本發(fā)明涉及間充質(zhì)干細(xì)胞用培養(yǎng)基及間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法等。

背景技術(shù)：

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell；MSC)是在成體的骨髓等中存在的成體干細(xì)胞之一種，被定義為有向骨、軟骨、脂肪細(xì)胞的分化能的粘接性的細(xì)胞。與胚性干(embryonic stem；(ES)細(xì)胞或人工多能性干(induced pluripotent stem；iPS)細(xì)胞等的胚性的干細(xì)胞不同，被認(rèn)為癌化的危險性極少，被視為作為再生醫(yī)療中使用的細(xì)胞材料大有希望。在日本，也以關(guān)節(jié)疾病為中心，已經(jīng)進(jìn)行多個臨床研究。

間充質(zhì)干細(xì)胞，一般而言，被知為“老化”的細(xì)胞，被知為如果培養(yǎng)期間變長(分裂次數(shù)多)，則增殖速度的降低、進(jìn)一步導(dǎo)致停止(非專利文獻(xiàn)1)。在非專利文獻(xiàn)1中報告，由在低氧分壓下的培養(yǎng)可抑制人間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSC)的老化，但還不知培養(yǎng)基的氨基酸組成如何影響人間充質(zhì)干細(xì)胞的老化或增殖。

在專利文獻(xiàn)1及專利文獻(xiàn)2中，公開了由自培養(yǎng)基除去特定的氨基酸的干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的例。這些是與被稱為ES細(xì)胞或iPS細(xì)胞的多能性干細(xì)胞相關(guān)的技術(shù)，是選擇性地殺滅－除去分化誘導(dǎo)時殘留的未分化狀態(tài)的細(xì)胞，升高在細(xì)胞組合物中分化的物質(zhì)的純度的技術(shù)。至今日，無論是成體干細(xì)胞、多能性干細(xì)胞，在什么樣的干細(xì)胞中都不知，來自培養(yǎng)基中的特定的氨基酸除去抑制細(xì)胞的老化，或促進(jìn)增殖的例。

【現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)】

【專利文獻(xiàn)】

專利文獻(xiàn)1：特開2009-100702號公報

專利文獻(xiàn)2：WO2012/056997A1

【非專利文獻(xiàn)】

非專利文獻(xiàn)1：Jin，Y.，et al.，Biochem Biophys Res Commun.，Vol.391，p.1471-1476。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

【發(fā)明要解決的技術(shù)課題】

間充質(zhì)干細(xì)胞是老化的細(xì)胞，被知為如果培養(yǎng)期間變長(分裂次數(shù)多)，則增殖速度的降低、進(jìn)一步會導(dǎo)致停止。從而，不容易確保充分的細(xì)胞數(shù)，這成為進(jìn)行人間充質(zhì)干細(xì)胞的基礎(chǔ)研究、臨床應(yīng)用方面的一個障礙。從而本發(fā)明旨在提供不使用特別的裝置、機材等而比以往長期間增殖間充質(zhì)干細(xì)胞、特別是人間充質(zhì)干細(xì)胞的手段。

【解決課題的技術(shù)方案】

本發(fā)明人為解決上述課題而銳意探討的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸及谷氨酸的7種非必須氨基酸的量降低的培養(yǎng)液中培養(yǎng)人間充質(zhì)干細(xì)胞，則相比在該非必須氨基酸的量未降低的通常的培養(yǎng)液中培養(yǎng)時更長期間的增殖培養(yǎng)變得可能，得到更多間充質(zhì)干細(xì)胞。

基于以上的見解完成本發(fā)明。即，本發(fā)明如下。

[1]間充質(zhì)干細(xì)胞用培養(yǎng)基，其中至少1種氨基酸的濃度是甘氨酸不足5μM、丙氨酸不足5μM、絲氨酸不足3μM、脯氨酸不足5μM、天冬酰胺不足1μM、天冬氨酸不足2μM、和/或谷氨酸不足3μM。

