本發(fā)明總體上涉及核酸分析。更具體地說，本發(fā)明涉及一種通過模板-非依賴性單鏈DNA連接，環(huán)化來自生物樣本的核酸分子的方法。它還涉及單鏈DNA環(huán)的擴增和/或檢測。單鏈DNA環(huán)的生成在單一反應(yīng)容器中，直接從生物樣本進行，而無任何插入的分離和/或純化步驟。還提供用于執(zhí)行該方法的試劑盒。背景核酸分析被廣泛用于臨床和應(yīng)用領(lǐng)域，以及學術(shù)研究中。雖然對于某些樣本/領(lǐng)域，優(yōu)質(zhì)生物樣本的大量供應(yīng)是可獲得的，但在許多情況下，樣本可能是罕見的或被損壞。例如，在癌癥研究和診斷中，越來越需要從福爾馬林-固定的、石蠟包埋的(FFPE)組織樣本，以及從樣本內(nèi)感興趣的特定區(qū)域分析核酸。在一些情況下，僅分析少數(shù)細胞是需要的。目前，許多固定的組織樣本在DNA提取后不能提供足夠的DNA用于分析(例如定向重新測序和基于PCR的診斷試驗)，且往往DNA具有差的質(zhì)量，這進一步限制了這些試驗的有效性。全-基因組擴增(WGA)包括目標DNA的非-特異性擴增。WGA往往通過多重置換擴增(MDA)技術(shù)實現(xiàn)，其在一個等溫反應(yīng)中，使用在目標DNA的多個位置引發(fā)DNA合成的隨機寡核苷酸引物，連同具有鏈置換活性的高保真性DNA聚合酶(如，Phi29聚合酶)。盡管目前可市售獲得的WGAMDA系統(tǒng)例如GenomiPhi(GEHealthcare,USA)和RepliG(Qiagen)試劑盒提供具有高分子量目標DNA的最佳結(jié)果，但當目標DNA是短的和/或被高度片段化時，這些系統(tǒng)的性能就差。當目標序列長度少于約1,000個核苷酸時，使用常規(guī)方法擴增目標DNA導致降低的擴增速度，尤其是接近目標DNA兩端的明顯的序列丟失，和高度序列-偏倚性擴增。其一些與這樣的觀察有關(guān)，即隨著模板DNA的長度減少，模板在MDA反應(yīng)中被引發(fā)的可能性數(shù)倍減少。這降低了這些較短片段的擴增潛力。因此，用于非-特異性地擴增短的、片段化DNA的有效方法是高度需要的。連接介導的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)已被用來擴增片段化dsDNA。然而，在這些反應(yīng)中，只有一小部分的片段化DNA被擴增，導致基因組覆蓋率不足。為有效地擴增片段化dsDNA，模板可先進行酶促修復，然后通過鈍端連接來連環(huán)化(concatemerized)，以生成長于1000堿基對(bp)的序列。然而，常常需要相對高濃度的目標DNA，以促進分子間連環(huán)化(concatemerization)和后續(xù)的擴增。雙鏈目標DNA的環(huán)化也已用于各種基于核酸的測定，包括MDA、WGA、超分支滾環(huán)擴增(RCA)和大規(guī)模平行DNA測序。為有效地環(huán)化和擴增片段化dsDNA，片段化DNA的雙鏈端首先被修復，隨后通過鈍端連接以形成雙鏈DNA環(huán)。然而，環(huán)化長度少于250bp的雙鏈DNA片段是困難的，而長度少于大約150bp的DNA則是不可能的，因為這是雙鏈DNA的持續(xù)長度。首先可使雙鏈DNA變性以產(chǎn)生單鏈DNA(ssDNA)，然后可在模板-依賴性分子內(nèi)連接反應(yīng)中，使用支架/橋接寡核苷酸和連接酶進一步環(huán)化。然而，需要目標DNA的先前序列信息執(zhí)行模板-依賴性環(huán)化。ssDNA的模板-非依賴性分子內(nèi)連接也已有文獻記載。例如，TS2126RNA連接酶(在商標名ThermoPhageTMRNA連接酶II或ThermoPhageTMssDNA連接酶(Prokaria,Matis,Iceland)或CircLigaseTMssDNA連接酶(EpicentreBiotechnologies,Wisconsin,USA)下可經(jīng)市售獲得)已被用來制造數(shù)字DNA球(digitalDNAball)，和/或DNA(例如基因組DNA)的位點-特異性裂解和擴增。通過使用TS2126RNA連接酶，從有限量的片段化DNA，還已生成用于滾環(huán)擴增的DNA模板。該方法包括使線性、片段化dsDNA變性以獲得線性ssDNA片段，使線性ssDNA與CircLigaseTMssDNA連接酶連接以獲得單鏈DNA環(huán)，然后用隨機引物和Phi29DNA聚合酶通過RCA擴增單鏈DNA環(huán)。此外，連接-擴增反應(yīng)的所有嘗試包括中間分離、純化和/或清潔步驟，因而使得連接-擴增工作流程繁瑣。例如，通過環(huán)化，隨后通過滾環(huán)擴增的片段化DNA的法醫(yī)樣本的分析以多步驟進行，包括5'DNA磷酸化、接頭連接、DNA環(huán)化，和全-基因組擴增。每個步驟在執(zhí)行下一步驟之前經(jīng)受反應(yīng)清理。當連接和擴增在單一反應(yīng)容器中進行時，未觀察到擴增優(yōu)點。然而，多-步驟過程常常導致模板DNA的損失并造成分析失敗。WO2010094040A1(Epicentre)描述了預-腺苷酸化(pre-adenylated)噬菌體TS2126RNA連接酶的發(fā)現(xiàn)和使用，以解決不同序列和大小的線性單鏈DNA分子的可變分子內(nèi)連接效率。這種酶以名稱CircLigaseII經(jīng)商業(yè)出售。只有預先純化的DNA才被用作分子內(nèi)連接的起始原料。在ForensicSciIntGenet.2012Mar；6(2):185-90中，為了改進有限數(shù)量的片段化DNA的法醫(yī)STR特性分析的目的，Tate等在單鏈DNA環(huán)化和滾環(huán)擴增之前，評價了用于預先純化的基因組DNA樣本的制備和處理的一個多-步驟過程。他們發(fā)現(xiàn)在他們的多-步驟過程后，STR擴增效率沒有改進且STR基因分型失敗，"推測是由于因多個中間硅膠柱純化步驟導致的DNA模板的損失，其中的每個步驟導致模板DNA的損失"。