該發(fā)明涉及一個通過使用三孢布拉霉菌正負菌株混合培養(yǎng)深層發(fā)酵制造β-胡蘿卜素或番茄紅素的簡單而高效的方法，該方法的突出特征是三孢布拉霉菌菌株的生產(chǎn)率高。高生產(chǎn)率是通過正確執(zhí)行本發(fā)明的方法而實現(xiàn)的，執(zhí)行過程中考慮了絲狀生長的半菌株的形態(tài)狀況以及混合菌株時的生長狀態(tài)(也稱為配對)。
背景技術(shù)：
：類胡蘿卜素是天然染料，染色顏色黃色至紅，往往出現(xiàn)在蔬菜中。作為抗氧化劑和維生素A的前體，類胡蘿卜素一直是大量研究的對象。由于其抗氧化性，它們可以預防許多疾病，例如：癌癥、動脈硬化、風濕病或阿爾茨海默氏癥。其中，番茄紅素(出現(xiàn)在例如西紅柿中)具有最大的抗氧化能力，被認為能夠有效對抗特別活性的單線態(tài)氧。工業(yè)上，類胡蘿卜素被當做食品添加劑和著色劑用在人造黃油、油、醬汁、湯和果汁中，也用作動物飼料添加劑。類胡蘿卜素可使用化學和生物技術(shù)制造。通過生物技術(shù)生產(chǎn)的類胡蘿卜素可以很容易具有復雜的結(jié)構(gòu)以及自然出現(xiàn)的構(gòu)象異構(gòu)。生產(chǎn)β-胡蘿卜素的工業(yè)生物技術(shù)工藝以使用鹽生杜氏藻或者三孢布拉霉菌菌株為基礎(chǔ)，其中使用三孢布拉霉菌時進行正負菌株混合發(fā)酵，以達到β-胡蘿卜素的最大產(chǎn)量。在現(xiàn)有技術(shù)水平，通過三孢布拉霉菌發(fā)酵制造β-胡蘿卜素在眾多專利文獻中都有描述，例如在EP1367131A1、WO93/20183A1以及WO02/010429A1中。上述文獻描述的發(fā)酵方法都基于一個原理：正的和負的半菌株共同在生物反應器中接種。WO93/20183A1描述了使用所選變異的三孢布拉霉菌菌株在特定發(fā)酵條件下生產(chǎn)β-胡蘿卜素。WO02/010429A1披露了一種發(fā)酵方法，在發(fā)酵過程中通過定義的pH值調(diào)節(jié)并添加大豆卵磷脂作為培養(yǎng)基，從而提高β-胡蘿卜素相對于其他類胡蘿卜素的生產(chǎn)率。EP1367131A1中描述的發(fā)酵條件規(guī)定了編程化的氧和/或β-紫羅蘭酮添加以及對所使用菌株營養(yǎng)生長階段的控制。US5,422,247A和WO2005/030976A2中揭示了其它的發(fā)酵方法，其中包括對pH值以及必要時對氧分壓的調(diào)節(jié)。在文獻中還描述了使用化學組分用于增產(chǎn)。但這樣的成分可能有毒，另外，它們用于食物或藥物目的時的合法授權(quán)可能有問題。技術(shù)實現(xiàn)要素：因此，本發(fā)明的目的是提供一種生產(chǎn)類胡蘿卜素，特別是β-胡蘿卜素和番茄紅素的有效方法，不需要化學添加劑，但提供良好的產(chǎn)品產(chǎn)率。另外，它還應該成本盡量低，且執(zhí)行簡單、耗費少，并能減少發(fā)酵時間。本發(fā)明的任務是通過使用三孢布拉霉菌正負菌株混合培養(yǎng)深層發(fā)酵制造β-胡蘿卜素或番茄紅素，從中選出類胡蘿卜素并從獲得的生物質(zhì)或從發(fā)酵液油相獲取類胡蘿卜素的方法而完成的，其特征為，首先分別預培養(yǎng)正和負菌株至完全形成形態(tài)，然后將負菌株接種到生物反應器中并在負菌株指數(shù)式增長過程中將正菌株按1:5到1:100的體積比(也稱為配對比)添加到負菌株中以誘導形成類胡蘿卜素，兩種菌株在18℃至24℃下，且無需pH值及氧分壓調(diào)節(jié)地條件下發(fā)酵，必要時直至形成類胡蘿卜素(繁殖期)結(jié)束。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，菌株分別預培養(yǎng)為26℃-30℃，特別優(yōu)選為28℃。單獨預培養(yǎng)負菌株要進行約55小時。約55小時后，負菌株被轉(zhuǎn)移到生物反應器中。生物反應器中負菌株的發(fā)酵同樣優(yōu)選為26℃-30℃，特別優(yōu)選為28℃。