[2]上述[1]所述的培養(yǎng)基，其中甘氨酸不足5μM。

[3]上述[1]所述的培養(yǎng)基，其中甘氨酸不足1μM。

[4]上述[1]～[3]之任一項所述的培養(yǎng)基，其中丙氨酸不足5μM。

[5]上述[1]～[3]之任一項所述的培養(yǎng)基，其中丙氨酸不足1μM。

[6]上述[1]～[5]之任一項所述的培養(yǎng)基，其中絲氨酸不足3μM。

[7]上述[1]～[5]之任一項所述的培養(yǎng)基，其中絲氨酸不足0.7μM。

[8]上述[1]～[7]之任一項所述的培養(yǎng)基，其中脯氨酸不足5μM。

[9]上述[1]～[7]之任一項所述的培養(yǎng)基，其中脯氨酸不足1μM。

[10]上述[1]～[9]之任一項所述的培養(yǎng)基，其中天冬酰胺不足1μM。

[11]上述[1]～[9]之任一項所述的培養(yǎng)基，其中天冬酰胺不足0.1μM。

[12]上述[1]～[11]之任一項所述的培養(yǎng)基，其中天冬氨酸不足2μM。

[13]上述[1]～[11]之任一項所述的培養(yǎng)基，其中天冬氨酸不足0.5μM。

[14]上述[1]～[13]之任一項所述的培養(yǎng)基，其中谷氨酸不足3μM。

[15]上述[1]～[13]之任一項所述的培養(yǎng)基，其中谷氨酸不足0.7μM。

[16]上述[1]所述的培養(yǎng)基，其中甘氨酸不足5μM、丙氨酸不足5μM、絲氨酸不足3μM、脯氨酸不足5μM、天冬酰胺不足1μM、天冬氨酸不足2μM、及谷氨酸不足3μM。

[17]上述[1]所述的培養(yǎng)基，其中甘氨酸不足1μM、丙氨酸不足1μM、絲氨酸不足0.7μM、脯氨酸不足1μM、天冬酰胺不足0.1μM、天冬氨酸不足0.5μM、及谷氨酸不足0.7μM。

[18]上述[1]～[17]之任一項所述的培養(yǎng)基，其含有實施了低分子除去處理的血清或血清替代物。

[19]上述[18]所述的培養(yǎng)基，其中上述低分子除去處理由透析進(jìn)行。

[20]上述[18]或[19]所述的培養(yǎng)基，其中血清是人血清。

[21]上述[1]～[20]之任一項所述的培養(yǎng)基，其不含非人動物來源的成分。

[22]上述[1]～[21]之任一項所述的培養(yǎng)基，其中間充質(zhì)干細(xì)胞是人間充質(zhì)干細(xì)胞。

[23]上述[22]所述的培養(yǎng)基，其中間充質(zhì)干細(xì)胞是自骨髓采集的。

[24]間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其包括在上述[1]～[23]之任一項所述的培養(yǎng)基中培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的工序。

[25]上述[24]所述的培養(yǎng)方法，其中培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的工序是使間充質(zhì)干細(xì)胞增殖70天以上的工序。

[26]細(xì)胞組合物，其由上述[24]或[25]所述的培養(yǎng)方法得到。

[27]上述[26]所述的細(xì)胞組合物，其對選自CD73、CD90及CD105的至少1種標(biāo)志物是陽性的。

[28]上述[26]所述的細(xì)胞組合物，其對選自CD73、CD90及CD105的至少1種標(biāo)志物是陽性的，并且對CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79、CD19及HLA-DR是陰性的。

[29]細(xì)胞醫(yī)療用的細(xì)胞，其由上述[24]或[25]所述的培養(yǎng)方法得到。

[30]間充質(zhì)干細(xì)胞用培養(yǎng)基，其未添加甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸及谷氨酸而含有實施了低分子除去處理的血清或血清替代物。

[31]上述[30]所述的培養(yǎng)基，其中添加組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、及纈氨酸。

[32]上述[31]所述的培養(yǎng)基，其中還添加精氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、及酪氨酸。

【發(fā)明效果】

由本發(fā)明使至今困難的間充質(zhì)干細(xì)胞的長期間增殖培養(yǎng)變得可能。從而，可簡便地得到更多間充質(zhì)干細(xì)胞，使得為了在研究或醫(yī)療等中使用而大量地供給間充質(zhì)干細(xì)胞變得可能。

【附圖說明】

【圖1】圖1是顯示由本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)人間充質(zhì)干細(xì)胞(批編號：OF3825)7天中的細(xì)胞增殖促進(jìn)效果的圖。

【圖2】圖2是顯示由本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)人間充質(zhì)干細(xì)胞(批編號：OF3825)約70天中的細(xì)胞增殖促進(jìn)效果的圖。

【圖3】圖3是顯示由本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)人間充質(zhì)干細(xì)胞(批編號：OF3853及OF4266)約30天中的細(xì)胞增殖促進(jìn)效果的圖。

【圖4】圖4是顯示由本發(fā)明的培養(yǎng)基自人間充質(zhì)干細(xì)胞(批編號：BM103)的第一繼代起培養(yǎng)109天中的細(xì)胞增殖促進(jìn)效果的圖。橫軸的括號內(nèi)的數(shù)字表示自培養(yǎng)開始的天數(shù)。

【圖5】圖5是顯示由本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)的人間充質(zhì)干細(xì)胞(批編號：BM103PN2(圖5A)及BM105PN2(圖5B))向脂肪細(xì)胞的分化促進(jìn)效果的圖。

【實施方式】

本發(fā)明提供選自甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸及谷氨酸的至少1種氨基酸的量降低的間充質(zhì)干細(xì)胞用培養(yǎng)基(以下，有時簡記作“本發(fā)明的培養(yǎng)基”)。更具體而言提供至少1種氨基酸的濃度是甘氨酸不足5μM、丙氨酸不足5μM、絲氨酸不足3μM、脯氨酸不足5μM、天冬酰胺不足1μM、天冬氨酸不足2μM、和/或谷氨酸不足3μM的間充質(zhì)干細(xì)胞用培養(yǎng)基。

