專利名稱：：慢病毒三鏈體dna、及含有慢病毒三鏈體dna的載體和重組細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及病毒核酸和含有病毒核酸的細(xì)胞。更具體地，本發(fā)明涉及可以是三鏈體DNA結(jié)構(gòu)一部分的病毒核酸序列，以及含有這些病毒核酸序列的核酸載體、病毒和細(xì)胞。本發(fā)明還涉及使用這些DNA結(jié)構(gòu)和核酸序列的方法。相關(guān)技術(shù)描述在造血干細(xì)胞(HSC)中進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移對于遺傳性和獲得性疾病的因?yàn)镠SC具有廣泛的增殖能力，所以穩(wěn)定的基因轉(zhuǎn)移^^"1^#基因的基因組整合?；谀迥崾箢惏籽〔《?MoMLV)的逆轉(zhuǎn)錄病毒之所以非常流行，是因?yàn)樗鼈冋系剿拗骷?xì)胞基因組中并能允許長期轉(zhuǎn)基因表達(dá)。但是，這些腫瘤逆轉(zhuǎn)錄病毒不整合到非分裂細(xì)胞中，而大多數(shù)HSC是靜止的.已經(jīng)開發(fā)了許多利用不同細(xì)胞因子組合的預(yù)刺激方法來引發(fā)HSC的細(xì)胞周期，以便使它們能被胂瘤病毒來源的有絲分裂依賴性基因轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)導(dǎo)，但是，細(xì)胞因子刺激誘導(dǎo)增殖，也誘導(dǎo)分化，HSC的潛能可能會在轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中喪失。這個問題可通過使用慢病毒來源的載體解決，因?yàn)槁《疽扬@示感染分裂和非分裂細(xì)胞(Poznansky等，1991;Naldini等，1996).過去三年發(fā)表的使用這類慢病毒衍生載體轉(zhuǎn)導(dǎo)HSC的最新報(bào)道顯示很有前途，但結(jié)果差異很大(Case等，1991;E麗s等，1999:Uchida等，1998;Miyoshi等，1999).慢病毒進(jìn)化了一套允許其DNA基因組穿越宿主細(xì)胞核膜的向核輸入策略。慢病毒的這種活躍的向核輸入解釋了它們在逆轉(zhuǎn)錄病毒中獨(dú)特的能在非分裂靶細(xì)胞如組織巨噬細(xì)胞中有效復(fù)制的能力。肝瘤病毒如MoMLV的復(fù)制限于分裂細(xì)胞，似乎是由于需要在有絲分裂過程中核膜屏障的破壞，使MoMLV整合前復(fù)合物(PIC)能進(jìn)入核(Roe等，1993)。在慢病毒體內(nèi)復(fù)制策略開始、因而也是其致病性開始時慢病毒不依賴有絲分裂的復(fù)制已使得產(chǎn)生了具有治療應(yīng)用前景的慢病毒基因轉(zhuǎn)移載體(Poz腦asky等，1991;Naldini等，1996)。慢病毒不依賴有絲分裂的復(fù)制最初是由VISNA慢病毒生產(chǎn)性感染非有絲分裂軟骨樣細(xì)胞證實(shí)的(Thormar,1963)。在其發(fā)現(xiàn)后不久，發(fā)現(xiàn)HIV在分化的初級巨噬細(xì)胞中復(fù)制(Gartner等，1986;Ho等，1986)。HIVDNA整合在非有絲分裂耙細(xì)胞的染色體(Weinberg等，1991;Lewis等，1992)，提示HIV-1PIC能跨越宿主細(xì)胞的核膜(Bukrinsky等，1992)。因此，不依賴有絲分裂的向核輸入是負(fù)責(zé)慢病毒在非分裂細(xì)胞中復(fù)制能力的關(guān)鍵事件。搜索負(fù)責(zé)HIV-1DNA基因組活躍向核輸入的病毒決定因子已構(gòu)成一個活躍而有爭議的研究名頁域。在基質(zhì)蛋白(MA)和Vpr病毒蛋白中存在推測的核定位信號(NLS)產(chǎn)生了如下主張，即它們可能以冗余的方式在證-1DNA向核輸入中起作用(Bukrinsky等，1993b;Eme簡n等，1994;Popov等，1998;vonSchwedler等，1994)。已提出，一小部分(1%)MA分子在C-端酪氨酸殘基處磷酸化觸發(fā)它們從質(zhì)膜釋放和與HIV-1整合酶蛋白締合(Gallay等，1995a;1995b)。這些蛋白質(zhì)對HIV-1PIC的親核特性的貢獻(xiàn)目前是一個很有爭議的問題(Freed和Martin,1994:Freed等，1995;Fouchier等，1997;Freed等，1997;Koostra和Schuitemaker，1999)。新近，已在整合酶蛋白(IN)中鑒定了NLS基序，且據(jù)報(bào)道這些基序中的突變消除IN與細(xì)胞NLS受體karyopherina的相互作用(Gallay等，1997)。發(fā)明概述無論這些候選病毒蛋白在HIV向核輸入中的作用如何，本發(fā)明顯示，逆轉(zhuǎn)錄的HIV-1基因組本身帶有其向核輸入的順式作用決定因子(cis—actingdeterminant)。本發(fā)明提供含有三鏈(三鏈體)結(jié)構(gòu)(如慢病毒的三鏈結(jié)構(gòu))的核酸。該三鏈體刺激核酸進(jìn)入細(xì)胞核。該核酸可包含'艮病毒的cPPT和CTS順式作用序列。該慢病毒可以是任何慢病毒，包括但不限于HIV-1、HIV-2、VISNA、EINV、FIV、和CAE。在實(shí)施方案中，該核酸處在載體如表達(dá)載體中。因此，本發(fā)明還提供載體，例如核酸栽體。核酸載體可包括從本本發(fā)明還提供含有本發(fā)明核酸的病毒和細(xì)胞(真核細(xì)胞或原核細(xì)胞)。該細(xì)胞可以是重組細(xì)胞。本發(fā)明還提供通過例如將宿主細(xì)胞暴露給本發(fā)明的核酸、載體、病毒或細(xì)胞而轉(zhuǎn)移核酸到宿主細(xì)胞核以提供重組細(xì)胞的方法。本發(fā)明方法允i午核酸高效轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞核，例如造血干細(xì)胞的細(xì)胞核。高效轉(zhuǎn)移允許本領(lǐng)域技術(shù)人員實(shí)施各種治療方法，包括但不限于預(yù)防性治療方法，改善性治療方法，和治療性治療方法。例如本發(fā)明使得基因治療方法成為可能.通常，基因治療可用于治療血液疾病、腦疾病、病毒性疾病、以及其它許多遺傳的和獲得的疾病。附圖簡述圖1顯示逆轉(zhuǎn)錄中心起始是HIV-1復(fù)制周期的重要步驟。(A)在HIV-1cPPT序列中導(dǎo)入突變，構(gòu)建了保守和半保守cPPT突變病毒'半保守突變體cPPT-D在19聚體cPPT中包含10個突變。突變體cPPT-AG是其對照病毒，在該病毒中單個噤呤到噤呤突變在重疊整合酶編碼區(qū)導(dǎo)入了相同的氨基酸改變.突變以翻轉(zhuǎn)型顯示。(B)cPPT中的突變對HIV-1感染性的影響.在PHA刺激的PBL(左圖)和MT4(右圖)上的病毒復(fù)制動力學(xué)。按照病毒上清的衣殼抗原(p24)含量用等量的病毒顆粒感染細(xì)胞。通過RT活性跟蹤病毒隨時間的產(chǎn)生。(C)在分裂或非分裂的坊棲菌素處理P4細(xì)胞(HelaCD4-LTRLacZ)中單周期病毒滴定.用化學(xué)發(fā)光分析測定P-半乳糖苷酶活性.結(jié)果表示為相對光單位(RLU)/秒/ng接種物p24，四個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值iSD。圖2顯示了cPPT中的突變不影響病毒生產(chǎn)、病毒DNA合成和病毒DNA體外整合能力。(A)cPPT中的突變對病毒生產(chǎn)的影響。用pLAI、pcPPT-AG、pcPPT-D質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞。病毒生產(chǎn)通過定量感染后48小時細(xì)胞上清中的p24病毒抗原來測量。(B)cPPT中的突變對逆轉(zhuǎn)錄效率的影響。用相同量的病毒顆粒(每l(f細(xì)胞300ngp24抗原)感染P4細(xì)胞，12小時后提取DNA。逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA的總量，以內(nèi)部MscIHIV-l片段代表，通過用相同DNA片段作為探針進(jìn)行Southern印跡來檢測，并用磷光成像儀(phosphorimager)定量。(C)cPPT中的突變對體外整合的影響。MT4細(xì)胞與H9-LAI或H9-cPPT-255慢性感染細(xì)胞共培養(yǎng)。從感染細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)分離的病毒整合前復(fù)合物的體夕卜整合按前人所述進(jìn)州Farnet和Haseltine，1990)。每一泳道加載2xl(f感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)DNA。圖3顯示，中心DNA三鏈體突變病毒是病毒DNA向核輸入缺陷的。(A)HIV-1DNA合成、環(huán)化和整合的定量性跟蹤策略。在感染后不同時間提取感染細(xì)胞的DNA，用Mscl和Xhol消化，并通過用重疊5，Mscl位點(diǎn)的探針進(jìn)行Southern印跡來分析。無論整合或未整合狀態(tài)的所有病毒DNA種類都共有的內(nèi)部1.9kbDNA片段指示了感染細(xì)胞中病毒DNA的總量。揭示了2.6kb、2.8kb、和3.4kb分別相應(yīng)于未整合線性DNA、一個、和兩個LTR環(huán)狀DNA的信號。因?yàn)镻CR產(chǎn)生的探針剛好與Mscl位點(diǎn)重疊，所以每個條帶的強(qiáng)度直接與相應(yīng)病毒DNA種類的量成比例，因此，整合的前病毒DNA的量可通過從病毒DNA的總量中減去未整合的線性和環(huán)狀病毒DNA的信號來計(jì)算。(B)在感染細(xì)胞中加工的病毒DNA的Southern印跡分析.P4細(xì)胞用按上清p24含量標(biāo)化的等量的每種病毒感染.感染細(xì)胞在感染后不同時間裂解，提取DNA，用于上述定量分析。