生物反應器中負菌株的培養(yǎng)要進行約13到14個小時(營養(yǎng)期)。同樣特別優(yōu)選正負菌株共同發(fā)酵(繁殖期)形成類胡蘿卜素在22℃下進行。根據(jù)本發(fā)明，負半菌株的培養(yǎng)以反應器規(guī)模進行，直至完全形成菌絲(營養(yǎng)期)，然后在負菌株指數(shù)式增長過程中正半菌株會作為誘導措施添加進去。由此可以縮短發(fā)酵過程的時間并節(jié)省成本。此外，在營養(yǎng)期和繁殖期之間生長最佳溫度也從26℃至30℃轉(zhuǎn)換到18℃到24℃。較低的溫度不僅不會抑制半菌株的活性，還能促進產(chǎn)品在發(fā)酵過程中的穩(wěn)定性。本方法中，無需調(diào)節(jié)pH值或氧含量就能成功培養(yǎng)出產(chǎn)品并達到良好的產(chǎn)品產(chǎn)出率。由于無需調(diào)節(jié)pH值，所以無需添加酸或堿，因此節(jié)省了成本。在整個產(chǎn)品形成(繁殖期)過程中放氣速率、轉(zhuǎn)速和溫度保持恒定，這顯然有利于真菌與主要條件匹配。產(chǎn)品形成使用的特征是BDS(生物干燥劑)含量和pH值同時降低。類胡蘿卜素形成的終止標準可以通過pH值明顯增加檢測出來。也就是說，pH值增加0.5到0.8后，類胡蘿卜素形成終止。菌株在錐形瓶中單獨預培養(yǎng)過程中的攪拌速度優(yōu)選為130-156轉(zhuǎn)/分鐘。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地將在生物反應器(營養(yǎng)期)中培養(yǎng)負菌株的攪拌速度調(diào)節(jié)到230-350轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)，特別優(yōu)選244-344轉(zhuǎn)/分鐘。營養(yǎng)期的放氣體積流量優(yōu)選約1vvm(空氣體積/發(fā)酵罐體積/分鐘)。在繁殖期，也就是產(chǎn)品形成的階段，又稱為誘導后正負菌株共同發(fā)酵的階段，攪拌速度和放氣體積流量的條件與營養(yǎng)期一樣。配對比例(以正菌株與負菌株體積比例的方式注明)在本發(fā)明特定實施方案中為1:5到1:20，特別優(yōu)選1:5到1:10。在本發(fā)明方法的繁殖期中，也就是產(chǎn)品形成的階段，又稱為誘導后正負菌株共同發(fā)酵的階段，三孢布拉霉菌使用的的培養(yǎng)基能夠作為培養(yǎng)基或發(fā)酵培養(yǎng)基，特別是那些同時包含碳水化合物和有機氮化合物的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中也可以添加脂類。根據(jù)本發(fā)明，培養(yǎng)基中碳水化合物優(yōu)選淀粉或糖。研究表明，尤其是使用糖含量為10至50g/L的含糖培養(yǎng)基時，獲得良好的類胡蘿卜素產(chǎn)出率。含糖培養(yǎng)基優(yōu)選包括糖蜜、麥芽汁或淀粉工業(yè)的副產(chǎn)品或它們的組合。誘導后正負菌株共同發(fā)酵的階段的培養(yǎng)基優(yōu)選包含脂類的培養(yǎng)基。脂類最好是一種或多種油。而油最好是一種或多種天然油。特別是在培養(yǎng)基中可以使用植物油，優(yōu)選天然植物油。合適的植物油的實例有橄欖油、菜籽油、玉米油和葵花籽油。如果要使用根據(jù)本發(fā)明的方法制造番茄紅素，則優(yōu)選給正負菌株共同發(fā)酵(繁殖期)時的培養(yǎng)基添加一種環(huán)化酶抑制劑，優(yōu)選咪唑和/或咪唑衍生物。根據(jù)本發(fā)明的方法在制造番茄紅素時也允許不添加潛在有毒的化學物質(zhì)，例如環(huán)化酶抑制劑。此時，番茄紅素優(yōu)選從發(fā)酵液的油相中獲得。在本發(fā)明的方法中，可以使用所有已知的和培養(yǎng)集合中獲得的三孢布拉霉菌半菌株，例如DSM2388負菌株和DSM2387正菌株或ATCC14272負菌株和ATCC14271正菌株。