本發(fā)明涉及來(lái)自多能干細(xì)胞的心肌細(xì)胞群的制造方法。
背景技術(shù)：
：作為由人多能干細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化誘導(dǎo)方法，已經(jīng)報(bào)道了例如下述方法：使用激活素A和骨形成蛋白4(BoneMorphogeneticProtein4，BMP4)對(duì)在飼養(yǎng)細(xì)胞上維持培養(yǎng)的人多能干細(xì)胞進(jìn)行分化誘導(dǎo)的方法(非專利文獻(xiàn)1、2)，使用Wnt3a、R-Spondin-1及DKK1對(duì)在Matrigel上維持培養(yǎng)的人多能干細(xì)胞進(jìn)行分化誘導(dǎo)的方法(非專利文獻(xiàn)3)，使用生物反應(yīng)器對(duì)在飼養(yǎng)細(xì)胞上維持培養(yǎng)的人多能干細(xì)胞大量地進(jìn)行分化誘導(dǎo)的方法(非專利文獻(xiàn)3)等。在進(jìn)行由多能干細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化誘導(dǎo)時(shí)，通常會(huì)在批次間觀察到該心肌細(xì)胞分化效率不穩(wěn)定。在作為再生醫(yī)療的移植細(xì)胞源使用時(shí)，在作為移植細(xì)胞的心肌細(xì)胞純度不滿足基準(zhǔn)值時(shí)則有必要對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行純化。關(guān)于用于再生醫(yī)療的來(lái)自人多能干細(xì)胞的心肌細(xì)胞的純度，有報(bào)道指出：并非必須以100％為目標(biāo)，反而是70％左右時(shí)在功能性方面更良好(非專利文獻(xiàn)4)。因此，將來(lái)自人多能干細(xì)胞的心肌細(xì)胞純度小于70％的細(xì)胞群的心肌細(xì)胞純度提高到70％左右，特別是在細(xì)胞治療中的移植細(xì)胞制備中意義重大。此外，由于難以將心肌細(xì)胞分化效率在批次間調(diào)整到同一程度，因此可預(yù)測(cè)，在藥物開發(fā)篩選研究中分化效率的批次間差異會(huì)影響結(jié)果的重復(fù)性。進(jìn)而，為了靈敏地檢測(cè)心肌細(xì)胞的藥劑響應(yīng)性，需要使除心肌細(xì)胞以外的細(xì)胞所產(chǎn)生的背景強(qiáng)度為最低限度。已經(jīng)報(bào)道了幾種提高分化誘導(dǎo)后的心肌細(xì)胞的純度的方法，大體上可以分為兩類方法。第一類方法為利用細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)缺陷的方法，即使用去除了除心肌細(xì)胞以外的細(xì)胞生存所必需的營(yíng)養(yǎng)源的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，來(lái)除去心肌細(xì)胞以外的細(xì)胞。例如，專利文獻(xiàn)1記載了用低葡萄糖濃度的培養(yǎng)基來(lái)提高心肌細(xì)胞的純度的方法。但是，擔(dān)心該方法不僅損傷除心肌細(xì)胞以外的細(xì)胞，連心肌細(xì)胞也會(huì)損傷顯著。此外，還存在心肌細(xì)胞的挑選需要長(zhǎng)時(shí)間(至少數(shù)天)的問(wèn)題。第二類方法是用針對(duì)心肌細(xì)胞特異性表面抗原、糖鏈的抗體來(lái)分離獲得心肌細(xì)胞的方法，即使用流式細(xì)胞術(shù)、磁珠的方法。但是，用流式細(xì)胞術(shù)分離獲得細(xì)胞時(shí)，存在根據(jù)所需的細(xì)胞量而需要相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間的問(wèn)題。此外，存在擔(dān)心使用流式細(xì)胞術(shù)、磁珠而使所回收的細(xì)胞損傷、污染的問(wèn)題。因此，在像細(xì)胞移植這樣需要大量細(xì)胞的情況下，采用該方法是不現(xiàn)實(shí)的。進(jìn)而，使用該方法時(shí)，需要評(píng)價(jià)抗體、磁珠的殘存，需要時(shí)間和功夫。如果檢測(cè)到磁珠殘存，則難以確保移植細(xì)胞的安全性。就純化來(lái)自人多能干細(xì)胞的分化細(xì)胞來(lái)制備移植用細(xì)胞的理想方法而言，不僅要提高分化細(xì)胞的純度、細(xì)胞收獲量，而且要確保對(duì)于接受移植的人的安全性，同時(shí)可以制備出移植后可在體內(nèi)發(fā)揮目標(biāo)功能的細(xì)胞，這些都是不可或缺的。更理想的是，期望一種對(duì)細(xì)胞的損傷低、且可以在短時(shí)間內(nèi)處理大量細(xì)胞的簡(jiǎn)單方法。但是，很難說(shuō)通過(guò)目前報(bào)道的方法可以制備能夠用于臨床的細(xì)胞。因此，迫切需要開發(fā)出能夠簡(jiǎn)便且大量地制備能夠用于臨床的細(xì)胞、即安全且損傷少的細(xì)胞的新方法?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1：日本特開2013-143968號(hào)公報(bào)非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)1：YangLetal.,Nature,2008May22；453(7194):524-8,doi:10.1038/nature06894,Epub2008Apr23非專利文獻(xiàn)2：TakahashiKetal.,Cell,2007Nov30；131(5):861-72非專利文獻(xiàn)3：KawamuraMetal.,Circulation,2012Sep11；126(11Suppl1):S29-37非專利文獻(xiàn)4：ThavandiranNetal.,ProcNatlAcadSciUSA.2013Dec3；110(49):E4698-707,doi:10.1073/pnas.1311120110,Epub2013Nov19技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：發(fā)明所要解決的問(wèn)題本發(fā)明的課題在于，提供一種在短時(shí)間內(nèi)以簡(jiǎn)便的操作使用由多能干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化誘導(dǎo)后的細(xì)胞群來(lái)制造能夠用于臨床的、安全且損傷少的心肌細(xì)胞群的方法。用于解決問(wèn)題的方法為了解決上述課題，本發(fā)明包括以下的各發(fā)明。[1]一種心肌細(xì)胞群的制造方法，其特征在于，包含：(1)將多能干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化誘導(dǎo)的工序，(2)使分化誘導(dǎo)后的細(xì)胞群與選自由層粘連蛋白α2β1γ1、層粘連蛋白α2β2γ1、層粘連蛋白α1β1γ1及層粘連蛋白α1β2γ1組成的組中的層粘連蛋白或者該層粘連蛋白的具有整聯(lián)蛋白結(jié)合活性的片段接觸的工序，及(3)回收附著于上述層粘連蛋白或上述片段的細(xì)胞的工序。[2]根據(jù)上述[1]所述的制造方法，其特征在于，還包含從分化誘導(dǎo)后的細(xì)胞群除去未分化細(xì)胞的工序。[3]根據(jù)上述[2]所述的制造方法，其特征在于，上述除去未分化細(xì)胞的工序設(shè)置在上述工序(1)和(2)之間，上述除去未分化細(xì)胞的工序包含：(A)使分化誘導(dǎo)后的細(xì)胞群與選自由層粘連蛋白α5β1γ1、層粘連蛋白α5β2γ1、層粘連蛋白α3β1γ1、層粘連蛋白α3β2γ1及層粘連蛋白α3β3γ2組成的組中的層粘連蛋白或者該層粘連蛋白的具有整聯(lián)蛋白結(jié)合活性的片段接觸的工序，及(B)回收未附著于上述層粘連蛋白或上述片段的細(xì)胞的工序。[4]根據(jù)上述[1]～[3]中任一項(xiàng)所述的制造方法，其特征在于，在上述工序(2)和/或工序(A)中，使包被在培養(yǎng)器具的培養(yǎng)面或載體上的層粘連蛋白或該層粘連蛋白的具有整聯(lián)蛋白結(jié)合活性的片段與分化誘導(dǎo)后的細(xì)胞群接觸。[5]根據(jù)上述[1]～[4]中任一項(xiàng)所述的制造方法，其中，層粘連蛋白的具有整聯(lián)蛋白結(jié)合活性的片段為層粘連蛋白E8片段。