(C)一個感染周期(感染后48小時)結(jié)束時細(xì)胞內(nèi)病毒DNA的分布圖。結(jié)果表示為總病毒DNA的百分?jǐn)?shù)。用MT4細(xì)胞獲得類似的細(xì)胞內(nèi)病毒DNA分布圖(數(shù)據(jù)未顯示)。圖4顯示，來自中心DNA三鏈體突變病毒的線性DNA在核膜附近聚集。(A)感染P4細(xì)胞的核/胞質(zhì)的分級分離。感染后24小時核(N)和胞質(zhì)(C)組分的病毒DNA的Southern印跡分析。按前人所述進(jìn)行基于triton裂解的分級分離(Belgrader等，1991),DNA用Mscl限制性消化，并用重疊Mscl位點(diǎn)的探針雜交。(B)通過熒光原位雜交(FISH)檢測各HIV-1基因組。P4細(xì)胞以高復(fù)數(shù)(每106細(xì)胞2pgp24抗原)感染，并用全長HIV-1基因組探針雜交。熒光信號通過tyramid沉淀放大。用去巻積顯微鏡檢查(deconvolutionmicroscopy)分析通過細(xì)胞的光學(xué)切片。圖5顯示，在基于HIV-1的載體中插入中心DNA三鏈體增強(qiáng)載體DNA基因組的GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)和向核輸入。(A)載體基因組的示意圖。在逆轉(zhuǎn)錄過程中負(fù)責(zé)DNA三鏈體形成的cPPT和CTS中心順式作用序列插入在先前描述的HRGFP載體(Naldini等，1996)的中心位置。TRIPinv-GFP以相反的、非功能性定向包括中心DNA三鏈體序列.(B)使用有或沒有中心DNA三鏈體的HIV載體進(jìn)行GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率比較。分裂或非分裂(蚜棲菌素處理的)Hela細(xì)胞用作靼標(biāo)，用微量滴定板熒光計(jì)(Wallac)定量轉(zhuǎn)導(dǎo)后48小時的GFP熒光，結(jié)果表示為三次重復(fù)進(jìn)行的代表性實(shí)驗(yàn)的平均值±SD.從信號中減去GFP活性的假轉(zhuǎn)導(dǎo)(pseudotransduction),(C)Southern印跡分析在轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中加工的載體DNA.轉(zhuǎn)導(dǎo)的Hela細(xì)胞在感染后不同時間裂解，提取DNA，限制性消化，并使用類似用于病毒的策略進(jìn)行Southern印跡.MscI消化代以EcoNI和Avail消化，探針是剛好覆蓋EcoNI位點(diǎn)的PCRDNA片段.(D)感染48小時后載體DNA細(xì)胞內(nèi)狀態(tài)的定量分析。結(jié)果表示為總載體DNA的百分?jǐn)?shù)。圖6顯示依賴于DNA三鏈體的HIV-1基因組向核輸入模型。(A)中心DNA三鏈體突變病毒的觀察到的表現(xiàn)型概觀。HIV-l逆轉(zhuǎn)錄的中心起始和終止步驟創(chuàng)建了一個長的正鏈DNA瓣片結(jié)構(gòu)(flapstructure):中心DNA三鏈體。HIV-1正鏈作為兩個分離的半基因組區(qū)段來合成。下游區(qū)段起始于多嘌呤段序列的中心拷貝(cPPT)處。上游區(qū)段在99個核苷酸長鏈替換事件后終止于cPPT下游，被中心終止序列(CTS)阻斷。在單個感染完成時，野生型病毒的病毒DNA幾乎全部加工成整合的前病毒(-55%)、1LTR(35%)和2LTR環(huán)狀DNA(〈5%),而小部分保持線性DNA(<10%)。cPPT中的突變影響中心DNA三鏈體的形成。中心起始突變病毒的最終逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是缺少中心DNA三鏈體的連續(xù)雙鏈線性DNA(Charneau等，1992)。cPPT-D突變病毒的病毒DNA在感染細(xì)胞中以線性DNA分子積累，并位于核膜附近。(B)經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄復(fù)合物(RTC)成熟為整合前復(fù)合物(PIC)和線性DNA轉(zhuǎn)運(yùn)通過核孔，三鏈體依賴性HIV-1基因組向核輸入的兩個推測的機(jī)制。HIV-1逆轉(zhuǎn)錄可能發(fā)生在被衣殼蛋白裝置包圍的有結(jié)構(gòu)的(有序)復(fù)合物內(nèi)。RTC的大小超過核孔的排除直徑。在轉(zhuǎn)移之前，RTC經(jīng)過變?yōu)槭ヒ職さ鞍椎母IC的成熟過程(Karageorgos等，1993)。DNA三鏈體的形成表示病毒DNA合成結(jié)束，并可能表示HIVDNA從衣殼裝置內(nèi)脫離.在PIC中，與LTRs頂端結(jié)合的整合酶蛋白二聚化后，線性DNA的末端可能橋接在一起(Miller等，1997).鑒于DNA三鏈體處于中心位置，故HIV-1PIC的一個合理結(jié)構(gòu)是雙絲，通過整合酶二聚化在中心三鏈體每一側(cè)對稱折疊.這樣，DNA三鏈體將構(gòu)成可能與親核穿梭蛋白相互作用的頂端，允許HIV-1DNA絲通過核孔，在cPPT突變病毒中，RTC成熟為PIC的缺陷將導(dǎo)致在核孔處積累完整病毒衣殼.或者，在cPPT突變線性DNA中DNA三鏈體的缺乏將抑制與穿梭蛋白相互作用，阻止HIV-1DNA轉(zhuǎn)移通過核孔。在兩種情況下，cPPT突變病毒的DNA都在核膜附近積累成線性DNA,圖7顯示采用CD34+人臍帶血細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。(A)在這里所述的條件下存在100ng/ml病毒P24時轉(zhuǎn)導(dǎo)24小時的人臍帶血CD34+細(xì)胞的FACS分析。分析在24小時轉(zhuǎn)導(dǎo)期結(jié)束時洗滌細(xì)胞后48小時進(jìn)行。百分?jǐn)?shù)表示形態(tài)學(xué)gated造血細(xì)胞的比例。X平均值表示綠色熒光強(qiáng)度的平均值。(B)在轉(zhuǎn)導(dǎo)后5天分析GFP表達(dá)。圖8以圖表示病毒劑量對轉(zhuǎn)染效率的影響。(A)表達(dá)eGFP的CD34+細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。(B)CD34+eGFP+細(xì)胞的GFP焚光強(qiáng)度平均值。(C)CD34+eGFP+細(xì)胞的GFP熒光強(qiáng)度平均值乘以CD34+eGFP+細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。CD34+細(xì)胞在本文所述條件下用包含CMV啟動子控制下的eGFP編碼序列和包含(粗線)或沒有(虛線)三鏈體結(jié)構(gòu)的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)24小時。分析在24小時轉(zhuǎn)導(dǎo)期結(jié)束時洗滌細(xì)胞后48小時進(jìn)行。圖9顯示對在本文所述條件下用具有完整HIV-1LTR(左圖)或U3缺失的HIV-1LTR(右圖)和內(nèi)部CMV啟動子(上圖)或EF-1a啟動子(下圖)的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)了24小時的人臍帶血CD34+細(xì)胞的FACS分析。(A)在24小時轉(zhuǎn)導(dǎo)期結(jié)束時洗滌細(xì)胞后48小時進(jìn)行分析。(B)在24小時轉(zhuǎn)導(dǎo)期結(jié)束時洗滌細(xì)胞后120小時進(jìn)行分析。分析可區(qū)分明亮的(未成熟)和暗淡的CD34細(xì)胞。百分?jǐn)?shù)表示為形態(tài)學(xué)gated的造血細(xì)胞的比例。當(dāng)指明時，第二個數(shù)代表綠色焚光的平均值。發(fā)明詳述前面我們已顯示，HIV-1進(jìn)化了一套復(fù)雜的逆轉(zhuǎn)錄策略，該策略在基因組中心處發(fā)生的兩個步驟上與胂瘤病毒不同與終止步騍偶聯(lián)的正鏈合成的一個附加起始.HIV-1正鏈DNA作為兩個分開的半基因組區(qū)段而合成。在所有慢病毒基因組中心存在的一個多噤呤段順式作用序列的附加拷貝(cPPT)起始下游正鏈的合成(Charneau等，1991,1992)。起始于3，PPT的上游正鏈區(qū)段在鏈轉(zhuǎn)移后前進(jìn)到基因組的中心，并在不連續(xù)的鏈置換事件后終止(圖6A)。HIV-l逆轉(zhuǎn)錄的該最后時間順序事件由中心終止序列(CTS)順式作用序列控制，后者在鏈置換合成的特定環(huán)境中在該位點(diǎn)排出HIV-1逆轉(zhuǎn)錄斷RTXCharneau等，1994;Lavigne等，1997)。因此，HIV-l逆轉(zhuǎn)錄的最終產(chǎn)物是在中心含有穩(wěn)定的99核苷酸長DNA瓣片的線性DNA分子，此DNA瓣片在此稱作中心DNA三鏈體(圖6A)。中心起始和終止突變病毒都合成沒有野生型DNA三鏈體的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。如圖6A所示，對于中心起始突變體，最終產(chǎn)物是缺乏中心三鏈體的連續(xù)雙鏈線性DNA(Charneau等，1992)。起始于cPPT處的下游正鏈區(qū)段沒有合成。因此，在基因組中心沒有發(fā)生鏈置換；轉(zhuǎn)移的正鏈延伸到整個基因組。對于中心終止突變體，中心鏈置換事件不再被突變的CTS序列控制，而且與不連續(xù)的野生型DNA三鏈體相比，產(chǎn)生更長的隨機(jī)分布的正鏈重疊(Charneau等，1994)。cPPT或CTS順式作用序列中的突變嚴(yán)重?fù)p害HIV復(fù)制，表明中心三鏈體在逆轉(zhuǎn)錄生命周期中的直接作用(Charneau等，1992;Hungnes等，1992;Char廳u等，1994)本發(fā)明揭示，在病毒DNA轉(zhuǎn)移通過核孔之前即刻、或過程中HIV-1基因組向核輸入的后期步驟涉及HIV-l的中心DNA三鏈體.