動(dòng)物雙歧桿菌乳酸亞種CGMCC No.9273的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了保藏編號(hào)為CGMCC No.9273的動(dòng)物雙歧桿菌乳酸亞種(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能中的應(yīng)用，所述應(yīng)用不包括治療人體或動(dòng)物體的疾病。此外，本發(fā)明還公開(kāi)了一種含有如上所述的動(dòng)物雙歧桿菌乳酸亞種作為活性成分的組合物。相比于同屬的其它雙歧桿菌，保藏編號(hào)為CGMCC No.9273的動(dòng)物雙歧桿菌乳酸亞種能夠更有效地調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，對(duì)癌癥的治療和/或預(yù)防、對(duì)Th1型疾病的治療和/或預(yù)防效果更佳。
CGMCC No. 9273
2014.06.05
【專(zhuān)利說(shuō)明】動(dòng)物雙歧桿菌乳酸亞種CGMCC No. 9273的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及動(dòng)物雙歧桿菌乳酸亞種CGMCC No. 9273的應(yīng)用，具體的涉及動(dòng)物雙歧 桿菌乳酸亞種CGMCC No. 9273在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能中的應(yīng)用，本發(fā)明還涉及含有動(dòng)物雙歧 桿菌乳酸亞種CGMCC No. 9273的組合物。

【背景技術(shù)】
[0002] 免疫是人體的一種生理功能，涉及非特異性免疫和特異性免疫，非特異性免疫不 需要預(yù)先接觸抗原，一旦病原體進(jìn)入了機(jī)體，則會(huì)快速清除病原體。吞瞻細(xì)胞和自然殺傷細(xì) 胞都具有清除和殺傷作用，是非特異性免疫系統(tǒng)中的重要成員。特異性免疫具有特異地識(shí) 別外來(lái)異物并具有免疫記憶能力的免疫細(xì)胞（T淋己細(xì)胞和B淋己細(xì)胞）。免疫系統(tǒng)之間最 首要的信息傳導(dǎo)子就是細(xì)胞因子，每種細(xì)胞因子對(duì)不同的細(xì)胞類(lèi)型具有不同的刺激功能， 它們通過(guò)結(jié)合細(xì)胞表面的特異性受體而誘導(dǎo)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育和功能活性。人體依靠該種功 能識(shí)別"自己"和"非己"成分，從而破壞和排斥進(jìn)入人體的抗原物質(zhì)或人體本身所產(chǎn)生的 損傷細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等，W維持人體的健康，抵抗或防止微生物或寄生物的感染或其它所 不希望的生物的侵入。
[0003] 雙歧桿菌作為人類(lèi)腸道的生理菌，在維護(hù)宿主的健康上起了重要的作用，雙歧桿 菌能夠通過(guò)菌體及其組分來(lái)發(fā)揮對(duì)機(jī)體的免疫促進(jìn)功能。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一株更具有免疫優(yōu)勢(shì)的雙歧桿菌的應(yīng)用。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了保藏編號(hào)為CGMCC No. 9273的動(dòng)物雙歧桿菌乳 酸亞種炬ifidobacterium animalis subsp. Iactis)在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能中的應(yīng)用，所述 應(yīng)用不包括治療人體或動(dòng)物體的疾病。
[0006] 優(yōu)選地，所述應(yīng)用包括制備用于治療和/或預(yù)防癌癥的藥物。
[0007] 優(yōu)選地，所述應(yīng)用包括制備用于預(yù)防和/或治療Th2型疾病的藥物。
[0008] 另一方面，本發(fā)明還提供了含有保藏編號(hào)為CGMCC No. 9273的動(dòng)物雙歧桿菌乳酸 亞種炬ifidobacterium animalis subsp. Iactis)作為活性成分的組合物。
[0009] 相比于同屬的其它雙歧桿菌，保藏編號(hào)為CGMCC No. 9273的動(dòng)物雙歧桿菌乳酸亞 種能夠更有效地調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，通過(guò)實(shí)驗(yàn)顯示，保藏編號(hào)為CGMCC No. 9273的動(dòng)物 雙歧桿菌乳酸亞種能夠提高W下指標(biāo)中的至少一種：吞瞻細(xì)胞的吞瞻率，脾淋己細(xì)胞的增 殖能力，血清中IgG的含量，增強(qiáng)腸粘膜上化R-2、TNF-Q、IFN-Y的表達(dá)，W及腸黏膜上 IFN- Y八心4的比值。其中，腸粘膜上化R-2和TNF- a表達(dá)的增強(qiáng)能夠有效地對(duì)癌癥進(jìn)行 治療和/或預(yù)防，IFN- Y的表達(dá)增強(qiáng)W及IFN- Y八心4的比值的提高能夠有效的預(yù)防和/ 或治療Th2型疾病。