[6]根據(jù)上述[5]所述的制造方法，其中，層粘連蛋白E8片段的包被濃度為0.1μg/cm2～2μg/cm2。[7]根據(jù)上述[5]或[6]所述的制造方法，其中，上述工序(2)中的接觸時(shí)間為15分鐘～180分鐘。[8]根據(jù)上述[5]～[7]中任一項(xiàng)所述的制造方法，其中，上述工序(A)中的接觸時(shí)間為5分鐘～30分鐘。[9]根據(jù)上述[1]～[8]中任一項(xiàng)所述的制造方法，其中，心肌細(xì)胞群的心肌細(xì)胞的純度為50％～90％。[10]一種提高由多能干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化誘導(dǎo)后的細(xì)胞群的心肌細(xì)胞的純度的方法，其特征在于，包含以下工序1及工序2，工序1：使選自由層粘連蛋白α2β1γ1、層粘連蛋白α2β2γ1、層粘連蛋白α1β1γ1及層粘連蛋白α1β2γ1組成的組中的層粘連蛋白或該層粘連蛋白的具有整聯(lián)蛋白結(jié)合活性的片段與上述細(xì)胞群接觸的工序，工序2：回收附著于上述層粘連蛋白或上述片段的細(xì)胞的工序。[11]根據(jù)上述[10]所述的方法，其中，上述具有整聯(lián)蛋白結(jié)合活性的片段為層粘連蛋白E8片段。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明，可以在短時(shí)間內(nèi)以簡(jiǎn)便的操作使用由多能干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化誘導(dǎo)后的細(xì)胞群來(lái)制造能夠用于臨床的、安全且損傷少的心肌細(xì)胞群。此外，根據(jù)本發(fā)明，可以在短時(shí)間內(nèi)以簡(jiǎn)便的操作提高由多能干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化誘導(dǎo)后的細(xì)胞群的心肌細(xì)胞的純度。附圖說(shuō)明圖1是示出研究使用人層粘連蛋白E8片段(511E8、311E8、332E8)來(lái)除去由人iPS細(xì)胞分化誘導(dǎo)成心肌細(xì)胞的細(xì)胞群中的未分化細(xì)胞的結(jié)果的圖。圖2是示出將人層粘連蛋白511E8片段對(duì)未分化細(xì)胞的特異性與人層粘連蛋白221E8片段對(duì)未分化細(xì)胞的特異性進(jìn)行比較研究的結(jié)果的圖。圖3是示出對(duì)使用人層粘連蛋白E8片段(221E8、211E8、511E8)來(lái)提高由人iPS細(xì)胞分化誘導(dǎo)成心肌細(xì)胞的細(xì)胞群的心肌細(xì)胞率、以及所使用的人層粘連蛋白E8片段對(duì)心肌細(xì)胞的特異性進(jìn)行研究的結(jié)果的圖。圖4是示出用人層粘連蛋白221E8片段處理由人iPS細(xì)胞分化誘導(dǎo)成心肌細(xì)胞的細(xì)胞群、經(jīng)時(shí)地回收附著細(xì)胞、研究附著細(xì)胞中的心肌細(xì)胞率的結(jié)果的圖。圖5是示出對(duì)于使用人層粘連蛋白E8片段(511E8、221E8、211E8)來(lái)除去由人iPS細(xì)胞分化誘導(dǎo)成心肌細(xì)胞的細(xì)胞群中的未分化細(xì)胞、改變處理時(shí)間(接觸時(shí)間)進(jìn)行研究的結(jié)果的圖。圖6是示出對(duì)于使用人層粘連蛋白E8片段(511E8、221E8、211E8)來(lái)進(jìn)行由人iPS細(xì)胞分化誘導(dǎo)成心肌細(xì)胞的細(xì)胞群的心肌細(xì)胞的純化、改變處理時(shí)間(接觸時(shí)間)進(jìn)行研究的結(jié)果的圖。圖7是示出對(duì)于使用人層粘連蛋白E8片段(511E8、221E8、211E8)來(lái)進(jìn)行由人iPS細(xì)胞分化誘導(dǎo)成心肌細(xì)胞的細(xì)胞群的心肌細(xì)胞的純化、改變?nèi)藢诱尺B蛋白E8片段的包被濃度進(jìn)行研究的結(jié)果的圖。圖8是示出對(duì)221E8處理和511E8處理時(shí)的由人iPS細(xì)胞分化誘導(dǎo)成心肌細(xì)胞的細(xì)胞群的心肌細(xì)胞富集效果進(jìn)行比較的結(jié)果的圖。圖9是示出對(duì)221E8處理和無(wú)糖培養(yǎng)基處理時(shí)的由人iPS細(xì)胞分化誘導(dǎo)成心肌細(xì)胞的細(xì)胞群的心肌細(xì)胞的純化進(jìn)行比較的結(jié)果的圖。具體實(shí)施方式〔心肌細(xì)胞群的制造方法〕本發(fā)明提供一種心肌細(xì)胞群的制造方法(以下稱為“本發(fā)明的制造方法”)。本發(fā)明的制造方法包含以下的工序(1)、工序(2)及工序(3)即可：(1)將多能干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化誘導(dǎo)的工序；(2)使分化誘導(dǎo)后的細(xì)胞群與選自由層粘連蛋白α2β1γ1、層粘連蛋白α2β2γ1、層粘連蛋白α1β1γ1及層粘連蛋白α1β2γ1組成的組中的層粘連蛋白或者該層粘連蛋白的具有整聯(lián)蛋白結(jié)合活性的片段接觸的工序；(3)回收附著于上述層粘連蛋白或上述片段的細(xì)胞的工序。本發(fā)明的制造方法優(yōu)選還包含從由多能干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化誘導(dǎo)后的細(xì)胞群除去未分化細(xì)胞的工序。該除去未分化細(xì)胞的工序優(yōu)選設(shè)置在工序(1)和(2)之間。通常認(rèn)為，來(lái)自多能干細(xì)胞的心肌細(xì)胞群中殘存的未分化細(xì)胞越少，則移植細(xì)胞的安全性越提高。此外，本發(fā)明的制造方法中，在工序(3)之后可以包含對(duì)工序(3)所回收的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的工序(4)。上述除去未分化細(xì)胞的工序可以適當(dāng)使用公知的未分化細(xì)胞除去方法。作為公知的未分化細(xì)胞除去方法，可以列舉：國(guó)際公開WO2012/056997號(hào)中記載的方法、國(guó)際公開WO2012/147992號(hào)中記載的方法、國(guó)際公開WO2012/133674號(hào)中記載的方法、國(guó)際公開WO2012/012803號(hào)(日本特表2013-535194)中記載的方法、國(guó)際公開WO2012/078153號(hào)(日本特表2014-501518)中記載的方法、日本特開2013-143968號(hào)公報(bào)及CellStemCellVol.12January2013,Page127-137中記載的方法、PNAS2013Aug27；110(35):E3281-90中記載的方法等。本發(fā)明的制造方法中，優(yōu)選使用包含以下的工序(A)及工序(B)的方法作為上述除去未分化細(xì)胞的方法：(A)使分化誘導(dǎo)后的細(xì)胞群與選自由層粘連蛋白α5β1γ1、層粘連蛋白α5β2γ1、層粘連蛋白α3β1γ1、層粘連蛋白α3β2γ1及層粘連蛋白α3β3γ2組成的組中的層粘連蛋白或者該層粘連蛋白的具有整聯(lián)蛋白結(jié)合活性的片段接觸的工序；(B)回收未附著于上述層粘連蛋白或上述片段的細(xì)胞的工序。通過(guò)本發(fā)明的制造方法制造的“心肌細(xì)胞群”是指包含由多能干細(xì)胞分化誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的細(xì)胞群?！靶募〖?xì)胞群”的心肌細(xì)胞中包括成熟心肌細(xì)胞及心肌前體細(xì)胞兩者。此外，“心肌細(xì)胞群”中還可以包含除心肌細(xì)胞以外的細(xì)胞。作為除心肌細(xì)胞以外的細(xì)胞，可以列舉例如：由多能干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化過(guò)程中的細(xì)胞。此外，還可以包含由多能干細(xì)胞分化的血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、其它細(xì)胞。所得到的心肌細(xì)胞群可以優(yōu)選作為臨床中用于移植治療的心肌細(xì)胞群使用。