本說明書中記載的氨基酸是指L-體、D-體、DL-體之任何，另外不僅是指各自的氨基酸的游離體，還是指鹽的形態(tài)。

在鹽的形態(tài)中，可舉出酸加成鹽或與堿的鹽等，優(yōu)選不表現(xiàn)出細(xì)胞毒性而作為藥品容許的鹽。作為形成這樣的鹽的酸，例如，可舉出氯化氫、溴化氫、硫酸、磷酸等的無機酸、醋酸、乳酸、檸檬酸、酒石酸、馬來酸、富馬酸或單甲基硫酸等的有機酸，另外，作為形成這樣的鹽的堿，例如，可舉出鈉、鉀、鈣等的金屬的氫氧化物或碳酸化物、或氨等的無機堿、乙二胺、丙二胺、乙醇胺、單烷基乙醇胺、二烷基乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺等的有機堿。上述鹽可為含水合物(的水鹽)。

在本發(fā)明的培養(yǎng)基中，選自甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸及谷氨酸的至少1種氨基酸(以下，有時將這7種氨基酸合記作“本發(fā)明的降低的氨基酸”)的量降低。本說明書中，“降低的”是指比在一般的培養(yǎng)基中使用的量少，并且是指其含量被抑制到低至使間充質(zhì)干細(xì)胞的長期間的增殖培養(yǎng)成為可能的程度。作為一般的培養(yǎng)基中使用的量，例如，可舉出當(dāng)是甘氨酸時是133～667μM、當(dāng)是丙氨酸時是50～400μM、當(dāng)是絲氨酸時是238～400μM、當(dāng)是脯氨酸時是150～400μM、當(dāng)是天冬酰胺時是50～400μM、當(dāng)是天冬氨酸時是50～400μM、當(dāng)是谷氨酸時是50～510μM。為了實現(xiàn)氨基酸的量的降低，在制作本發(fā)明的培養(yǎng)基時使用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基及向其中添加的添加物優(yōu)選為不含本發(fā)明的降低的氨基酸或?qū)嵤┝顺ケ景l(fā)明的降低的氨基酸等的低分子的操作的。另外，在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的培養(yǎng)基基本上不含有本發(fā)明的降低的氨基酸的至少1種、更優(yōu)選為7種全部。“基本上不含有”是指通過使用不含本發(fā)明的降低的氨基酸或?qū)嵤┝顺ケ景l(fā)明的降低的氨基酸等的低分子的操作的基礎(chǔ)培養(yǎng)基及其添加物來抑制本發(fā)明的培養(yǎng)基中的本發(fā)明的降低的氨基酸的培養(yǎng)時的最終濃度盡可能低，優(yōu)選為，本發(fā)明的培養(yǎng)基中的濃度在檢測界限以下的濃度。氨基酸的檢測可通過由茚三酮法的氨基酸分析方法(例如參照Clinical Chemistry(1997),Vol.43,No.8,p1421-1428)等進(jìn)行。作為氨基酸的檢測法使用茚三酮法時，“檢測界限以下的濃度”是指無法通過由茚三酮法的氨基酸分析方法檢測的程度的濃度。作為本發(fā)明的降低的氨基酸中的各氨基酸的濃度的具體例，可舉出甘氨酸不足5μM、優(yōu)選為不足1μM、更優(yōu)選為不足0.8μM、丙氨酸不足5μM、優(yōu)選為不足1μM、更優(yōu)選為不足0.8μM、絲氨酸不足3μM、優(yōu)選為不足0.7μM、更優(yōu)選為不足0.4μM、脯氨酸不足5μM、優(yōu)選為不足1μM、更優(yōu)選為不足0.7μM、天冬酰胺不足1μM、優(yōu)選為不足0.1μM、更優(yōu)選為不足0.06μM、天冬氨酸不足2μM、優(yōu)選為不足0.5μM、更優(yōu)選為不足0.15μM、谷氨酸不足3μM、優(yōu)選為不足0.7μM、更優(yōu)選為不足0.5μM。

在本發(fā)明的培養(yǎng)基中，對于本發(fā)明的降低的氨基酸7種中的1、2、3、4、5、6或7種其(它們的)量降低，在多種氨基酸的量降低時，可為任何氨基酸的組合。在優(yōu)選的實施方式中，在本發(fā)明的培養(yǎng)基中，7種全的氨基酸的量降低。

本發(fā)明的降低的氨基酸以外的氨基酸的，關(guān)于本發(fā)明的培養(yǎng)基中的含量，只要不抑制間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖，就不特別限定，可適宜采用通常的細(xì)胞培養(yǎng)中使用的濃度。