在單一反應(yīng)容器中，直接從生物樣本擴增短的DNA序列，而無任何序列偏倚和任何插入的清潔步驟的有效方法因而是高度需要的。發(fā)明簡述在本發(fā)明的一個方面，提供一種從生物樣本生成單鏈DNA環(huán)的方法。該方法包括以下步驟：用提取劑處理生物樣本以釋放核酸，從而形成樣本混合物；中和提取劑；使釋放的核酸變性以生成單鏈核酸；和使單鏈核酸與連接酶接觸，所述連接酶能夠模板-非依賴性分子內(nèi)連接單鏈DNA序列，以生成單鏈DNA環(huán)。該方法的所有步驟在沒有任何中間核酸分離或核酸純化的情況下進行。在某些實施方案中，所述步驟以順序的方式，在單一反應(yīng)容器中進行。在某些實施方案中，單鏈DNA環(huán)被擴增，以使生物樣本的隨后分析成為可能。在某些實施方案中，樣本混合物在中和步驟之前在固體基質(zhì)上干燥。在某些實施方案中，對DNA的損傷在變性步驟之前經(jīng)酶促修復。在本發(fā)明的第二個方面，提供一種分析生物樣本的方法。因此，根據(jù)本發(fā)明的某些實施方案生成的單鏈DNA環(huán)被擴增，并分析擴增產(chǎn)物。分析可通過例如擴增產(chǎn)物的定向測序來進行。在本發(fā)明的另一方面，提供一種從生物樣本檢測染色體重排斷點的方法。因此，根據(jù)本發(fā)明的某些實施方案生成的單鏈DNA環(huán)被擴增，并例如通過測序分析擴增產(chǎn)物。通過比較該序列與已知的參考序列鑒定任何染色體重排斷點。在本發(fā)明的又一方面，提供一種試劑盒，其包含用于處理生物樣本以釋放核酸的提取劑；用于中和提取劑的試劑；和能夠模板-非依賴性分子內(nèi)連接單鏈DNA序列的連接酶。附圖當參考附圖閱讀以下詳細的描述時，本發(fā)明的這些和其它特征、方面和優(yōu)點將會變得更好地理解。圖1舉例說明根據(jù)本發(fā)明實施方案的方法工作流程的概圖。圖2表示在不同量的中和提取劑的存在下，環(huán)化反應(yīng)的結(jié)果。圖3提供了表明使用高Tm引物的擴增反應(yīng)更耐遺留(carryover)抑制作用的數(shù)據(jù)。圖4提供了表明根據(jù)本發(fā)明的實施方案從人體組織直接擴增片段化DNA的實例的數(shù)據(jù)。圖5提供了表明根據(jù)本發(fā)明的實施方案，在福爾馬林固定的樣本的DNA修復和環(huán)化后，改進的序列覆蓋率和SNP檢測的數(shù)據(jù)。詳細描述以下詳細描述是示例性的并不打算限制本發(fā)明或本發(fā)明的應(yīng)用。貫穿整個說明書，特定術(shù)語的范例應(yīng)被視為非-限制性實例。單數(shù)形式“一”、“一個”和“該”包括復數(shù)指代，除非上下文中另外清楚地指明。如此處貫穿說明書和權(quán)利要求書使用的近似語言，可被用來修飾在不導致其相關(guān)基本功能改變的情況下可允許變化的任何定量表示。因此，由術(shù)語例如“約”修飾的值并不限于所指定的精確值。除非另外指明，說明書和權(quán)利要求書中使用的表示成分的數(shù)量、特性例如分子量、反應(yīng)條件等的所有數(shù)字應(yīng)被理解為在所有情況下由術(shù)語“約”修飾。因此，除非有相反的指示，在以下說明書和所附權(quán)利要求書中提出的數(shù)字參數(shù)是近似的，其可根據(jù)本發(fā)明探尋而獲得的所需特性而變化。至少，并且不試圖限制等同原則適用至權(quán)利要求書的范圍，每個數(shù)字參數(shù)至少應(yīng)該根據(jù)報告的有效數(shù)字的數(shù)目并通過應(yīng)用普通的四舍五入技術(shù)解釋。必要時，提供范圍，并且所述范圍包括其之間的所有子范圍。為了更清楚和簡明地描述和指出本發(fā)明要求的主題，對在以下描述和所附權(quán)利要求書中使用的特定術(shù)語提供了以下定義。如在此所用的，術(shù)語“核苷”指一種糖基胺化合物，其中核酸堿基(核堿基)連接于糖部分?！昂塑账帷敝噶姿岷塑?。核苷酸可使用如表1所述的對應(yīng)于其核苷的字母表字母(字母代號)表示。例如，A表示腺苷(一種包含核堿基腺嘌呤的核苷)，C表示胞苷，G表示鳥苷，U表示尿苷，和T表示胸苷(5-甲基尿苷)。W表示A或者T/U，和S表示G或者C。N表示一種隨機的核苷和dNTP指脫氧核糖核苷三磷酸。N可以是A、C、G或T/U的任何一個。表1：各種核苷酸的字母代號。符號字母由符號字母代表的核苷酸GGAATTCCUURG或AYT/U或CMA或CKG或T/USG或CWA或T/UHA或C或T/UBG或T/U或CVG或C或ADG或A或T/UNG或A或T/U或C如在此所用的，術(shù)語“核苷酸類似物”是指在結(jié)構(gòu)上與天然存在的核苷酸類似的化合物。核苷酸類似物可具有改變的磷酸骨架、糖部分、核堿基，或其組合。核苷酸類似物可以是天然核苷酸、合成核苷酸、修飾的核苷酸，或代用的替換部分(如，肌苷)。一般來說，具有改變的核堿基的核苷酸類似物尤其賦予不同堿基配對和堿基堆積形式。如在此所用的，術(shù)語“LNA(鎖定核酸)核苷酸”指核苷酸類似物，其中核苷酸的糖部分含有鎖定在核糖核酸(RNA)-模擬糖構(gòu)型中的雙環(huán)呋喃糖單位。從脫氧核糖核苷酸(或核糖核苷酸)向LNA核苷酸的結(jié)構(gòu)變化從化學角度來看是有限的，即在2'位和4'位的碳原子之間引入另外的連鍵(如，2'-C,4'-C-氧基亞甲基連鍵；見，例如，Singh,S.K.等,Chem.Comm.,4,455?456,1998，或Koshkin,A.A.等,Tetrahedron,54,3607?3630,1998.))。在LNA核苷酸中的呋喃糖單位的2'和4'位置可經(jīng)O-亞甲基(如，氧基-LNA:2'-O,4'-C-亞甲基-β-D-呋喃核糖基核苷酸)、S-亞甲基(硫代-LNA)，或NH-亞甲基部分(氨基-LNA)等連接。這樣的連鍵限制呋喃糖環(huán)的構(gòu)象自由。LNA寡核苷酸顯示對互補單鏈RNA，和互補單鏈或雙鏈DNA的增強雜交親和性。LNA寡核苷酸可誘導A-型(RNA-樣)雙螺旋構(gòu)象。具有改變的磷酸-糖骨架(如，PNA、LNA)的核苷酸類似物往往尤其修飾鏈特性，例如二級結(jié)構(gòu)形成。