例如，可以用于制作移植用心肌片層，或者用于通過(guò)導(dǎo)管或注射針直接注入心臟。此外，所得到的心肌細(xì)胞群作為藥物開發(fā)篩選、發(fā)生研究等研究用細(xì)胞也是非常有用的。作為本發(fā)明的制造方法中使用的多能干細(xì)胞，可以列舉：ES細(xì)胞(胚胎干細(xì)胞)、iPS細(xì)胞(誘導(dǎo)多能干細(xì)胞)、mGS細(xì)胞(多能生殖干細(xì)胞)、ES細(xì)胞與體細(xì)胞的融合細(xì)胞等。優(yōu)選ES細(xì)胞或iPS細(xì)胞，更優(yōu)選iPS細(xì)胞。多能干細(xì)胞優(yōu)選為來(lái)自哺乳動(dòng)物的干細(xì)胞。對(duì)哺乳動(dòng)物沒(méi)有特別限定，可以列舉：人、小鼠、大鼠、牛、豬等。其中優(yōu)選人。通過(guò)使用人多能干細(xì)胞，可以制造對(duì)人安全的心肌細(xì)胞群。層粘連蛋白為由α鏈、β鏈及γ鏈這3條亞基鏈構(gòu)成的異三聚體分子。已知α鏈有α1～α5這5種、β鏈有β1～β3這3種、γ鏈有γ1～γ3這3種，通過(guò)它們的組合，存在至少12種以上的異形體。在本發(fā)明的制造方法中，工序(2)中使用的層粘連蛋白優(yōu)選為對(duì)在心肌細(xì)胞的細(xì)胞表面表達(dá)的整聯(lián)蛋白具有結(jié)合特異性的層粘連蛋白。層粘連蛋白結(jié)合性整聯(lián)蛋白有α3β1、α6β1、α6β4及α7β1(Hynesetal.,CellVol.110,673-687,2002)。已知這些整聯(lián)蛋白在生物體內(nèi)的表達(dá)部位分別具有特征性，肌組織中選擇性表達(dá)整聯(lián)蛋白α7β1。此外報(bào)道了：整聯(lián)蛋白α7β1中有由于α7鏈的選擇性剪接而產(chǎn)生的α7X1β1和α7X2β1這2個(gè)類型，在心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞中主要表達(dá)α7X2β1(Israeli-rosenbergetal.,CircRes.2014；114:572-586)。作為對(duì)整聯(lián)蛋白α7X2β1的結(jié)合特異性高的層粘連蛋白，報(bào)道了層粘連蛋白α2β1γ1、層粘連蛋白α2β2γ1、層粘連蛋白α1β1γ1、層粘連蛋白α1β2γ1(Taniguchietal.,TheJournalofBiologicalChemistry,7820-7831,2009)。因此，在工序(2)中，優(yōu)選使用對(duì)整聯(lián)蛋白α7X2β1的結(jié)合特異性高的層粘連蛋白α2β1γ1、層粘連蛋白α2β2γ1、層粘連蛋白α1β1γ1或?qū)诱尺B蛋白α1β2γ1。以下分別記作層粘連蛋白211、層粘連蛋白221、層粘連蛋白111、層粘連蛋白121。在本發(fā)明的制造方法中，從分化誘導(dǎo)后的細(xì)胞群除去未分化細(xì)胞的工序、即工序(A)中使用的層粘連蛋白優(yōu)選為對(duì)在未分化的多能干細(xì)胞表面表達(dá)的整聯(lián)蛋白具有結(jié)合特異性的層粘連蛋白。已知多能干細(xì)胞、特別是人多能干細(xì)胞較多表達(dá)整聯(lián)蛋白中的α6β1(MiyazakiTetal.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,375:27-32,2008)。作為對(duì)整聯(lián)蛋白α6β1的結(jié)合特異性高的層粘連蛋白，報(bào)道了層粘連蛋白α5β1γ1、層粘連蛋白α5β2γ1、層粘連蛋白α3β3γ2(Nishiuchietal.,MatrixBiol.,25:189-197,2006)。因此，在工序(A)中，優(yōu)選使用對(duì)整聯(lián)蛋白α6β1的結(jié)合特異性高的層粘連蛋白α5β1γ1、層粘連蛋白α5β2γ1或?qū)诱尺B蛋白α3β3γ2。此外，發(fā)明人們確認(rèn)了與層粘連蛋白α3β3γ2同樣包含α3鏈的層粘連蛋白α3β1γ1、層粘連蛋白α3β2γ1對(duì)整聯(lián)蛋白α6β1的結(jié)合特異性也高，這些也可以優(yōu)選用于工序(A)中。以下分別記作層粘連蛋白511、層粘連蛋白521、層粘連蛋白332、層粘連蛋白311、層粘連蛋白321。本發(fā)明的制造方法中使用的層粘連蛋白可以是全長(zhǎng)層粘連蛋白，也可以是具有整聯(lián)蛋白結(jié)合活性的層粘連蛋白片段。即，可以為由全長(zhǎng)α鏈、全長(zhǎng)β鏈及全長(zhǎng)γ鏈構(gòu)成的全長(zhǎng)層粘連蛋白，也可以為包含α鏈、β鏈及γ鏈中的至少1個(gè)以上為比全長(zhǎng)短的片段的層粘連蛋白片段。層粘連蛋白片段優(yōu)選形成異三聚體。層粘連蛋白片段具有整聯(lián)蛋白結(jié)合活性這一點(diǎn)可以通過(guò)使用了作為結(jié)合對(duì)象的整聯(lián)蛋白的固相結(jié)合分析等來(lái)確認(rèn)。層粘連蛋白片段形成異三聚體這一點(diǎn)可以通過(guò)將層粘連蛋白片段供于SDS-PAGE并檢測(cè)條帶數(shù)等來(lái)確認(rèn)。作為具有整聯(lián)蛋白結(jié)合活性的層粘連蛋白片段，可以優(yōu)選使用層粘連蛋白E8片段(以下記作“層粘連蛋白E8”)。層粘連蛋白E8是將小鼠層粘連蛋白111用彈性蛋白酶消化得到的形成了異三聚體的片段中被鑒定為具有強(qiáng)細(xì)胞粘附活性的片段(EdgarDetal.,J.CellBiol.,105:589-598,1987)。推測(cè)對(duì)除小鼠層粘連蛋白111以外的層粘連蛋白用彈性蛋白酶進(jìn)行消化時(shí)也存在與小鼠層粘連蛋白111E8相當(dāng)?shù)钠危€沒(méi)有將除小鼠層粘連蛋白111以外的層粘連蛋白用彈性蛋白酶消化并分離、鑒定了層粘連蛋白E8的報(bào)告。因此，本發(fā)明中使用的層粘連蛋白E8并不要求為層粘連蛋白的彈性蛋白酶消化產(chǎn)物，只要為具有與小鼠層粘連蛋白111E8同樣的細(xì)胞粘附活性、具有同樣的結(jié)構(gòu)、具有同程度的分子量的層粘連蛋白的片段即可。對(duì)層粘連蛋白或?qū)诱尺B蛋白片段的來(lái)源沒(méi)有特別限定，可以使用來(lái)自各種生物的層粘連蛋白或?qū)诱尺B蛋白片段。優(yōu)選來(lái)自哺乳動(dòng)物的層粘連蛋白或?qū)诱尺B蛋白片段。作為哺乳動(dòng)物，可以列舉例如：人、小鼠、大鼠、牛、豬等，但不被限定。其中，特別優(yōu)選使用來(lái)自人的層粘連蛋白片段。為了制造對(duì)人安全的心肌細(xì)胞群而要求在制造工序中排除來(lái)自異種生物的成分的使用，因此優(yōu)選使用來(lái)自人的層粘連蛋白片段。層粘連蛋白可以為天然型，也可以為在維持其生物學(xué)活性的狀態(tài)下1個(gè)或1個(gè)以上的氨基酸殘基被修飾的修飾型。對(duì)層粘連蛋白的制造方法沒(méi)有特別限定，可以列舉例如：由層粘連蛋白高表達(dá)細(xì)胞純化的方法、和以重組蛋白形式來(lái)制造的方法等。對(duì)層粘連蛋白片段的制造方法沒(méi)有特別限定，可以列舉例如：將全長(zhǎng)層粘連蛋白用彈性蛋白酶等蛋白水解酶消化，并分離、純化目標(biāo)片段的方法，和以重組蛋白形式來(lái)制造的方法等。從制造量、品質(zhì)的均勻性、制造成本等觀點(diǎn)出發(fā)，層粘連蛋白及層粘連蛋白片段兩者均優(yōu)選以重組蛋白形式來(lái)制造。重組層粘連蛋白、重組層粘連蛋白片段可以通過(guò)適當(dāng)使用公知的基因重組技術(shù)來(lái)制造。作為重組層粘連蛋白、重組層粘連蛋白片段的制造方法，例如可以通過(guò)如下方法制造：分別獲取編碼α鏈、β鏈及γ鏈的各全長(zhǎng)蛋白或部分蛋白的DNA，將其分別插入表達(dá)載體，將所得到的3種表達(dá)載體共導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞并使其表達(dá)，通過(guò)公知方法來(lái)純化形成了三聚體的蛋白質(zhì)。作為重組層粘連蛋白(全長(zhǎng))的制造方法，可以列舉例如Ido等(HiroyukiIdoetal.,TheJournalofBiologicalChemistry,279,10946-10954,2004)的方法等，但不受其限定。