本發(fā)明處于植物生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地，涉及通過外源序列有效轉(zhuǎn)化甜菜原生質(zhì)體的方法和方式(或工具)。
背景技術(shù)：
：在植物遺傳學(xué)領(lǐng)域中，一直需要通過同源重組(基因靶向)修飾染色體的能力，這是因?yàn)榛虬邢蚩梢园邢蛱禺愋孕蛄谢蚝塑账?，從而?dǎo)致特定植物功能的修飾并開創(chuàng)用于作物改善、用于具有所需碳水化合物譜或具有提高的營養(yǎng)品質(zhì)的新種子的產(chǎn)量提高，或用于提高對疾病和應(yīng)激的耐受性的新的可能性。來源于黃單胞菌屬(xanthomonas)的植物病原體細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)子核酸酶(TranscriptionActivator-LikeEffectorNucleases)(TALEN)序列在疾病中起重要作用并通過結(jié)合宿主DNA和激活效應(yīng)子-特異性宿主基因來引起防御。TALEN's是特異性轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)子核酸酶(人工限制酶)，其可以設(shè)計(jì)成結(jié)合并切割基因組中的特異性DNA序列。一旦將這些TALEN's引入細(xì)胞，則它們可以用于基因組編輯。這些核酸酶序列和它們的衍生蛋白允許有效靶向和/或加工雙鏈核酸序列。它們的衍生蛋白是由核心骨架組成的特異性嵌合蛋白單體，所述核心骨架包含對靶序列具有結(jié)合特異性的重復(fù)可變二肽區(qū)(RepeatVariableDipeptideregion)(RVD)，所述靶序列在其N末端部分融合了催化結(jié)構(gòu)域。該催化結(jié)構(gòu)域(其可以是核酸酶的單體)，位于可能與融合至另一TAL單體的另一催化結(jié)構(gòu)域相互作用的位置，從而當(dāng)兩個(gè)單體結(jié)合至其各自靶標(biāo)DNA序列時(shí)，兩個(gè)催化結(jié)構(gòu)域?qū)⑿纬煽赡芗庸ぴ摪行蛄懈浇腄NA的催化實(shí)體(catalyticentity)。國際專利申請WO2011/072246描述了通過使用該轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)子核酸酶(也稱為DNA酶)核苷酸序列或其衍生蛋白來修飾細(xì)胞的遺傳物質(zhì)的方法，其中TAL效應(yīng)子核酸酶將結(jié)合至并且將加工所述靶DNA。該方法還將包括以下步驟：向細(xì)胞提供包含與至少部分靶標(biāo)DNA序列同源的序列的核酸序列，從而可以在布置在感興趣的基因序列之間的靶序列部分和其相應(yīng)的核酸部分之間發(fā)生同源重組。可以通過使用包含編碼TALEN蛋白質(zhì)的序列的一種或多種載體或者通過機(jī)械注射、通過細(xì)菌分泌系統(tǒng)或者通過電穿孔直接將相應(yīng)衍生蛋白引入細(xì)胞來獲得細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。通過使用轉(zhuǎn)錄激活子樣蛋白，具體地II類限制核酸內(nèi)切酶(如FokI)，該方法已用于多種細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。然而，在植物遺傳學(xué)領(lǐng)域中，轉(zhuǎn)化方法復(fù)雜、不總有效且費(fèi)時(shí)。對于一些植物品種，如甜菜細(xì)胞和難以遺傳轉(zhuǎn)化的植物，這是特別真實(shí)的。因此，明確需要針對轉(zhuǎn)化的遺傳方法的改善，特別是甜菜植物的基因靶向。因此，本發(fā)明旨在提供用于甜菜細(xì)胞和植物基因靶向的新方法和工具，其允許甜菜原生質(zhì)體的遺傳轉(zhuǎn)化，具體地，其基因靶向和編輯。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明涉及甜菜原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化方法，包括以下步驟：-從分離自甜菜(Betavulgaris)植物的氣孔保衛(wèi)細(xì)胞獲得原生質(zhì)體，-用包含感興趣的核苷酸序列和轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)子核酸酶(TALEN)或者包含編碼這些轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)子核酸酶(TALEN)序列的序列的一個(gè)或多個(gè)載體的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化這些原生質(zhì)體，其中這些轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