在本發(fā)明的實施例中，也可以使用BS01負菌株(在德國不倫瑞克的德國微生物菌種保藏中心(DSMZ)國際保藏單位中保存在編號DSM16755下)和BS01正菌株(同樣保存在該處編號DSM16754下)。在本發(fā)明具體的實施方案中，主要有以下步驟：(1)在錐形瓶中，28℃和145rpm下，正負菌株分別單獨預培養(yǎng)，負菌株培養(yǎng)約55小時，正菌株培養(yǎng)約68小時。(2)在大約55小時后，負菌株轉(zhuǎn)移到反應器中，在28℃、放氣速率大約1vvm和攪拌轉(zhuǎn)速244-344rpm下，發(fā)酵大約13-14小時。(3)添加正菌株后，將培養(yǎng)溫度調(diào)節(jié)到22℃。正菌株和負菌株的體積比為1:9。優(yōu)選地，攪拌轉(zhuǎn)速保持在244-344rpm。(4)不需調(diào)節(jié)pH值。對生物質(zhì)的處理按照專業(yè)人員通常已知的方法進行，例如固體-液體分離或必要時生物質(zhì)顆粒溫和干燥后的固體提取?？傊?，可以確定，本方法僅通過物理參數(shù)控制就能保證布拉菌株的高生產(chǎn)效率，由此根據(jù)本發(fā)明制造的類胡蘿卜素在食品和藥物合法授權(quán)方面會毫無問題，因為根據(jù)本發(fā)明的方法沒有毒性或其他危險物質(zhì)殘留在產(chǎn)品中。使用本發(fā)明的方法，生物干物質(zhì)中類胡蘿卜素的生產(chǎn)量最少達到2％，優(yōu)選能達到4％到6％。使用本發(fā)明的方法，類胡蘿卜素不僅能從得到的生物質(zhì)中獲取，而且也可以或者額外從發(fā)酵液的油相中獲得。我們已經(jīng)知道，在三孢布拉霉菌中在繁殖期時類胡蘿卜素形成的更多，而其中負菌株首先在脂類或油間層儲積。類胡蘿卜素，特別是疏水性β-胡蘿卜素在該細胞內(nèi)油相儲積。發(fā)酵結(jié)束后，類胡蘿卜素可以從得到的生物質(zhì)中獲取，將細胞破碎并將類胡蘿卜素或類胡蘿卜素-油混合物從細胞內(nèi)油相中萃取出來。令人驚奇的是，結(jié)果表明，實施本發(fā)明過程時，大量的類胡蘿卜素由發(fā)酵期間的生物體釋放并作為類胡蘿卜素-油混合物釋放到發(fā)酵液中。由此，使用本發(fā)明的方法借助分離發(fā)酵液油相就能獲得類胡蘿卜素。無需破壞細胞，而且獲取的類胡蘿卜素無需其他流程步驟就能繼續(xù)使用。本發(fā)明提供一種制造類胡蘿卜素的方法，通過使用三孢布拉霉菌正負菌株混合培養(yǎng)深層發(fā)酵獲得β-胡蘿卜素或番茄紅素，從中選出類胡蘿卜素并從發(fā)酵液油相中提取類胡蘿卜素，其突出特征為，首先分別預培養(yǎng)正和負菌株至完全形成形態(tài)，然后將負菌株接種到生物反應器中，并在負菌株指數(shù)式增長過程中將正菌株按1:5到1:100的體積比(也稱為配對比)添加到負菌株中以誘導形成類胡蘿卜素，兩種菌株在18℃至24℃下，均無需調(diào)節(jié)pH值及氧分壓下發(fā)酵，必要時直至形成類胡蘿卜素(繁殖期)階段結(jié)束。接著，將油相從發(fā)酵液中分離，如有必要需要過濾，由此肉眼可見的成分，也就是平均直徑1μm或更大的成分從油相中被清除。這樣可以得到可以應用的含類胡蘿卜素的油，經(jīng)過進一步的提純可以獲得更純的類胡蘿卜素餾分。通過將生物在繁殖期形成的類胡蘿卜素以類胡蘿卜素-油混合物的形式從細胞內(nèi)部釋放出來，在本發(fā)明的方法中，不論發(fā)酵培養(yǎng)基本身是否包含脂類或油，均可以從發(fā)酵液形成的油相中獲取類胡蘿卜素。對于按照本發(fā)明的方法，要從發(fā)酵液獲取類胡蘿卜素，最好是使用包含一種或多種脂類的培養(yǎng)基。脂類最好是一種或多種油。而油最好是一種或多種天然油。特別是可以在培養(yǎng)基中使用植物油，優(yōu)選天然植物油。合適的植物油的實例有橄欖油、菜籽油、玉米油和葵花籽油。與之前從得到的生物質(zhì)中獲取類胡蘿卜素，因此通常采用不連續(xù)設計的方法不同，按照本發(fā)明的方法在從發(fā)酵液油相獲取類胡蘿卜素時也允許連續(xù)的或至少是多周期性的工藝方案。