作為重組層粘連蛋白片段(層粘連蛋白E8)的制造方法，可以列舉例如Ido等(HiroyukiIdoetal.,TheJournalofBiologicalChemistry,282,11144-11154,2007)的方法，但不受該方法限定。編碼構(gòu)成主要的哺乳動(dòng)物的層粘連蛋白的α鏈、β鏈、γ鏈的基因的堿基序列信息和各鏈的氨基酸序列信息可以從公知的數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank等)獲取。對(duì)于包括人在內(nèi)的主要的哺乳動(dòng)物，表1示出構(gòu)成層粘連蛋白的各鏈的登錄號(hào)。這些以外的來(lái)自各種生物的層粘連蛋白構(gòu)成鏈的堿基序列信息及氨基酸序列信息也同樣可以從公知的數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank等)獲取。[表1]氨基酸序列堿基序列人層粘連蛋白α1鏈NP_005550NM_005559人層粘連蛋白α2鏈NP_000417NM_000426人層粘連蛋白α3鏈NP_000218NM_000227人層粘連蛋白α4鏈NP_002281NM_002290人層粘連蛋白α5鏈NP_005551NM_005560人層粘連蛋白β1鏈NP_002282NM_002291人層粘連蛋白β2鏈NP_002283NM_002292人層粘連蛋白β3鏈NP_000219NM_000228人層粘連蛋白γ1鏈NP_002284NM_002293人層粘連蛋白γ2鏈NP_005553NM_005562人層粘連蛋白γ3鏈NP_006050NM_006059小鼠層粘連蛋白α5鏈NP_001074640NM_001081171小鼠層粘連蛋白β1鏈NP_032508NM_008482小鼠層粘連蛋白γ1鏈NP_034813NM_010683大鼠層粘連蛋白α5鏈NP_001178538NM_001191609大鼠層粘連蛋白β1鏈NP_001100191NM_001106721大鼠層粘連蛋白γ1鏈NP_446418NM_053966層粘連蛋白E8是α鏈的從C末端片段除去球形結(jié)構(gòu)域4和5后的片段(以下記作“α鏈E8”)、β鏈的C末端片段(以下記作“β鏈E8”)及γ鏈的C末端片段(以下記作“γ鏈E8”)形成三聚體后的片段，三聚體的分子量為約150～約170kDa。α鏈E8通常由約770個(gè)氨基酸構(gòu)成，N末端側(cè)的約230個(gè)氨基酸與三聚體形成有關(guān)。β鏈E8通常由約220～約230個(gè)氨基酸構(gòu)成。γ鏈E8通常由約240～約250個(gè)氨基酸構(gòu)成。γ鏈E8的C末端部起第3位的谷氨酸殘基對(duì)于層粘連蛋白E8的整聯(lián)蛋白結(jié)合活性是必須的(HiroyukiIdoetal.,TheJournalofBiologicalChemistry,282,11144-11154,2007)。在本發(fā)明的工序(1)中，將多能干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化誘導(dǎo)的方法可以適當(dāng)使用公知的分化誘導(dǎo)方法。可以列舉例如：使用激活素A和BMP4(BoneMorphogeneticProtein4，骨形成蛋白4)對(duì)在飼養(yǎng)細(xì)胞上維持培養(yǎng)的人多能干細(xì)胞進(jìn)行分化誘導(dǎo)的方法(非專利文獻(xiàn)1、2)，使用Wnt3a、R-Spondin-1及DKK1對(duì)在Matrigel上維持培養(yǎng)的人多能干細(xì)胞進(jìn)行分化誘導(dǎo)的方法(非專利文獻(xiàn)3)，使用生物反應(yīng)器對(duì)在飼養(yǎng)細(xì)胞上維持培養(yǎng)的人多能干細(xì)胞大量地進(jìn)行分化誘導(dǎo)的方法(非專利文獻(xiàn)3)，僅通過(guò)已知組成的添加因子對(duì)人多能干細(xì)胞進(jìn)行由維持培養(yǎng)至分化誘導(dǎo)的方法(國(guó)際公開WO2014/078414號(hào))等。其中，作為適于制造能夠向人移植的心肌細(xì)胞群的分化誘導(dǎo)方法，可以列舉例如：上述國(guó)際公開WO2014/078414號(hào)中記載的方法、將在人層粘連蛋白511E8上維持培養(yǎng)的人多能干細(xì)胞(日本特開2011-078370號(hào)公報(bào))分化誘導(dǎo)成心肌細(xì)胞的方法等。在本發(fā)明的工序(2)及工序(A)中，使工序(1)中分化誘導(dǎo)成心肌細(xì)胞的細(xì)胞群與層粘連蛋白或其片段接觸的方法不受特別限定?？梢粤信e例如：在培養(yǎng)皿等培養(yǎng)器具的培養(yǎng)面包被層粘連蛋白或其片段，在其中添加分化誘導(dǎo)成心肌細(xì)胞的細(xì)胞群的細(xì)胞懸浮液并靜置一定時(shí)間的方法。此外，可以列舉例如：在小珠等載體上包被層粘連蛋白或其片段，將該載體投入分化誘導(dǎo)成心肌細(xì)胞的細(xì)胞群的細(xì)胞懸浮液中并靜置一定時(shí)間的方法。此外，可以列舉例如：使用中空纖維膜作為載體，在中空纖維膜的內(nèi)部包被層粘連蛋白或其片段，將分化誘導(dǎo)成心肌細(xì)胞的細(xì)胞群的細(xì)胞懸浮液注入中空纖維膜內(nèi)并使其通過(guò)的方法等。在工序(2)及工序(A)中，對(duì)層粘連蛋白或?qū)诱尺B蛋白片段的包被濃度沒(méi)有特別限定，可以適當(dāng)選擇并使用可實(shí)現(xiàn)工序(2)及工序(A)的目的的包被濃度。例如，優(yōu)選從約0.1～約2.0μg/cm2的范圍中選擇。在本發(fā)明的制造方法中使用層粘連蛋白E8的情況下，對(duì)工序(2)及工序(A)中層粘連蛋白E8的包被濃度沒(méi)有特別限定，優(yōu)選為約0.1～約2.0μg/cm2，更優(yōu)選為約0.25～約1.0μg/cm2，進(jìn)一步優(yōu)選為約0.5～約1.0μg/cm2。在工序(2)及工序(A)中，使層粘連蛋白或?qū)诱尺B蛋白片段與細(xì)胞接觸的時(shí)間(層粘連蛋白處理時(shí)間)不受特別限定，根據(jù)所使用的包被濃度使用可實(shí)現(xiàn)工序(2)及工序(A)的目的的時(shí)間即可。在本發(fā)明的制造方法中使用層粘連蛋白E8的情況下，對(duì)工序(2)中層粘連蛋白E8與細(xì)胞的接觸時(shí)間沒(méi)有特別限定，優(yōu)選為約15分鐘～約180分鐘，更優(yōu)選為約15分鐘～約120分鐘，進(jìn)一步優(yōu)選為約15分鐘～約60分鐘，進(jìn)一步優(yōu)選為約25分鐘～約60分鐘。此外，對(duì)工序(A)中層粘連蛋白E8與細(xì)胞的接觸時(shí)間沒(méi)有特別限定，優(yōu)選為約30分鐘以下，更優(yōu)選為約5分鐘～約30分鐘，進(jìn)一步優(yōu)選為約5分鐘～約15分鐘。在本發(fā)明的工序(3)中，對(duì)回收附著于層粘連蛋白或?qū)诱尺B蛋白片段的細(xì)胞的方法沒(méi)有特別限定，可以適當(dāng)選擇并使用將附著細(xì)胞剝離的公知方法。例如，在除去未附著的細(xì)胞后，對(duì)層粘連蛋白或?qū)诱尺B蛋白片段的包被面添加EDTA液或?qū)⑤d體投入EDTA液中，通過(guò)吹打等使細(xì)胞剝離并進(jìn)行回收?；蛘撸梢允褂靡鹊鞍酌敢捍鍱DTA液來(lái)剝離細(xì)胞。此外，在工序(3)后進(jìn)行對(duì)所回收的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的工序(4)的情況下，也可以僅除去未附著的細(xì)胞。在本發(fā)明的工序(B)中，對(duì)回收未附著于層粘連蛋白或?qū)诱尺B蛋白片段的細(xì)胞的方法沒(méi)有特別限定。例如，在使用包被有層粘連蛋白或?qū)诱尺B蛋白片段的培養(yǎng)器具的情況下，可以通過(guò)離心分離等來(lái)回收包含在所回收的培養(yǎng)基以及用PBS等洗滌包被表面數(shù)次而得的洗滌液中的細(xì)胞。在將包被有層粘連蛋白或?qū)诱尺B蛋白片段的載體投入細(xì)胞懸浮液中的情況下，可以通過(guò)離心分離等來(lái)回收已經(jīng)回收載體后的細(xì)胞懸浮液中殘留的細(xì)胞。在使用包被有層粘連蛋白或?qū)诱尺B蛋白片段的中空纖維膜的情況下，可以回收通過(guò)了中空纖維膜的細(xì)胞懸浮液，并通過(guò)離心分離等回收未附著的細(xì)胞。