因此，慢病毒逆轉(zhuǎn)錄的該獨(dú)特特征至少部分地解釋了在逆轉(zhuǎn)錄病毒中慢病毒在非分裂相比細(xì)胞中復(fù)制的特有能力。本發(fā)明還揭示，缺乏中心DNA三鏈體的HIV基因轉(zhuǎn)移載體顯示強(qiáng)烈的向核輸入缺陷。本發(fā)明證明，HIV-1基因組中心順式作用序列插入前人描述的HIV載體(Naldini等，1996)中通過彌補(bǔ)原始載體DNA的向核輸入缺陷到野生型水平增加了轉(zhuǎn)導(dǎo)效率.該發(fā)現(xiàn)提供了中心DNA三鏈體在HIV-1向核輸入中的作用的又一獨(dú)立證據(jù)。DNA三鏈體描述成慢病毒的向核輸入決定因子，對于設(shè)計(jì)有效的慢病毒載體具有重要意義。因?yàn)槁《靖腥痉欠至寻壹?xì)胞依賴于它們在主動向核輸入途徑中的應(yīng)用，所以優(yōu)選在衍生的載體結(jié)構(gòu)中保留該慢病毒向核輸入決定因子。傳統(tǒng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體結(jié)構(gòu)是置換型載體，其中LTRs中間的整個病毒^碼序列被缺失，并替代以目的序列(MillerAD，1997)。對于慢病毒載體，這種傳統(tǒng)策略導(dǎo)致中心順式作用序列cPPT和CTS的缺失。三鏈體在HIV向核輸入中的重要作用暗示，這種置換載體結(jié)構(gòu)不是最佳的。該發(fā)現(xiàn)確立了如下事實(shí)，即該DNA三鏈體向核輸入決定因子在HIV-1衍生慢病毒載體的異源環(huán)境中是可操作的。尤其是來自天然HIV-1基因組環(huán)境的DNA三鏈體可促進(jìn)異源DNA序列的向核輸入(PCT法國9805197，1998年4月24日)。DNA三鏈體序列的存在誘導(dǎo)造血干細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的顯著增加。因此，一方面，本發(fā)明提供能參與三鏈體核酸結(jié)構(gòu)(即三鏈核酸)的核酸(DNA或RNA，或其類似物)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，該核酸是慢病毒序列。在一些實(shí)施方案中，該核酸通過例如定向誘變(即有意缺失、插入、或替代至少一個核普酸)或選擇性壓力誘變從慢病毒序列衍生而來。本發(fā)明的核酸允許高效轉(zhuǎn)移核酸到宿主細(xì)胞，尤其是宿主細(xì)胞核中。由于具有該能力，與本發(fā)明核酸可操作地或物理地連接的基因可以以高水平和/或在高百分?jǐn)?shù)的暴露于該核酸的細(xì)胞中表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明插入在慢病毒基因組三鏈區(qū)中的DNA在該結(jié)構(gòu)中尤其穩(wěn)定，并有助于實(shí)現(xiàn)高水平的轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)染。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供慢病毒cPPT和CTS區(qū)誘導(dǎo)的三鏈DNA序列，其能誘導(dǎo)載體DNA高比率地進(jìn)入宿主細(xì)胞細(xì)胞核，或能增加載體DNA的向核輸入的比率。在一些實(shí)施方案中，該三鏈DNA序列可與異源核酸序列如報(bào)道基因或其它目的基因共價相連.例如本發(fā)明核酸可包含編碼肽、多肽或蛋白質(zhì)的的異源核酸序列。在一些實(shí)施方案中，異源核酸序列存在于三螺旋區(qū)內(nèi)，在一些實(shí)施方案中，異源核酸序列與三螺旋區(qū)存在于相同核酸上，但在三螺旋之外.在一些實(shí)施方案中，單個核酸包含慢病毒cPPT和CTS區(qū)誘導(dǎo)的一個以上三鏈序列，另一方面，本發(fā)明提供含有至少一個能參與三鏈體核酸結(jié)構(gòu)形成的序列的載體，如穿梭載體、表達(dá)載體、整合載體、轉(zhuǎn)座子、反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子和類似物。在一些實(shí)施方案中，載體含有能參與三鏈體核酸結(jié)構(gòu)形成的單個序列。在一些實(shí)施方案中，載體含有至少一個能參與三鏈體核酸結(jié)構(gòu)形成的序列。該載體可用于將本發(fā)明的核酸從一個細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個，用于幫助產(chǎn)生大量本發(fā)明的核酸，和用作其它目的核酸序列(如報(bào)道基因、治療基因)可以插入其中的基本分子。在另一方面，本發(fā)明提供用含有至少一個能參與三鏈體核酸結(jié)構(gòu)的序列的病毒核酸序列高效感染、轉(zhuǎn)染、或轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的方法。在一些實(shí)施方案中，該方法包括將細(xì)胞、或多個細(xì)胞暴露給至少一個拷貝的本發(fā)明核酸、載體、病毒、或細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，暴露細(xì)胞給本發(fā)明核酸、載體、病毒、或細(xì)胞的步驟在這樣的條件下進(jìn)行，使得本發(fā)明的核酸、載體、病毒、或細(xì)胞能進(jìn)入靶(宿主)細(xì)胞。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該條件是使得高水平的本發(fā)明核酸、載體、病毒、或細(xì)胞進(jìn)入扭細(xì)胞的條件。在一些實(shí)施方案中，該方法是高效的，允i午本發(fā)明核酸插入到30%或更多暴露給該核酸的細(xì)胞中。在一些實(shí)施方案中，攝取本發(fā)明核酸的細(xì)胞核的百分?jǐn)?shù)是40%或更高，例如50%或更高，60%或更高，70%或更高，80%或更高，或90%_10%。在優(yōu)選實(shí)施方案中，攝取本發(fā)明核酸的細(xì)胞核的百分?jǐn)?shù)是大于80%,更優(yōu)選大于85%,最優(yōu)選大于90%，例如大于95%。在一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞用含本發(fā)明核酸的全病毒(包括噬菌體)或細(xì)菌感染或轉(zhuǎn)染。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明核酸采用機(jī)械的和/或化學(xué)的方法(如電穿孔、脂質(zhì)體融合)導(dǎo)入細(xì)胞中。在一些實(shí)施方案中，靶宿主細(xì)胞攝取棵的本發(fā)明核酸。因此，在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供含有cPPT和CTS區(qū)域的核苷酸序列的用途，其在慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子載體中在逆轉(zhuǎn)錄后采取三鏈DNA結(jié)構(gòu)(三鏈體)，并刺激載體DNA進(jìn)入轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的細(xì)胞核中，還刺激載體DNA向核輸入到轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的細(xì)胞核中的比率.在本發(fā)明的一個方面，提供含有本發(fā)明核酸或載體的重組細(xì)胞。重組細(xì)胞可以是任何細(xì)胞(原核的或真核的)，包括其后代或衍生物。因此，本發(fā)明包括用本發(fā)明的細(xì)胞創(chuàng)建的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞是真核細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞，如HeLa細(xì)胞或造血細(xì)胞，如造血干細(xì)胞。因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供轉(zhuǎn)導(dǎo)真核細(xì)胞的方法，其中該方法包括使用由慢病毒cPPT和CTS區(qū)域誘導(dǎo)的三鏈DNA序列，其能誘導(dǎo)載體DNA高比率地進(jìn)入宿主細(xì)胞核，或能增加載體DNA向核輸入的比率。因?yàn)楸景l(fā)明重組細(xì)胞能高水平地表達(dá)目的異源基因，所以這些細(xì)胞可用于許多應(yīng)用中。這些應(yīng)用包括但不限于在細(xì)胞培養(yǎng)中生產(chǎn)高水平的目的蛋白質(zhì)(如有治療價值的蛋白質(zhì))和通過將本發(fā)明的重組細(xì)胞導(dǎo)入需要該蛋白的個體內(nèi)來體內(nèi)原位生產(chǎn)目的蛋白。該個體可以是動物或人。因此，本發(fā)明具有獸醫(yī)應(yīng)用和醫(yī)療應(yīng)用。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的該方面提供通過將靶細(xì)胞暴露給本發(fā)明的核酸、載體、或病毒并經(jīng)過例如轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化、或轉(zhuǎn)染等允許該靶細(xì)胞攝取本發(fā)明的核酸，而生產(chǎn)目的重組蛋由質(zhì)的方法.在核酸導(dǎo)入耙細(xì)胞后，細(xì)胞在一定條件下培養(yǎng)，籍此由該耙細(xì)胞表達(dá)、并因而產(chǎn)生目的重組蛋白質(zhì)，該靶細(xì)胞現(xiàn)在被認(rèn)為是根據(jù)本發(fā)明的重組細(xì)胞。盡管該方法可以在單個的個別細(xì)胞上實(shí)施，但4艮明顯，如果在所有細(xì)胞都是克隆的細(xì)胞群上實(shí)施的話，該方法將常常更為實(shí)用。