)子核酸酶靶向并處理原生質(zhì)體的靶(DNA)序列，并通過用包含感興趣的核苷酸序列的核酸構(gòu)建體同源重組來替換該靶(DNA)序列，-可能地，向這些原生質(zhì)體的體外培養(yǎng)應(yīng)用對所述原生質(zhì)體的體外培養(yǎng)有毒的，優(yōu)選地致死的培養(yǎng)基(如一種或多種除草劑)，和-從細(xì)胞培養(yǎng)再生甜菜植物，優(yōu)選地，從整合了包含感興趣的序列的核酸構(gòu)建體的存活的原生質(zhì)體再生甜菜植物，所述感興趣的序列可能使所述轉(zhuǎn)化的細(xì)胞對所應(yīng)用的培養(yǎng)基(如一種或多種除草劑)的毒性，優(yōu)選地致死活性具有耐受性。優(yōu)選地，在根據(jù)本發(fā)明所述的方法中，所述核酸構(gòu)建體還包含用于感興趣的核苷酸序列在甜菜原生質(zhì)體、細(xì)胞、組織(愈傷組織)和/或植物中表達(dá)的一種或多種調(diào)控序列。優(yōu)選地，在根據(jù)本發(fā)明所述的方法中，應(yīng)用于原生質(zhì)體的體外培養(yǎng)的培養(yǎng)基包含一種或多種ALS抑制劑(除草劑)，其選自由以下各項(xiàng)組成的組：磺酰脲除草劑、磺酰氨基羰基三唑啉酮除草劑、咪唑啉酮除草劑、三唑并嘧啶除草劑、嘧啶基(硫代)苯甲酸酯除草劑或它們的混合物。更優(yōu)選地，這些磺酰脲除草劑選自由以下各項(xiàng)組成的組：甲酰胺磺隆(foramsulfuron)、碘甲磺隆(iodosulfuron)、酰嘧磺隆(amidosulfuron)、乙氧嘧磺隆(ethoxysulfuron)、氯嘧磺隆(chloramsulfuron)或它們的混合物。更優(yōu)選地，在根據(jù)本發(fā)明所述的方法中，對于甲酰胺磺隆，以(約)5×10-9M至(約)1×10-6M的濃度，對于乙氧嘧磺隆，以(約)5×10-11M至(約)1×10-10M的濃度，應(yīng)用ALS抑制劑(除草劑)。在根據(jù)本發(fā)明所述的方法中，感興趣的序列編碼賦予(或者參與)對一種或多種除草劑的耐受性、對昆蟲的耐受性、對線蟲的耐受性、對植物疾病的耐受性、對病毒感染的耐受性、對應(yīng)激(如氫或鹽應(yīng)激)的耐受性的肽或蛋白質(zhì)，可以編碼一種或多種酶和/或可以編碼具有抗細(xì)菌或抗真菌特性的肽或蛋白質(zhì)。在根據(jù)本發(fā)明所述的方法中使用的核酸構(gòu)建體還可以使用或存在于包含用于感興趣的核酸序列在甜菜原生質(zhì)體、細(xì)胞、組織和/或植物中表達(dá)的一種或多種調(diào)控序列的載體中。這些調(diào)控序列優(yōu)選地選自由以下各項(xiàng)組成的組：啟動(dòng)子或轉(zhuǎn)錄終止和/或聚-A信號序列，更優(yōu)選地，得自根癌農(nóng)桿菌(agrobacteriumtumefaciens)的CAMV35S啟動(dòng)子序列和Nos終止子序列。當(dāng)感興趣的核酸序列是與其相應(yīng)的野生型ALS序列相比，在氨基酸113位攜帶從L-丙氨酸(Ala)至L-酪氨酸(Tyr)的序列突變的BVALS113序列時(shí)，優(yōu)選且適合的ALS抑制劑(除草劑)是上述除草劑之一，更優(yōu)選地，是甲酰胺磺隆和/或乙氧嘧磺隆。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇與上述ALS序列相互作用的其它合適的除草劑，并且其中上述突變(與其野生型相應(yīng)的ALS序列相比，在氨基酸113位從L-丙氨酸(Ala)至L-酪氨酸(Tyr)的突變)可以賦予原生質(zhì)體細(xì)胞組織和植物對該ALS抑制劑(除草劑)或ALS抑制劑(除草劑)的混合物的耐受性。在根據(jù)本發(fā)明所述的方法中，優(yōu)選的原生質(zhì)體是氣孔保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體，當(dāng)在適合的培養(yǎng)基中生長時(shí)，其具有分化(生長)和引起(originate)病毒甜菜愈傷組織的能力。愈傷組織是指未分化的細(xì)胞塊(mass)，其可以得自外植體，如來自葉或子葉的胚胎或薄壁組織(parenchyma)來源的外植體。根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)在適合的培養(yǎng)基中生長時(shí)，如含有聚合物的培養(yǎng)基(優(yōu)選地，含有海藻酸鹽或瓊脂糖的培養(yǎng)基)，愈傷組織優(yōu)選地是通過良好再生的(氣孔(stomatate))保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體的生長獲得的，具有出芽和再生為活的甜菜植物的能力。