為保證連續(xù)的或多周期性的工藝方案，在誘導后要給發(fā)酵料重新添加培養(yǎng)基，這樣發(fā)酵料中提供的營養(yǎng)成分能允許發(fā)酵料持續(xù)培養(yǎng)。其中，添加發(fā)酵培養(yǎng)基可以進行一次、多次或定期進行。添加發(fā)酵培養(yǎng)基的方式優(yōu)選為保證發(fā)酵料中碳源的濃度不低于菌株死亡的閾值。例如，首次添加發(fā)酵培養(yǎng)基為放入正菌株誘導后20小時到60小時的時間段內(nèi)。添加發(fā)酵培養(yǎng)基可以多次或定期進行。例如，首次添加發(fā)酵培養(yǎng)基在通過放入正菌株誘導后20小時到60小時的時間段內(nèi)，而接下來每一次添加都在前一次添加后24小時到48小時的時間段內(nèi)。各次添加的時間間隔可能或長或短。起決定作用的是，培養(yǎng)基含量不持續(xù)或較長時間的低于導致抑制真菌的濃度。在特定實施方案中，通過一個使用三孢布拉霉菌正負菌株混合培養(yǎng)深層發(fā)酵制造從β-胡蘿卜素或番茄紅素中選出的類胡蘿卜素和從發(fā)酵液油相獲取類胡蘿卜素的符合本發(fā)明的方法的突出特征是以下步驟：(1)在錐形瓶中正負菌株在28℃和145rpm下分別單獨預培養(yǎng)，負菌株培養(yǎng)約55小時，正菌株培養(yǎng)約68小時。(2)在大約55小時后，負菌株轉(zhuǎn)移到反應器中，在28℃、放氣速率大約1vvm和攪拌轉(zhuǎn)速244-344rpm下發(fā)酵大約13-14小時。(3)通過添加正菌株誘導類胡蘿卜素生成后將培養(yǎng)溫度設定為22℃。正菌株和負菌株的體積比為1:9。(4)不需調(diào)節(jié)pH值。(5)添加正菌株后20小時到60小時向發(fā)酵液添加新的發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基可選地含油。(6)可以選擇繼續(xù)給發(fā)酵液添加發(fā)酵培養(yǎng)基，接下來每一次添加都在前一次添加后24小時到48小時的時間段內(nèi)。在期間發(fā)酵最好在不變的條件下持續(xù)進行。(7)從剩余的發(fā)酵液中分離油相(含類胡蘿卜素的)，如有必要需要過濾以獲得含類胡蘿卜素的油或油混合物。在本發(fā)明的方法中，由于環(huán)境條件的改變，例如通過添加發(fā)酵培養(yǎng)基重新或進一步添加營養(yǎng)成分，次級代謝產(chǎn)物如類胡蘿卜素從菌株的微生物油中被排出。該過程類似排毒，保證了菌株繼續(xù)存活。通過從發(fā)酵液中排出細胞內(nèi)的類胡蘿卜素-油混合物，可直接得到發(fā)酵液油相的類胡蘿卜素，無需從生物質(zhì)中昂貴且費時地分離類胡蘿卜素。因此，無需對生物質(zhì)進行機械、熱學、酶或化學處理，可以將類胡蘿卜素作為天然類胡蘿卜素直接以發(fā)酵液油相的形式提取。通過這里建議的方法實施方案，類胡蘿卜素提取可以通過連續(xù)的方法進行，其產(chǎn)率比常規(guī)的方法更高，特別是當不僅能從發(fā)酵液的油相中，而且還另外也可以從生物質(zhì)中得到類胡蘿卜素時。通過多次添加發(fā)酵培養(yǎng)基，在本發(fā)明的方法中可以提高油產(chǎn)物的類胡蘿卜素和葉黃素含量。為了達到持續(xù)或周期性的方法實施方案和盡量多的添加周期，在按照本發(fā)明的方法中，可以給發(fā)酵液一次或多次性添加額外的正或負半菌株并相應地給油繼續(xù)充實類胡蘿卜素。已經(jīng)表明，通過本發(fā)明的方法，特別是在從發(fā)酵液油相獲取類胡蘿卜素時，可以生產(chǎn)類胡蘿卜素含量，特別是天然類胡蘿卜素含量400mg/L或者更多，最好1500mg/l或更多，特別是400到1500mg/L及更多的油或油混合物。已經(jīng)表明，通過本發(fā)明的方法，特別是在從發(fā)酵液油相獲取類胡蘿卜素時，可以生產(chǎn)番茄紅素含量，特別是天然番茄紅素含量2mg/L或者更多，最好2到20mg/L及更多的油或油混合物。因此使用本發(fā)明的方法可以生產(chǎn)不受細胞破碎過程中的流程影響的天然類胡蘿卜素。