這里所用的"細(xì)胞"是指單個細(xì)胞或相同細(xì)胞的群體。該方法可以還包括從重組細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)液中純化或分離目的蛋白質(zhì).在這樣的方法中，可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的蛋，一質(zhì)表達(dá)和純化技術(shù)。這些技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，因此不需要在此詳述。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的該方面提供體外表達(dá)目的基因的方法，其中該方法包括a)在一定條件下將靶細(xì)胞暴露給含有目的基因和至少一個拷貝的逆轉(zhuǎn)錄病毒cPPT和CTS順式作用區(qū)域的分離或純化核酸，其中cPPT和CTS區(qū)域可誘導(dǎo)三鏈DNA結(jié)構(gòu)，所述條件允許該核酸被乾細(xì)胞攝取以產(chǎn)生重組細(xì)胞，和b)在允許至少一部分該核酸轉(zhuǎn)移到重組細(xì)胞的細(xì)胞核并允許目的基因表達(dá)的條件下培養(yǎng)重組細(xì)胞.在一些實(shí)施方案中，該方法使用根據(jù)本發(fā)明的載體，因此，本發(fā)明提供在例如組織培養(yǎng)物中體外表達(dá)目的基因的方法。在一些實(shí)施方案中，該方法包括在靶細(xì)胞能攝取含有目的基因的本發(fā)明分子的條件下將乾細(xì)胞暴露給本發(fā)明的核酸、載體、病毒、或細(xì)胞。然后在目的基因表達(dá)的條件下使由此制備的重組細(xì)胞生長和復(fù)制。在一些實(shí)施方案中，基因表達(dá)的體外方法與純化或分離目的蛋白質(zhì)的方法偶聯(lián)。在這些實(shí)施方案中，可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)，包括但不限于液層色譜、沉淀、離心、凝膠過濾和親和層析，從其它細(xì)胞組分中純化或分離目的蛋白質(zhì)。適當(dāng)?shù)募夹g(shù)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，不需要詳細(xì)描述。因此，本發(fā)明還提供在例如需要目的基因表達(dá)的蛋白質(zhì)的個體內(nèi)體內(nèi)表達(dá)目的基因的方法。在一些實(shí)施方案中，體內(nèi)表達(dá)基因的方法包括在該個體外通過將宿主細(xì)胞暴露給本發(fā)明的核酸、栽體、病毒、或細(xì)胞制備根據(jù)本發(fā)明的重組細(xì)胞來制備重組細(xì)胞。然后將本發(fā)明的該重組細(xì)胞施用、導(dǎo)入、或以其它方式暴露給該個體，由此表達(dá)此目的基因。例如，該方法可包括將含有本發(fā)明核酸的重組細(xì)胞施用給個體，并允許該重組細(xì)胞在該個體體內(nèi)表達(dá)該核酸。在一個優(yōu)選實(shí)施方案，重組細(xì)胞是造血干細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，該重組細(xì)胞首先從非重組細(xì)胞中純化或分離，然后施用、導(dǎo)入、或以其它方式暴露給該個體，在其它實(shí)施方案中，體內(nèi)表達(dá)基因的方法包括將該個體暴露(例如施用、導(dǎo)入等)給本發(fā)明的核酸、載體和/或病毒。在一些實(shí)施方案中，此核酸、載體、和/或病毒轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)/感染該個體的至少一個細(xì)胞，由此表達(dá)該目的基因。例如，該方法可包括將本發(fā)明的核酸、栽體、或病毒以足以導(dǎo)致目的基因在個體體內(nèi)表達(dá)的量和形式施用給該個體。優(yōu)選地，該方法導(dǎo)致目的基因在靶組織或細(xì)胞內(nèi)表達(dá).在一個實(shí)施方案，本發(fā)明的該方面提供了治療患有、或很有可能發(fā)展具有遺傳基礎(chǔ)的疾病或病癥的個體的方法.該方法包括給該個體施用含有a)編碼治療性蛋白質(zhì)的核酸和b)至少一個拷貝的逆轉(zhuǎn)錄病毒cPPT和CTS順式作用區(qū)域的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中cPPT和CTS區(qū)可誘導(dǎo)三鏈DNA結(jié)構(gòu)，所施用的載體量足以導(dǎo)致表達(dá)足以治療該疾病或病癥的量的治療性蛋白質(zhì)。該治療可以是預(yù)防性的、改善性的、或治療4生的。該方法可治療血液疾病或病癥、腦或神經(jīng)系統(tǒng)疾病或病癥、或發(fā)育疾病或病癥。體內(nèi)導(dǎo)入和/或表達(dá)基因的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。實(shí)施者可以選擇最適于給定蛋白質(zhì)或靶組織或細(xì)胞的技術(shù)。因此，本發(fā)明提供治療宿主的方法，包括使用含有由慢病毒cPPT和CTS區(qū)域誘導(dǎo)的三鏈DNA序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其能誘導(dǎo)載體DNA高比率地進(jìn)入宿主細(xì)胞核，或能增加載體DNA向核輸入的比率。根據(jù)本發(fā)明的上述各方面，本發(fā)明提供試劑盒。該試劑盒能包含本發(fā)明的至少一個核酸、至少一個載體、至少一個病毒、或至少一個細(xì)胞、或這些的任何或所有組合。該試劑盒能在單個組合物中一起提供、或分開地(例如在不同容器中)提供本發(fā)明上述實(shí)施方案的每一個。在一些實(shí)施方案中，該試劑盒包含將本發(fā)明核酸、載體、病毒和細(xì)胞用于期望目的所必需試劑和物資的一些或全部。本發(fā)明公開了HIV-1向核輸入的獨(dú)創(chuàng)機(jī)制，在該機(jī)制中三鏈DNA結(jié)構(gòu)，DNA三鏈體，起到關(guān)鍵作用。HIV-1進(jìn)化了一套復(fù)雜的逆轉(zhuǎn)錄策略，由此，與逆轉(zhuǎn)錄的中心起始和終止連續(xù)的中心鏈置換事件在未整合線性HIV-1基因組的中心創(chuàng)建了一個DNA三鏈體。該DNA三鏈體反過來又充當(dāng)HIV-1基因組向核輸入的順式作用決定因子。本發(fā)明顯示，HIV-1逆轉(zhuǎn)錄的兩個獨(dú)特步驟，中心起始和終止，解釋了HIV-1感染非分裂靶細(xì)胞的能力。本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)一步顯示，DNA三鏈體的缺乏導(dǎo)致產(chǎn)生在分裂或非分裂細(xì)胞中幾乎無感染性的病毒.結(jié)構(gòu)cPPT中的突變不影響病毒DNA合成的速率或其體外整合的能力，但cPPT突變病毒的大部分逆轉(zhuǎn)錄DNA分子隨著時間的過去積累成非整合的線性DNA。相反，野生型病毒的線性DNA幾乎全部加工成整合的前病毒和DNA環(huán)。cPPT突變病毒的細(xì)胞內(nèi)DNA分布圖表明向核輸入的缺陷，病毒DNA由于不能到達(dá)其能整合或環(huán)化的核區(qū)室而導(dǎo)致積累成線性分子.最可能影響通過NPC的轉(zhuǎn)運(yùn)的病毒DNA輸入的最后缺陷，被感染細(xì)胞的分級分離和細(xì)胞內(nèi)病毒DNA的直接觀察(FISH)所證實(shí)。三鏈體缺陷的線性DNA分子與核膜相聯(lián)。本發(fā)明集中在cPPT突變病毒的分析，其特征在于沒有中心DNA三鏈體。本文給出的大多數(shù)實(shí)驗(yàn)也用先前描述的CTS突變病毒(Charneau等，1994)來進(jìn)行，得到相同的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。在CTS突變病毒中，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生含有比野生型病毒的不連續(xù)中心DNA三鏈體更大的、隨機(jī)分布的正鏈重疊的線性DNA分子。因此，DNA三鏈體的存在及其結(jié)構(gòu)的完整性是HIVDNA向核輸入重要的。本發(fā)明顯示，DNA三鏈體在基于HIV-1的載體系統(tǒng)中是有效的。它插入沒有三鏈體的載體中可逆轉(zhuǎn)載體DNA向核輸入的強(qiáng)烈缺陷到野生型的向核輸入水平。中心DNA三鏈體是慢病毒共同的向核輸入決定因子。對于HIV-1，中心DNA三鏈體的位置已精確地定義。中心鏈置換起始于cPPT序列之后的第一個核苷酸(Charneau和Clavel，1991)，一般終止于下游99個核普酸，CTS的ter2位點(diǎn)處(Charneau等，1994)。三鏈體三DNA鏈的三維構(gòu)型還不清楚。然而，在基因組中心存在DNA三鏈體可以推及所有慢病毒。PPT的中心拷貝是所有慢病毒基因組的共有特征，并且在約100核苷酸下游還存在由(A)n和(T)n序列段的存在所揭示的推測CTS終止子元件(Charneau等，1994)。最近已表征了有蹄類動物慢病毒EIAV的中心DNA三鏈體(Stetor等，1999)。通過Sl核酸酶切割揭示VISNA病毒DNA中的中心鏈不連續(xù)性，稱作缺口，但最可能是中心鏈置換造成的切口(Harris等，1986)。因?yàn)樵S多慢病毒已描述了不依賴有絲分裂的復(fù)制(Gartner等，1986;Thormar，1963)，所以這里對HIV-1所描述的DNA三鏈體在向核輸入中的作用可推及所有慢病毒。不受限制地，本發(fā)明提供中心DNA三鏈體在HIV-1向核輸入中作用的機(jī)制假說如下充當(dāng)向核輸入順式?jīng)Q定因子的三鏈DNA結(jié)構(gòu)是一種沒有已知的細(xì)胞或病毒對應(yīng)物的新生物學(xué)現(xiàn)象.因此，說明中心DNA三鏈體在HIV向核輸入中的作用的任何分子機(jī)制假說都是推測的.