在本發(fā)明的制造方法中，在工序(3)后進(jìn)行對(duì)工序(3)所回收的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的工序(4)的情況下，對(duì)培養(yǎng)方法沒(méi)有特別限定，可以從公知的細(xì)胞培養(yǎng)方法中適當(dāng)選擇。優(yōu)選為適合于心肌細(xì)胞的培養(yǎng)的培養(yǎng)方法。可以列舉例如：使用工序(2)中所用的包被有層粘連蛋白或?qū)诱尺B蛋白片段的培養(yǎng)器具進(jìn)行培養(yǎng)的方法?？梢栽诠ば?3)中，在層粘連蛋白處理時(shí)間結(jié)束后，除去未附著的細(xì)胞而在板上留下附著細(xì)胞，添加新的培養(yǎng)基，由此進(jìn)入工序(4)的培養(yǎng)。對(duì)培養(yǎng)時(shí)間沒(méi)有特別限定，可以適當(dāng)設(shè)定為可維持目標(biāo)心肌細(xì)胞純度的心肌細(xì)胞群的時(shí)間。通過(guò)本發(fā)明的制造方法制造的心肌細(xì)胞群的心肌細(xì)胞的純度(心肌細(xì)胞率)需要至少為10％以上，優(yōu)選為30％以上。更優(yōu)選為50％～90％，進(jìn)一步優(yōu)選為60％～80％。心肌細(xì)胞群的心肌細(xì)胞的純度(心肌細(xì)胞率)例如可以使用流式細(xì)胞術(shù)等以心肌細(xì)胞群中的心肌型肌鈣蛋白T陽(yáng)性細(xì)胞的比率形式來(lái)確認(rèn)。對(duì)通過(guò)本發(fā)明的制造方法制造的心肌細(xì)胞群中的未分化細(xì)胞率沒(méi)有特別限定。在本發(fā)明的制造方法中，通過(guò)在工序(1)和(2)之間進(jìn)行除去未分化細(xì)胞的工序，從而與未進(jìn)行除去未分化細(xì)胞的工序的情況相比可以使所得到的心肌細(xì)胞群中的未分化細(xì)胞減少，因此優(yōu)選進(jìn)行除去未分化細(xì)胞的工序。特別是，通過(guò)采用工序(A)及工序(B)作為除去未分化細(xì)胞的工序，可以在不損傷所得到的心肌細(xì)胞群的條件下除去未分化細(xì)胞。心肌細(xì)胞群的未分化細(xì)胞率例如可以使用流式細(xì)胞術(shù)等以心肌細(xì)胞群中的BC2LCN陽(yáng)性細(xì)胞的比率形式來(lái)確認(rèn)。在本發(fā)明的制造方法中，由于采用了使由多能干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化誘導(dǎo)后的細(xì)胞群與層粘連蛋白或?qū)诱尺B蛋白片段接觸、并回收附著細(xì)胞的方法，因此與其它制造方法相比，在以下方面是優(yōu)良的。第一，操作簡(jiǎn)便，且可以在非常短的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行。以往的制造方法由于是利用心肌細(xì)胞與其它細(xì)胞、特別是仍維持了未分化性的細(xì)胞之間的代謝通路的差異來(lái)篩選心肌細(xì)胞，因此篩選操作需要長(zhǎng)時(shí)間(至少數(shù)天)。該篩選操作給細(xì)胞帶來(lái)較大負(fù)荷，所篩選的細(xì)胞的生存能力的降低不可避免。本發(fā)明的制造方法中，篩選所需要的時(shí)間短，為數(shù)分鐘～數(shù)小時(shí)，篩選操作給細(xì)胞帶來(lái)的負(fù)荷小。第二，由于通過(guò)由整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞向基材的粘附來(lái)篩選目標(biāo)細(xì)胞，從而不僅不會(huì)損害細(xì)胞的生存能力，反而可以期待提高生存能力。實(shí)際上，已知整聯(lián)蛋白依賴性的細(xì)胞向?qū)诱尺B蛋白的粘附在抑制細(xì)胞凋亡、維持細(xì)胞存活的同時(shí)，還使促進(jìn)細(xì)胞增殖的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活化(GuJetal.TheJournalofBiologicalChemistry277:19922-19928,2002)。因此，本發(fā)明的制造方法與以往的方法不同，具有可以在維持高生存能力的狀態(tài)下、且在短時(shí)間內(nèi)篩選由多能干細(xì)胞分化誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞群的顯著優(yōu)點(diǎn)。進(jìn)而，在本發(fā)明的制造方法中，容易將工序(2)的操作連續(xù)重復(fù)進(jìn)行、或者將工序(2)及工序(3)的操作連續(xù)重復(fù)進(jìn)行，通過(guò)連續(xù)重復(fù)操作，從而容易提高所得到的心肌細(xì)胞群的心肌細(xì)胞的純度。從而，通過(guò)本發(fā)明的制造方法制造的心肌細(xì)胞群是安全性非常高且生存能力高的細(xì)胞，因此作為移植用心肌細(xì)胞群是非常優(yōu)良的。本發(fā)明的制造方法的工序(2)中使用的層粘連蛋白211、層粘連蛋白221、層粘連蛋白111或?qū)诱尺B蛋白α121不僅對(duì)心肌細(xì)胞、而且對(duì)骨骼肌細(xì)胞也具有結(jié)合特異性，因此通過(guò)將工序(1)變更為將多能干細(xì)胞向骨骼肌細(xì)胞分化誘導(dǎo)的工序，從而可以提供骨骼肌細(xì)胞的制造方法。此外，通過(guò)按照細(xì)胞來(lái)區(qū)分使用用于本發(fā)明的制造方法的工序(2)的層粘連蛋白，從而能夠使用包被有該層粘連蛋白的基材粘附依賴性地篩選由多能干細(xì)胞分化誘導(dǎo)的各種細(xì)胞。具體而言，報(bào)道了由人多能干細(xì)胞分化誘導(dǎo)的肝臟前體細(xì)胞依賴于整聯(lián)蛋白α6β1而粘附于層粘連蛋白111(TakayamaK.etal.StemCellReports1:322-335,2013)。據(jù)報(bào)道，層粘連蛋白111在再生肝中一過(guò)性地表達(dá)(KikkawaYetal.ExperimentalCellResearch305:99-109,2005)。基于這些見(jiàn)解，能夠使用包被有層粘連蛋白111的基材來(lái)篩選、純化由人多能干細(xì)胞分化誘導(dǎo)的肝臟前體細(xì)胞。即，在本發(fā)明的制造方法中，通過(guò)將工序(1)變更為使多能干細(xì)胞向肝臟前體細(xì)胞分化誘導(dǎo)的工序、將工序(2)中使用的層粘連蛋白變更為層粘連蛋白111，從而可以提供肝臟前體細(xì)胞的制造方法。〔心肌細(xì)胞的純度提高方法〕本發(fā)明提供一種提高由多能干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化誘導(dǎo)后的細(xì)胞群的心肌細(xì)胞的純度的方法。本發(fā)明的心肌細(xì)胞的純度提高方法包含以下的工序1及工序2即可：工序1：使選自由層粘連蛋白α2β1γ1、層粘連蛋白α2β2γ1、層粘連蛋白α1β1γ1及層粘連蛋白α1β2γ1組成的組中的層粘連蛋白或該層粘連蛋白的具有整聯(lián)蛋白結(jié)合活性的片段與上述細(xì)胞群接觸的工序；工序2：回收附著于上述層粘連蛋白或上述片段的細(xì)胞的工序。工序1及工序2的內(nèi)容與上述本發(fā)明的制造方法的工序(2)及工序(3)相同。本發(fā)明的心肌細(xì)胞的純度提高方法可以與上述本發(fā)明的制造方法同樣地實(shí)施。實(shí)施例以下通過(guò)實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明不受這些實(shí)施例限定。〔實(shí)驗(yàn)材料及方法〕(1)人層粘連蛋白E8使用人層粘連蛋白511E8、人層粘連蛋白332E8、人層粘連蛋白311E8、人層粘連蛋白221E8及人層粘連蛋白211E8這5種人層粘連蛋白E8。以下，在實(shí)施例中分別簡(jiǎn)單記作511E8、332E8、311E8、221E8及211E8。511E8使用購(gòu)入的iMatrix-511(商品名、株式會(huì)社Nippi)。511E8以外的層粘連蛋白E8按照Ido等(HiroyukiIdoetal.,TheJournalofBiologicalChemistry,282,11144-11154,2007)、Taniguchi等(YukimasaTaniguchietal.,TheJournalofBiologicalChemistry,7820-7831,2009)中記載的方法來(lái)制作。