在本發(fā)明的培養(yǎng)基中，可使用公知的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，只要不抑制間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖，不特別限定，但例如，可舉出DMEM、EMEM、IMDM(Iscove氏改良的Dulbecco氏培養(yǎng)基)、GMEM(Glasgow氏MEM)、RPMI-1640、α-MEM、Ham氏培養(yǎng)基F-12、Ham氏培養(yǎng)基F-10、Ham氏培養(yǎng)基F12K、培養(yǎng)基199、ATCC-CRCM30、DM-160、DM-201、BME、Fischer、McCoy氏5A、Leibovitz氏L-15、RITC80-7、MCDB105、MCDB107、MCDB131、MCDB153、MCDB201、NCTC109、NCTC135、Waymouth氏MB752/1、CMRL-1066、William氏培養(yǎng)基E、Brinster氏BMOC-3培養(yǎng)基、E8培養(yǎng)基(Nature Methods,2011,8,424-429)、ReproFF2培養(yǎng)基(ReproCELL公司)、及這些的混合培養(yǎng)基等。另外，也可使用為了間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)而改變的培養(yǎng)基，或上述基礎(chǔ)培養(yǎng)基與其他培養(yǎng)基的混合物等。根據(jù)期望，也可對這些培養(yǎng)基實施本發(fā)明的除去降低的氨基酸等的低分子的操作。

在本發(fā)明的培養(yǎng)基中，可含公知的添加物。作為添加物，只要不抑制間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖，不特別限定，但例如，可舉出生長因子(例如胰島素等)、鐵源(例如轉(zhuǎn)鐵蛋白等)、聚胺類(例如腐胺等)、礦物(例如硒酸鈉等)、糖類(例如葡萄糖等)、有機酸(例如丙酮酸、乳酸等)、本發(fā)明的降低的氨基酸以外的氨基酸(例如L-谷氨酰胺等)、還原劑(例如2-巰基乙醇等)、維生素類(例如抗壞血酸、d-生物素等)、類固醇(例如β-雌二醇、黃體酮等)、抗生物質(zhì)(例如鏈霉素、青霉素、慶大霉素等)、緩沖劑(例如HEPES等)等、脂質(zhì)類(例如亞油酸等)、核酸類(例如胸腺嘧啶等)。另外，也可適宜含一直以來在間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)中使用的公知的添加物。添加物優(yōu)選以各自公知的濃度范圍內(nèi)含。

在本發(fā)明的培養(yǎng)基中可含血清。作為血清，只要是動物來源的血清，只要不抑制間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖，就不特別限定，但優(yōu)選為哺乳動物來源的血清(例如胎牛血清、人血清等)，更優(yōu)選為人血清。血清的濃度只要在公知的濃度范圍內(nèi)即可。再者，將培養(yǎng)后的間充質(zhì)干細(xì)胞以醫(yī)療目的使用時，由于其他動物來源成分有成血液媒介病原菌的感染源或異種抗原的可能性，也可適宜地使用不含血清的培養(yǎng)基。當(dāng)不含血清時，也可使用血清的替代添加物(例如Knockout Serum Replacement(KSR)(Invitrogen)、Chemically-defined Lipid concentrated(Gibco)等)。上述血清及血清替代添加物優(yōu)選不含有本發(fā)明的降低的氨基酸的，或者實施了除去本發(fā)明的降低的氨基酸等的低分子的操作的。

即，作為本發(fā)明的培養(yǎng)基的一例，可舉出“不添加本發(fā)明的降低的氨基酸而含有實施了低分子除去處理的血清或血清替代物的間充質(zhì)干細(xì)胞用培養(yǎng)基”。在所述培養(yǎng)基中，可根據(jù)期望添加本發(fā)明的降低的氨基酸以外的氨基酸、具體而言，組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸及纈氨酸，優(yōu)選另外添加。也可再根據(jù)期望添加精氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺及酪氨酸，優(yōu)選另外添加。

將由本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞以細(xì)胞醫(yī)療等的醫(yī)療目的使用時，由于有引起病原菌的感染，或成為異種抗原的可能性，在本發(fā)明的培養(yǎng)基中，更優(yōu)選不含非人動物來源成分。

上述的“除去本發(fā)明的降低的氨基酸等的低分子的操作”只要可維持供于該操作的樣品的期望的效果的同時除去本發(fā)明的降低的氨基酸，就如何進(jìn)行都可，可舉出透析或凝膠過濾等的操作。作為具體例，可舉出向作為在培養(yǎng)基制作中使用的試劑的含有氨基酸以外的培養(yǎng)基成分(鹽類、維生素等)的試劑以對于間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖必要的濃度添加本發(fā)明的降低的氨基酸以外的氨基酸、再添加由透析、凝膠過濾等的操作而除去本發(fā)明的降低的氨基酸及其他低分子的血清等的方法。

