本發(fā)明屬于分子生物學
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種T1R3基因過表達慢病毒載體、T1R3慢病毒及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
：味覺功能學研究表明，甜味主要由味覺細胞的G蛋白偶聯(lián)受體(Gproteincoupledreceptors，GPCRs)家族所介導(dǎo)，即味覺受體第1家族(tastereceptorfamily1members，T1Rs)。其中T1R2和T1R3是甜味受體，它們以T1R2+T1R3異二聚體的形式發(fā)揮作用，共同對甜味進行識別。甜味受體在結(jié)合配體后，下游G蛋白被激活，其α亞基與β、γ亞基分離，Gα亞基進入胞漿進而激活下游效應(yīng)器，最終導(dǎo)致細胞內(nèi)鈣離子濃度升高。因此，通過構(gòu)建共表達T1R2、T1R3和Gα基因的細胞系，可用鈣流檢測方法對甜味物質(zhì)進行識別。構(gòu)建共表達人T1R2、T1R3和Gα基因的細胞系，需要使用到帶有人T1R3基因的過表達載體。現(xiàn)有的方法采用的是將整合有T1R3基因的質(zhì)粒載體通過脂質(zhì)體對宿主細胞進行轉(zhuǎn)染，但是脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染質(zhì)粒載體的轉(zhuǎn)染效率較低，要構(gòu)建能穩(wěn)定共表達T1R2、T1R3和Gα三種基因的細胞系成功率也較低。因此，如何提高T1R3基因過表達載體的轉(zhuǎn)染效率是目前亟需解決的問題。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種T1R3基因過表達慢病毒載體、T1R3慢病毒及其構(gòu)建方法，該方法所構(gòu)建的慢病毒載體，轉(zhuǎn)染效率高，并能將T1R3基因整合到宿主細胞的基因組中，因此能特異、持續(xù)、高效地促進T1R3基因在宿主細胞中的穩(wěn)定表達。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：一種T1R3基因過表達慢病毒載體，以慢病毒pLVX-Puro慢病毒表達載體為基礎(chǔ)進行構(gòu)建，并整合有T1R3基因，得到T1R3基因過表達慢病毒載體pLVX-Puro-T1R3。本發(fā)明還提供pLVX-Puro-T1R3慢病毒表達載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟：步驟(1)，人工合成T1R3基因；步驟(2)，以下列PCR擴增引物進行T1R3基因的PCR擴增：所述的PCR擴增引物為：T1R3-F：agattctagagctagcaccaccatggatgctgggccctgctg；T1R3-R：agatccttgcggccgctcactcatgtttcccctg；步驟(3)，用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI分別對T1R3基因的PCR產(chǎn)物和慢病毒載體pLVX-Puro進行雙酶切；步驟(4)，用T4DNA連接酶將酶切的得到的線性化的T1R3基因和慢病毒載體連接，將得到的連接液轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，并進行PCR鑒定，對PCR鑒定陽性的克隆進行測序和比對，比對正確的克隆即為構(gòu)建成功的T1R3基因過表達慢病毒載體pLVX-Puro-T1R3；其中，步驟(4)PCR鑒定采用的PCR擴增引物與步驟(2)所采用的PCR擴增引物相同。步驟(4)測序所用引物為：CMV-F：cgcaaatgggcggtaggcgtg；PGK：cattctgcacgcttcaaaag；T1R3seq1：accttcccctccttcttc；T1R3seq2：ctctgtctacgcagctgtg。本發(fā)明另外提供一種T1R3慢病毒的構(gòu)建方法，采用上述T1R3基因過表達慢病毒載體，方法是：使用慢病毒包裝質(zhì)粒pRSV-Rev、pMDlg-pRRE和pMD2.G對T1R3基因過表達慢病毒載體pLVX-Puro-T1R3進行包裝。，通過轉(zhuǎn)染HEK293細胞，得到T1R3慢病毒。本發(fā)明還要求保護上述T1R3慢病毒的構(gòu)建方法構(gòu)建得到的T1R3慢病毒。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其有益效果為：本發(fā)明所構(gòu)建的T1R3基因過表達慢病毒載體對宿主細胞的轉(zhuǎn)染效率高達80％～90％，比起現(xiàn)有的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染效率提高了1倍以上。此外由于慢病毒能將T1R3基因整合到宿主細胞的基因組中，因此使用該方法能特異、持續(xù)、高效地促進基因T1R3在宿主細胞中的穩(wěn)定表達。過表達T1R3基因的細胞可用于構(gòu)建共表達T1R2、T1R3和Gα基因的細胞系，可用鈣流檢測方法對甜味物質(zhì)進行識別。