在字母代號前的星號(*)符號表示，由字母指定的核苷酸是硫代磷酸酯修飾的核苷酸。例如，*N表示硫代磷酸酯修飾的隨機核苷酸。在字母代號前的加(+)號表示，由字母指定的核苷酸是LNA核苷酸。例如，+A表示腺苷LNA核苷酸，和+N表示鎖定的隨機核苷酸(即，隨機LNA核苷酸)。如在此所用的，術(shù)語“BNA(橋接核酸)核苷酸”(2',4'-BNANC(2'-O,4'-氨基亞乙基橋接核酸)，是包含具有N-O連鍵的6元橋接結(jié)構(gòu)的化合物。這種新核酸類似物可被合成并結(jié)合到寡核苷酸中。當與較早一代的LNA比較時，BNA被發(fā)現(xiàn)具有：對RNA補體的較高的結(jié)合親和力，優(yōu)越的單一-錯配鑒別力，增強的RNA選擇性結(jié)合，更強和更高的序列選擇性三螺旋形成特性，對內(nèi)切核酸酶和外切核酸酶的更強的核酸酶抗性，即，甚至高于S(p)-硫代磷酸酯類似物。如在此所用的，術(shù)語“寡核苷酸”指核苷酸的寡聚物。如在此所用的術(shù)語“核酸”指核苷酸的聚合物。如在此所用的術(shù)語“序列”指寡核苷酸或核酸的核苷酸序列。貫穿整個說明書，每當寡核苷酸或核酸用一系列字母表示時，核苷酸按5′→3′的順序從左至右。例如，由字母序列(W)x(N)y(S)z表示的寡核苷酸，其中x=2，y=3和z=1，表示寡核苷酸序列WWNNNS，其中W是5'末端核苷酸和S是3'末端核苷酸。寡核苷酸或核酸可以是DNA、RNA，或它們的類似物(如，硫代磷酸酯類似物)。寡核苷酸或核酸也可包含修飾的堿基和/或骨架(如，修飾的磷酸連鍵或修飾的糖部分)。賦予核酸穩(wěn)定性和/或其它優(yōu)點的合成骨架的非-限制性實例可包括硫代磷酸酯連鍵、肽核酸、鎖定核酸、木糖核酸，或其類似物。如在此所用的，術(shù)語“引物”指與目標核酸序列(如，要擴增的DNA模板)雜交以引發(fā)核酸合成反應(yīng)的短的線性寡核苷酸。引物可以是RNA寡核苷酸、DNA寡核苷酸，或嵌合序列。引物可含有天然的、合成或修飾的核苷酸。引物長度的上限和下限均憑經(jīng)驗確定。引物長度的下限是在核酸擴增反應(yīng)條件下，在與目標核酸雜交時形成穩(wěn)定的雙螺旋體所需的最小長度。在這樣的雜交條件下，極短的引物(通常少于3個核苷酸長)不與目標核酸形成熱力學穩(wěn)定的雙螺旋體。上限往往通過在目標核酸中并非預定的核酸序列的區(qū)域中具有雙螺旋體形成的可能性確定。一般來說，合適的引物長度是在約3個核苷酸長至約40個核苷酸長的范圍內(nèi)。如在此所用的，術(shù)語“隨機引物”指引物序列的混合物，其通過在寡核苷酸序列的任何給定位置的核苷酸的隨機化來生成，其方式為給定的位置可由任何可能的核苷酸或其類似物組成(完全隨機化)。因此，隨機引物是寡核苷酸序列的隨機混合物，其由序列中核苷酸的每一種可能的組合組成。例如，一種六聚體隨機引物可由序列NNNNNN或(N)6表示。六聚體隨機DNA引物由4種DNA核苷酸，A、C、G和T的每一種可能的六聚體組合組成，導致包含46(4,096)個獨特的六聚體DNA寡核苷酸序列的隨機混合物。當目標核酸的序列未知或為了全基因組擴增反應(yīng)時，隨機引物可有效地用來引發(fā)核酸合成反應(yīng)。如在此所用的，術(shù)語“滾環(huán)擴增(RCA)”指經(jīng)由滾環(huán)機制擴增環(huán)狀核酸模板(如，單鏈DNA環(huán))的核酸擴增反應(yīng)。滾環(huán)擴增反應(yīng)通過引物雜交至環(huán)狀(往往是單鏈)核酸模板而啟動。核酸聚合酶然后延伸引物，所述引物通過圍繞環(huán)狀核酸模板不斷前進，雜交至環(huán)狀核酸模板，以反復地復制核酸模板的序列(滾環(huán)機制)。滾環(huán)擴增通常產(chǎn)生包含環(huán)狀核酸模板序列的串聯(lián)重復單元的連環(huán)體(concatemers)。滾環(huán)擴增可以是線性RCA(LRCA)，顯示出線性擴增動力學(如，使用單一特異性引物的RCA)，或可以是顯示指數(shù)擴增動力學的指數(shù)RCA(ERCA)。滾環(huán)擴增也可使用多個引物(多重引發(fā)的滾環(huán)擴增或MPRCA)進行，導致超支鏈的連環(huán)體。例如，在雙-引發(fā)的RCA中，一個引物可以是(如在線性RCA中)與環(huán)狀核酸模板互補的，而另一個可以是與RCA產(chǎn)物的串聯(lián)重復單元核酸序列互補的。因而，雙-引發(fā)的RCA可作為具有指數(shù)(幾何學)擴增動力學的鏈反應(yīng)進行，其特征為多-雜交、引物-延伸和涉及兩個引物的鏈置換事件的級聯(lián)。這往往生成一組離散的連環(huán)(concatemeric)雙鏈核酸擴增產(chǎn)物。滾環(huán)擴增可在等溫條件下，使用合適的核酸聚合酶例如Phi29DNA聚合酶在體外進行。如在此所用的，術(shù)語“反向PCR”指用來擴增具有僅僅一個已知序列的DNA的聚合酶鏈反應(yīng)的一個變型。常規(guī)PCR的一個限制是它需要與目標DNA兩端互補的引物，而反向PCR允許PCR即使在只有一個序列可從可設(shè)計的引物獲得的情況下進行，雖然它需要環(huán)化的DNA模板或?qū)τ诰€性模板需要具有直接重復的引發(fā)序列。因此，對于環(huán)化的DNA模板，通常在彼此錯誤的方向結(jié)合的引物對(從線性DNA上的共同位點向外擴增，其僅提供線性擴增動力學)按用于指數(shù)擴增動力學的PCR所要求的改為會聚，以產(chǎn)生越過環(huán)化點的擴增產(chǎn)物。如在此所用的，術(shù)語“固體基質(zhì)”指一種允許某些成分通過，而保留其它成分存在于液體中的選擇性屏障(即膜)，通常由纖維素、玻璃或石英纖維/微纖維材料組成。固體基質(zhì)也可包含多孔聚合物，例如多孔膜材料例如聚酯、聚醚砜(PES)、聚酰胺(尼龍)、聚丙烯、聚四氟乙烯(PTFE)、聚碳酸酯、硝酸纖維素、醋酸纖維素、藻酸鹽或氧化鋁。固體基質(zhì)通常具有高的表面:體積比?；|(zhì)可以是有序或者無序的。一些例子包括玻璃纖維、硝化纖維素、石英纖維、903卡、FTA紙和FTA-洗提紙。