“干細(xì)胞”是指有自身復(fù)制能及分化/增殖能的未成熟的細(xì)胞。在干細(xì)胞中，根據(jù)分化能力，包括多能性干細(xì)胞(pluripotent stem cell)、復(fù)能性干細(xì)胞(multipotent stem cell)、單能性干細(xì)胞(unipotent stem cell)等的亞集團(tuán)。多能性干細(xì)胞是指有能向構(gòu)成生物體的全部組織或細(xì)胞分化的能力的細(xì)胞。復(fù)能性干細(xì)胞是指，雖不是向全部種類，但有能向多種組織或細(xì)胞分化的能力的細(xì)胞。單能性干細(xì)胞是指有能向特定的組織或細(xì)胞分化的能力的細(xì)胞。

在本發(fā)明中作為對象的間充質(zhì)干細(xì)胞是能分化為脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等的復(fù)能性干細(xì)胞的一種，與ES細(xì)胞或iPS細(xì)胞等的多能性干細(xì)胞不同，作為在移植到生物體時形成腫瘤的可能性低的細(xì)胞被知。本發(fā)明中的間充質(zhì)干細(xì)胞可為自骨髓采集的間充質(zhì)干細(xì)胞、可優(yōu)選為，對于1種以上的間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物(例如，CD73、CD90、CD105等)是陽性的、更優(yōu)選為，對于該標(biāo)志物是陽性的，并且，確認(rèn)不到在間充質(zhì)干細(xì)胞中表達(dá)的分子的表達(dá)可為陰性。作為在間充質(zhì)干細(xì)胞中確認(rèn)不表達(dá)的分子的例，可舉出CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79、CD19、HLA-DR等。

本發(fā)明的培養(yǎng)基可在任何的動物來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖中適宜地使用。能使用本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞是例如，小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠等的嚙齒類、兔等的兔目、豬、牛、山羊、馬、綿羊等的有蹄目、狗、貓等的貓目、人、猴、恒河猴、狨猴、猩猩、黑猩猩等的靈長類等來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，優(yōu)選為，人來源的間充質(zhì)干細(xì)胞。

本發(fā)明的培養(yǎng)基優(yōu)選為間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖培養(yǎng)用培養(yǎng)基?！霸鲋撑囵B(yǎng)用培養(yǎng)基”是指在維持間充質(zhì)干細(xì)胞的自身復(fù)制能或分化復(fù)能性的狀態(tài)下，使該細(xì)胞的復(fù)制(即，增殖)成為可能的培養(yǎng)基。從而，由本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞以維持增殖能作為特征。在本說明書中，“增殖能”是指不因細(xì)胞老化等而失去進(jìn)行細(xì)胞分裂的能力，例如，當(dāng)培養(yǎng)中的細(xì)胞的大部分(例如，細(xì)胞組合物中的60％、優(yōu)選為70％、更優(yōu)選為80％、再優(yōu)選為90％、最優(yōu)選為100％的細(xì)胞)對于細(xì)胞老化標(biāo)志物(例如，老化關(guān)聯(lián)β-半乳糖苷酶活性的升高等)是陰性時，或當(dāng)培養(yǎng)中的細(xì)胞的大部分(例如，細(xì)胞組合物中的60％、優(yōu)選為70％、更優(yōu)選為80％、再優(yōu)選為90％、最優(yōu)選為100％的細(xì)胞)屬于細(xì)胞周期的G1、S、G2或M期的任何時，可說該細(xì)胞維持增殖能。

由本發(fā)明的培養(yǎng)基使得在維持增殖能的狀態(tài)下長期有效進(jìn)行間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)變得可能。例如，由本發(fā)明的培養(yǎng)基，能維持增殖能的狀態(tài)下進(jìn)行間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)50天以上、優(yōu)選為70天以上、更優(yōu)選為87天以上、再優(yōu)選為118天以上。另外，本發(fā)明的培養(yǎng)基由于未失間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能，能由培養(yǎng)得到大量的間充質(zhì)干細(xì)胞。通過使用本發(fā)明的培養(yǎng)基，可比以往得到大量的間充質(zhì)干細(xì)胞，例如，可得培養(yǎng)開始時的1230倍以上的細(xì)胞數(shù)的間充質(zhì)干細(xì)胞。

在本發(fā)明的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞與在以往的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞相比，有同程度的向骨細(xì)胞的分化能。向骨細(xì)胞的分化，例如，可通過在骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基(例如，添加10(v/v)％FBS、100nM地塞米松、50μM L-抗壞血酸-2磷酸、10mMβ-甘油磷酸的DMEM培養(yǎng)基)中培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞來進(jìn)行。向骨細(xì)胞分化與否可通過由Arizalin Red染色檢測骨組織中的鈣離子的沉積來確認(rèn)。另外，在本發(fā)明的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞與在以往的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞相比，有同程度的向軟骨細(xì)胞的分化能。向軟骨細(xì)胞的分化，例如，可通過向軟骨分化試劑盒(LONZA公司：PT-3003)添加10ng/mL TGF-β3而使用來進(jìn)行。向軟骨細(xì)胞分化與否，例如，可通過由市售的葡萄糖胺基聚糖測定試劑盒等檢測葡萄糖胺基聚糖的產(chǎn)生來確認(rèn)。再者，在本發(fā)明的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞與在以往的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞相比，向脂肪細(xì)胞的分化能可被亢進(jìn)。向脂肪細(xì)胞的分化，例如，可通過在脂肪分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基(例如，添加10(v/v)％FBS、0.01mg/mL胰島素、1μM地塞米松、0.2mM吲哚美辛、0.5mM異丁基甲基黃嘌呤的含有高葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基)中培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞而進(jìn)行。向脂肪細(xì)胞分化與否可通過，例如，使用市售的三甘油酯測定試劑盒等檢測三甘油酯的產(chǎn)生來確認(rèn)。