中心三鏈體可能充當(dāng)通過核孔的HIVDNA絲攝取起始的病毒決定因子。這可能通過DNA三鏈體與核孔成分的直接相互作用，或作為替代，通過三鏈體與在宿主細(xì)胞的胞質(zhì)和核之間穿梭并可能牽引HIV基因組到核內(nèi)的細(xì)胞或病毒蛋白質(zhì)的相互作用來實(shí)現(xiàn)。在識別HIV-1DNA絲一端起始攝取后，9.7kbHIV基因組轉(zhuǎn)運(yùn)通過最大直徑26nm的核孔必須以特定方向發(fā)生。信使RNA的核輸出中出現(xiàn)類似的情形，在此，RNA絲攝取通過核孔是由5，帽子結(jié)構(gòu)指導(dǎo)的(Hamm和Mattaj，1990)。盡管HIV-1PIC的構(gòu)象尚不十分清楚，但已經(jīng)證實(shí)的是，可能在與LTR頂端結(jié)合的整合酶蛋白質(zhì)二聚化后，線性DNA的末端橋接在一起(Miller等，1997)。有趣的是，在所有慢病毒基因組中，在中心位置都發(fā)現(xiàn)cPPT和CS順式作用序列。慢病毒PIC的一個合理結(jié)構(gòu)是雙DNA絲，通過整合酶二聚化在中心三鏈體的每一側(cè)對稱折疊(圖6B)。然后三鏈體將構(gòu)成絲狀HIV-1PIC的一個端點(diǎn)，整合酶二聚體構(gòu)成另一個端點(diǎn)。在cPPT突變體的PIC中，沒有DNA三鏈體將導(dǎo)致它們不被核孔機(jī)器或穿梭蛋白質(zhì)識別。鑒定中心DNA三鏈體的蛋白質(zhì)配體將對于我們理解HIV-1PIC向核輸入和最終開發(fā)靶向HIV復(fù)制的該步驟的藥物十分重要.另一個解釋三鏈體突變病毒的性質(zhì)的機(jī)制假說涉及病毒DNA轉(zhuǎn)運(yùn)到核內(nèi)之前HIV衣殼成熟為PIC中的缺陷。根據(jù)該模型，三鏈體缺陷的病毒DNA將被俘獲為完整病毒衣殼，而不能轉(zhuǎn)運(yùn).逆轉(zhuǎn)錄病毒的逆轉(zhuǎn)錄在被感染細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中病毒成分高度稀釋時不能發(fā)生，而需要逆轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的結(jié)構(gòu)環(huán)境，在這里病毒成分被限定在衣殼蛋白裝置中。HIV衣殼大小超過核孔的排除直徑(Dworetzky等，1998;Gelderblom,1991)。因此，病毒DNA能進(jìn)入核之前，HIV逆轉(zhuǎn)錄復(fù)合物必須經(jīng)過變?yōu)榇笮∨c轉(zhuǎn)運(yùn)通過核孔相適應(yīng)的PIC的成熟過程(Karageorgos等，1993)。核轉(zhuǎn)運(yùn)之前病毒衣殼的成熟在一些其它病毒系統(tǒng)中已十分明確，在這些病毒系統(tǒng)中復(fù)制周期涉及DNA基因組轉(zhuǎn)運(yùn)通過宿主細(xì)胞的核膜(Whittaker和Helenius，1998).盡管對MLV而言在病毒衣殼內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄已經(jīng)過物理學(xué)的證實(shí)(Bowerman等，1989),但這對于HIV-1還不可能，這可能是因?yàn)镠IV-1衣殼的易脆性(Borroto-Esoda和Boone，1990)。HIV逆轉(zhuǎn)錄復(fù)合物包含許多拷貝的RT聚合酶(每個衣殼約30-50個)(Panet等，1975)。由于HIV-l逆轉(zhuǎn)錄酶的重要分布，酶與病毒RNA模板的高化學(xué)計(jì)量是在正鏈和負(fù)鏈合成及中心三鏈體的準(zhǔn)確形成過程中克服許多逆轉(zhuǎn)錄限制步驟(如鏈轉(zhuǎn)移或聚合中止)所必需的(Klarmann等，1993;Char廳u等，1994)。這強(qiáng)烈提示，慢病毒逆轉(zhuǎn)錄的最后事件一一中心終止，發(fā)生在完整衣殼結(jié)構(gòu)內(nèi)。標(biāo)志病毒DNA合成結(jié)束的中心終止可能是病毒DNA去衣殼和隨后轉(zhuǎn)運(yùn)到核內(nèi)的必需信號。DNA三鏈體介導(dǎo)的HIV-1向核輸入的這兩個推測的分子機(jī)制不是相互排斥的。中心DNA三鏈體的形成可能觸發(fā)病毒衣殼成熟為PIC，因此使DNA三鏈體可接近穿梭蛋白質(zhì)。中心DNA三鏈體的完整性為HIV-1基因組進(jìn)入宿主細(xì)胞核所必需的事實(shí)表明，DNA合成的整個過程，包括最后中心鏈置換事件，在HIVPIC轉(zhuǎn)運(yùn)通過核孔之前完成。慢病毒逆轉(zhuǎn)錄的亞細(xì)胞分布目前仍有爭論，HIV復(fù)制是否在特定細(xì)胞區(qū)室內(nèi)發(fā)生仍然是一個有待解決的問題?；诜旨壏蛛x研究，已報(bào)道，HIV逆轉(zhuǎn)錄可完全在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)生(Bukrinsky等，1993a)。但是分級分離技術(shù)不能區(qū)分核內(nèi)定位和與核膜相聯(lián)。相反，另一些作者提出，逆轉(zhuǎn)錄復(fù)合物與細(xì)胞骨架相聯(lián)是病毒DNA合成的前提(Bukrinhkaya等，1998)。HIV-1DNA合成的動力學(xué)研究和其與核組分相連表明，后一過程比前者快得多，逆轉(zhuǎn)錄單個周期的過程中HIV-1DNA的合成僅在感染后24-48小時到達(dá)平臺，而95%以上的HIV-1DNA在早在感染后4-6小時與感染細(xì)胞的細(xì)胞核分級分離(Barbosa等，1994).因此，我們贊同第三種可能性，即慢病毒逆轉(zhuǎn)錄主要在核膜和NPC的緊靠附近、在病毒衣殼內(nèi)發(fā)生，盡管需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)該假說.細(xì)胞有絲分裂不提供三鏈體缺陷性病毒DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞核的替代途徑。本發(fā)明實(shí)施例顯示，中心三鏈體突變體病毒在非分裂細(xì)胞和分裂細(xì)胞中的復(fù)制能力都被強(qiáng)烈妨礙.相反，在基于HIV-l的栽體中插入DNA三鏈體序列刺激在分裂和非分裂細(xì)胞兩者中的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。這與已公開的MA/Vpr突變病毒的表型不同，在MA/Vpr突變病毒中復(fù)制缺陷只描述于非分裂細(xì)胞中(Bukringsky等，1993b;Heinzinger等，1994;vonSchwedler等，1994)。因此，MA/Vpr病毒突變體的行為類似有絲分裂依賴性胂瘤病毒。中心三鏈體突變體不同行為的一個可能解釋是，這些病毒在向核輸入過程的一個晚期步驟中有缺陷，結(jié)果，三鏈體缺陷性DNA分子與核膜相連。這種密切相連在有絲分裂過程中一直持續(xù)。突變病毒DNA可能被捕獲于有絲分裂的核膜小泡內(nèi)，這樣它就不能達(dá)到細(xì)胞染色體，例如對NLS-LacZ蛋白所報(bào)道的情況(Bo匿rot等，1987)。然而，抑制與karyopherins相互作用的細(xì)胞NLS中的突變已知i秀導(dǎo)突變蛋白質(zhì)的細(xì)胞質(zhì)積累(Kalderon等，1984;Lanford和Butel，1984)。因此，正如先前所述的(Gulizia等，1994),有利于HIV-1PIC親核特性的NLS序列中的突變應(yīng)當(dāng)誘導(dǎo)病毒DNA的細(xì)胞質(zhì)滯留。因此，在有絲分裂過程中MA/Vpr突變病毒的PIC有可能在核膜破裂后到達(dá)細(xì)胞染色體.然而，慢病毒DNA基因組有絲分裂依賴性向核輸入途徑還沒有直接證據(jù)。正如MA/Vpr突變病毒的公開表型必須謹(jǐn)慎看待一樣，同樣應(yīng)謹(jǐn)慎看待慢病毒核轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷應(yīng)僅在非分裂細(xì)胞中導(dǎo)致復(fù)制缺陷的該起始假設(shè)。慢病毒是否能夠采用有絲分裂依賴性核輸入策略，或慢病毒基因組是否在分裂和非分裂細(xì)胞中均有主動核輸入，仍是一個待研究的問題。本發(fā)明提供慢病毒載體的設(shè)計(jì)方案。由于慢病毒引起的非分裂把細(xì)胞感染依賴于它們對主動細(xì)胞核輸入途徑的使用，因此在衍生的載體結(jié)構(gòu)中保留慢病毒向核輸入決定因子是重要的。經(jīng)典的逆轉(zhuǎn)錄載體結(jié)構(gòu)是置換型載體，其中兩個LTR之間的整個病毒編碼序列被缺失并替換為目的序列，對于慢病毒，這種經(jīng)典策略導(dǎo)致中間的順式作用序列cPPT和CTS的缺失.該三鏈體在HIV向核輸入中的重要作用提示這種置換型載體結(jié)構(gòu)不是最佳的.因此，HIVDNA三鏈體在HRGFP置換型載體(Naldini等，1996)中的插入由于彌補(bǔ)了HR載體基因組的向核輸入缺陷而增強(qiáng)了其基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，達(dá)到近似于野生型HIV-1的DNA轉(zhuǎn)運(yùn)率。值得一提的是，盡管缺少DNA三鏈體的HIV載體仍能夠進(jìn)行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)(圖2C、2D)，但在cPPT中發(fā)生突變的病毒的殘余復(fù)制等于零或極低(圖6A、6B)。一個可能的解釋是獨(dú)立于三鏈體的向核輸入可以發(fā)生在小載體基因組(對于HR-GFP,約4kb)上，但DNA三鏈體的存在對于9.7kb的天然HIV-1基因組的輸入是必須的。實(shí)際上，活躍的，雖然相對低效的，3-4kb大小的DNA分子的向核輸入已有報(bào)道(Hagstrom等，1997)。在所有慢病毒基因組的中央均發(fā)現(xiàn)了負(fù)責(zé)該DNA三鏈體形成的順式作用序列。