本發(fā)明涉及細胞培養(yǎng)領域，特別涉及一種NK細胞培養(yǎng)基及NK細胞的培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
：自然殺傷細胞(naturalkillercell，NK)是機體重要的免疫細胞，不僅與抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調(diào)節(jié)有關(guān)，而且在某些情況下參與超敏反應和自身免疫性疾病的發(fā)生，其發(fā)育成熟依賴于骨髓和胸腺微環(huán)境。NK細胞的功能主要是通過一下方式實現(xiàn)的。NK細胞自然殺傷活性：NK細胞識別靶細胞(某些腫瘤細胞、病毒感染細胞、某些自身組織細胞、寄生蟲等)，接著NK細胞釋放穿孔素，細胞毒因子，活化的NK細胞釋放TNF因子，從而達到裂解和殺傷靶細胞的可能。NK細胞毒作用(ADCC效應)，主要是NK細胞表面具有FcγRⅢA，主要結(jié)合人IgG1和IgG3的Fc段(Cγ2、Cγ3功能區(qū))，在針對靶細胞特異性IgG抗體的介導下可殺傷相應靶細胞?；罨腘K細胞可合成和分泌多種細胞因子，發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫和造血作用以及直接殺傷靶細胞的作用。NK細胞通過自然殺傷和ADCC發(fā)揮的細胞毒作用，在機體抗病毒感染、免疫監(jiān)視中起重要作用。因此，現(xiàn)有技術(shù)中為了能夠獲取更多數(shù)量的NK細胞，所以研究人員通過體外培養(yǎng)的方式來進行大規(guī)模的繁殖，但是，由于體外環(huán)境與人體內(nèi)的環(huán)境不完全相同，所以導致NK細胞的免疫活性并不是很高。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種有利于提高NK細胞的免疫活性的NK細胞培養(yǎng)基及NK細胞的培養(yǎng)方法。本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案得以實現(xiàn)的：一種NK細胞培養(yǎng)基，按重量份數(shù)計，包括無血清基礎培養(yǎng)基94～98份、血漿7～10份、抗CD3單克隆抗體0.6～1.6份、類胰島素一號增長因子2～4份、PBS緩沖液20～30份、烏賊墨1～4份、紅花多糖2～6份、大蒜素2.5～4.5份、苜蓿多糖1～3份、桂皮醛2～4份。作為優(yōu)選，按重量份數(shù)計，包括無血清基礎培養(yǎng)基96份、血漿8.5份、抗CD3單克隆抗體1份、類胰島素一號增長因子3份、PBS緩沖液25份、烏賊墨2.5份、紅花多糖4份、大蒜素3.5份、苜蓿多糖2份、桂皮醛3份。由于無血清基礎培養(yǎng)基、血漿、抗CD3單克隆抗體、類胰島素一號增長因子共同組成為了NK細胞生存所需的人體骨髓的環(huán)境。由于烏賊墨內(nèi)還有IL-2,而在NK細胞表面有IL-2親和性受體，IL-2可誘導NK細胞的活化和分化，從而有利于提高NK細胞的增殖效率，并活化后的NK細胞能夠合成和分泌多種細胞因子，進而直接抑制腫瘤細胞分化增殖。同時，在烏賊墨中還存在大量的抗腫瘤的肽聚糖，分別是：SIPG02-A、SIPG02-B、SIPG02-C，他們在NK細胞培養(yǎng)的過程中就會很自然的依附在NK細胞的表面，這樣在利用NK細胞抑制腫瘤細胞的時候，抗腫瘤的肽聚糖也能夠進一步協(xié)助NK細胞提高免疫能力。再者，NK細胞培養(yǎng)基內(nèi)部還含有大量的氨基酸和金屬元素，而這些又是NK細胞分化和增殖的過程中所不可或缺的物質(zhì)，從而進一步提高了NK細胞的活化性能。再者，桂皮醛和紅花多糖在NK細胞培養(yǎng)的過程中能夠促進細胞因子分泌，從而進一步提高了NK細胞殺傷活性。另外，苜蓿多糖可以顯著地增強NK細胞對K562靶細胞的殺傷活性，而大蒜素能夠改變NK細胞S+G2/M1周期比例，同時，其可以促進NK細胞分泌IFN-γ，而IFN-γ又大大提高了NK細胞的殺傷性能。作為優(yōu)選，所述無血清基礎培養(yǎng)基為LonzaX-VIVO15無血清細胞培養(yǎng)基。