在一些實施方案中，本發(fā)明提供用于DNA提取，任選的酶促修復，和來自生物來源的片段化DNA的單鏈DNA環(huán)化的方法。因此，本發(fā)明的一個實施方案提供一種從生物樣本生成單鏈DNA環(huán)的方法，該方法包括：(A)用提取劑處理生物樣本以釋放核酸，從而形成樣本混合物；(B)中和提取劑；(C)使釋放的核酸變性以生成單鏈核酸；和(D)使單鏈核酸與連接酶接觸，所述連接酶能夠模板-非依賴性分子內(nèi)連接單鏈DNA序列，以生成單鏈DNA環(huán)，其中在沒有任何中間核酸分離或核酸純化的情況下進行該方法的所有步驟。在某些實施方案中，步驟(A)-(D)在單一反應(yīng)容器(如，微量離心管)中，以順序的方式進行。步驟(B)和(C)可以任一次序執(zhí)行。生物樣本(如，從生物來源獲得的樣本)可以是福爾馬林-固定的組織、固定的單個細胞、血漿、古舊的組織樣本，或其它環(huán)境暴露的生物樣本。例如，生物樣本可從(但不限于)體液(如，血、血漿、血清、尿、乳汁、腦脊液、胸腔積液、淋巴液、淚、痰、唾液、糞便、肺穿刺液、咽喉或生殖器拭子)、器官、組織、細胞培養(yǎng)物、細胞級分、切片(如，器官或組織的切片部分)或從生物受試者或從生物受試者的樣本的特定區(qū)域(如，含有患病細胞的區(qū)域)分離的細胞獲得。生物樣本可具有真核來源、原核來源、病毒來源或噬菌體來源。生物樣本用提取劑處理以釋放核酸，從而形成樣本混合物。將提取劑加入到樣本中以溶解組織/細胞，和/或穩(wěn)定/消化蛋白，為下游反應(yīng)提供可接近的核酸。然后中和提取劑以滅活提取劑，否則其將抑制下游酶促反應(yīng)。在某些實施方案中，提取劑通過加入螯合劑中和。在其它實施方案中，提取劑通過物理條件改變，例如加熱來中和。術(shù)語“提取劑”指的是分解組織或細胞，和穩(wěn)定/消化蛋白的組分，以使核酸可適合用于下游反應(yīng)。術(shù)語“螯合劑”指中和提取劑的作用的組分。例如，如果提取劑包括堿，那么酸可被用來使溶液呈中性。例如，當生物樣本是血漿時，蛋白酶K可被用作提取劑，而蛋白酶K抑制劑被用作中和蛋白酶K的螯合劑。或者，加熱步驟可被用來滅活蛋白酶K。在某些實施方案中，提取劑包括去垢劑，例如SDS。包含環(huán)糊精的螯合劑可被用來中和SDS的作用。來自生物樣本的核酸可以是基因組DNA、線粒體DNA、微生物DNA、病毒DNA或其它DNA來源。DNA可被片段化。來自生物樣本的核酸長度范圍可從15個核苷酸至21,000個核苷酸。由于持續(xù)長度，它通常不大可能環(huán)化具有序列長度少于150bp的dsDNA，環(huán)化dsDNA是極其困難的，直至DNA長于200bp。相反，具有序列長度15個核苷酸(nt)或更多的線性ssDNA分子通過合適的連接酶被極其有效地環(huán)化，只要5'端被磷酸化和3'端被羥基化。對于血漿中的核酸，它們一般為約150-180bp長，因而以如同雙鏈DNA的低得率環(huán)化。在舊FFPE樣本(>20年)中，DNA大部分為60-70nt長的片段。根據(jù)本發(fā)明的某些實施方案的方法特別地適合于分析這樣的生物樣本。來自中和的樣本的核酸在分子內(nèi)連接反應(yīng)之前經(jīng)變性為單鏈形式。這可通過使用任何本領(lǐng)域-公認的用于將dsDNA轉(zhuǎn)化為ssDNA序列的方法實現(xiàn)。例如，dsDNA可經(jīng)熱變性、化學變性，或熱變性和化學變性二種。dsDNA可使用減少dsDNA的熔化溫度的變性劑(如，堿、甘油、乙二醇、甲酰胺，脲或其組合)進行化學變性。變性劑在每10%(vol./vol.)的變性劑加入到反應(yīng)混合物中時，可減少熔化溫度5℃-6℃。變性劑或變性劑的組合(如，10%甘油和6-7%乙二醇)可占反應(yīng)混合物(vol./vol.)的1%、5%、10%、15%、20%，或25%。降低雜交嚴格性的鹽可以低濃度包含在反應(yīng)緩沖液中，以在低溫下使dsDNA化學變性。dsDNA可通過例如，于95℃加熱dsDNA經(jīng)熱變性。在變性步驟后，生成的ssDNA可在模板的不存在下，用能夠分子內(nèi)連接ssDNA底物的DNA或RNA連接酶處理，以形成單鏈DNA環(huán)?？杀挥糜谶B接反應(yīng)的合適的連接酶包括，但不限于，TS2126RNA連接酶、T4DNA連接酶、T3DNA連接酶或大腸桿菌(E.coli)DNA連接酶。在一些實施方案中，ssDNA轉(zhuǎn)化為單鏈DNA環(huán)用熱穩(wěn)定的RNA連接酶進行，所述酶具有有效的用于具有5'磷?；?'羥基的線性ssDNA底物的模板-非依賴性的、分子內(nèi)連接活性。連接酶可以基本上預腺苷化形式存在。例如，源自感染嗜熱細菌，水管致黑棲熱菌(Thermusscotoductus)的棲熱菌屬噬菌體TS2126的TS2126RNA連接酶，可被用于將片段化線性ssDNA經(jīng)模板-非依賴性環(huán)化為環(huán)狀ssDNA。TS2126RNA連接酶是比許多嗜溫性RNA連接酶如T4RNA連接酶更加熱穩(wěn)定的(在至多約75℃是穩(wěn)定的)。對于TS2126RNA連接酶活性的溫度范圍可大于約40℃，例如，從約50℃至約75℃。于此，TS2126RNA連接酶可在較高的溫度下使用，這進一步減少ssDNA的不需要的二級結(jié)構(gòu)。線性ssDNA的環(huán)化也可使用并非TS2126RNA連接酶的連接酶或通過使用具有DNA連接活性的任何其它酶如拓撲異構(gòu)酶實現(xiàn)。在一些實施方案中，片段化的、單鏈DNA分子的環(huán)化通過源自嗜熱古細菌，熱自養(yǎng)甲烷桿菌(Methanobacteriumthermoautotrophicum)的RNA連接酶1(MthRNA連接酶)實現(xiàn)，該酶在環(huán)化線性的、片段化ssDNA分子中具有高度模板-非依賴性連接酶活性。在一些實施方案中，提供一種用于通過TS2126RNA連接酶，提高環(huán)化ssDNA的效率的方法。為連接反應(yīng)使用具有8.0的pH的HEPES緩沖液增加連接效率。