由此，本發(fā)明也涉及天然類胡蘿卜素或包含天然類胡蘿卜素的油或油混合物，其中天然類胡蘿卜素可以按照本發(fā)明的方法制造。按照本發(fā)明的含類胡蘿卜素的油或油混合物最好具有濃度為400mg/l或更大的天然類胡蘿卜素。按照本發(fā)明的含類胡蘿卜素的油或油混合物最好具有以下特征：β-胡蘿卜素濃度為20至1500mg/L，特別優(yōu)選30至1300mg/L，非常特別優(yōu)選300至1300mg/L。按照本發(fā)明的方法制造的含類胡蘿卜素的油或油混合物，優(yōu)選番茄紅素濃度大于2mg/L，特別優(yōu)選2至20mg/L，非常特別優(yōu)選2至15mg/L。在具體實施方案中，按照本發(fā)明的含類胡蘿卜素的油或油混合物具有至少30mg/L的β-胡蘿卜素以及至少2mg/L的番茄紅素，優(yōu)選至少400mg/L的β-胡蘿卜素以及至少5mg/L番茄紅素。符合本發(fā)明的含類胡蘿卜素的油或油混合物可以例如包含：≥0.25mg/L葉黃素，≥2mg/L的β-隱黃質(zhì)，≥2mg/L番茄紅素，≥3mg/Lγ-胡蘿卜素，≥0.25mg/Lα-胡蘿卜素，和≥30mg/Lβ-胡蘿卜素。例如，含類胡蘿卜素的油或油混合物可以例如包含：0.25-1mg/L葉黃素，2-25g/Lβ-隱黃質(zhì)，2-15g/L番茄紅素，3-35mg/Lγ-胡蘿卜素，0.2-25mg/Lα-胡蘿卜素，和30-1300mg/Lβ-胡蘿卜素。特別，含類胡蘿卜素的油或油混合物可以例如包含：0.28-0.71mg/L葉黃素，2.05-24.9mg/Lβ-隱黃質(zhì)，2.09-14.35mg/L番茄紅素，3.01-31.8mg/Lγ-胡蘿卜素，0.29-24.9mg/Lα-胡蘿卜素，和30.9-1295mg/Lβ-胡蘿卜素。接下來將通過實例更詳細地說明本發(fā)明，但并不限于此。附圖說明圖：圖1至7顯示：圖1：天然葵花籽油HPLC色譜。圖2：3次添加含淀粉培養(yǎng)基(葵花籽油)后含類胡蘿卜素的油的HPLC色譜。圖3：5次添加含淀粉培養(yǎng)基(葵花籽油)后含類胡蘿卜素的油的HPLC色譜。圖4：5次添加含葡萄糖培養(yǎng)基(葵花籽油)后含類胡蘿卜素的油的HPLC色譜。圖5：天然玉米胚芽油HPLC色譜。圖6：一次添加含淀粉培養(yǎng)基(玉米胚芽油)后含類胡蘿卜素的油的HPLC色譜。圖7：5次添加含淀粉培養(yǎng)基(玉米胚芽油)后含類胡蘿卜素的油的HPLC色譜。具體實施方式示例示例1：半菌株DSM2387和DSM2388分別在YPsS固體介質(zhì)(淀粉：15g/L，酵母抽提物：4g/L，硫酸鎂：0.45g/L，磷酸氫二鉀：1.0g/L，瓊脂：20g/L)中培養(yǎng)。產(chǎn)孢應在3日內(nèi)獲得。自培養(yǎng)第3天起，孢子可以用0.2％Span20溶液殺菌漂洗。一個300mL的燒瓶使用200mLYPsS介質(zhì)(淀粉：15g/L，酵母抽提物：4g/L，硫酸鎂：0.45g/L，磷酸氫二鉀：1.0g/L，瓊脂：2g/L，硫胺素：0.002g/L，葵花籽油：30g/L)填充。121℃下蒸汽消毒20分鐘的介質(zhì)在冷卻到室溫后注入2*106個孢子。正負菌株單獨在28℃下分別預培養(yǎng)，負菌株培養(yǎng)55小時，正菌株68小時。搖動頻率為145rpm。給額定容積5L的反應器填充3200mL液體介質(zhì)(YPsS無酵母抽提物)并在121℃下消毒30分鐘。介質(zhì)冷卻后加入消毒的酵母抽提物(360mL)和硫胺素(12mL)。液體介質(zhì)各組分的稱重在3572mL時進行。培養(yǎng)溫度調(diào)節(jié)到28℃后，在反應器中注入200ml的DSM2388培養(yǎng)料。進行培養(yǎng)13小時，以便菌株進入指數(shù)生長期。接著，添加400mL的DSM2387培養(yǎng)料以誘導類胡蘿卜素形成。繁殖期時溫度降低到22℃。36至48小時內(nèi)生物質(zhì)開始強烈染橙色。培養(yǎng)無需控制pH值和pO2值。在300rpm的攪拌器速度下以1VVM連續(xù)加氣。