本發(fā)明還涉及通過根據(jù)本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)化方法獲得的原生質(zhì)體、細(xì)胞、組織(愈傷組織)或植物，更具體地，涉及在其基因組中整合了感興趣的核苷酸序列，優(yōu)選地上述序列中的一種或多種的甜菜植物?，F(xiàn)將參考作為本發(fā)明的非限制性實(shí)施方式提供的附圖，在以下本發(fā)明的具體實(shí)施方式中詳細(xì)描述本發(fā)明。附圖說明圖1表示用于根據(jù)本發(fā)明的重組，使用特異性TALEN序列和含有突變以及側(cè)翼序列的供體基質(zhì)在甜菜原生質(zhì)體中引入ALS113突變。圖2表示根據(jù)本發(fā)明用于甜菜BvALSTALEN活性驗(yàn)證的T7E1測定。圖3表示具有在原生質(zhì)體中表達(dá)的特異性轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)子核酸酶(TALEN)序列的兩種植物表達(dá)載體。圖4-6表示根據(jù)本發(fā)明的供體基質(zhì)序列的序列。具體實(shí)施方式圖1顯示了使用TALEN技術(shù)在甜菜ALS基因中引入特異性突變以提供針對ALS-抑制劑的耐受性。CPS發(fā)展了基于其酵母篩選平臺的TALENs(TALEN序列)并提供了SV，所述SV具有針對ALS序列中3個(gè)不同靶位點(diǎn)的3個(gè)工程化的TALEN對(靶位點(diǎn)非常接近于ALS113突變位點(diǎn))。所有3個(gè)TALEN對與針對每個(gè)TALEN的3個(gè)特異性供體基質(zhì)一起進(jìn)入植物表達(dá)載體。當(dāng)TALEN對與供體基質(zhì)一起共轉(zhuǎn)化時(shí)，TALEN對在特異性位點(diǎn)進(jìn)行雙鏈切割，然后基于側(cè)翼序列的同源重組，供體基質(zhì)接觸插入切割位點(diǎn)的特異性突變(ALS113)。設(shè)計(jì)并產(chǎn)生了3個(gè)TALENS(TALEN序列)以用于將點(diǎn)突變(A113Y，GCA至TAT)引入到甜菜3′ALS基因中。從甜菜(Betavulgaris)基因組鑒別了2個(gè)ALS同源基因座(loci)，并且它們中的任一個(gè)可以用作靶位點(diǎn)。TALEN對質(zhì)粒名稱gal37(sd)gal30(sd)BvALS_T01.1pCLS24852-pCLS248540.85(0.02)0.87(0.06)BvALS_T02.1pCLS24856-pCLS248580.83(0.03)0.84(0.06)BvALS_T03.1pCLS24860-pCLS248620.91(0.03)0.90(0.06)表1：通過酵母測定產(chǎn)生并驗(yàn)證的TALEN的列表合成了3個(gè)TALEN對以用于在ALS基因中的突變位點(diǎn)附近進(jìn)行雙鏈斷裂。目標(biāo)是通過使用深度測序法測量這三種TALEN的效率來尋找NHEJ(非同源末端連接，(Non-HomologousEndJoining))活性并選擇具有攜帶甜菜轉(zhuǎn)化和供體基質(zhì)的更高效的物質(zhì)。TALEN序列：BvALS_T01：TATTGAAGATTCATCTTTCGTTTCTCGATTTGGCCCTGATGAACCCAGABvALS_T02：TCTTGAGCGTGAAGGTGTTACCAATGTGTTTGCTTACCCTGGTGGTGCABvALS_T03：TGAACAAGGCGGGGTTTTCGCCGCCGAGGGATATGCTAGAGCTACTGGA通過使用標(biāo)準(zhǔn)指導(dǎo)性基因轉(zhuǎn)化規(guī)程(standarddirectgenetransformationprotocol)的甜菜原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，評價(jià)每個(gè)TALEN對切割雙鏈DNA的效率。轉(zhuǎn)化程序后，將原生質(zhì)體在約26℃的溫度下培育24小時(shí)。培育后，將所得原生質(zhì)體冷凍，并根據(jù)相同標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程進(jìn)行DNA分離。通過PCR擴(kuò)增側(cè)翼TALENs識別位點(diǎn)的序列。然后，將純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行454深度測序。通過生物信息學(xué)分析序列以鑒別由NHEJ(非同源末端連接)事件所造成的目標(biāo)缺失或插入的存在。基于有限的454測序結(jié)果，鑒別了TALENBvALS_T03切割活性(～2.2％NHEJ致突變率，參見表2)。將使用PCR片段克隆和進(jìn)行半定量SANGER測序的另一種方法用于鑒別BvALS_T02和BvALS_T03兩者均具有良好的切割活性(～5％，表2)。表2.