LonzaX-VIVO15無血清細胞培養(yǎng)基是由美國Lonza公司生產(chǎn)的，其一般保存在2～8℃，同時，其化學成份明確，不含任何外源生長因子、人造細胞增殖刺激因子或不明成分的添加劑；尤其適用于活化的人和鼠淋巴細胞第二信號系統(tǒng)的研究；另外，X-VIVO15TM經(jīng)過優(yōu)化使之適合于無血清條件下腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）的增殖，其配方有助于外周血及人類腫瘤中分離純化的CD3+細胞的增殖。同時還用于維持人類單核細胞、巨噬細胞及細胞系、細胞和自然殺傷細胞（NK）的生長。作為優(yōu)選，所述烏賊墨經(jīng)過黑色素代謝酶處理。通過黑色素代寫酶的處理之后，烏賊墨中的黑色素就可以很好地被除去，從而在保證NK細胞正常分化增殖的情況下，又可以減少黑色素對NK細胞培養(yǎng)過程中的干擾。一種NK細胞的培養(yǎng)方法，包括以下步驟：S1、采集健康人的外周血，并用稀釋液對外周血進行稀釋，獲得稀釋血；S2、向離心管一中加入Ficoll，沿傾斜的管壁緩慢加入稀釋血；S3、將離心管一放入到18℃的恒溫室中進行離心30min～45min；S4、用吸管輕輕吸取S3的離心管一中的PBMC層移入到離心管二中；S5、向離心管二中加入足量稀釋液進行洗滌，并離心5min～7min后去除上清液，獲得潔凈的PBMC細胞；S6、將PBMC細胞進行磁珠分選，獲得NK細胞；S7、將獲得的NK細胞轉(zhuǎn)移到上述NK細胞培養(yǎng)基中，并將NK細胞培養(yǎng)液放置在培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。作為優(yōu)選，S1中外周血與稀釋液的體積比為1：2～3。作為優(yōu)選，S2中的Ficol與稀釋血的體積比為1:2～4。作為優(yōu)選，S3和S5的離心轉(zhuǎn)速為1500r/min～1800r/min。在該種離心轉(zhuǎn)速的離心下能夠快速地將所需要的細胞分離出來，從而大大提高了NK細胞提取的效率，并且在這個過程中又不容易造成NK細胞的破損。作為優(yōu)選，S7中培養(yǎng)箱的溫度為2～8℃，且其的二氧化碳的濃度為5～6%。作為優(yōu)選，S7中NK細胞的培養(yǎng)時間為13～15天。綜上所述，本發(fā)明具有以下有益效果：1.無血清基礎培養(yǎng)基、血漿、抗CD3單克隆抗體、類胰島素一號增長因子共同組成了NK細胞生存所需的人體骨髓的環(huán)境。2.烏賊墨、紅花多糖、大蒜素、苜蓿多糖和桂皮醛均有利于提高NK細胞的活性，從而增強了NK細胞的殺傷性；3.使用由黑色素代謝酶處理過的烏賊墨可以有效的降低黑色素對NK細胞培養(yǎng)過程中所造成的干擾。附圖說明圖1是NK細胞的培養(yǎng)流程圖。具體實施方式以下結(jié)合附圖1對本發(fā)明作進一步詳細說明。實施例一：NK細胞培養(yǎng)基:無血清基礎培養(yǎng)基94g、血漿7g、抗CD3單克隆抗體0.6g、類胰島素一號增長因子2g、PBS緩沖液20g、烏賊墨1g、紅花多糖2g、大蒜素2.5g、苜蓿多糖1g和桂皮醛2g；NK細胞的培養(yǎng)：S1、采集健康人的10ml外周血，并用20ml稀釋液對外周血進行稀釋，獲得稀釋血；S2、向離心管一中加入10mlFicoll，并沿傾斜的管壁緩慢加入稀釋血；S3、將離心管一放入到18℃的恒溫室中以1500r/min轉(zhuǎn)速進行離心30min；S4、用吸管輕輕吸取S3的離心管一中的PBMC層移入到離心管二中；S5、向離心管二中加入足量稀釋液進行洗滌，并以1500r/min離心5min后去除上清液，獲得潔凈的PBMC細胞；S6、將PBMC細胞進行磁珠分選，獲得NK細胞；S7、將獲得的NK細胞轉(zhuǎn)移到上述NK細胞培養(yǎng)基中，并將NK細胞培養(yǎng)液放置在溫度為2～8℃，且二氧化碳的濃度為5%的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)13天。