在一實施方式中，本發(fā)明提供間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法(以下有時記作“本發(fā)明的培養(yǎng)方法”)，其包括在本發(fā)明的培養(yǎng)基中培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的工序。

在間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)中使用的培養(yǎng)器只要能培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞，就不特別限定，但可舉出瓶、組織培養(yǎng)用瓶、皿、平皿、組織培養(yǎng)用皿、多聯(lián)皿、微平板、微孔板、多聯(lián)盤、多孔板、顯微鏡載玻片、室玻片、培養(yǎng)皿、管、托盤、培養(yǎng)袋、及滾瓶。

培養(yǎng)器可為細(xì)胞粘接性的，也可為細(xì)胞非粘接性，根據(jù)目的適宜選擇。細(xì)胞粘接性的培養(yǎng)器可為為了提高培養(yǎng)器的表面與細(xì)胞的粘接性的目的而被細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)等的任意的細(xì)胞支持用基質(zhì)包被的培養(yǎng)器。細(xì)胞支持用基質(zhì)可為以間充質(zhì)干細(xì)胞的粘接作為目的的任意的物質(zhì)，可舉出使用ECM的基質(zhì)膠、或者膠原或明膠、聚-L-賴氨酸、聚-D-賴氨酸、層粘連蛋白、纖連蛋白等。

此外的培養(yǎng)條件，可適宜設(shè)定。例如，培養(yǎng)溫度不特別限定，可為約30～40℃、優(yōu)選為約37℃。CO₂濃度可為約1～10％、優(yōu)選為約2～5％。氧濃度可為1～20％、優(yōu)選為1～10％。

在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的培養(yǎng)方法，可還包括使間充質(zhì)干細(xì)胞增殖50天以上、優(yōu)選為70天以上、更優(yōu)選為87天以上、再優(yōu)選為118天以上的工序。本發(fā)明的培養(yǎng)方法由于不失間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能，從而通過進(jìn)行上述長期間的培養(yǎng)可得大量的間充質(zhì)干細(xì)胞，例如，能得到培養(yǎng)開始時的細(xì)胞數(shù)的1230倍以上的細(xì)胞數(shù)的間充質(zhì)干細(xì)胞。

本發(fā)明也提供由本發(fā)明的培養(yǎng)方法得到的細(xì)胞組合物(以下，也記作“本發(fā)明的細(xì)胞組合物”)。本發(fā)明的細(xì)胞組合物，其大部分(例如，細(xì)胞組合物中的60％、優(yōu)選為70％、更優(yōu)選為80％、再優(yōu)選為90％、最優(yōu)選為100％的細(xì)胞)優(yōu)選為未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞。作為間充質(zhì)干細(xì)胞的公知的標(biāo)志物的例，可舉出CD73、CD90及CD105。從而，本發(fā)明的細(xì)胞組合物，其大部分(例如，細(xì)胞組合物中的60％、優(yōu)選為70％、更優(yōu)選為80％、再優(yōu)選為90％、最優(yōu)選為100％的細(xì)胞)優(yōu)選對CD73、CD90及CD105的任一種，優(yōu)選對任何2個的組合，更優(yōu)選對全部3個標(biāo)志物是陽性的。再者，本發(fā)明的細(xì)胞組合物更優(yōu)選不表達(dá)在間充質(zhì)干細(xì)胞中確認(rèn)不到表達(dá)的分子。作為在間充質(zhì)干細(xì)胞中確認(rèn)不表達(dá)的分子，例如，可舉出CD45(在造血干細(xì)胞中表達(dá))、CD34(在造血干細(xì)胞中表達(dá))、CD14(在單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞中表達(dá))、CD11b(在單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、粒細(xì)胞中表達(dá))、CD79(在B細(xì)胞中表達(dá))、CD19(在B細(xì)胞中表達(dá))及HLA-DR(在樹突細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞中表達(dá))等。從而，在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的細(xì)胞組合物，其大部分(例如，細(xì)胞組合物中的60％、優(yōu)選為70％、更優(yōu)選為80％、再優(yōu)選為90％、最優(yōu)選為100％的細(xì)胞)是在間充質(zhì)干細(xì)胞確認(rèn)不到表達(dá)的分子的表達(dá)陰性。