即，分別制作人α3鏈E8片段(N末端側(cè)含有6×His標(biāo)簽)表達(dá)載體、人α2鏈E8片段(N末端側(cè)含有6×His標(biāo)簽)表達(dá)載體、人β3鏈E8片段(N末端側(cè)含有HA標(biāo)簽)表達(dá)載體、人β2鏈E8片段(N末端側(cè)含有HA標(biāo)簽)表達(dá)載體、人β1鏈E8片段(N末端側(cè)含有HA標(biāo)簽)表達(dá)載體、人γ2鏈E8片段(N末端側(cè)含有FLAG標(biāo)簽)表達(dá)載體及人γ1鏈E8片段(N末端側(cè)含有FLAG標(biāo)簽)表達(dá)載體，選擇α鏈、β鏈及γ鏈的組合，轉(zhuǎn)染來(lái)自人腎臟的293細(xì)胞并進(jìn)行72小時(shí)培養(yǎng)后，回收培養(yǎng)液，通過(guò)使用Ni-NTA瓊脂糖和ANTI-FLAGM2親和凝膠的親和層析進(jìn)行純化。(2)培養(yǎng)皿的層粘連蛋白E8包被培養(yǎng)皿使用6孔或12孔多孔板(BDFalcon公司)。將層粘連蛋白E8用PBS稀釋到期望的濃度，在每1孔中添加1ml(6孔)或0.4ml(12孔)。在37℃下靜置2小時(shí)以上后，除去層粘連蛋白液，用PBS將板表面洗滌2次。培養(yǎng)皿的包被在即將使用前進(jìn)行。實(shí)施例1～4及9中使用6孔多孔板，實(shí)施例5～8中使用12孔多孔板。(3)人iPS細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化誘導(dǎo)從理化學(xué)研究所購(gòu)入并使用人iPS細(xì)胞株253G1。按照Matsuura等(MatsuuraKetal.,BiochemBiophysResCommun,2012Aug24；425(2):321-7,doi:10.1016/j.bbrc.2012.07.089.Epub2012Jul25)中記載的方法使用反應(yīng)器進(jìn)行心肌分化誘導(dǎo)。具體而言，將在PrimateES培養(yǎng)基(ReproCELL公司)中添加了5ng/ml的bFGF的培養(yǎng)基作為未分化維持培養(yǎng)基使用，在進(jìn)行了絲裂霉素C處理的MEF上培養(yǎng)未分化253G1細(xì)胞。使用剝離液(ReproCELL公司)回收10個(gè)10cm培養(yǎng)皿的量的未分化253G1細(xì)胞，懸浮在添加了10μM的Y27632(ROCK抑制劑)的mTeSR培養(yǎng)基(STEMCELLTechnologies)100ml中后，轉(zhuǎn)移到容器(vessel)中，用生物反應(yīng)器(ABLE公司)開始攪拌培養(yǎng)。1天后從培養(yǎng)基中除去Y27632。1～3天后將培養(yǎng)基置換為StemPro-34(LifeTechnologies)，3天～4天后添加0.5ng/ml的BMP4，4～7天后添加10ng/ml的BMP4、5ng/ml的bFGF和3ng/ml的激活素A，7～9天后添加4μM的IWR-1，第9天以后添加5ng/ml的VEGF和10ng/ml的bFGF并持續(xù)攪拌，16～18天后回收細(xì)胞。(4)分化誘導(dǎo)后的細(xì)胞懸浮液的制備使253G1細(xì)胞分化誘導(dǎo)成心肌細(xì)胞后，使用0.05％胰蛋白酶-EDTA液(LifeTechnologies)將細(xì)胞塊分散，用70μm的篩網(wǎng)過(guò)濾器過(guò)濾而制備細(xì)胞懸浮液。以每分鐘1500轉(zhuǎn)離心分離5分鐘。將沉淀用PBS懸浮，再次以每分鐘1500轉(zhuǎn)離心分離5分鐘。將沉淀按照20萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/毫升的濃度用培養(yǎng)基(含1％牛血清白蛋白的DMEM)懸浮。(5)層粘連蛋白處理在用層粘連蛋白E8包被的6孔多孔板中，在每1孔中接種3ml的細(xì)胞懸浮液(60萬(wàn)個(gè)細(xì)胞)?；蛘咴谟脤诱尺B蛋白E8包被的12孔多孔板中，在每1孔中接種1.2ml的細(xì)胞懸浮液(24萬(wàn)個(gè)細(xì)胞)。經(jīng)過(guò)一定的處理時(shí)間(接觸時(shí)間)后，分別回收懸浮細(xì)胞及附著細(xì)胞。即，回收培養(yǎng)上清，用PBS洗滌培養(yǎng)面并回收洗滌液，再次用PBS洗滌培養(yǎng)面并回收洗滌液。將培養(yǎng)上清和2次洗滌液中所含的細(xì)胞作為懸浮細(xì)胞。另一方面，對(duì)用PBS洗滌2次后的培養(yǎng)面添加EDTA液，通過(guò)吹打而進(jìn)行剝離并回收細(xì)胞。進(jìn)而用PBS洗滌培養(yǎng)面并回收洗滌液。將用EDTA剝離的細(xì)胞和此后的洗滌液中的細(xì)胞作為附著細(xì)胞。分別離心分離(每分鐘1500轉(zhuǎn)，5分鐘)后除去上清。將沉淀用心肌型肌鈣蛋白T(檢測(cè)心肌細(xì)胞)或BC2LCN(檢測(cè)未分化細(xì)胞)染色，使用流式細(xì)胞術(shù)或免疫染色進(jìn)行評(píng)價(jià)?！矊?shí)施例1：使用511E8、311E8、332E8除去懸浮細(xì)胞中的未分化細(xì)胞〕使253G1細(xì)胞分化誘導(dǎo)成心肌細(xì)胞后，用511E8、311E8或332E8處理30分鐘，分別回收懸浮細(xì)胞及附著細(xì)胞。層粘連蛋白E8的濃度設(shè)為0、1、2.5、5及10μg/ml(0、0.1、0.25、0.5及1μg/cm2)這5個(gè)等級(jí)。分別通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)評(píng)價(jià)所回收的懸浮細(xì)胞及附著細(xì)胞中的BC2LCN陽(yáng)性細(xì)胞率(未分化細(xì)胞率)。將結(jié)果示于圖1。上部為未分化細(xì)胞率，下部為細(xì)胞回收數(shù)。圖中，LN511表示511E8，LN311表示311E8，LN332表示332E8。層粘連蛋白處理前的未分化細(xì)胞率為1.7％，與此相對(duì)，用任一層粘連蛋白E8處理的情況下，懸浮細(xì)胞中的未分化細(xì)胞率均濃度依賴性地降低。特別是在511E8的情況下，低濃度下也確認(rèn)到未分化細(xì)胞率降低，包被濃度0.5μg/cm2時(shí)未分化細(xì)胞率降低到0.8％。用任一層粘連蛋白E8處理的情況下所回收的懸浮細(xì)胞數(shù)均濃度依賴性地減少。〔實(shí)施例2：未分化細(xì)胞相對(duì)于511E8的特異性〕使253G1細(xì)胞分化誘導(dǎo)成心肌細(xì)胞后，用包被濃度0.5μg/cm2的511E8或1μg/cm2的221E8處理30分鐘，分別回收懸浮細(xì)胞及附著細(xì)胞。分別通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)評(píng)價(jià)所回收的懸浮細(xì)胞及附著細(xì)胞中的BC2LCN陽(yáng)性細(xì)胞率(未分化細(xì)胞率)。將結(jié)果示于圖2。圖中，LN511表示511E8，LN221表示221E8。處理前，未分化細(xì)胞率為2.5％，與此相對(duì)，用0.5μg/cm2的511E8處理后的懸浮細(xì)胞中的未分化細(xì)胞率降低到1.6％。此外，附著細(xì)胞中的未分化細(xì)胞率上升到3.7％。另一方面，用1μg/cm2的層粘連蛋白221處理后的懸浮細(xì)胞及附著細(xì)胞中的未分化細(xì)胞率均為2.7％?！矊?shí)施例3：使用221E8、211E8、511E8的心肌細(xì)胞分離獲得及特異性〕使253G1細(xì)胞分化誘導(dǎo)成心肌細(xì)胞后，用221E8、211E8或511E8處理30分鐘，分別回收懸浮細(xì)胞及附著細(xì)胞。層粘連蛋白E8的包被濃度設(shè)為0、0.25、0.5、1及2μg/cm2這5個(gè)等級(jí)。分別通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)評(píng)價(jià)所回收的懸浮細(xì)胞及附著細(xì)胞中的心肌型肌鈣蛋白T陽(yáng)性細(xì)胞率(心肌細(xì)胞率)。將結(jié)果示于圖3。