完成培養(yǎng)后進行生物質(zhì)處理(固體-液體分離或必要時生物質(zhì)顆粒溫和干燥后的固體提取)。生物質(zhì)中β-胡蘿卜素的產(chǎn)量為3.2％到6.18％。示例2：半菌株DSM2387和DSM2388分別在YPsS固體介質(zhì)(淀粉：15g/L，酵母抽提物：4g/L，硫酸鎂：0.45g/L，磷酸氫二鉀：1.0g/L，瓊脂：20g/L)中培養(yǎng)。產(chǎn)孢應在3日內(nèi)獲得。自培養(yǎng)第3天起，孢子可以用0.2％Span20溶液殺菌漂洗。一個300mL的燒瓶使用200mLYPsS介質(zhì)(麥芽汁：10g/L，酵母抽提物：4g/L，硫酸鎂：0.45g/L，磷酸氫二鉀：1.0g/L，瓊脂：2g/L，硫胺素：0.002g/L，葵花籽油：30g/L)填充。121℃下蒸汽消毒20分鐘的介質(zhì)在冷卻到室溫后注入2*106個孢子。正負菌株單獨在28℃下分別預培養(yǎng)，負菌株培養(yǎng)55小時，正菌株68小時。搖動頻率為145rpm。給額定容積5L的反應器填充3200mL液體介質(zhì)(麥芽汁：10g/L，硫酸鎂：0.45g/L，磷酸氫二鉀：1.0g/L，瓊脂：2g/L，葵花籽油：30g/L)并在121℃下消毒30分鐘。介質(zhì)冷卻后加入消毒的酵母抽提物(14.292g/360mL)和硫胺素(0.0072g/12mL)。液體介質(zhì)各組分的稱重在3572mL時進行。培養(yǎng)溫度調(diào)節(jié)到28℃后，在反應器中注入200mL的DSM2388培養(yǎng)料。進行培養(yǎng)13小時，以便菌株進入指數(shù)生長期。接著添加400mL的DSM2387培養(yǎng)料以誘導類胡蘿卜素形成。繁殖期時溫度降低到22℃。40至56小時內(nèi)生物質(zhì)開始強烈染橙色。培養(yǎng)無需控制pH值和pO2值。在300rpm的攪拌器速度下以1VVM連續(xù)加氣。完成培養(yǎng)后進行生物質(zhì)處理(固體-液體分離或必要時生物質(zhì)顆粒溫和干燥后的固體提取)。生物質(zhì)中β-胡蘿卜素的產(chǎn)量為1.8％到2.3％。示例3：半菌株ATCC14271和ATCC14272分別在YPsS固體介質(zhì)(淀粉：15g/L，酵母抽提物：4g/L，硫酸鎂：0.45g/L，磷酸氫二鉀：1.0g/L，瓊脂：20g/L)中培養(yǎng)。產(chǎn)孢應在3日內(nèi)獲得。自培養(yǎng)第3天起，孢子可以用0.2％Span20溶液殺菌漂洗。一個300mL的燒瓶使用200mLYPsS介質(zhì)(淀粉：15g/L，酵母抽提物：4g/L，硫酸鎂：0.45g/L，磷酸氫二鉀：1.0g/L，瓊脂：2g/L，硫胺素：0.002g/L，葵花籽油：30g/L)填充。121℃下蒸汽消毒20分鐘的介質(zhì)在冷卻到室溫后注入2*106個孢子。正負菌株單獨在28℃下分別預培養(yǎng)，負菌株培養(yǎng)55小時，正菌株68小時。搖動頻率為145rpm。給額定容積5L的兩個反應器分別填充3200mL液體介質(zhì)(YPsS無酵母抽提物)并在121℃下消毒30分鐘。介質(zhì)冷卻后加入消毒的酵母抽提物(360mL)和硫胺素(12mL)。液體介質(zhì)各組分的稱重在3572mL。將培養(yǎng)溫度調(diào)節(jié)到28℃后，在反應器中注入200mL的ATCC14271培養(yǎng)料和ATCC14272培養(yǎng)料。進行培養(yǎng)14小時，以便菌株進入指數(shù)生長期。在額定容積15L的反應器中預先加入9LYPsS介質(zhì)，消毒，然后注入500mLATCC14272。菌株在14小時后進入指數(shù)增長期。添加1L的ATCC14271培養(yǎng)料，以誘導產(chǎn)品形成。繁殖期時溫度降低到22℃。在接下來50至64小時內(nèi)生物質(zhì)開始強烈染橙色。培養(yǎng)無需控制pH值和pO2值。在300rpm的攪拌器速度下以1VVM連續(xù)加氣。完成培養(yǎng)后進行生物質(zhì)處理(固體-液體分離或必要時生物質(zhì)顆粒溫和干燥后的固體提取)。