從TALEN轉(zhuǎn)化的甜菜原生質(zhì)體DNA擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果。T7E1是識別錯(cuò)配雙鏈DNA并對錯(cuò)配位點(diǎn)進(jìn)行切割的核酸內(nèi)切酶。當(dāng)PCR產(chǎn)物(擴(kuò)增序列)變性并再退火時(shí)，具有和不具有缺失的單鏈DNA(序列)可以產(chǎn)生具有錯(cuò)配的雙鏈DNA(序列)。那些DNA(序列)靶向T7E1。與454測序測定相比，T7E1測定簡單且廉價(jià)，但是技術(shù)人員可以檢測超過5％的TALEN活力。圖2顯示了T7E1測定結(jié)果。由于甜菜基因組中兩個(gè)ALS基因之間存在SNP，因此T7E1測定表明甚至在野生型材料中存在一些默認(rèn)切割(defaultcutting)。那些帶型圖案可以覆蓋從BvALS_T01至BvALS_T03切割的切割。從BvALS_T02樣品(圖2中指出)切下額外部分(extra)，表明BvALS_T02具有明顯的切割活力。基于不同驗(yàn)證分析的結(jié)果，BvALS_T02和BvALS_T03均為良好的TALEN序列。考慮到以下事實(shí)：BvALS_T02的供體不含3個(gè)設(shè)計(jì)突變之外的任何額外突變，在甜菜中選擇BvALST02及其供體的轉(zhuǎn)化從而在甜菜ALS基因中引入ALS113突變。使用TALEN和供體基質(zhì)組合的甜菜轉(zhuǎn)化本發(fā)明人已使用TALENBvALS_T02(pCLS24856-pCLS24858)及其相應(yīng)供體基質(zhì)BvALST2(pCLS26201)起始了轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)以測試攜帶突變的ALS的靶向插入的效率。一旦確定效率，使用針對所選ALS抑制劑除草劑，優(yōu)選地甲酰胺磺隆和乙氧嘧磺隆確定的殺滅曲線濃度，起始轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)以再生攜帶突變的植物。序列表<110>西斯凡德爾哈維公眾公司<120>通過TALEN平臺技術(shù)的甜菜原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化方法<130>BPSESS0013PC00<160>10<170>PatentInversion3.5<210>1<211>49<212>DNA<213>人工的<220><223>TALEN序列<400>1tattgaagattcatctttcgtttctcgatttggccctgatgaacccaga49<210>2<211>49<212>DNA<213>人工的<220><223>TALEN序列<400>2tcttgagcgtgaaggtgttaccaatgtgtttgcttaccctggtggtgca49<210>3<211>49<212>DNA<213>人工的<220><223>TALEN序列<400>3tgaacaaggcggggttttcgccgccgagggatatgctagagctactgga49<210>4<211>521<212>DNA<213>人工的<220><223>基于4D6834_47C_1731C的供體的原始序列<400>4tcttcaaccctccccttttccacccctcccaaaaccccaactccactctttcaccgtccc60ctccaaatctcatcctcccaatcccacaaatcatccgccattaaaacacaaactcaagca120ccttcttctccagctattgaagattcatctttcgtttctcgatttggccctgatgaaccc180agaaaagggtccgatgtcctcgttgaagctcttgagcgtgaaggtgttaccaatgtgttt240gcttaccctggtggtgcatctatggaaatccaccaagctctcacacgctctaaaaccatc300cgcaatgtcctccctcgccatgaacaaggcggggttttcgccgccgagggatatgctaga360gctactggaaaggttggtgtctgcattgcgacttctggtcctggtgctaccaacctcgta420tcaggtcttgctgacgctctccttgattctgtccctcttgttgccatcactggccaagtt480ccacgccgtatgattggcactgatgcttttcaggagactcc521<210>5<211>521<212>DNA<213>人工的<220><223>基于4D6834_47C_1731C的BVALST1供體<400>5tcttcaaccctccccttttccacccctcccaaaaccccaactccactctttcaccgtccc60ctccaaatctcatcctcccaatcccacaaatcatccgccattaaaacacaaactcaagca120ccttcttctccagcgatcgaagattcatctttcgtttctcgatttggccctgatgaaccc180agaaaagggtccgatgtcctcgttgaagctcttgagcgtgaaggtgttaccaatgtgttt240gcttaccctggtggttattctatggaaatccaccaagctctcacacgctctaaaaccatc300cgcaatgtcctccctcgccatgaacaaggcggggttttcgccgccgagggatatgctaga360gctactggaaaggttggtgtctgcattgcgacttctggtcctggtgctaccaacctcgta420tcaggtcttgctgacgctctccttgattctgtccctcttgttgccatcactggccaagtt480ccacgccgtatgattggcactgatgcttttcaggagactcc521<210>6<211>3105<212>DNA<213>人工的<220><223>供體基質(zhì)pCLS26200的完整序列<400>6tgcagctctggcccgtgtctcaaaatctctgatgttacattgcacaagataaaaatatat60catcatgaacaataaaactgtctgcttacataaacagtaatacaaggggtgttatgagcc120atattcaacgggaaacgtcgaggccgcgattaaattccaacatggatgctgatttatatg180ggtataaatgggctcgcgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgcttgtatg240ggaagcccgatgcgccagagttgtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaatgatg300ttacagatgagatggtcagactaaactggctgacggaatttatgcctcttccgaccatca360agcattttatccgtactcctgatgatgcatggttactcaccactgcgatccccggaaaaa420cagcattccaggtattagaagaatatcctgattcaggtgaaaatattgttgatgcgctgg480cagtgttcctgcgccggttgcattcgattcctgtttgtaattgtccttttaacagcgatc540gcgtatttcgtctcgctcaggcgcaatcacgaatgaataacggtttggttgatgcgagtg600attttgatgacgagcgtaatggctggcctgttgaacaagtctggaaagaaatgcataaac660ttttgccattctcaccggattcagtcgtcactcatggtgatttctcacttgataacctta720tttttgacgaggggaaattaataggttgtattgatgttggacgagtcggaatcgcagacc780gataccaggatcttgccatcctatggaactgcctcggtgagttttctccttcattacaga840aacggctttttcaaaaatatggtattgataatcctgatatgaataaattgcagtttcatt900tgatgctcgatgagtttttctaatcagaattggttaattggttgtaacattattcagatt960gggcttgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgat1020aatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgta1080gaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaa1140acaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctt1200tttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtag1260ccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgcta1320atcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactca1380agacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacag1440cccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaa1500agcgccacgct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