上部為心肌型肌鈣蛋白T陽(yáng)性細(xì)胞率(心肌細(xì)胞率)，下部為細(xì)胞回收數(shù)。圖中，LN221表示221E8，LN211表示211E8、LN511表示511E8。層粘連蛋白處理前的心肌細(xì)胞率為18.5％。用任一層粘連蛋白E8處理的情況下懸浮細(xì)胞中的心肌細(xì)胞率均與處理前的值幾乎相等，與此相對(duì)，用221E8或211E8處理的附著細(xì)胞中的心肌細(xì)胞率均上升。另一方面，用511E8處理的情況下，附著細(xì)胞及懸浮細(xì)胞中的心肌細(xì)胞率未確認(rèn)到較大差異。用任一層粘連蛋白E8處理的情況下回收的附著細(xì)胞數(shù)均濃度依賴性地上升?！矊?shí)施例4：221E8處理所引起的附著細(xì)胞數(shù)及心肌細(xì)胞率的經(jīng)時(shí)變化〕使253G1細(xì)胞分化誘導(dǎo)成心肌細(xì)胞后，用包被濃度1μg/cm2的221E8進(jìn)行處理，經(jīng)時(shí)地回收附著細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)評(píng)價(jià)其細(xì)胞數(shù)和心肌細(xì)胞率(心肌型肌鈣蛋白T陽(yáng)性細(xì)胞率)。將結(jié)果示于圖4A、B、C。A是221E8的處理時(shí)間為15、20、25及30分鐘的附著細(xì)胞數(shù)，B是221E8的處理時(shí)間為0.5、1、8及24小時(shí)的附著細(xì)胞數(shù)(有別于A實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果)，C是221E8的處理時(shí)間為15、20、25、30及60分鐘的附著細(xì)胞數(shù)中的心肌細(xì)胞率。需要說(shuō)明的是，接觸時(shí)間為0的心肌細(xì)胞率是221E8處理前的心肌細(xì)胞率。附著細(xì)胞數(shù)在221E8的處理時(shí)間為15～30分鐘期間經(jīng)時(shí)地增加(圖4A)，在1～8小時(shí)內(nèi)逐漸增加后，到24小時(shí)為止有減少傾向(圖4B)。221E8的處理前的心肌細(xì)胞率為16.1％?？梢源_認(rèn)到如下傾向：在221E8處理后15分鐘，心肌細(xì)胞率上升到35.9％，然后經(jīng)時(shí)地減少(圖4C)?！矊?shí)施例5：使用511E8、211E8、221E8除去懸浮細(xì)胞中的未分化細(xì)胞〕使253G1細(xì)胞分化誘導(dǎo)成心肌細(xì)胞后，用包被濃度1μg/cm2的511E8、211E8或221E8進(jìn)行處理，在處理開始起15分鐘、30分鐘、60分鐘、120分鐘后回收懸浮細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)評(píng)價(jià)所回收的懸浮細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)和未分化細(xì)胞率(BC2LCN陽(yáng)性細(xì)胞率)。未分化細(xì)胞率以相對(duì)于處理前的未分化細(xì)胞數(shù)的變化率、即處理后的BC2LCN陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)除以處理前的BC2LCN陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)而得的值來(lái)表示。將結(jié)果示于圖5A、B。A表示懸浮細(xì)胞中的未分化細(xì)胞率的經(jīng)時(shí)變化，B表示各回收時(shí)間的懸浮細(xì)胞數(shù)。圖中，LN511表示511E8，LN221表示221E8，LN211表示211E8。如圖5A所示，用211E8或221E8進(jìn)行處理時(shí)的未分化細(xì)胞率在任意的回收時(shí)間均幾乎為1以上，用511E8進(jìn)行處理的情況下，任意的回收時(shí)間均小于1。該結(jié)果顯示出511E8處理對(duì)除去懸浮細(xì)胞中的未分化細(xì)胞是有效的。如圖5B所示，顯示出：回收的懸浮細(xì)胞數(shù)在任意的層粘連蛋白的情況下均接觸時(shí)間依賴性地減少，在使用511E8的情況下，接觸30分鐘以上時(shí)懸浮細(xì)胞數(shù)顯著減少。該結(jié)果提示：如果考慮未分化細(xì)胞率的經(jīng)時(shí)變化和懸浮細(xì)胞數(shù)的經(jīng)時(shí)變化，在作為除去未分化細(xì)胞的工序的工序(A)中，細(xì)胞與層粘連蛋白E8的接觸時(shí)間優(yōu)選為30分鐘以下，更優(yōu)選為15分鐘以下?！矊?shí)施例6：使用511E8、211E8、221E8的心肌細(xì)胞純化：處理時(shí)間的研究〕(1)處理時(shí)間(接觸時(shí)間)所引起的心肌細(xì)胞率及附著細(xì)胞數(shù)的變化使253G1細(xì)胞分化誘導(dǎo)成心肌細(xì)胞后，用包被濃度1μg/cm2的511E8、211E8或221E8進(jìn)行處理，在處理開始起15分鐘、30分鐘、60分鐘、120分鐘后回收附著細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)評(píng)價(jià)所回收的附著細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)和心肌細(xì)胞率(心肌型肌鈣蛋白T陽(yáng)性細(xì)胞率)。心肌細(xì)胞率以相對(duì)于處理前的心肌細(xì)胞數(shù)的變化率、即處理后的心肌型肌鈣蛋白T陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)除以處理前的心肌型肌鈣蛋白T陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)而得到的值來(lái)表示。將結(jié)果示于圖6A、B。A表示附著細(xì)胞中的心肌細(xì)胞率的經(jīng)時(shí)變化，B表示各回收時(shí)間的附著細(xì)胞數(shù)。圖中，LN511表示511E8，LN221表示221E8，LN211表示211E8。如圖6A所示，用511E8進(jìn)行處理時(shí)，任意的回收時(shí)間下，心肌細(xì)胞率均為1左右，用211E8或221E8進(jìn)行處理的情況下，在任意的回收時(shí)間下均超過(guò)1，通過(guò)用211E8或221E8處理并回收附著細(xì)胞可以提高心肌細(xì)胞的純度。如圖6B所示，用211E8或221E8進(jìn)行處理時(shí)的附著細(xì)胞數(shù)在處理時(shí)間(接觸時(shí)間)達(dá)到60分鐘前均時(shí)間依賴性地增加。該結(jié)果提示：工序(2)中，細(xì)胞與層粘連蛋白E8的接觸時(shí)間優(yōu)選為約30分鐘～約60分鐘?！矊?shí)施例7：使用511E8、211E8、221E8的心肌細(xì)胞純化：層粘連蛋白E8包被濃度的研究〕使253G1細(xì)胞分化誘導(dǎo)成心肌細(xì)胞后，以0.25、0.5、1及2μg/cm2的4等級(jí)包被濃度進(jìn)行511E8、211E8或221E8處理，處理開始起30分鐘后回收附著細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)評(píng)價(jià)所回收的附著細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)和心肌細(xì)胞率(心肌型肌鈣蛋白T陽(yáng)性細(xì)胞率)。心肌細(xì)胞率以相對(duì)于處理前的心肌細(xì)胞數(shù)的變化率、即處理后的心肌型肌鈣蛋白T陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)除以處理前的心肌型肌鈣蛋白T陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)而得的值來(lái)表示。將結(jié)果示于圖7A、B。A表示各包被濃度的附著細(xì)胞中的心肌細(xì)胞率，B表示各包被濃度中的附著細(xì)胞數(shù)。圖中，LN511表示511E8，LN221表示221E8，LN211表示211E8。