[0010] 本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的【具體實(shí)施方式】部分予W詳細(xì)說(shuō)明。 生物保藏 本發(fā)明的動(dòng)物雙歧桿菌乳酸亞種炬ifidobacterium animalis subsp. lactis),于2014 年6月5日被保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中也（地址：北京市朝陽(yáng) 區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼：100101)(保藏單位的縮寫(xiě)為 CGMCC)，保藏編號(hào)為 CGMCC No. 9273。

【具體實(shí)施方式】
[0011] W下對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體 實(shí)施方式僅用于說(shuō)明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[001引本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，相比于同屬的其它雙歧桿菌，保藏編號(hào)為CGMCC No. 9273的 動(dòng)物雙歧桿菌乳酸亞種炬ifidobacterium animalis subsp. lactis)能夠更有效地調(diào)節(jié)機(jī) 體的免疫功能，例如，提高W下指標(biāo)中的任意一種：吞瞻細(xì)胞的吞瞻率，脾淋己細(xì)胞的增殖 能力，血清中IgG的含量，腸粘膜上化R-2、TNF- a、IFN- Y的表達(dá)，W及腸黏膜上IFN- Y / 比-4的比值。其中，腸粘膜上化R-2和TNF-a表達(dá)的增強(qiáng)能夠有效地對(duì)癌癥進(jìn)行治療和/ 或預(yù)防，IFN-Y的表達(dá)W及IFN-Y/IL-4的比值的提高能夠有效的預(yù)防和/或治療Th2型 疾病。
[0013] 其中，機(jī)體的特異性免疫主要有兩類(lèi)，即體液免疫反應(yīng)（Th2型）和細(xì)胞介導(dǎo)免疫 反應(yīng)（Thl)。Thl型細(xì)胞因子（比-2、IFN-Y)可W促進(jìn)細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)，有助于機(jī)體抵抗 腫瘤、細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌感染和病毒感染。化2型細(xì)胞因子（比-4、比-5、比-6)可W介導(dǎo)體液免疫 反應(yīng)，有助于機(jī)體產(chǎn)生特定抗原的抗體，其中，當(dāng)Th2型免疫過(guò)強(qiáng)時(shí)，容易誘發(fā)機(jī)體的自身 免疫反應(yīng)，導(dǎo)致自身免疫性疾病。IFN-Y ^L-4的比值表明化1/化2細(xì)胞的分化，IFN-Y/ IL-4的比值大于1，說(shuō)明其誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)更傾向于Thl免疫，從而能夠在一定程度上抑制 化2型免疫。保藏編號(hào)為CGMCC No. 9273的動(dòng)物雙歧桿菌乳酸亞種能夠有效地調(diào)節(jié)IFN- Y / IL-4的比值，使免疫反應(yīng)更傾向于Thl免疫。
[0014] 基于W上發(fā)現(xiàn)，一方面，本發(fā)明提供了保藏編號(hào)為CGMCC No. 9273的動(dòng)物雙歧桿菌 乳酸亞種炬ifidobacterium animalis subsp. lactis)在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能中的應(yīng)用，所述 應(yīng)用不包括治療人體或動(dòng)物體的疾病。
[0015] 本發(fā)明只保護(hù)在非疾病狀態(tài)下需要提高機(jī)體免疫力的保藏編號(hào)為CGMCC No. 9273 的動(dòng)物雙歧桿菌乳酸亞種炬ifidobacterium animalis subsp. lactis)在增強(qiáng)機(jī)體免疫功 能中的應(yīng)用，而對(duì)于需要提高免疫力W治療疾病時(shí)，應(yīng)用保藏編號(hào)為CGMCC No. 9273的動(dòng)物 雙歧桿菌乳酸亞種炬ifidobacterium animalis subsp. lactis)并不在本發(fā)明的保護(hù)范圍 之內(nèi)。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明，所述應(yīng)用包括制備增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的藥物和/或食品。