當反應(yīng)在TRIS緩沖液(如，對于CircLigaseTMII，EpiCenter提示的10x反應(yīng)緩沖液包含0.33MTRIS-乙酸鹽(pH7.5)、0.66M乙酸鉀，和5mMDTT)中進行時，模板-非依賴性ssDNA連接是無效的。此外，錳(一種用于連接反應(yīng)的重要輔因子)在堿性條件下迅速氧化并在TRIS的存在下形成沉淀。Mn2+在空氣中氧化為Mn3+可由與Mn3+離子強烈絡(luò)合的陰離子促進。例如，當?shù)润w積的具有用HC1適當調(diào)節(jié)的pH的0.2mol/升Tris和2mmol/升MnC12混合時，在pH9.3(單獨的TRIS堿的pH)時，顏色立刻改變；在pH8.5時有一個約3分鐘的初始時間滯后。雖然反應(yīng)在較低的pH下沒有發(fā)生，但在較高pH觀察到的改變未被添加酸逆轉(zhuǎn)。由于錳在TRIS緩沖液中迅速氧化，當分子內(nèi)連接在TRIS緩沖液中進行時，較高濃度的錳對于連接反應(yīng)是重要的(如，加入MnCl2至2.5mM的最終濃度)。此外，當錳濃度隨時間推移的繼續(xù)降低時，精確地預測錳在反應(yīng)中的工作濃度將變得困難。當連接和擴增在單一反應(yīng)容器中進行時，較高濃度的錳可導致在擴增期間聚合酶的較高的錯誤率。在連接反應(yīng)中，通過用HEPES緩沖液替換TRIS緩沖液，有效的分子內(nèi)連接可用少于0.5mM的錳離子濃度實現(xiàn)。除了HEPES，任何其它的Good緩沖液(見，例如，Good,Normanetal.Biochemistry,5(2):467–477,1966；和Good,Normanetal.,MethodsEnzymol.,24:53–68,1972.)可用于分子內(nèi)連接反應(yīng)。在某些實施方案中，在用提取劑處理生物樣本以釋放核酸后，和在中和步驟之前，樣本混合物任選地經(jīng)受在固體基質(zhì)上的干燥步驟。將樣本施加于固體基質(zhì)可通過防止與樣本處理、混合和移液有關(guān)的剪切力，減少生成的核酸的剪切。這可導致更完整的核酸。更完整的核酸可被更有效地修復。例如，如果雙鏈DNA明顯地具有切口，并且溫和的處理防止DNA在切口位點之間分離，DNA連接步驟因而更有效。干燥步驟可增加細胞溶解和蛋白變性效率，從而釋放更大數(shù)量和更易接近的核酸。而且，溫和的溶解和固定化DNA可促進更有效的修復反應(yīng)。另外，干燥也允許樣本以穩(wěn)定的形式暫時貯存，允許關(guān)于工作流時限的更大的靈活性。在某些實施方案中，固體基質(zhì)是玻璃纖維濾器或石英纖維濾器(QMA)。在某些其它實施方案中，固體基質(zhì)是纖維素濾紙，例如FTA紙、FTAElute紙，或Whatman903紙。FTA紙(包括FTA微型卡、FTA指示，和FTA標準)是用核酸提取和穩(wěn)定的化學物質(zhì)(例如弱堿、螯合劑和陰離子表面活性劑)處理的纖維素濾紙，從而支持表面用穩(wěn)定的化學物質(zhì)浸漬。FTAElute在此描述類似的紙，但用離液劑例如硫氰酸胍鎓涂覆。在此Whatman903描述未涂覆的纖維素濾紙。在某些實施方案中，在施用樣本后，核酸提取和穩(wěn)定的化學物質(zhì)可被加入到固體基質(zhì)中。在某些實施方案中，在中和步驟之后，但在變性步驟之前，樣本混合物任選地經(jīng)受修復DNA損傷或除去DNA損壞的步驟。例如，尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)可被用來切除由于胞嘧啶的脫氨基作用可能出現(xiàn)的尿嘧啶堿。甲酰氨基嘧啶[fapy]-DNA糖基化酶(fpg)可被用來除去損傷的嘌呤。脫嘌呤脫嘧啶核酸內(nèi)切酶(APE1和EndoIV)可被用來在脫堿基(abasic)位點和氧化損傷位點切開DNA。DNA聚合酶I可被用來替換在切口位點或在切口位點附近的損傷的堿基，而T4DNA連接酶可被用來連接切口位點。進一步地，可使用T4多核苷酸激酶以生成適于在通常不能環(huán)化的那些片段上連接的DNA末端(使具有5'-OH的DNA末端的磷酸化和使具有3'-磷酸基的DNA末端脫磷酸化)。該方法的主要益處是執(zhí)行每一個連續(xù)的操作，而無將必然導致DNA損失的任何中間純化步驟的能力。該方法允許分析比如果需要純化步驟可能的生物材料更少得多的量的生物材料。因此，該方法能夠從少量的生物樣本例如少數(shù)細胞，或小的感興趣的區(qū)域(ROI)或在其中提取的DNA的量有限，或低質(zhì)量，和其中DNA純化步驟不可行或?qū)е虏粷M意的DNA損失或需要復雜和費時的樣本處理的情況下分析DNA。例如，通過從FFPE組織載玻片選擇小的感興趣的區(qū)域，這種方法將能夠從目標區(qū)域中的特定細胞更可靠地檢測DNA序列變化和結(jié)構(gòu)改變，例如染色體重排。這是有利的，因為小樣本是更純的，因為它在細胞組成可以是異質(zhì)的較大組織樣本中未被稀釋。此外，這種方法可用于載玻片上或者另外收集的固定細胞。例如，分離的循環(huán)腫瘤細胞，或細針抽吸物，其中細胞是離散的和在混合物中，且特別是其中需要DNA擴增用于基因分析。環(huán)化反應(yīng)當用片段化DNA來源進行時具有特別的重要性，因為它允許使用反應(yīng)，例如滾環(huán)擴增和反向PCR進行隨后的擴增和分析。標準的多重置換擴增反應(yīng)在少于大約1000nt的片段化DNA上不能有效地工作，產(chǎn)生具有高水平的序列丟失(尤其是分子的兩端附近)的DNA，此外，產(chǎn)生高度偏倚性擴增。將片段化輸入DNA轉(zhuǎn)化為單鏈環(huán)能夠使DNA擴增通過高度靈敏和有效的滾環(huán)機制進行。因此，根據(jù)本發(fā)明的某些實施方案，環(huán)化的單鏈DNA環(huán)被進一步擴增。擴增可用包含鎖定核酸核苷酸或橋接核酸核苷酸或未修飾的脫氧核糖核酸核苷酸的隨機引物進行。例如，在連接反應(yīng)混合物中的ssDNA環(huán)可在等溫條件下，通過滾環(huán)擴增(RCA)方法擴增。擴增試劑(包括DNA聚合酶、引物和dNTPs)可被加入到相同的反應(yīng)容器中，以產(chǎn)生擴增反應(yīng)混合物并啟動RCA反應(yīng)。