生物質(zhì)中β-胡蘿卜素的產(chǎn)量為3.8％到4.5％。示例4：半菌株DSM2387和DSM2388分別在YPsS固體介質(zhì)(淀粉：15g/L，酵母抽提物：4g/L，硫酸鎂：0.45g/L，磷酸氫二鉀：1.0g/L，瓊脂：20g/L)中培養(yǎng)。產(chǎn)孢應在3日內(nèi)獲得。自培養(yǎng)第3天起，孢子可以用0.2％Span20溶液殺菌漂洗。一個300mL的燒瓶使用200mLYPsS介質(zhì)(淀粉：15g/L，酵母抽提物：4g/L，硫酸鎂：0.45g/L，磷酸氫二鉀：1.0g/L，瓊脂：2g/L，硫胺素：0.002g/L，葵花籽油：30g/L)填充。121℃下蒸汽消毒20分鐘的介質(zhì)在冷卻到室溫后注入2*106個孢子。正負菌株單獨在28℃下分別預培養(yǎng)，負菌株培養(yǎng)55小時，正菌株68小時。搖動頻率為145rpm。給額定容積5L的反應器填充3200mL液體介質(zhì)(YPsS無酵母抽提物)并在121℃下消毒30分鐘。介質(zhì)冷卻后加入消毒的酵母抽提物(360mL)和硫胺素(12mL)。液體介質(zhì)各組分的稱重在3572mL時進行。培養(yǎng)溫度調(diào)節(jié)到28℃后，在反應器中注入200mL的DSM2388培養(yǎng)料。進行培養(yǎng)13小時，以便菌株進入指數(shù)生長期。接著添加400mL的DSM2387培養(yǎng)料以誘導類胡蘿卜素形成。繁殖期時溫度降低到22℃。36至48小時內(nèi)生物質(zhì)開始強烈染橙色。培養(yǎng)無需控制pH值和pO2值。在300rpm的攪拌器速度下以1VVM連續(xù)加氣。添加正菌株24小時后向發(fā)酵液添加新的發(fā)酵培養(yǎng)基。培養(yǎng)介質(zhì)的添加以12到48小時的時間間隔多次重復進行，以便強化效果。10至48小時內(nèi)，葵花籽油開始強烈染橙到紅色。完成培養(yǎng)后進行生物質(zhì)和油相處理(固體-液體分離或必要時生物質(zhì)顆粒溫和干燥后的固體提取)。生物質(zhì)中β-胡蘿卜素的產(chǎn)量為3％到6％，七次添加新發(fā)酵培養(yǎng)基時，油相中β-胡蘿卜素含量為500-1500mgL-1。示例5：半菌株ATCC14271和ATCC14272分別在YPsS固體介質(zhì)(淀粉：15g/L，酵母抽提物：4g/L，硫酸鎂：0.45g/L，磷酸氫二鉀：1.0g/L，瓊脂：20g/L)中培養(yǎng)。產(chǎn)孢應在3日內(nèi)獲得。自培養(yǎng)第三天起，孢子可以用0.2％Span20溶液殺菌漂洗。一個300mL的燒瓶使用200mLYPsS介質(zhì)(淀粉：15g/L，酵母抽提物：4g/L，硫酸鎂：0.45g/L，磷酸氫二鉀：1.0g/L，瓊脂：2g/L，硫胺素：0.002g/L，玉米胚芽油：30g/L)填充。121℃下蒸汽消毒20分鐘的介質(zhì)在冷卻到室溫后注入2*106個孢子。正負菌株單獨在28℃下分別預培養(yǎng)，負菌株培養(yǎng)55小時，正菌株68小時。搖動頻率為145rpm。給額定容積5L的反應器填充3200mL液體介質(zhì)(YPsS無酵母抽提物)并在121℃下消毒30分鐘。介質(zhì)冷卻后加入消毒的酵母抽提物(360mL)和硫胺素(12mL)。液體介質(zhì)各組分的稱重在3572mL時進行。培養(yǎng)溫度調(diào)節(jié)到28℃后，在反應器中注入200mL的DSM2388培養(yǎng)料。進行培養(yǎng)13小時，以便菌株進入指數(shù)生長期。接著添加400mL的DSM2387培養(yǎng)料以誘導類胡蘿卜素形成。繁殖期時溫度降低到22℃，36至48小時內(nèi)生物質(zhì)開始強烈染橙色。培養(yǎng)無需控制pH值和pO2值。在300rpm的攪拌器速度下以1VVM連續(xù)加氣。添加正菌株30小時后向發(fā)酵液添加新的發(fā)酵培養(yǎng)基。培養(yǎng)介質(zhì)的添加以12到48小時的時間間隔多次重復進行，以便強化效果。