由本發(fā)明的培養(yǎng)方法得到的細(xì)胞可在細(xì)胞醫(yī)療等的醫(yī)療用中適宜地使用。該細(xì)胞可根據(jù)對象疾病等，未分化原樣，或者向骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞或脂肪細(xì)胞等分化之后使用。作為對象疾病，例如，可舉出月狀骨無腐性壞死、大腿骨頭無腐性壞死、難斷性骨軟骨炎、腰椎椎間盤突出、缺血性心疾病、表皮水皰癥等。另外，該細(xì)胞能在向脂肪細(xì)胞分化之后，用于美容整形。

作為成為所述細(xì)胞醫(yī)療的對象的動物，例如，可舉出小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠等的嚙齒類或兔等的實驗動物、豬、牛、山羊、馬、綿羊、貂等的家畜、狗、貓等的寵物、人、猴、恒河猴、狨猴、猩猩、黑猩猩等的靈長類等，優(yōu)選為人。

上述細(xì)胞醫(yī)療中的細(xì)胞的施用量及施用方法只要得到期望的效果，就不特別限制，可根據(jù)成為治療對象的疾病或癥狀的程度、成為施用對象的動物等適宜設(shè)定。

接下來示實施例，更詳細(xì)地說明本發(fā)明，但這些不限定本發(fā)明的范圍。

【實施例】

【材料與方法】

【1.細(xì)胞】

使用自LONZA公司購入的、自正常人供體采集、調(diào)制的人間充質(zhì)干細(xì)胞(貨號：PT-2501)、及本發(fā)明人自主采集的人間充質(zhì)干細(xì)胞(批編號：BM103～104)。

【2.間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)】

在間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)中，含氨基酸以外的構(gòu)成DMEM(Dulbecco’s modified Eagle medium、GIBCO)的成分(鹽類、維生素等)的培養(yǎng)基(以下，有時表示為“0培養(yǎng)基”)，向其中添加20種氨基酸的培養(yǎng)基(以下，有時表示為“完全培養(yǎng)基”)、或者，添加除甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸及谷氨酸之外的13種氨基酸的培養(yǎng)基(以下，有時表示為“-7培養(yǎng)基”)、向各自的培養(yǎng)基添加由透析除去低分子的FBS(胎牛血清、Life Technologies公司：26400-044)至成10(v/v)％而使用。

在表1中，示培養(yǎng)中使用的血清中的透析后的上述7種氨基酸的濃度、向-7培養(yǎng)基中添加這些氨基酸時的使用時的最終濃度、一般的培養(yǎng)基中的這些氨基酸的濃度。

【表1】

間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)在37℃、5％CO₂氣氛下的溫育器內(nèi)進(jìn)行。

【3.向脂肪細(xì)胞的分化培養(yǎng)及脂肪細(xì)胞的維持培養(yǎng)】

自間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的分化使用脂肪分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基(添加10(v/v)％FBS(Life Technologies公司：26400-044)、0.01mg/mL胰島素(NACALAI TESQUE公司：19251-95)、1μM地塞米松(SIGMA公司：D2915)、0.2mM吲哚美辛(SIGMA公司：I7378)、0.5mM異丁基甲基黃嘌呤(SIGMA公司：I7018)的含有高葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基(GIBCO))進(jìn)行。向脂肪細(xì)胞的分化后的培養(yǎng)使用脂肪維持培養(yǎng)基(添加10(v/v)％FBS(Life Technologies公司：26400-044)、0.01mg/mL胰島素(NACALAI TESQUE公司：19251-95)的含有高葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基(GIBCO))進(jìn)行。

自間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的分化培養(yǎng)及分化后的維持培養(yǎng)在37℃、5％CO₂氣氛下的溫育器內(nèi)進(jìn)行。

【4.脂肪細(xì)胞分化誘導(dǎo)與分化效率的測定】

將每1孔2×10⁵細(xì)胞的間充質(zhì)干細(xì)胞接種到6孔板，在間充質(zhì)干細(xì)胞用培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)至100％匯合。接下來，將培養(yǎng)基更換為脂肪分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基而培養(yǎng)3天之后，將培養(yǎng)基更換為脂肪維持培養(yǎng)基而再進(jìn)行3天培養(yǎng)。將此由脂肪分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基和脂肪維持培養(yǎng)基的計6天的培養(yǎng)實施3個循環(huán)合計18天。

將培養(yǎng)后的細(xì)胞用10％福爾馬林固定之后，進(jìn)行油紅O染色。接下來，將細(xì)胞溶解于0.1％Thesit(注冊商標(biāo))(聚桂醇)，用血清三甘油酯測定試劑盒(SIGMA公司：TR0100-1KT)定量三甘油酯量。通過使用BCA(雙金雞寧酸)試劑對蛋白質(zhì)進(jìn)行定量，比較每蛋白質(zhì)量的三甘油酯量來探討每細(xì)胞的分化效率。

