泌IFN-y的水平；圖8c和d為淋巴細(xì)胞表 面標(biāo)志物的檢測(cè)結(jié)果，從中可以看出轉(zhuǎn)染hsa-miR-381-3p-I組的DC可誘導(dǎo)較高水平的CD4+CXCR5+保護(hù)性Th(該亞群Th細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)由文獻(xiàn)Slight,S.，J.Rangel-Moreno, R.Gopal,Y.Lin,J.B.Fallert,S.Mehra,M.Selman,E.BecerriI-Villanueva,J. Baquera-Heredia,andL.Pavon. 2013.CXCR5 +Thelpercellsmediateprotective immunityagainsttuberculosis.J.Clin.Invest. 123: 712-726?闡明。）和CD8+ ⑶107+CTL(其中，⑶107是⑶8+T細(xì)胞釋放殺傷性顆粒酶過程中、將顆粒酶轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜 的載體蛋白，可指示殺傷性顆粒酶的釋放，從而顯示CD8+T細(xì)胞的殺傷活性）；圖Se為淋巴 細(xì)胞中⑶8+T細(xì)胞對(duì)DC的殺傷活性的檢測(cè)結(jié)果，從中可以看出轉(zhuǎn)染hsa-miR-381-3p-I組 的T細(xì)胞殺傷水平顯著上調(diào)。
[0050] 上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯不：hsa-miR-381_3p抑制物（hsa-miR-381_3pinhibitor) 可抑制hsa-miR-381-3p的功能，其可解除BCG感染對(duì)DC中⑶Ic表達(dá)的抑制，促進(jìn)DC 對(duì)T細(xì)胞的活化，對(duì)T細(xì)胞增殖、IFN-y分泌及其殺傷活性也具有顯著的促進(jìn)作用，可見 hsa-miR-381_3p抑制物（hsa-miR-381_3pinhibitor)不僅具有治療結(jié)核病的作用，同 時(shí)也能增強(qiáng)體內(nèi)的免疫力，也可應(yīng)用于免疫增強(qiáng)劑的制備?？梢奾sa-miR-381-3p抑制物 (hsa-miR-381-3pinhibitor)具有結(jié)核感染基因治療的應(yīng)用價(jià)值，可為結(jié)核感染的過繼細(xì) 胞免疫治療開辟新徑，可應(yīng)用于治療結(jié)核病藥物的制備和免疫增強(qiáng)劑的制備。
[0051] 綜上所述，所有對(duì)hsa-miR-381-3p具有抑制作用的物質(zhì)均可用于結(jié)核病的治療、 免疫增強(qiáng)劑的制備。對(duì)hsa-miR-381-3p具有抑制作用的物質(zhì)可以是抑制hsa-miR-381-3p 表達(dá)、促進(jìn)hsa-miR-381-3p降解的物質(zhì)、或抑制hsa-miR-381-3p發(fā)揮正常作用的物 質(zhì)。抑制hsa-miR-381_3p發(fā)揮正常作用的物質(zhì)可以是hsa-miR-381_3pinhibitor (118&-11111?-381-3口抑制物）、118&-11111?-381-3口&1^&8〇111；[1'(118&-11111?-381-3口詰抗劑）。
[0052] 上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. hsa-miR-381-3p作為結(jié)核病治療靶點(diǎn)的應(yīng)用。2. 對(duì)hsa-miR-381-3p具有抑制作用的物質(zhì)在制備免疫增強(qiáng)劑中的應(yīng)用。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于：所述對(duì)hsa-miR-381-3p具有抑制作用 的物質(zhì)選自抑制hsa-miR-38l-3p表達(dá)的物質(zhì)、促進(jìn)hsa-miR-38l-3p降解的物質(zhì)、抑制 hsa-miR-381-3p發(fā)揮正常作用的物質(zhì)中的至少一種。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：所述抑制hsa-miR-381-3p發(fā)揮正常作用 的物質(zhì)選自hsa-miR-381_3pinhibitor、hsa-miR-381_3pantagomir中的至少一種。5. 對(duì)hsa-miR-381-3p具有抑制作用的物質(zhì)在制備治療結(jié)核病藥物中的應(yīng)用。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于：所述對(duì)hsa-miR-381-3p具有抑制作用 的物質(zhì)選自抑制hsa-miR-38l-3p表達(dá)的物質(zhì)、促進(jìn)hsa-miR-38l-3p降解的物質(zhì)、抑制 hsa-miR-381-3p發(fā)揮正常作用的物質(zhì)中的至少一種。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于：所述抑制hsa-miR-381-3p發(fā)揮正常作用 的物質(zhì)選自hsa-miR-381_3pinhibitor、hsa-miR-381_3pantagomir中的至少一種。
【專利摘要】本發(fā)明公開了hsa-miR-381-3p在結(jié)核病治療中的應(yīng)用。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)hsa-miR-381-3p抑制物可解除BCG感染對(duì)DC細(xì)胞中CD1c表達(dá)的抑制，促進(jìn)DC對(duì)T細(xì)胞的活化，對(duì)T細(xì)胞增殖、IFN-γ分泌及其殺傷活性也具有顯著的促進(jìn)作用，hsa-miR-381-3p抑制物不僅具有治療結(jié)核病的作用，也具有增強(qiáng)體內(nèi)免疫力的作用，可應(yīng)用于免疫增強(qiáng)劑的制備。hsa-miR-381-3p抑制物具有結(jié)核感染基因治療的應(yīng)用價(jià)值，可為結(jié)核感染的過繼細(xì)胞免疫治療開辟新徑，可應(yīng)用于治療結(jié)核病藥物的制備和免疫增強(qiáng)劑的制備。
【IPC分類】A61K45/00, A61P37/04, C12Q1/66, A61P31/06, A61K45/06
【公開號(hào)】CN105194672
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510594033
【發(fā)明人】馬驪, 溫茜, 熊文景
【申請(qǐng)人】南方醫(yī)科大學(xué)
【公開日】2015年12月30日
【申請(qǐng)日】2015年9月16日