附圖說明圖1是pLVX-Puro慢病毒表達載體圖譜；圖2是pRSV-Rev慢病毒包裝質(zhì)粒圖譜；圖3是pMDlg-pRRE慢病毒包裝質(zhì)粒圖譜；圖4是pMD2.G慢病毒包裝質(zhì)粒圖譜。具體實施方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的詳細描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。主要實驗試劑及廠家：大腸桿菌菌株DH5α(Invitrogen)胎牛血清FBS(Invitrogen)胰蛋白酶(Invitrogen)DMEM完全培養(yǎng)基(含10％FBS、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素)(Invitrogen)限制性內(nèi)切酶(Fermentas)T4DNA連接酶(NEB公司)質(zhì)粒DNA提取試劑盒(Axygen公司)制備感受態(tài)試劑盒(BIOSCIENCES)PrimeSTARMaxPremix(2X)(Takara)逆轉(zhuǎn)錄酶MuLV(NEB)RNAnase抑制劑(NEB)SYBRGreenqPCRMasterMix(2X)(ThermoScientific)pLVX-Puro、pRSV-Rev、pMDlg-pRRE和pMD2.G，均可商購于上海比昂生物醫(yī)藥科技有限公司。實施例1：T1R3基因過表達慢病毒載體構(gòu)建。1、人工合成T1R3基因，其DNA如SEQIDNO.1所示。2、使用PrimeSTAR高保真酶，以人工合成的T1R3基因為模板，通過如表1所示引物進行的PCR擴增：表1PCR反應(yīng)體系與條件如表2：表2試劑體積模板1μL上游引物T1R3-F(10μM)1μL下游引物T1R3-R(10μM)1μLPrimeSTARMax(2x)10μLddH2O7μL總體積20μLPCR程序如表3：表33、瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物大小是否與預(yù)期一致，切割在瓊脂糖凝膠電泳膠中的目的片段條帶，用DNA回收試劑盒回收純化；4、用EcoRI和BamHI限制性內(nèi)切酶分別對T1R3基因的PCR產(chǎn)物和慢病毒表達載體pLVX-Puro進行雙酶切(于37℃酶切3h)，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如表4：表45、瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切效果，切割在瓊脂糖凝膠電泳膠中的T1R3基因片段條帶和線性化的慢病毒載體，用膠回收試劑盒回收DNA；6、用T4DNA連接酶于16℃水浴下，將兩種酶切產(chǎn)物進行連接，過夜。反應(yīng)如表5：表5試劑體積10XT4DNA連接酶buffer2μLT4DNA連接酶(400U/μL)1μLT1R3基因片段10μL線性化的慢病毒表達載體4μLddH2O3μL總體積20μL7、轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞：從-80℃冰箱取出1管100μLDH5α感受態(tài)細胞，放冰上解凍(解凍至無冰狀態(tài))后取10μL上述步驟6中的連接產(chǎn)物加到感受態(tài)細胞中混勻，靜置30min，42℃水浴熱激1min，冰上靜置2min。加LB液體培養(yǎng)基500μL，37℃振蕩培養(yǎng)1小時。3000rpm離心5min，留100μl左右上清液混勻細菌后涂到LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。8、挑取數(shù)個菌落，做菌落PCR檢測轉(zhuǎn)化子，反應(yīng)體系和條件見步驟2；9、將菌落PCR鑒定得到的陽性克隆進行測序驗證，測序引物如表6：表6引物序列引物序列(5’-3’)SEQIDNO.CMV-Fcgcaaatgggcggtaggcgtg4PGKcattctgcacgcttcaaaag5T1R3seq1accttcccctccttcttc6T1R3seq2ctctgtctacgcagctgtg7實施例2：T1R3慢病毒包裝1、用胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的HEK293細胞，細胞密度為5×106時；重新接種于含有25mL含10％(v/v)FBS的無抗生素DMEM培養(yǎng)基直徑為15cm的細胞培養(yǎng)皿中，37℃，50mL/LCO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；2、制備慢病毒包裝系統(tǒng)中四種質(zhì)粒DNA溶液：將以上質(zhì)粒加入無菌水定容至1800μL，再加入CaCl2(2.5mol/L)溶液200μL，混勻，加入2×PBS緩沖鹽溶液2000μL，室溫放置20～30min；3、當細胞密度達60％～70％時進行轉(zhuǎn)染。此時將步驟2中制備的DNA溶液和磷酸鈣混合液轉(zhuǎn)移至步驟1得到的含單層細胞的細胞培養(yǎng)皿中，混勻，培養(yǎng)12h后棄去培養(yǎng)液，細胞用15mLPBS溶液沖洗，共洗3次。