【結(jié)果】

【實施例1：由在-7培養(yǎng)基中的短期間培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞增殖促進(jìn)效果(圖1)】

用0培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基或-7培養(yǎng)基對人間充質(zhì)干細(xì)胞(批編號：OF3825)進(jìn)行7天培養(yǎng)，評價細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞數(shù)的測量由CCK測定進(jìn)行。使用作為市售的試劑盒的細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8(Dojindo)，根據(jù)試劑盒附屬的使用說明書進(jìn)行操作。在CCK測定中，細(xì)胞數(shù)與OD450nm(縱軸)成比例。以各培養(yǎng)基3孔進(jìn)行評價，將各孔的值用○表示，將3孔的平均值用●表示。發(fā)現(xiàn)相比在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)的情況，在-7培養(yǎng)基中間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖顯著地被促進(jìn)。

【實施例2：由在-7培養(yǎng)基中的長期間培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞增殖促進(jìn)效果(圖2)】

用-7培養(yǎng)基或完全培養(yǎng)基對人間充質(zhì)干細(xì)胞(批編號：OF3825)進(jìn)行70天培養(yǎng)，測量用各自的培養(yǎng)基培養(yǎng)時的累積細(xì)胞數(shù)。在繼代時，將細(xì)胞通過胰蛋白酶處理從培養(yǎng)容器剝離，與錐蟲藍(lán)混合之后，將細(xì)胞懸浮液供于血細(xì)胞計數(shù)板，測量細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞數(shù)的測量在以下的實施例中也用同樣的方法進(jìn)行。與用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)時比，用-7培養(yǎng)基培養(yǎng)時累積細(xì)胞數(shù)顯著地增大。從而表明，-7培養(yǎng)基是對于間充質(zhì)干細(xì)胞的長期增殖培養(yǎng)適宜的培養(yǎng)基。

【實施例3：不同的批的間充質(zhì)干細(xì)胞的由在-7培養(yǎng)基中的培養(yǎng)的細(xì)胞增殖促進(jìn)效果(圖3)】

將批編號：OF3853及批編號：OF4266的人間充質(zhì)干細(xì)胞在-7培養(yǎng)基或完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天，測量累積細(xì)胞數(shù)。對于兩批的人間充質(zhì)干細(xì)胞，確認(rèn)了由-7培養(yǎng)基的顯著的增殖促進(jìn)效果。

【實施例4：由完全培養(yǎng)基的間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)中的增殖培養(yǎng)可能期間的探討(圖4)】

使用-7培養(yǎng)基或完全培養(yǎng)基對人間充質(zhì)干細(xì)胞(批編號：BM103)進(jìn)行109天培養(yǎng)，測量各自累積細(xì)胞數(shù)。在-7培養(yǎng)基中的培養(yǎng)中，累積細(xì)胞數(shù)不達(dá)到頂點地增殖持續(xù)，與此相比，當(dāng)在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，自培養(yǎng)開始起第70天往后，累積細(xì)胞數(shù)大致達(dá)到頂點。在完全培養(yǎng)基中的培養(yǎng)中，由至達(dá)到極限的培養(yǎng)，最終的累積細(xì)胞數(shù)是培養(yǎng)開始時的細(xì)胞數(shù)的1230倍。從而得知，能由完全培養(yǎng)基增殖培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的期間大概是70天，此時的累積細(xì)胞數(shù)是培養(yǎng)開始時的細(xì)胞數(shù)的1230倍左右。

【參考例1：在-7培養(yǎng)基中培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的分化促進(jìn)(圖5)】

使用在-7培養(yǎng)基或完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)20天～24天的人間充質(zhì)干細(xì)胞(批編號：BM103PN2(圖5A)及BM105PN2(圖5B))，進(jìn)行向脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞或軟骨細(xì)胞的分化誘導(dǎo)。關(guān)于向骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞的分化，在-7培養(yǎng)基中培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞與在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞相比，顯示同程度的分化效率。關(guān)于向脂肪細(xì)胞的分化，在-7培養(yǎng)基中培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞與在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞相比，分化效率顯著地高(圖5)。從而表明，-7培養(yǎng)基是關(guān)于間充質(zhì)干細(xì)胞的向骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞的分化，維持與以往的培養(yǎng)基同程度的分化能的同時，使以比以往更好的效率向脂肪細(xì)胞分化成為可能的培養(yǎng)基。

【工業(yè)實用性】

由本發(fā)明在能不使間充質(zhì)干細(xì)胞老化而進(jìn)行長期間增殖培養(yǎng)，需要大量的間充質(zhì)干細(xì)胞時特別有用。由本發(fā)明培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞可適宜地用于細(xì)胞醫(yī)療等的用途。

本申請以在日本申請的特愿2014-168580(申請日2014年8月21日)作為基礎(chǔ)，其內(nèi)容應(yīng)全部包含在本說明書中。