[0017] 本發(fā)明中，所述食品可W是任意類(lèi)型的食品，例如果汁制品、乳制品、丑制品等。食 品也可W根據(jù)食用對(duì)象的不同而有所不同。所述食品中還可W含有常規(guī)的添加劑，例如香 料、礦物質(zhì)、維生素、穩(wěn)定劑、增稠劑、防腐劑等。另外，所述藥物可W根據(jù)給藥途徑的不同而 制備成不同的形式，例如，可W制備成散劑、片劑、顆粒劑、膠囊劑、溶液劑、乳劑、混息劑等 形式，所述藥物中還可W包括藥學(xué)上可接受的佐劑，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)不同的劑型 選擇不同的佐劑，本發(fā)明在此不再詳細(xì)費(fèi)述。
[0018] 優(yōu)選地，所述應(yīng)用包括制備用于治療和/或預(yù)防癌癥的藥物。
[0019] 優(yōu)選地，所述應(yīng)用包括制備用于預(yù)防和/或治療Th2型疾病的藥物。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明，所述治療Th2型疾病是指，能夠治療由于Th2型免疫過(guò)強(qiáng)引起的疾 病，或是由于Thl型免疫過(guò)弱引起的疾病。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明，所述藥物的種類(lèi)可W為如上所述的，本發(fā)明在此不再詳細(xì)費(fèi)述。
[0022] 另一方面，本發(fā)明還提供了一種含有保藏編號(hào)為CGMCC No. 9273的動(dòng)物雙歧桿菌 乳酸亞種炬ifidobacterium animalis subsp. Iactis)作為活性成分的組合物。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明，在所述組合物中含有如上所述動(dòng)物雙歧桿菌的活菌體和/或死菌體 作為活性成分。優(yōu)選地，含有所述動(dòng)物雙歧桿菌的活菌體或者活菌體和死菌體的混合菌體 作為活性成分。當(dāng)使用活菌體或死菌體的混合菌體作為活性成分時(shí)，活菌體的數(shù)量?jī)?yōu)選高 于死菌體的數(shù)量。
[0024] 在本發(fā)明的所述組合物中，盡管將所述動(dòng)物雙歧桿菌添加到所述組合物中，并對(duì) 個(gè)體進(jìn)行給藥，即可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，即起到調(diào)節(jié)免疫的作用，但優(yōu)選情況下，但為了進(jìn) 一步增強(qiáng)所述組合物的保健效果，優(yōu)選地，W每克所述組合物為基準(zhǔn)，所述動(dòng)物雙歧桿菌的 含量為l〇6-l〇iiC即。
[00巧]根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的組合物可W W多種形式而存在，例如，可W W藥物的形式存 在，也可W W食品的形式存在，該根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的實(shí)際需求而定。
[0026] CFU (Colony-Forming化its,菌落形成單位）指活菌個(gè)數(shù)。在活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)時(shí)，由 單個(gè)菌體或聚集成團(tuán)的多個(gè)菌體在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖所形成的集落，稱(chēng)為菌落形成單 位，W其表達(dá)活菌的數(shù)量，可W通過(guò)平板菌落計(jì)數(shù)法獲得。本發(fā)明中，當(dāng)雙歧桿菌的死菌體 的濃度W CFU/ml表示時(shí)，是指雙歧桿菌的活菌體死亡后得到相應(yīng)數(shù)量的死菌體，并將其溶 于緩沖液中配制成所需濃度。
[0027] W下的實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不因此限制本發(fā)明。
[002引在下述制備例、實(shí)施例和對(duì)比例中：
[0029] 受試菌株及培養(yǎng)條件：
[0030] 動(dòng)物雙歧桿菌乳酸亞種 A6 炬ifidobacterium animalis subsp. Iactis) ( W下簡(jiǎn)稱(chēng) A6);陽(yáng)性對(duì)照菌株BB12 (動(dòng)物雙歧桿菌，來(lái)自科漢森公司），受試菌在MRS厭氧液體培養(yǎng)基 中于37C厭氧培養(yǎng)12h，使菌濃度達(dá)到IO9C化/ml,菌液在室溫下W 4200g離也15min收集 菌體，菌體用無(wú)菌生理鹽水重息洗涂?jī)纱魏螅脽o(wú)菌生理鹽水調(diào)整至不同濃度。本領(lǐng)域技術(shù) 人員能夠理解的是，該制備的菌息液中是包括一定數(shù)量的雙歧桿菌的死菌體的。
[0031] 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：