該中央位置可能基于其對于PIC構(gòu)象的結(jié)構(gòu)含義而進(jìn)化，以致圍繞該三鏈體的線性DNA分子的左臂和右臂的對稱折疊可能是其通過NPC有效進(jìn)入所必須的(圖7B)。如果這對于病毒是對的話，那么該DNA三鏈體的中央位置也可能是載體基因組有效向核輸入所要求的。實(shí)施例本發(fā)明將通過以下實(shí)施例進(jìn)一步闡明，這些實(shí)施例旨在純粹作為本發(fā)明的示例。實(shí)施例1:實(shí)驗(yàn)步驟細(xì)胞MT4細(xì)胞是HTLV-1轉(zhuǎn)化的人CD4+T細(xì)胞，允許急性致細(xì)胞病變性HIV-1感染(Harada等，1985)。H9細(xì)胞不太適合HIV，但可在感染后進(jìn)行慢性生產(chǎn)。MT4和H9細(xì)胞被維持在補(bǔ)加了10。/。胎牛血清(FCS)的RPML1640培養(yǎng)基中。從健康供體獲得外周血淋巴細(xì)胞(PBLs)，用lfig/ml植物凝集素(Wellcome)刺激，并在白介素2(10%lymphocult;BiotestDiagnostics)存在下維持。293T細(xì)胞培養(yǎng)在補(bǔ)加10%FCS的DMEM培養(yǎng)基中.P4指示細(xì)胞是HIV可感染的HeLaCD4+細(xì)胞，帶有處于HIV-1LTR控制下的LacZ基因(Charneau等，1994).P4細(xì)胞培養(yǎng)在補(bǔ)加10%FCS和500pg/mlG418的DMEM培養(yǎng)基中.細(xì)胞的收集和分級分離在母親的知情同意下收集臍帶血液樣品。CD34+細(xì)胞按前人所述(Robin,C.等，1卯1)采風(fēng)miniMACS免疫磁珠分離系統(tǒng)(MiltenyBiotec)純化。磁珠分離的CD34+細(xì)胞的純度大于75%。CD34+CD381o/-組分采用抗CD34-PE-Cy5(I咖unotech)和CD38-PE(BectonDickinson)的鼠源單克隆抗體(MoAbs)以及裝配有氬離子激光的FACSVantageTM(BectonDickinson)通過細(xì)胞分揀進(jìn)一步純化。CD34+細(xì)胞在含有10%DMSO(Sig邁a)的胎牛血清(FCS,干細(xì)胞)中凍存，或立即使用。DNA結(jié)構(gòu)前病毒質(zhì)粒按前人所述(Kunkel,1985)在帶有來自感染性分子克隆pLAI3的EcoRI1.lkb插入片段(4684-5779)的M13mpl8中進(jìn)行定點(diǎn)誘變。誘變引物如下cPPT-AG5'pCAATTTTAAAAGAAGAGGGGGGATT3'(SEQIDNO:l)cPPT-D:5'pATTCATCCACAACTTCAAGCGCCGCGGTGGTATTGGGGGGTAC3'(SEQIDNO:2).通過將該突變的EcoRI片段克隆回pLAI3中構(gòu)建pcPPT-AG、pcPPT-D、pcPPT-25和pCTS。栽體質(zhì)粒載體質(zhì)粒來源于HR，CMVLacZ(Naldini等，1996)。用EGFP基因(Clontech)替換該LacZ報(bào)道基西.EGFP基因采用Pfu聚合酶(Stratagene)從pEGFP-Nl質(zhì)粒中通過PCR擴(kuò)增，并分別在5，和3，末端加上BamHI和XhoI限制性位點(diǎn).PCR引物如下B咖GFP:5'CCGGATCCCCACCGGTCGCCACC3'(SEQIDNO:3)XhoGFP:5'CCCTCGAGCTAGAGTCGCGGCCG3'(SEQIDNO:4).通過將該P(yáng)CR片段克隆回pHR，CMVLacZ的BamHI和Xhol位點(diǎn)中，以EGFP替換該LacZ0RF，構(gòu)建HRGFP栽體.TRIPAU3CMVGFP和TRIPAU3PLCMVGFP:首先，構(gòu)建含有單一LTR的亞克隆，命名為pUCLTR,將TRIPGFP中包含其3，LTR的Kpnl/Xbal片段克隆至pUC18中。然后，通過補(bǔ)平破壞該EcoRI位點(diǎn)，產(chǎn)生載體pUCLTRRI-。為了擴(kuò)增除U3序列的啟動子和增強(qiáng)子之外的整個質(zhì)粒，在pUCLTRRI-上進(jìn)行背馳PCR。引物是DU3-:5'CGGAATTCGGATCCGCGGCCGCATCGATCTTGTCTTCGTTGGGAGTG3'(SEQIDNO:5)DU3+:5'CGGAATTCAGCCGTCTCGAGAGATGCTGCATATAAGCAGC3'(SEQIDNO:6).引物含有插入替代U3序列的限制性位點(diǎn)，其中包括存在于每個引物上的EcoRI位點(diǎn)。用EcoRI消化該P(yáng)CR產(chǎn)物，然后用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌。由此構(gòu)建的質(zhì)粒命名為pLTRAU3RI-。pLTRAU3RI-中插入替代U3序列的多聚接頭是Clal-Notl-BamHI-EcoRI-MluI-XhoI。用pLTRAU3RI-的Kpnl/Xbal片段替代TRIPGFP中含有3'LTR的Kpnl/Nhel片段(Nhel和Xbal限殺U生產(chǎn)物是相容的)，構(gòu)建TRIPAU3PLGFP質(zhì)粒。然后通過Clal/Xhol消化和補(bǔ)平從pLTRAU3RI-中缺失該多聚接頭(PL)。采用pLTRU3APLRI-的Kpnl/Xbal片段交換TRIPGFP的Kpnl/Nhel片段，構(gòu)建TRIPAU3GFP質(zhì)粒。PCR擴(kuò)增pLAI3中包含cPPT和CTS的178bp片段(4793-4971)為了將該片段插入HRGFP的單一ClaI位點(diǎn)中，在引物的5，添加Narl限制性位點(diǎn)NarTRJP+:5'GTGGTCGGCGCCGAATTCACAAATGGCAGTATTCATCC3'(SEQIDNO:7)NarTRIP-:5'GTCGTCGGCGCCCCAAAGTGGATCTCTGCTGTCC3'(SEQIDNO:8)按正確方向插入該三鏈體序列產(chǎn)生TRIPGFP質(zhì)粒載體，而相反方向插入產(chǎn)生TRIPinvGFP'或者，從pcPPT-AG、pcPPT-D、pcPPT-225和pCTS質(zhì)粒擴(kuò)增此相同的三鏈體片段，以產(chǎn)生在cPPT或CTS中含有與相應(yīng)病毒相同突變的載體.TRIPEFlaGFP和TRIPAU3EFlaGFP:用EFla啟動子替換TRIPGFP的CMV啟動子。首先用部分重疊引物分別擴(kuò)增該三鏈體和EF1a啟動子.采用引物NarTRIP+和MluTRIP-在pLai基質(zhì)上擴(kuò)增三鏈體序列，并采用引物MluEFl+和BamEF1-在模板pEFpgkneo上擴(kuò)增EFla啟動子。NarTRJP+:5'GTCGTCGGCGCCGAATTCACAAATGGCAGTATTCATCC3'(SEQIDNO:9)—IDNO:10)MluEF1+:5'CTGATACGCGTCGTGAGGOTCCGGTG3'(SEQIDNO:11)BamEF1-:5'CGGGATCCTG丁GTTCTGGCGGCAAAC3'(SEQEDNO:12)然后采用外部引物NarTRIP+和BamEF1-,對頭兩次PCR產(chǎn)物的混合物進(jìn)行二次PCR。通過該技術(shù)將三鏈體序列和EFla啟動子粘結(jié)起來。用EcoRI/BamHI消化的PCR產(chǎn)物TRIPEFla(NarTRIP+引物在其5，末端中具有EcoRI位點(diǎn))替換含有三鏈體序列和CMV啟動子的TRIPGFP的EcoRI/BamHI片段，構(gòu)建質(zhì)粒TRIPEFlaGFP。為了構(gòu)建TRIPAU3EFlaGFP質(zhì)粒，將含有三鏈體和EFla啟動子的TRIPEFlaGFP的EcoRI/BamHI片段插入TRIPAU3GFP中，替換含有三鏈體序列和CMV啟動子的EcoRI/BamHI片段。病毒和載體制備對于圖1-6中報(bào)道的研究，通過磷酸鈣共沉淀技術(shù)瞬時轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞產(chǎn)生病毒。按前人所述(Naldini等，1996)，通過用載體質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒(p8.2)及VSV包膜表達(dá)質(zhì)粒(pHCMV-G,(Yee等，1994))瞬時共轉(zhuǎn)染293T，產(chǎn)生載體顆粒，所有病毒和載體上清用DNasel(lug/ml,含有l(wèi)uMMgCl2)37X:處理15分鐘。慢病毒顆粒制備對于圖7-9報(bào)道的研究，按前人所述(Naldini等，1996)，通過用載體質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒(p8.2)和VSV包膜表達(dá)質(zhì)粒(pHCMV-G，(Yee等，1994))瞬時共轉(zhuǎn)染293T,制備病毒。所有的病毒和載體上清液用DNasel(ljig/ml,含有l(wèi)jiMMgCl2)37K處理15分鐘.病毒和載體滴定對于圖1-6報(bào)道的研究，采用等量顆粒(每孔lngp24病毒抗原)，在存在20pMDEAE葡聚糖時，通過感染接種在96孔板中的P4細(xì)胞，重復(fù)三次進(jìn)行一個周期的病毒滴定。在整個實(shí)驗(yàn)過程中加入蛋白酶抑制劑Saquinavir(Roche)(lpM)，以將分析限制于單個的感染周期。在感染前一天，通過蚜棲菌素(8nM)處理抑制細(xì)胞有絲分裂。感染后48小時采用化學(xué)發(fā)光(5-Gal報(bào)道基因測試(Boehringer)測量(3半乳糖芬酶活性。用等量載體顆粒(每孔5ngP24)感染HeLa細(xì)胞，重復(fù)三次。在轉(zhuǎn)導(dǎo)后的48小時，用200^1TNB(Tris50mMpH7.5，NaCl150mM)代替培養(yǎng)基，并采用微滴定板熒光計(jì)(Victor2,Wallac)和EGFP適應(yīng)的濾波器(激發(fā)485nm，發(fā)射520nm)定量生活細(xì)胞的熒光。