實施例二：NK細胞培養(yǎng)基:無血清基礎培養(yǎng)基98g、血漿10g、抗CD3單克隆抗體1.6g、類胰島素一號增長因子4g、PBS緩沖液30g、烏賊墨4g、紅花多糖6g、大蒜素4.5g、苜蓿多糖3g和桂皮醛4g；NK細胞的培養(yǎng)：S1、采集健康人的10ml外周血，并用30ml稀釋液對外周血進行稀釋，獲得稀釋血；S2、向離心管一中加入7.5mlFicoll，并沿傾斜的管壁緩慢加入稀釋血；S3、將離心管一放入到18℃的恒溫室中以1800r/min轉(zhuǎn)速進行離心45min；S4、用吸管輕輕吸取S3的離心管一中的PBMC層移入到離心管二中；S5、向離心管二中加入足量稀釋液進行洗滌，并以1800r/min離心7min后去除上清液，獲得潔凈的PBMC細胞；S6、將PBMC細胞進行磁珠分選，獲得NK細胞；S7、將獲得的NK細胞轉(zhuǎn)移到上述NK細胞培養(yǎng)基中，并將NK細胞培養(yǎng)液放置在溫度為2～8℃，且二氧化碳的濃度為6%的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)15天。實施例三：NK細胞培養(yǎng)基:無血清基礎培養(yǎng)基96g、血漿8.5g、抗CD3單克隆抗體1g、類胰島素一號增長因子3g、PBS緩沖液25g、烏賊墨2.5g、紅花多糖4g、大蒜素3.5g、苜蓿多糖2g和桂皮醛3g；NK細胞的培養(yǎng)：S1、采集健康人的10ml外周血，并用15ml稀釋液對外周血進行稀釋，獲得稀釋血；S2、向離心管一中加入5mlFicoll，并沿傾斜的管壁緩慢加入稀釋血；S3、將離心管一放入到18℃的恒溫室中以1670r/min轉(zhuǎn)速進行離心37min；S4、用吸管輕輕吸取S3的離心管一中的PBMC層移入到離心管二中；S5、向離心管二中加入足量稀釋液進行洗滌，并以1650r/min離心6min后去除上清液，獲得潔凈的PBMC細胞；S6、將PBMC細胞進行磁珠分選，獲得NK細胞；S7、將獲得的NK細胞轉(zhuǎn)移到上述NK細胞培養(yǎng)基中，并將NK細胞培養(yǎng)液放置在溫度為2～8℃，且二氧化碳的濃度為5.5%的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)14天。實施例四：NK細胞培養(yǎng)基:無血清基礎培養(yǎng)基98g、血漿8.5g、抗CD3單克隆抗體1.6g、類胰島素一號增長因子3g、PBS緩沖液25g、烏賊墨4g、紅花多糖4g、大蒜素4.5g、苜蓿多糖1g和桂皮醛2g；NK細胞的培養(yǎng)：S1、采集健康人的10ml外周血，并用20ml稀釋液對外周血進行稀釋，獲得稀釋血；S2、向離心管一中加入6.7mlFicoll，并沿傾斜的管壁緩慢加入稀釋血；S3、將離心管一放入到18℃的恒溫室中以1670r/min轉(zhuǎn)速進行離心30min；S4、用吸管輕輕吸取S3的離心管一中的PBMC層移入到離心管二中；S5、向離心管二中加入足量稀釋液進行洗滌，并以1800r/min離心6min后去除上清液，獲得潔凈的PBMC細胞；S6、將PBMC細胞進行磁珠分選，獲得NK細胞；S7、將獲得的NK細胞轉(zhuǎn)移到上述NK細胞培養(yǎng)基中，并將NK細胞培養(yǎng)液放置在溫度為2～8℃，且二氧化碳的濃度為5%的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)14天。將實施例一至實施例四所獲得的帶有NK細胞的NK細胞培養(yǎng)基，加入到含有等量人體的腫瘤細胞的培養(yǎng)基中，并放置在37℃的環(huán)境下，培養(yǎng)6h，并每2h對含有人體的腫瘤細胞的培養(yǎng)基進行檢測，得到如下腫瘤細胞凋亡率的數(shù)據(jù)：時間/h0246實施例一0%45%82%95%實施例二0%52%89%98%實施例三0%47%8497%實施例四0%48%86%96%所以，本發(fā)明的實施例一至實施例四所培養(yǎng)出來的NK細胞具有很強的免疫活性，對腫瘤細胞具有很強的殺傷能力，適合用于各類腫瘤疾病的治療。本具體實施例僅僅是對本發(fā)明的解釋，其并不是對本發(fā)明的限制，本領域技術(shù)人員在閱讀完本說明書后可以根據(jù)需要對本實施例做出沒有創(chuàng)造性貢獻的修改，但只要在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍內(nèi)都受到專利法的保護。當前第1頁1 2 3