[0032] SPF級(jí)BALB/c小鼠，6到8周齡，雄性，體重18-22g，購(gòu)于北京維通利華公司實(shí)驗(yàn)動(dòng) 物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物食用安全監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中也（北京）動(dòng)物房，室 溫22 ±2 C，12小時(shí)燈照/黑暗循環(huán)，自由飲水和攝食。
[0033] 本發(fā)明所用的試劑、培養(yǎng)基組成W及實(shí)驗(yàn)學(xué)方法等在沒(méi)有特別說(shuō)明的情況下，均 為本領(lǐng)域常規(guī)使用的試劑、培養(yǎng)基組成W及實(shí)驗(yàn)學(xué)方法。在沒(méi)有特別說(shuō)明的情況下，W下所 測(cè)得的數(shù)值均是在實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)定8個(gè)平行樣品所得的平均值。
[0034] 實(shí)施例1-3
[00巧]小鼠隨機(jī)分組，每組10只，適應(yīng)性飼養(yǎng)7天后，各劑量組每天分別灌服不同濃度 的受試菌A60. 2ml/天，其中高劑量組為l〇i°c化/ml (作為實(shí)施例1)，中劑量組為IQSrfu/ ml (作為實(shí)施例2)，低劑量組為l〇6c化/ml (作為實(shí)施例扣。灌胃7周，每周稱(chēng)一次體重。
[0036] (1)滴片法測(cè)定巨瞻細(xì)胞吞瞻雞紅細(xì)胞（CRBC)吞瞻率
[0037] 小鼠摘除眼球取血后，經(jīng)頸椎脫白處死。在超凈工作臺(tái)盡快分離小鼠腹腔細(xì)胞液， 操作如下。
[0038] 小也剪去腹部毛皮，露出腹膜，用無(wú)菌注射器向腹腔注射4mL含有5% (v/v)胎牛 血清的Hank's液。輕輕揉動(dòng)腹部幾下，用注射器吸出腹腔液體（約2ml)，其中含有巨瞻細(xì) 胞。巨瞻細(xì)胞吞瞻雞紅細(xì)胞（CRBCs)的活性采用Giemsa平板染色法測(cè)定，用光學(xué)顯微鏡計(jì) 數(shù)CRBC的吞瞻個(gè)數(shù)，簡(jiǎn)述如下。在巨瞻細(xì)胞液中添加胎牛血清使其終濃度為20% (v/v)， 此血清濃度下巨瞻細(xì)胞能夠較好地貼壁。CRBC用生理鹽水配成1 % (v/v)的細(xì)胞液。將巨 瞻細(xì)胞液與CRBC等體積混合，吹打均勻后快速滴加到用蠟筆或3% (w/v)瓊脂封閉邊緣的 玻片的封閉圈內(nèi)，使混合細(xì)胞液布滿玻片。將玻片置于37C，5% C〇2培養(yǎng)箱中賠育20分 鐘，在此過(guò)程中，巨瞻細(xì)胞會(huì)完成對(duì)CRBC的吞瞻過(guò)程。培養(yǎng)結(jié)束后迅速用生理鹽水將未貼 壁的巨瞻細(xì)胞和未被吞瞻的CRBC沖掉（用吸管吸取生理鹽水吹打5次），滴加甲醇固定1 分鐘。Giemsa原液用PBS緩沖液稀釋8倍，均勻滴加到玻片上（每張玻片0. 5mL)，染色15 分鐘。用蒸觸水沖洗干凈，瞭干。巨瞻細(xì)胞吞瞻活性用60倍光鏡下計(jì)數(shù)被吞瞻的CRBC數(shù) 來(lái)表示。每張玻片計(jì)數(shù)100個(gè)巨瞻細(xì)胞，吞瞻率為每100個(gè)巨瞻細(xì)胞中吞瞻CRBC的巨瞻細(xì) 胞所占的百分比，結(jié)果見(jiàn)表1。
[0039] (2)脾淋己細(xì)胞增殖能力檢測(cè)
[0040] 脾淋己細(xì)胞的增殖采用CCK-8法測(cè)定。制備脾淋己細(xì)胞，用RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào) 整細(xì)胞濃度至2X 1〇6個(gè)/ml,將脾細(xì)胞加入96孔板，每孔100 y 1。每孔加入10 y 1含有 或不含有刀豆蛋白A (ConA,終濃度1. 5ug/ml，含有ConA的為刺激孔，不含的為對(duì)照孔）的 1640培養(yǎng)基。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)刺激孔和3個(gè)對(duì)照孔。同時(shí)設(shè)只加純培養(yǎng)基的空白孔。細(xì)胞 在37°C，5% (?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí)。距離培養(yǎng)結(jié)束前4小時(shí)，每孔加入IOy 1 CCK-8 試劑。培養(yǎng)結(jié)束后，用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔吸光值，脾細(xì)胞增殖情況用增殖率表 示，通過(guò)如下公式計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表1。
[00川增值率=[A(加 ConA)-A(空白）]/[A(無(wú) ConA)-A(空白）]X100%
[0042] A (加ConA);具有細(xì)胞、CCK-8溶液和ConA溶液的孔的吸光度 [004引 A (空白）：具有培養(yǎng)基和CCK-8溶液而沒(méi)有細(xì)胞的孔的吸光度
[0044] A (無(wú)ConA);具有細(xì)胞、CCK-8溶液而沒(méi)有ConA溶液的孔的吸光度