轉(zhuǎn)導(dǎo)步驟對于圖7-9報(bào)道的研究，根據(jù)廠家說明書用纖連蛋白(Bio-WhittakerEurope)包被24孑L或96孑L纟且纟只培養(yǎng)板。將人CD34+群體在純化或融解后按2-3xl(f細(xì)胞/ml立即接種在無血清培養(yǎng)基(含有11.5jiMa-硫代甘油、1.5%BSA(兩者均來自Sigma)、經(jīng)超聲的脂質(zhì)和鐵飽和的人轉(zhuǎn)鐵蛋白的IMDM)或含有10%FCS的a-MEM中，其中還存在4ng/mlpolybrene(Sigma)和4種重組(r)人(hu)細(xì)胞因子rhu-干細(xì)胞因子(SCF，100ng/ml，Amgen提供)、Flt3-配體(FL，100ng/ml，Diaclone)、IL-3(60ng/ml，Sandoz)、和聚乙二醇化(PEG-)rhu-巨細(xì)胞生長和分化因子(MGDF)(10ng/ml，Amgen)，以及100ng病毒P24/ml濃度的濃縮慢病毒，維持24小時。然后洗滌細(xì)胞，并在淋巴-骨髓條件(lympho-myeloidconditions)中培養(yǎng)48小時(在補(bǔ)加了10%人血清、5%FCS和下列7種細(xì)胞因子的RPMI中用MS5細(xì)胞預(yù)先包被組織培養(yǎng)板rhu-SCF(50ng/ml)、rhu-FL(50ng/ml)、PEG-rhu-MGDF(50ng/ml)、rhu-IL-3(10ng/ml)、rhu-IL-2(5ng/ml)、rhu-IL-15(10ng/ml)、和rhuIL-7(20ng/ml)(這三種IL來自Diaclone))。然后，采用CD34-PE-Cy5MoAb(Immunotech)評價CD34+細(xì)胞組分中的eGFP表達(dá)。采用Cellquest軟件(BectonDickinson)在FACSScan上進(jìn)行分析。克隆發(fā)生和長期培養(yǎng)(LTC)測定在含有30%FCS、1%去離子BSA、和10-4M2-巰基乙醇的0.8%甲基纖維素中，在存在50ng/mlrhu-SCF、10ng/mlrhu-GCSF(Amgen)、2ng/mlrhu—IL3矛口2U/mlrhu—EP0(Amersham)時，測定來自人新鮮CB細(xì)胞的克隆發(fā)生祖先細(xì)胞。按前人所述(PflumioF等，1996)，在存在rhu-SCF、-IL-3、-EPO、和-GM-CSF(10ng/ml)時，接種來自移植的NOD-SCID小鼠的骨髓(BM)細(xì)胞。根據(jù)已描述的標(biāo)準(zhǔn)(CroisilleL等，1994)在第14-16天對祖先細(xì)胞評分，并采用NikonEclipseTE300顯微鏡通過熒光顯微術(shù)觀察EGFP表達(dá)。按前人所述(IssaadC.等，1993),采用配有ACDU(BD)的FACSvantage在96孔板的有限稀釋物中，或在含有鼠基質(zhì)細(xì)胞系MS5匯合細(xì)胞層的24孔板的大量培養(yǎng)物中，進(jìn)行長期培養(yǎng)(LTC)。5-10周后，收獲粘著和非粘著細(xì)胞并接種用于克隆發(fā)生測定。對于克隆發(fā)生和LTC-IC測定，單獨(dú)地分別挑取集落并在PCR分析前凍存。PCR分析從來源于克隆發(fā)生祖先細(xì)胞的集落或培養(yǎng)在淋巴骨髓培養(yǎng)物中的克隆獲得基因組DNA，對其進(jìn)行PCR分析。裂解細(xì)胞并在含有蛋白酶K(10jig/ml)、KC1(50mM)、Tris-HCl(10mM，pH8.3)、MgCl2(2,5mM)、明膠(O.lmg/ml)、NP40(0.45%)、和Tween20(0.45%)的20fil緩沖液中消化蛋白質(zhì)。采用有義引物5，CCCTCGAGCTAGAGTCGCGGCCG3，(SEQIDNO:13)和反義引物5，CCGGATCCCCACCGGTCGCCACC3，(SEQIDNO:14)，以62t:的退火溫度進(jìn)行基因組DNA的擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)生一800bp產(chǎn)物。病毒和載體DNA分析以高復(fù)數(shù)病毒(每106個細(xì)胞150ngp24)感染P4或MT4細(xì)胞，或用載體(每106個細(xì)胞25ngp24)進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，對于P4細(xì)胞還存在20fig/mlDEAE葡聚糖。在各種時間抽提來自感染或轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的DNA，并作限制性分析和Southern印跡分析。在所有的情況下，通過DpnI消化從分析中除去污染的細(xì)菌質(zhì)粒DNA。來自感染細(xì)胞的DNA通過Mscl和Xhol進(jìn)行消化，而采用EcoNI、Avail和Xhol消化來自轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的DNA。10jig消化DNA電泳和轉(zhuǎn)移后，采用隨機(jī)引發(fā)「P]標(biāo)記DNA探針(RediprimeII，Amersham)對膜進(jìn)行雜交。采用下列引物從pLAI3質(zhì)粒模板PCR擴(kuò)增病毒特異性DNA探針5Msc:5'AGAAGAAATGATGACAGCATG3'(SEQIDNO:15)3Msc:5'TGCCAGTTCTAGCTCTG3'(SEQIDNO:16).所獲1680bpDNA片段(pLAI3的第1818-3498位)與病毒基因組第2655位Mscl限制性位點(diǎn)部分重疊。采用以下引物在pTRIPGFP上通過PCR合成載體探針5EcoNI:5'CAGGGACTTGAAAGCGAAAG3'(SEQIDNO:17)3EcoNl:5'GCTTGTGTAATTGTTAATTTCTCTGTC3'(SEQIDNO:18)載體探針是一個1027bp片段(pTRIPGFP第649-1676位)，與載體基因組第1156位EcoNI位點(diǎn)部分重疊。為了測定來自野生型和PPT-AG及cPPT-D病毒的逆轉(zhuǎn)錄DNA的量，進(jìn)行類似的程度，不同的是用Mscl和DpnI消化感染后第12小時提取的DNA。雜交用的探針是pLAI3的Mscl1.9kb內(nèi)部片段。雜交信號用磷光成像儀(MolecularDynamics)和ImageQuant軟件定量。原位雜交以高復(fù)數(shù)(對于所有病毒均是每106個細(xì)胞2jigp24抗原)，在存在20fig/mlDEAE葡聚糖的情況下，感染P4細(xì)胞'在感染后24小時，胰蛋白酶消化細(xì)胞，充分洗滌(以便除去吸附在質(zhì)膜中的病毒顆粒)，然后重新接種在24孔板中的蓋玻片上。再培養(yǎng)細(xì)胞48小時，并室溫在4。/。PFA/PBS固定20分鐘.在PBS中洗滌細(xì)胞，并室溫以PBS中的0.5%Triton/0.5%Saponin進(jìn)行透化處理5分鐘，用RNaseA(2xSSC中200jig/ml)處理脫水樣品1小時，然后用蛋白酶K(PBS中6pg/ml)處理約5分鐘。70。/。去離子甲酰胺/2xSSC70X:孵育2分鐘，之后30。/。去離子甲酰胺/2xSSC70X:終育2分鐘，使樣品變性.采用切刻平移生物素化的pLAI3質(zhì)粒，37X:過夜雜交(2xSSC中50%去離子甲酰胺、10%硫酸葡聚糖、10ng/ml鮭精DNA、0.1%Tween20)。充分洗滌樣品(在2xSSC/50X甲酰胺中室溫然后50"作系列洗滌)。采用酪胺-鏈霉親和素TSA-Direct試劑盒(NEN)根據(jù)廠家說明檢測雜交的探針。實(shí)施例2:逆轉(zhuǎn)錄的中心起始是HIV-1復(fù)制周期的必需步驟在以前的工作中，我們顯示了cPPT和CTS序列中的保守性突變嚴(yán)重地?fù)p害了病毒復(fù)制(Char腿u等，1992;Hung腦等，1992)。中心起始突變病毒(cPPT-225)和終止突變病毒(CTS)在一輪滴定實(shí)驗(yàn)中分別表現(xiàn)出4倍和IO倍的感染性降低。為了滅活cPPT的功能，在重疊的整合酶編碼區(qū)域中引入半保守性突變。在突變病毒cPPT-D中，第188位賴氨酸到精氨酸的改變使得在PPT引物的19個核苷酸序列中引入總共10個突變(圖1A)(Huber和Richardson,1990)。通過構(gòu)建對照cPPT-AG突變病毒，檢查該氨基酸改變對病毒復(fù)制的影響，在此對照突變病毒中嘌呤向嘌呤的單個突變，對于cPPT的多嘌呤性質(zhì)而言，誘導(dǎo)相同的氨基酸改變。DNA三鏈體在逆轉(zhuǎn)錄野生型和cPPT-AG病毒DNA中的存在、以及在cPPT-D病毒DNA中的缺失，按照前人所述(Harris等，1981;Charneau和Clavel,1991)通過SI核酸酶切割來自感染細(xì)胞的HirtDNA進(jìn)行驗(yàn)證。首先在經(jīng)典動力學(xué)復(fù)制實(shí)驗(yàn)中采用細(xì)胞培養(yǎng)物評價病毒的感染性。用等量病毒顆粒感染PHA刺激的外周血淋巴細(xì)胞(PBLs)和MT4細(xì)胞，根據(jù)病毒上清液的衣殼蛋白(p24)含量進(jìn)行標(biāo)化，并在該培養(yǎng)物上清液中持續(xù)跟蹤逆轉(zhuǎn)錄酶的活性一段時間(圖IB)。在兩種細(xì)胞系統(tǒng)中野生型HIV-1LAI和cPPT-AG對照病毒的生長曲線是相似的.K188R突變自然發(fā)生在一些HIV-1分離抹中，這一事實(shí)已經(jīng)提示它對于整合酶和PPT功能幾乎沒有或沒有影響.相反，當(dāng)用cPPT-D突變病毒感染PBL時，在培養(yǎng)的15天內(nèi)沒有檢測到復(fù)制.MT4細(xì)胞也是同樣的，盡管它們對HIV感染高度敏感.cPPT-D突變病毒在永生化細(xì)胞系如H9或CEM中也是非感染性的(資料未顯示)。然后通過基于單輪復(fù)制的滴定定量分析病毒感染性(圖1C)。用同等量不同病毒的病毒顆粒感染P4指示細(xì)胞(HeLaCD4LTR-LacZ)(Charneau等，1994)。