如圖7A所示，用511E8進(jìn)行處理時(shí)的心肌細(xì)胞率在任意的包被濃度下均為1左右，在用211E8或221E8進(jìn)行處理的情況下，在任意的包被濃度下均超過(guò)1，通過(guò)用211E8或221E8處理并回收附著細(xì)胞可以提高心肌細(xì)胞的純度。如圖7B所示，就用211E8或221E8進(jìn)行處理時(shí)的附著細(xì)胞數(shù)而言，在211E8的情況下直至0.5μg/cm2包被濃度依賴性地增加，在221E8的情況下直至2μg/cm2包被濃度依賴性地增加。該結(jié)果提示：工序(2)中，層粘連蛋白E8的包被濃度優(yōu)選為約0.5～約2μg/cm2?！矊?shí)施例8：221E8所帶來(lái)的心肌細(xì)胞富集效果的確認(rèn)〕使253G1細(xì)胞分化誘導(dǎo)成心肌細(xì)胞后，以包被濃度1μg/cm2的511E8或221E8處理30分鐘，回收附著細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定心肌細(xì)胞率(心肌型肌鈣蛋白T陽(yáng)性細(xì)胞率)。此外，處理30分鐘后除去懸浮細(xì)胞，在包被有1μg/cm2的511E8或221E8的板中培養(yǎng)附著細(xì)胞3天，對(duì)心肌型肌鈣蛋白T陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行免疫染色。作為對(duì)比染色，使用DAPI進(jìn)行核染色。將結(jié)果示于圖8。上部為流式細(xì)胞術(shù)的圖，中部為核染色的熒光顯微鏡圖像，下部為心肌型肌鈣蛋白T陽(yáng)性細(xì)胞的熒光顯微鏡圖像。如圖8所示，處理前的心肌細(xì)胞率為43％，與此相對(duì)，用511E8處理后的粘附細(xì)胞中的心肌細(xì)胞率降低到26％。另一方面，用層粘連蛋白221E8處理后的附著細(xì)胞中的心肌細(xì)胞率增加到67％。培養(yǎng)用511E8或221E8處理后的粘附細(xì)胞，用221E8處理時(shí)的通過(guò)核染色檢測(cè)到的細(xì)胞數(shù)比用511E8處理時(shí)的通過(guò)核染色檢測(cè)到的細(xì)胞數(shù)少，但其幾乎全是心肌型肌鈣蛋白T陽(yáng)性的細(xì)胞。另一方面，用511E8處理的細(xì)胞中，存在較多的除心肌型肌鈣蛋白T陽(yáng)性細(xì)胞以外的細(xì)胞。該結(jié)果顯示出：通過(guò)用221E8處理，可以有效地富集心肌細(xì)胞?！矊?shí)施例9：利用221E8處理及無(wú)糖培養(yǎng)基的心肌細(xì)胞純化的比較〕在使253G1細(xì)胞分化誘導(dǎo)成心肌細(xì)胞后，即實(shí)施上述〔實(shí)驗(yàn)材料及方法〕的(3)的方法16～18天后，將回收的細(xì)胞等分成2份，一份供于無(wú)糖培養(yǎng)基處理，另一份供于221E8處理。無(wú)糖培養(yǎng)基處理按照Tohyama等的方法(ShugoTohyamaetal.,CellStemCell,12,127-137,2013)進(jìn)行。即，在分化誘導(dǎo)后不進(jìn)行胰蛋白酶-EDTA處理，在胚狀體的狀態(tài)下，用無(wú)糖培養(yǎng)基、即不含葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基(LifeTechnologies)中添加了4mM的乳酸(和光純藥)的培養(yǎng)基培養(yǎng)6天。作為對(duì)照，使用用常規(guī)培養(yǎng)基(含1％牛血清白蛋白的DMEM)代替上述無(wú)糖培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)胞。在3小時(shí)后及3天后進(jìn)行培養(yǎng)基交換。6天后，用0.05％胰蛋白酶-EDTA將胚狀體分散并回收細(xì)胞。221E8處理組中，用0.05％胰蛋白酶-EDTA將胚狀體分散后，在以1μg/cm2的濃度包被有221E8的板中進(jìn)行處理。作為對(duì)照，使用在代替221E8而包被有胎牛血清的板上處理的細(xì)胞。處理開始起3小時(shí)后除去非附著細(xì)胞。在附著的細(xì)胞中加入新的培養(yǎng)基，在同一板、即以1μg/cm2的濃度包被有221E8的板或包被有胎牛血清的板中培養(yǎng)6天。3天后進(jìn)行培養(yǎng)基交換，6天后用0.05％胰蛋白酶-EDTA進(jìn)行處理并回收細(xì)胞。對(duì)6天后回收的各組的細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)評(píng)價(jià)心肌型肌鈣蛋白T陽(yáng)性細(xì)胞率(心肌細(xì)胞率)及BC2LCN陽(yáng)性率(未分化細(xì)胞率)。將結(jié)果示于圖9A、B、C。A表示回收細(xì)胞數(shù)，B表示心肌細(xì)胞率，C表示未分化細(xì)胞率。圖中，以涂黑來(lái)表示無(wú)糖培養(yǎng)基組(no-glu)，以斜線表示221E8處理組，以空心棒圖表示各自的對(duì)照組。如圖9A所示，在以胚狀體狀態(tài)進(jìn)行培養(yǎng)的無(wú)糖培養(yǎng)基組及其對(duì)照組中，回收細(xì)胞數(shù)為10萬(wàn)個(gè)左右，與此相對(duì)，在進(jìn)行粘附培養(yǎng)的221E8處理組及其對(duì)照組中，回收細(xì)胞數(shù)為100萬(wàn)個(gè)以上，顯著高，表明：與無(wú)糖培養(yǎng)基處理相比，221E8處理的細(xì)胞毒性低，并且對(duì)心肌細(xì)胞的維持也有效。如圖9B所示，處理前的心肌細(xì)胞率為42.1％(圖9B的圖上的橫線)。無(wú)糖培養(yǎng)基對(duì)照組(通常的胚狀體培養(yǎng))的培養(yǎng)6天后的心肌細(xì)胞率為25.6％，與此相對(duì)，無(wú)糖培養(yǎng)基組的培養(yǎng)6天后的心肌細(xì)胞率上升到38.7％。此外，221E8處理對(duì)照組(常規(guī)粘附培養(yǎng))的培養(yǎng)6天后的心肌細(xì)胞率為42.6％，與此相對(duì)，221E8處理組的培養(yǎng)6天后的心肌細(xì)胞率上升到57.2％。任意的處理與對(duì)照組相比心肌細(xì)胞率均上升，但221E8處理組的心肌細(xì)胞率顯著高于處理前的心肌細(xì)胞率。如圖9C所示，無(wú)糖培養(yǎng)基對(duì)照組(常規(guī)的胚狀體培養(yǎng))的培養(yǎng)6天后的未分化細(xì)胞率為13.8％，與此相對(duì)，無(wú)糖培養(yǎng)基組的培養(yǎng)6天后的未分化細(xì)胞率為0.5％。此外，221E8處理對(duì)照組(常規(guī)粘附培養(yǎng))的培養(yǎng)6天后的未分化細(xì)胞率為1.4％，與此相對(duì)，221E8處理組的培養(yǎng)6天后的未分化細(xì)胞率為0.4％。與對(duì)照組相比，無(wú)糖培養(yǎng)基處理的相對(duì)的未分化細(xì)胞除去率高于221E8處理的相對(duì)的未分化細(xì)胞除去率，但處理后的未分化細(xì)胞率均為0.4％～0.5％，從未分化細(xì)胞的殘存率的觀點(diǎn)考慮，兩者幾乎相等。根據(jù)以上的結(jié)果，221E8處理與無(wú)糖培養(yǎng)基處理相比，回收細(xì)胞數(shù)絕對(duì)性多，并且心肌細(xì)胞率與處理前相比也顯著增加，未分化細(xì)胞率與無(wú)糖培養(yǎng)基處理為相同程度，由此表明：221E8處理與無(wú)糖培養(yǎng)基處理相比，心肌細(xì)胞的純化效率絕對(duì)性高。即表明：與使用無(wú)糖培養(yǎng)基的方法相比，本申請(qǐng)發(fā)明作為心肌細(xì)胞純化法是極其優(yōu)良的。需要說(shuō)明的是，本發(fā)明不受上述各實(shí)施方式及實(shí)施例限定，可以在權(quán)利要求書所示的范圍內(nèi)進(jìn)行各種變更，將在不同實(shí)施方式中分別公開的技術(shù)特征適當(dāng)組合而得到的實(shí)施方式也包含在本發(fā)明的技術(shù)范圍內(nèi)。此外，本說(shuō)明書中記載的學(xué)術(shù)文獻(xiàn)及專利文獻(xiàn)全部以參考形式援引入本說(shuō)明書中。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3