10至48小時內(nèi)葵花籽油開始強烈染橙到紅色。完成培養(yǎng)后進行生物質(zhì)和油相處理(固體-液體分離或必要時生物質(zhì)顆粒溫和干燥后的固體提取)。生物質(zhì)中β-胡蘿卜素的產(chǎn)量為3％到6％，4次添加新發(fā)酵培養(yǎng)基時，油相中β-胡蘿卜素含量為400-600mgL-1。示例6：要確定油在類胡蘿卜素和葉黃素方面的構(gòu)成，對示例4和5中含類胡蘿卜素的油進行HPLC分析(表1)。表1:HPLC法HPLC：泵：MerckHitachiL-6200A自動取樣器：MerckHitachiAS-4000AUV-VIS探測器：MerckHitachiL-4250接口：AgilentInterface35900E軟件：OpenLAB為了確定本發(fā)明的油中的類胡蘿卜素和葉黃素的濃度，制造了現(xiàn)有標準的菌株溶液(表2)。為此，溶解定量的油或丙酮(CarlRoth有限公司和兩合公司)并存放到棕色瓶中。在HPLC分析之前過濾菌株溶液，以保證溶液無顆粒。根據(jù)算出的校準線(濃度比面積)可以從含類胡蘿卜素的油的峰面積推算出濃度。表2：標準標準供貨商菌株溶液[mgL-1]玉米黃素SigmaAldrich葉黃素SigmaAldrich45β-隱黃質(zhì)SigmaAldrich12.8番茄紅素VWR20γ-胡蘿卜素CaroteNature10α-胡蘿卜素SigmaAldrich20β-胡蘿卜素SigmaAldrich130為了分析含類胡蘿卜素的油，通過傾析分離出仍然含部分發(fā)酵液和生物質(zhì)的油。通過對3044g試樣5分鐘的離心分離，能夠明確分離出生物質(zhì)、發(fā)酵液和油相。為了進行HPLC測定，油試樣被分離過濾(孔徑0.45pm；PTFE注射過濾器；CarlRoth有限公司及兩合公司)，以保證試樣無顆粒。這種方法特別適合實驗室規(guī)模，為了從技術(shù)上實現(xiàn)，使用分離器和離心機進行液體-液體分離。研究的油的譜顯示在圖1到7中。其中圖1顯示天然葵花籽油的HPLC色譜；圖2顯示按照示例4在3次添加含淀粉培養(yǎng)基(葵花籽油)后含類胡蘿卜素油的HPLC色譜；圖3顯示按照示例4在5次添加含淀粉培養(yǎng)基(葵花籽油)后含類胡蘿卜素油的HPLC色譜；圖4顯示按照示例4在5次添加含葡萄糖培養(yǎng)基(葵花籽油)后含類胡蘿卜素油的HPLC色譜；圖5顯示玉米胚芽油的HPLC色譜；圖6顯示按照示例5在添加含淀粉培養(yǎng)基(玉米胚芽油)后含類胡蘿卜素油的HPLC色譜；而圖7顯示按照示例5在5次添加含淀粉培養(yǎng)基(玉米胚芽油)后含類胡蘿卜素油的HPLC色譜。為了能精確定量類胡蘿卜素和葉黃素，第一步確定所使用油的組成。從含類胡蘿卜素油試樣的峰面積中減去計算出的峰面積。由此得出的重要峰值檢測為葉黃素、β-隱黃質(zhì)、番茄紅素以及α、β和γ-胡蘿卜素(表3)。表3：通過HPLC測定的不同培養(yǎng)條件下含量的最小和最大值，單位：mgL-1。其中最小和最大值表示所有含類胡蘿卜素的油試樣的相應最小和最大值。當反應器規(guī)模為8次添加后，β-胡蘿卜素含量能夠達到1295mgL-1。在搖瓶試驗中，在4到5次添加后，β-胡蘿卜素含量的最大值約為700mgL-1。油相中的類胡蘿卜素含量取決于制造方法與策略。一到兩次添加后，例如β-胡蘿卜素的含量約為50-100mgL-1。通過重復添加含淀粉、糖漿或葡萄糖的介質(zhì)，可以增加油中的β-胡蘿卜素含量，在四到五次添加后，會增加至約500-800mgL-1，在次添加時會增加到1000mgL-1以上。當前試驗，添加的時間間隔為20到50小時，但該時間間隔也可以更短或更長。類胡蘿卜素和葉黃素含量主要取決于添加次數(shù)、使用的油和培養(yǎng)基。類胡蘿卜素的主要部分包含大約80-97％的β-胡蘿卜素，檢測出的其他類胡蘿卜素取決于使用的培養(yǎng)基、使用的油以及添加的次數(shù)。特別是，添加的次數(shù)降低了其他類胡蘿卜素的比例，從而也提高了β-胡蘿卜素的百分比，其中合成過程也可以改變含類胡蘿卜素油的含量。當前第1頁1 2 3