[0045] (3)血清IgG含量測(cè)定
[0046] 小鼠在宰殺之前，摘除眼球取血，血液樣品在室溫下放置約3小時(shí)凝血，然后置于 4°C冰箱過(guò)夜。將樣品室溫下1000巧m離也lOmin，小也收集上層血清，若混有紅細(xì)胞，則再 次離也，吸取上清。血清樣品于-2(TC凍存。血清中IgG濃度用ELISA法檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表1。
[0047] (4)腸黏膜細(xì)胞因子的測(cè)定
[0048] 處死小鼠，打開(kāi)腹腔，由盲腸向上5cm取遠(yuǎn)端回腸段，剪開(kāi)腸管，棄去粘液層，用蓋 玻片刮取小腸黏膜，使用TRIzol試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）按照其說(shuō)明書(shū) 提取總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司）按照其說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn) 錄為cDNA，RT-qPCR法測(cè)定目的基因化3-2、1^- a，IFN- Y和比-4的表達(dá)，并計(jì)算IFN- Y / IL-4的比值。其中，RT-qPCR反應(yīng)采用20y 1反應(yīng)體系；2X叫tra SYBR MixUire IOy 1，上、 下游引物（lOpmol/y I)各 0. 2y l，cDNA2y 1，(1地2〇7. 6y I ;反應(yīng)條件為 95°C 30s 預(yù)變性一 次，95°C15s，6(rC30s，72°C30s，8(rC5s，40個(gè)循環(huán)。其中，測(cè)定I'LR-2、TNF-a，IFN-y和 比-4的表達(dá)所用引物如下表所示，參比基因?yàn)镚APDH?；?-2、1^-〇 ,IFN-Y和比-4的表 達(dá)量為相對(duì)于GAPDH基因的表達(dá)量。結(jié)果如表1所示。
[0049]
[0050] 對(duì)比例1

【權(quán)利要求】
1·保藏編號(hào)為CGMCC No. 9273的動(dòng)物雙歧桿菌乳酸亞種（Bifidobacterium animalis subsp. lactis)在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能中的應(yīng)用，所述應(yīng)用不包括治療人體或動(dòng)物體的疾病。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中，所述調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能包括提高以下指標(biāo)中的 至少一種： 吞噬細(xì)胞的吞噬率，脾淋巴細(xì)胞的增殖能力，血清中IgG的含量，腸粘膜上TLR-2、 TNF- a、IFN- γ的表達(dá)，以及腸黏膜上IFN- γ /IL-4的比值。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其中，所述應(yīng)用包括制備增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的藥物 和/或食品。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其中，所述應(yīng)用包括制備用于治療和/或預(yù)防癌癥的藥 物。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其中，所述應(yīng)用包括制備用于預(yù)防和/或治療Th2型疾 病的藥物。
6. 含有保藏編號(hào)為CGMCC No. 9273的動(dòng)物雙歧桿菌乳酸亞種（Bifidobacterium animalis subsp. lactis)作為活性成分的組合物。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的組合物，其中，所述組合物含有所述動(dòng)物雙歧桿菌的活菌體 和/或死菌體作為活性成分。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的組合物，其中，以每克所述組合物為基準(zhǔn)，所述動(dòng)物雙歧 桿菌的含量為l〇6_l〇 nCFU。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的組合物，其中，所述組合物包括藥物和/或食品。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK104224851SQ201410404044
【公開(kāi)日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年8月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月15日
【發(fā)明者】朱媛博, 任發(fā)政, 郭慧媛, 趙亮 申請(qǐng)人:任發(fā)政