4、向上述細胞培養(yǎng)皿中加入含100mL/LFBS的DMEM細胞培養(yǎng)液15mL，繼續(xù)培養(yǎng)48h；5、收集轉(zhuǎn)染72h的HEK293細胞上清液；6、將收集的上清液于4℃，4000g離心10min，再次收集上清液；7、將再次收集得到的上清液以0.45μm濾器過濾；8、將濾液于40mL超速離心管中，4℃，25000r/min離心20min，棄上清液；9、而后以冰500ulPBS重旋病毒沉淀于4℃溶解過夜，得到慢病毒液，即T1R3慢病毒。實施例3：細胞轉(zhuǎn)染和篩選1、在6孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)HEK293細胞，待細胞完全貼壁匯合度為40％-50％后，即可進行細胞轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染前，每孔細胞換成500μL新鮮的DMEM完全培養(yǎng)基，并且每孔加入1μL的聚凝胺(polybrene)，放置于培養(yǎng)箱孵育1h。2、在上述6孔細胞培養(yǎng)板的2個孔中，分別加入5μL實施例2得到的T1R3慢病毒液，其中一孔細胞加10μL的空載慢病毒液(空載慢病毒液與T1R3慢病毒液的唯一區(qū)別是不含有T1R3基因，其余制備方法都相同)，另一孔做空白細胞對照，充分的搖勻后放入37℃、5％(v/v)CO2、95％相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3、轉(zhuǎn)染6小時后，吸走孔內(nèi)的培養(yǎng)基，并用PBS洗兩次；換成新鮮的DMEM完全培養(yǎng)基，放入37℃、5％(v/v)CO2、95％相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4、待細胞生長至80％融合度時，加入3μL的嘌呤霉素Puromycin(2mg/mL)進行藥篩(Puromycin的終濃度為3ug/ml)；5、第二天觀察到細胞多數(shù)漂浮，去除前一天藥篩的漂浮細胞，待細胞貼壁加入3μL的Puromycin(2mg/mL)維持；6、加藥后細胞多漂浮，每天更換完全培養(yǎng)基和3μL的Puromycin(2mg/mL)直至空白細胞HEK293全部凋亡后，給純化后的HEK293-T1R3換上新鮮的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；7、篩選得到純化的HEK293-T1R3細胞更換上新鮮的完全培養(yǎng)基繼續(xù)進行傳代擴大培養(yǎng)，每次更換細胞培養(yǎng)基均需要加入原藥物濃的一半來維持細胞生長，即Puromycin的終濃度為1.5ug/ml。實施例4：使用實時熒光定量PCR進行T1R3基因的表達檢測。1、HEK293-T1R3細胞總RNA提?。?)將10cm細胞培養(yǎng)皿中匯合度達80％的篩選得到的HEK293-T1R3細胞用預(yù)冷PBS緩沖液洗2遍，加1mlTrizol裂解液重懸。2)接著加入0.2ml三氯甲烷，劇烈搖動10s，室溫放置3分鐘。3)4℃，12000rpm離心20min。4)將上清水相轉(zhuǎn)移至另一新的無RNA酶離心管中，并加入等體積的異丙醇，混勻，-80℃放置1h。5)4℃，12000rpm離心10min，去上清。6)加入1ml體積濃度為75％乙醇洗滌沉淀。7)4℃，5000rpm離心3min，去上清，室溫晾干。9)加入40μLRNA-free水溶解RNA。2、去基因組DNA和cDNA的合成將RNA加入到gDNA吸附柱，室溫10,000g離心1min，收集濾液即為去除基因組DNA的RNA。cDNA合成條件：RNA1μgdNTP(10mM)1μloligodT(40μM)1μl隨機引物(40μM)1μl加RNase-free水至34.5μl；至于75℃5min，冰上5min。向上述反應(yīng)后的溶液中添加反轉(zhuǎn)錄試劑：MuLV1μl10Xbuffer4μlRNAnase抑制劑0.5ul42℃反應(yīng)1h，75℃滅活酶10min，備用3、cDNA的實時熒光定量PCR將T1R3基因和內(nèi)參基因actin的cDNA樣本分別取樣在熒光定量PCR儀上進行反應(yīng)，每個樣本設(shè)置3個平行實驗。PCR反應(yīng)體系為20μL，反應(yīng)體系如表7：表7熒光定量PCR使用的引物如表8：表8反應(yīng)條件為：循環(huán)結(jié)束后從60℃升高到98℃獲取熔解曲線。本發(fā)明所構(gòu)建的T1R3基因過表達慢病毒載體對宿主細胞的轉(zhuǎn)染效率高達80％～90％。實驗以actin為內(nèi)參基因，采用2-△ΔCt法進行分析，經(jīng)所構(gòu)建的pLVX-Puro-T1R3慢病毒載體轉(zhuǎn)染的HEK293細胞中T1R3基因的相對表達量是未轉(zhuǎn)入T1R3基因的HEK293細胞的2.62倍。以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。序列表當前第1頁1 2 3