擴增反應(yīng)混合物還可包括試劑例如單鏈DNA結(jié)合蛋白和/或合適的擴增反應(yīng)緩沖劑。ssDNA環(huán)的擴增在其中進行連接的相同反應(yīng)容器中進行。在擴增反應(yīng)之前，ssDNA環(huán)的分離或純化和/或連接酶的除去不是必需的。擴增DNA可通過任何目前已知的用于DNA檢測或DNA測序的方法檢測。RCA可通過使用本領(lǐng)域已知的任何DNA聚合酶如Phi29DNA聚合酶或BstDNA聚合酶進行。它可使用隨機引物混合物或通過使用特異性引物進行。在一些實施方案中，隨機引物被用于RCA反應(yīng)。也可使用包含一種或多種核苷酸類似物(如，LNA核苷酸、2-氨基-dA，或2-硫代-dT修飾)的引物序列。在一些實施方案中，耐核酸酶引物(如，包含在適當位置的硫代磷酸基團的引物序列)被用于擴增反應(yīng)(如，NNNN*N*N)。在一些實施方案中，RCA可通過使ssDNA環(huán)與包含隨機引物混合物的引物溶液接觸，以形成核酸模板-引物復合物；使核酸模板-引物復合物與DNA聚合酶和脫氧核糖核苷三磷酸接觸；和擴增核酸模板來進行。在一些實施方案中，引物可具有隨機的3'端，但在5'端具有能夠隨后進一步處理擴增產(chǎn)物的固定序列?；蛘撸谶B接反應(yīng)混合物中的ssDNA環(huán)可通過反向PCR擴增。包括熱穩(wěn)定的DNA聚合酶、引物和dNTPs的擴增試劑可被加入到相同的反應(yīng)容器中，以產(chǎn)生擴增反應(yīng)混合物并啟動PCR反應(yīng)。擴增反應(yīng)混合物可進一步包括試劑，例如單鏈DNA結(jié)合蛋白和/或合適的擴增反應(yīng)緩沖液。ssDNA環(huán)的擴增在進行連接的相同反應(yīng)容器中進行。在擴增反應(yīng)之前，ssDNA環(huán)的分離或純化和/或連接酶的除去不是必需的。擴增的DNA可通過任何目前已知的用于DNA檢測或DNA測序的方法檢測。在某些實施方案中，單鏈DNA環(huán)可首先通過滾環(huán)擴增，隨后通過PCR或反向PCR或PCR和反向PCR在一起的組合來擴增。本發(fā)明的某些實施方案提供從生物學材料檢測DNA的方法，而先前從該生物學材料是不可能檢測到DNA的。在過去，在進行單鏈DNA環(huán)化反應(yīng)之前，在樣本溶解后從其它生物成分純化DNA是必需的。Epicentre(WO2010094040A1)僅提供一種將具有5'-磷酸酯和3'-羥基端的純化的單鏈DNA片段轉(zhuǎn)化為單鏈環(huán)狀分子的優(yōu)化方法。然而，在許多情形下，DNA量是有限的，DNA受到損傷，和/或DNA可能沒有可連接的末端。在這些情形下，純化步驟將導致不可接受的DNA損失并可由于另外的處理而導致DNA的剪切。進一步地，損傷的DNA和具有不相容的末端的DNA將進一步減少可用于分析的DNA的量。例如，使用包括多個純化步驟的方法環(huán)化和擴增有限量的DNA的嘗試(Tate等ForensicScienceInternational:Genetics第6冊,第2期,185-190頁)已經(jīng)失敗，推測是由于DNA損失所致。即使使用粗制的溶胞產(chǎn)物，本發(fā)明的某些實施方案也提供允許DNA修復、單鏈DNA環(huán)化和擴增反應(yīng)有效進行的方法。粗制的溶胞產(chǎn)物含有許多生物學分子例如蛋白、脂質(zhì)、碳水化合物，以及用來提取DNA的化學物質(zhì)。這些分子可能潛在地干擾酶促反應(yīng)。然而單鏈核酸環(huán)成功地生成并使用所述新方法進一步擴增。圖1是根據(jù)本發(fā)明實施方案的工作流程的概圖。如所示的，片段化DNA使用包含SDS和蛋白酶K的緩沖液，直接從未純化的材料提取。然后中和這些化學物質(zhì)，隨后任選修復DNA，變性為單鏈，并使用單鏈連接酶環(huán)化。這些環(huán)狀分子適合于通過RCA或通過分析，使用反向PCR和外向引物擴增。以下是每個步驟的詳細描述：細胞溶解/組織消化–生物樣本，例如FFPE組織樣本、固定的單個細胞、血漿、古舊的組織樣本、環(huán)境暴露樣本，與包含SDS和蛋白酶K的緩沖溶液一起孵育>1小時以分解組織，溶解細胞，并提取DNA。任選地，溶胞產(chǎn)物在FTA紙上干燥，其有助于細胞溶解，保存DNA，并有助于隨后的DNA修復反應(yīng)。蛋白酶K和SDS的滅活–蛋白酶K和SDS對隨后的任選的修復、環(huán)化和DNA擴增反應(yīng)是高度抑制的且在這些步驟之前必須經(jīng)滅活。粗制的溶胞產(chǎn)物/干穿孔(driedpunch)與含有α-環(huán)糊精的溶液一起孵育，以螯合游離的SDS，使得它在下游反應(yīng)中不能抑制/變性酶。滅活蛋白酶K的一個方法是于高溫下加熱，其具有使DNA變性，阻止修復反應(yīng)利用互補序列來填補切口并合成完整的DNA的缺點。滅活蛋白酶K的另一個方法是利用蛋白酶K抑制劑(EMDMillipore，肽序列MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Phe-CH2Cl)，其在室溫下不可逆轉(zhuǎn)地滅活蛋白酶K。任選的DNA修復或DNA損傷去除–如果需要，粗制的DNA溶液在反應(yīng)中與一種或多種以下酶的合劑孵育：切除尿嘧啶堿(其可由于胞嘧啶的脫氨基作用而出現(xiàn))的尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)，在脫堿基位點和氧化損傷位點切開DNA的脫嘌呤脫嘧啶核酸內(nèi)切酶(APE1和EndoIV)，除去損傷的嘌呤的甲酰氨基嘧啶[fapy]-DNA糖基化酶(fpg)，在DNA的5'和3'兩端切除損傷的堿基的DNA聚合酶I，在切口位點或其附近修復DNA的DNA聚合酶I和T4DNA連接酶，以及生成DNA末端的T4多核苷酸激酶，所述DNA末端對在通常不能環(huán)化的那些片段上的連接是相容的(使具有5'-OH的DNA端磷酸化并使具有3'-磷酸基的DNA端脫磷酸化)。DNA環(huán)化–首先，于95℃加熱片段化輸入DNA，以使雙鏈DNA變性為單鏈。其次，加入包含HEPES、乙酸鉀、氯化錳和甜菜堿的緩沖液，并用能夠分子內(nèi)連接單鏈DNA底物以形成單鏈環(huán)的DNA或RNA連接酶處理DNA。單鏈環(huán)可用作隨后擴增和分析的模板。因此，在某些實施方案中，單鏈環(huán)經(jīng)受滾環(huán)擴增。加入擴增試劑以啟動RCA反應(yīng)，生產(chǎn)用于下游分析的高達微克量或更多的全-基因組擴增DNA。在某些其它實施方案中，單鏈環(huán)經(jīng)受反向PCR。在環(huán)狀DNA上的反向PCR將在其中只有單一序列是已知的情況下，提供生成包含斷點的旁側(cè)序列的擴增子的能力。因為DNA被片段化且斷點是隨機的和未知的，標準的PCR經(jīng)常失敗，因為斷點常常將位于所需的擴增子序列內(nèi)。在環(huán)狀DNA上的反向PCR將是成功的，而不管斷點的位置如何，從而提供回收這些擴增子的能力并允許更有效地分析具有隨機斷點的片段化DNA。在一個方面，本發(fā)明提供分析生物樣本的方法。因此，根據(jù)本發(fā)明的某些實施方案，首先生成單鏈DNA環(huán)，接著擴增單鏈DNA環(huán)；并分析擴增的單鏈DNA環(huán)。擴增的核酸可使用任何常規(guī)方法，例如測序、基因分型、比較基因組雜交等分析。在某些實施方案中，擴增的核酸通過全基因組測序分析。在其它實施方案中，擴增的核酸通過擴增的單鏈DNA環(huán)的定向測序分析。在某些實施方案中，通過使用其讀取長度長于初始片段大小(即在環(huán)化前)的DNA測序方法測序，分析擴增的核酸。示例性方法可包括得自PacificBiosciences的納米孔測序和SMRT(單分子實時(SingleMoleculeRealTime))測序技術(shù)。通過這些方法獲得的序列信息借助于冗余測序而為更精確的，以彌補容易出錯的所用方法的質(zhì)量。在另一個方面，本發(fā)明提供一種從生物樣本檢測染色體重排斷點的方法。因此，根據(jù)本發(fā)明的某些實施方案，首先生成單鏈DNA環(huán)，接著擴增單鏈DNA環(huán)；對擴增的單鏈DNA環(huán)測序；并通過比較該序列與已知的參考序列鑒定染色體重排斷點。在一些實施方案中，提供用于分析生物樣本的試劑盒。在一個實施方案中，所述試劑盒包含用于處理生物樣本以釋放核酸的提取劑；用于中和提取劑的試劑；和能夠模板-非依賴性分子內(nèi)連接單鏈DNA序列的連接酶。在一些實施方案中，提取劑包含蛋白酶K或去垢劑。在一些實施方案中，用于中和提取劑的試劑包含蛋白酶K抑制劑或環(huán)糊精。在其它實施方案中，連接酶是TS2126RNA連接酶(CircLigaseII)。在一些實施方案中，試劑盒還包含用于干燥樣本混合物的固體基質(zhì)。在一些實施方案中，試劑盒還包含修復一些類型的DNA損傷的酶。示例性的酶可以是多核苷酸激酶例如T4PNK。所述試劑盒還可包含緩沖劑(如，HEPES)、DNA擴增劑(如，DNA聚合酶、引物、dNTPs)和通過提供的方法用于單鏈DNA環(huán)的生成的其它試劑(如，MnCl2、甜菜堿)。在一些實施方案中，試劑盒可包括Phi29DNA聚合酶和隨機/部分約束的引物。試劑盒可包括用于核酸分析的其它試劑，例如用于對擴增的核酸樣本測序的試劑。試劑盒還可包括從線性DNA生成單鏈DNA環(huán)的用法說明書。實施例實施例1：在中和提取劑的存在下的環(huán)化反應(yīng)中和的組織消化緩沖液通過合并30mMHEPES(pH8.0)、1mMEDTA、0.5%SDS、0.01%吐溫-20，和2mg/ml蛋白酶K的溶液與2.5%α環(huán)糊精和0.25mM蛋白酶K抑制劑(EMDMillipore，肽序列MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Phe-CH2Cl)來制備。將逐漸增加量的這種中和緩沖液加入到含有48mMHEPES(pH8.0)、0.5mMDTT、49.3mMKOAc、2.5mMMnCl2、500mM甜菜堿，和0.5μM磷酸化64-聚體寡核苷酸的30μl環(huán)化反應(yīng)物中。于60℃孵育60min后，使用TBE緩沖液通過10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分析反應(yīng)，用SYBRGold(Invitrogen)染色并使用Typhoon成像儀可視化(圖2(A))。對線性和環(huán)狀物質(zhì)的相對強度定量并作為環(huán)化的寡核苷酸的百分比繪圖(圖2(B))。如在圖2中所示，組織消化緩沖液被中和并測試其對環(huán)化反應(yīng)的影響。即使在6μl組織消化緩沖液的存在下，64-聚體磷酸化寡核苷酸的環(huán)化效率在30μl反應(yīng)物中是相對不受影響的，表明所述組織消化緩沖液已被成功地中和。實施例2：使用高Tm引物的擴增反應(yīng)更耐遺留抑制作用通過在1.2mmFTA穿孔卡上干燥1μl溶胞緩沖液并執(zhí)行中和來制備遺留混合物。這種遺留混合物含有53mMHEPES(pH8.0)、0.18mMEDTA、0.05%SDS、0.07mg/ml蛋白酶K、0.01%吐溫-20、0.8%α-環(huán)糊精、16.7mMNaCl、2.6mMTris(pH7.9)、3.3mMMgCl2、2.2mMDTT、25μMATP、3.3μMdNTPs、2.5mMMnCl2、500mM甜菜堿、0.6mM尿酸，和0.08mM蛋白酶K抑制劑。將逐漸增加量的遺留混合物加入到包含20mMKCl、1ng人基因組DNA，和指定的隨機六聚體的20μl擴增反應(yīng)物中。通過加入少量SYBR綠I(SYBRgreenI)至擴增混合物中，并在Tecan板讀出儀中監(jiān)測熒光隨著時間推移的增加，進行實時擴增。確定熒光達到4000RFU的閾值的時間并作圖。圖3顯示，使用鎖定核酸(LNA)或橋接核酸(BNA)-修飾的隨機六聚體的全-基因組擴增反應(yīng)對遺留抑制劑的存在比使用標準的dN6六聚體進行的反應(yīng)有更大的抗性。而來自環(huán)化反應(yīng)的緩沖液成分的遺留對使用標準的dN6六聚體“NNNN*N*N”的全-基因組擴增反應(yīng)有顯著的負面影響，抑制作用可通過利用LNA或BNA六聚體來減少。AT隨機六聚體具有序列“+N+N(atN)(atN)(atN)*N”，其中+在LNA堿基之前，*表示硫代磷酸酯連鍵，和(atN)表示2-氨基-dA、t-硫代-dT、正常的dC，和正常的dG的隨機混合物。BNA六聚體具有序列“–N-NNN*N*N”，其中“-“表示BNA3堿基(Biosynthesis)。包含LNA或BNA的隨機六聚體的使用允許使用不太純的輸入材料并允許用來自單管溶胞的成分進行擴增反應(yīng)，來自生物樣本的DNA的中和、修復和環(huán)化反應(yīng)，而無需在前的DNA純化。實施例3：直接從人體組織擴增片段化DNA刮去包含固定的SKOV3異種移植組織的脫石蠟切片并于50℃在包含30mMHEPES(pH8.0)、1mMEDTA、0.5%SDS、0.01%吐溫-20，和0.5mg/ml蛋白酶K的溶胞緩沖液中經(jīng)歷消化1小時。將相當于大約1ng片段化DNA的1μl溶胞產(chǎn)物施加于1.2mmFTA穿孔紙中并使之干燥。在5μl中用2.5%α環(huán)糊精和0.25mM蛋白酶K抑制劑(EMDMillipore，肽序列MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Phe-CH2Cl)中和后，組織溶胞產(chǎn)物被直接用來修復和環(huán)化。修復反應(yīng)物(10μl)另外含有50mMNaCl、10mMMgCl2、5mMDTT、75uMATP、10mMdNTPs、NEB酶大腸桿菌(E.coli)聚合酶I(1U)、T4DNA連接酶(40U)、核酸內(nèi)切酶IV(1U)、UDG(0.5U)、APE1(1U)，和T4多核苷酸激酶(0.5U)并于37℃孵育30min，隨后于85℃經(jīng)15min。于95℃加熱修復反應(yīng)物以使DNA變性，然后在冰上快速冷卻。環(huán)化反應(yīng)物(30μl)另外含有48mMHEPES(pH8.0)、0.5mMDTT、49.3mMKOAc、2.5mMMnCl2、500mM甜菜堿。加入120U的CircLigaseII(EpiCentre)，然后將反應(yīng)物于60℃孵育8小時，然后通過于80℃孵育10分鐘滅活酶。滾環(huán)擴增反應(yīng)(60μl)另外含有25mMHEPES(pH8.0)、19mMMgCl2、400μMdNTPs、1mMTCEP、2.5%PEG-8000、40μMAT隨機六聚體，和1.2μgPhi29DNA聚合酶。通過加入少量的SYBR綠I(SYBRgreenI)至擴增混合物中并在Tecan板讀出儀上監(jiān)測隨時間推移的熒光增加(圖4(A))，進行實時擴增。測定熒光達到4000RFU閾值的時間并作圖(圖4(B))。圖4(A)中的上圖對應(yīng)于圖4(B)(K562)中的第一個數(shù)據(jù)點，和圖4(A)中的底圖對應(yīng)于圖4(B)(FFPE加修復和環(huán)化)中的最后的數(shù)據(jù)點。圖4顯示從人體組織直接擴增片段化DNA的實例。消化SKOV3異種移植物組織，中和反應(yīng)，并使相當于大約1ng的片段化DNA的溶胞產(chǎn)物經(jīng)受如所指定的修復和環(huán)化的組合。經(jīng)處理的DNA的全-基因組擴增動力學顯示，經(jīng)歷環(huán)化的反應(yīng)更快速地進行，表明片段化DNA在這些條件下已成功地經(jīng)歷環(huán)化，且擴增反應(yīng)已轉(zhuǎn)換為更快的滾環(huán)機制。實施例4：修復和環(huán)化后改進的序列覆蓋率和SNP檢測于室溫下，將一塊SKOV3異種移植物組織在25%中性-緩沖的福爾馬林中固定10天并純化DNA。使50ng這種片段化DNA經(jīng)受如在圖3中描述的修復和/或環(huán)化，除了修復酶混合物只含有T4多核苷酸激酶、UDG，和0.8UFpg外。實時DNA擴增通過加入少量SYBR綠I(SYBRgreenI)至擴增混合物中并在Tecan板讀出儀上監(jiān)測隨時間推移的熒光增加來進行(圖5A)。純化后，擴增的DNA通過準備條形碼化的IlluminaTruSeqAmpliconCancerPanel文庫并根據(jù)制造商的指示，使用MiSeq測序儀(Illumina)測序來分析。將讀出映射至人基因組DNA參考序列，并對覆蓋率的深度作圖(圖5B)。此外，進行變量分析以確定檢測的SNPs的數(shù)目和在這些位置的覆蓋率深度(圖5B)。在圖5中，來自高度福爾馬林-固定的SKOV3異種移植物組織的DNA經(jīng)歷多-步驟單管擴增方案，包括組織溶解、中和、用如所指明的修復和/或環(huán)化酶處理，接著通過RCA擴增DNA。其中DNA已經(jīng)歷環(huán)化的反應(yīng)的較快擴增動力學表明來自組織溶解步驟的蛋白酶K和SDS的成功的中和以及片段化DNA向環(huán)狀形式的轉(zhuǎn)化。此外，擴增的DNA通過準備IlluminaTruSeqAmpliconCancerPanel文庫并使用MiSeq測序儀(Illumina)測序來分析。結(jié)果證實經(jīng)歷修復和環(huán)化的反應(yīng)的覆蓋率深度顯著地改進。比較未擴增的FFPEDNA序列與參考基因組序列，揭示總共21個單核苷酸多態(tài)現(xiàn)象(SNPs)。對于擴增的DNA，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)更多的這些SNPs被檢測，且當DNA用修復和環(huán)化處理時，在這些位置的平均覆蓋率深度更高。雖然已顯示和描述了本發(fā)明的具體實施方案，對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見的將是，在不背離本發(fā)明的教導的情況下可進行改變和修飾。在前述的說明書和附圖中提出的主題僅僅通過舉例來提供且不作為一種限制。本發(fā)明的實際范圍當以基于現(xiàn)有技術(shù)以適當觀點評述時，意圖在以下的權(quán)利要求書中限定。當前第1頁1 2 3