這些一周期滴定證實(shí)cPPT-D突變病毒幾乎完全喪失感染性。在P4細(xì)胞中，cPPT-AG對照的感染性與野生型病毒的感染性一致，而cPPT-D突變體的感染性極大地降低至接近背景的水平。在蚜棲菌素處理的非分裂P4細(xì)胞中獲得了相同結(jié)果(圖1C，右圖)。這些結(jié)果有力地提示，逆轉(zhuǎn)錄的中心起始是HIV在非分裂以及增殖細(xì)胞中復(fù)制所必需的。實(shí)施例3:cPPT中的突變不影響病毒生產(chǎn)我們檢查到在cPPT-AG和cPPT-D質(zhì)粒前病毒中引入的不同突變不影響復(fù)制周期的后期步驟。在HeLa細(xì)胞被前病毒質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染后，根據(jù)上清液中的P24含量，定量病毒的生產(chǎn)。cPPT突變病毒的生產(chǎn)被發(fā)現(xiàn)與野生型病毒的生產(chǎn)沒有顯著不同(圖2A)。因此突變K188R沒有影響HIV-1復(fù)制的晚期階段。這樣，cPPT-D突變病毒表型涉及的缺陷步驟必定早于病毒DNA的表達(dá)并屬于HIV復(fù)制周期的早期階段。實(shí)施例4:cPPT中的突變不影響HIV-1基因組的逆轉(zhuǎn)錄速率通過量化單輪逆轉(zhuǎn)錄中合成的DNA，評價cPPT中突變對病毒DNA合成的影響(圖2B)。采用相應(yīng)的MscIDNA片段作為探針，通過Southern印跡檢測來自感染細(xì)胞的病毒DNA的內(nèi)部MscI限制性片段并量化.由于該內(nèi)部MscI片段對于整合的前病毒DNA和未整合的線性和環(huán)狀分子是共同的，因此不管是整合還是未整合狀態(tài)，它的定量都反映了病毒DNA的總量。為了將該分析限制于單周期逆轉(zhuǎn)錄，感染后12小時，再次感染周期起始前，從感染的P4細(xì)胞收獲DNA.在單個周期的逆轉(zhuǎn)錄中逆轉(zhuǎn)錄的DNA總量在用cPPT-D突變體、cPPT-AG對照或野生型病毒感染后是相同的.這些實(shí)驗(yàn)說明，盡管cPPT中的突變造成病毒復(fù)制流產(chǎn)，但它們不影響DNA合成的速率。cPPT突變病毒的復(fù)制缺陷涉及病毒DNA合成的后續(xù)步驟。實(shí)施例5:缺少中心DNA三鏈體不影響HIV-1PIC的體外整合按Farnet所述(Farnet和Haseltine，1990)，稍加改動，在定量性體外整合測定中比較野生型HIV-1和中心起始突變體的PIC的體外整合能力(圖2C)。由于HIV-1復(fù)制復(fù)合物僅瞬時存在于剛感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中(Barbosa等，1994)，制備足量的HIVPIC需要大量感染和4-6小時的細(xì)胞分級分離。這是通過共培養(yǎng)慢性感染了野生型或cPPT-225病毒的H9細(xì)胞和未感染的HUT78耙細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)的。代替不能建立慢性感染的非感染性cPPT-D，cPPT-0225突變病毒(圖1A)被選擇用于這些實(shí)驗(yàn)。cPPT-225突變病毒的殘余感染性低，但足于允許它在細(xì)胞培養(yǎng)物中緩慢增殖(Charneau等，1992)。從感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中分離HIVPIC,并在線性化Bluescript質(zhì)粒靶DNA存在時進(jìn)行孵育。對HIV-1探針有反應(yīng)性的12.7kb片段(相應(yīng)于中間整合了3kb靶DNA的9.7kb線性HIV基因組的預(yù)期大小)反映了整合的發(fā)生.整合在質(zhì)粒DNA中的線性DNA的量在野生型和cPPT225突變病毒之間沒有區(qū)別(圖2C).因此，來自cPPT突變體的HIV-1PIC保留了其體外整合的全部能力。中心DNA三鏈體突變病毒的缺陷性復(fù)制步驟必定發(fā)生在逆轉(zhuǎn)錄之后但在線性HIV基因組整合至宿主細(xì)胞染色質(zhì)中之前.實(shí)施例6:中心DNA三鏈體突變病毒的減弱的向核輸入前述實(shí)驗(yàn)提示，中心DNA三鏈體突變病毒的復(fù)制缺陷與HIVPIC到達(dá)細(xì)胞靶標(biāo)染色質(zhì)有關(guān).因此，我們測試了cPPT突變病毒DM的向核輸入缺陷的假說.缺乏在病毒DNA水平上對向核輸入的定量和可重復(fù)的分析妨礙了對HIV-1PIC向核輸入的研究.一旦在細(xì)胞質(zhì)中逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄病毒線性DNA即輸入到核內(nèi)，在核內(nèi)它要么整合，要么環(huán)化。含有一個或兩個LTR的非整合逆轉(zhuǎn)錄DNA環(huán)僅在核內(nèi)發(fā)現(xiàn)，因而代表了病毒DNA向核輸入的方便的標(biāo)志。為了評價HIVDNA向核輸入，以前的研究使用兩個非整合LTRDNA環(huán)的PCR擴(kuò)增。然而，正如本文和Barbosa等(1994)報(bào)道的，因?yàn)閮蓚€LTR的環(huán)代表被感染細(xì)胞中HIVDNA的很少一部分，所以它們的檢測對于細(xì)胞生理或病毒感染性的較小改變十分敏感。因此，我們設(shè)計(jì)了一種新的測定方法，其允許通過Southern印跡對HIV-DNA合成、環(huán)化和整合進(jìn)行定量跟蹤。簡而言之，在多個時間點(diǎn)從感染細(xì)胞制備DNA，用切割HIV-1基因組兩次的限制酶MscI消化。^使用剛好重疊該5，MscI位點(diǎn)的PCR產(chǎn)生的DNA探針，揭示了幾個特異的條帶(圖3A)。內(nèi)部1.9kbMscI片段是所有病毒DNA種類共有的，無論其處于整合還是非整合狀態(tài)，該條帶的定量指示了感染細(xì)胞中病毒DNA的總量。2.6kb條帶相應(yīng)于非整合線性HIV-DNA的遠(yuǎn)端5，Mscl片段。為了使由于DNA環(huán)特異片段大小較大造成的轉(zhuǎn)移偏差降低到最小，進(jìn)一步用Xhol切割DNA。這樣，一和兩LTR的環(huán)狀DNA分別出現(xiàn)在2.8和3.4kb。因?yàn)镈NA探針剛好與5，Mscl位點(diǎn)重疊，所以每個條帶的強(qiáng)度直接與相應(yīng)病毒DNA種類的量成比例。整合的前病毒DNA的量通過從病毒DNA總量中減去非整合線性和環(huán)狀病毒DNA的信號計(jì)算。在Hirt分級分離分開了低分子量非整合病毒DNA和高分子量整合前病毒DNA后，進(jìn)行相同感染細(xì)胞群體的平行定量。這給出了相同的結(jié)果，因此證明一步減法計(jì)算是有效的。正如總病毒DNA(1.9kb內(nèi)部條帶)積累的動力學(xué)所表明的，病毒DNA合成在感染后進(jìn)行24-48小時，反映了異步感染過程.cPPT-AG和cPPT-D突變病毒總病毒DNA的量與野生型HIV-1類似.正如先前的一樣，cPPT中的突變不影響DNA合成速率.早在感染后6小時，細(xì)胞中就存在可檢測量的全長非整合線性DNA(圖3B).整合的前病毒和DNA環(huán)首先在感染后12小時檢測到.整合和環(huán)化在再36小時后進(jìn)行到完成.一個感染周期完成后，對于野生型病毒，約55。/。的病毒DNA整合到宿主細(xì)胞DNA中，約35%的環(huán)化成一個LTR的環(huán)，不到10%的小部分保持穩(wěn)定的非整合線性DNA形式(圖3C)。值得注意的是，盡管在感染后48小時可檢測到，但兩LTR的環(huán)狀DNA僅以痕量存在。cPPT-AG對照病毒的DNA與野生型病毒的DNA的加工方式類似。對于cPPT-D突變病毒，細(xì)胞內(nèi)病毒DNA模式有明顯改變，非整合線性分子明顯和持續(xù)積累。在感染后48小時，僅產(chǎn)生非常少量的一LTR環(huán)狀DNA和整合的前病毒DNA，90%以上的cPPT-D突變DNA以非整合線性形式被阻斷(圖3C)。預(yù)期向核輸入缺陷降低核病毒DNA種類(整合的前病毒和一或兩LTR環(huán))的比例，并同時增加非轉(zhuǎn)移線性DNA分子的比例。因此，cPPT-D突變病毒的細(xì)胞內(nèi)DNA分布圖強(qiáng)烈說明病毒DNA向核輸入的缺陷。實(shí)施例7:中心DNA三鏈體突變病毒的線性DNA在核膜附近積累為了進(jìn)一步表征中心DNA三鏈體突變病毒的向核輸入缺陷，我們研究了突變的線性DNA分子是否在特定亞細(xì)胞區(qū)室內(nèi)積累的問題。向核輸入過程可以分為兩個主要階段，核成分?？吭诤四ど虾推滢D(zhuǎn)移通過核孔復(fù)合物(NPC)。我們首先進(jìn)行了被感染細(xì)胞的傳統(tǒng)核/胞質(zhì)分級分離，然后用Southern印跡檢測病毒DNA。感染后24小時，所有病毒的全部病毒DNA都與被感染P4細(xì)胞的核相聯(lián)(圖4A),表明HIVDNA?？亢四げ槐恢行腄NA三鏈體缺乏影響。為了證實(shí)中心三鏈體缺陷DNA分子在核膜積累，我們使用熒光原位雜交(FISH)直接顯現(xiàn)HIV基因組的細(xì)胞內(nèi)位置。P4細(xì)胞在一個周期的條件下被高復(fù)數(shù)感染，用全長HIV-l基因組探針雜交，并通過解巻積顯徵鏡(deconvolutionmicroscopy)觀察，對于野生型病毒和cPPT-AG對照病毒，主要在核內(nèi)發(fā)現(xiàn)特異斑點(diǎn)(圖4B).因?yàn)镕ISH不能區(qū)分不同HIVDNA種類，所以這些核內(nèi)病毒DNA分子可能是整合的前病毒或非整合的DNA環(huán)，一些稀少基因組與核膜相聯(lián)，可能代表感染后相同時間用Southern印跡檢測到的殘余線性DNA.其它一些與質(zhì)膜相聯(lián)的點(diǎn)很可能來自含有部分逆轉(zhuǎn)錄基因組的膜吸附的缺陷顆粒(Lori等，1992)。相反，對于cPPT-D突變病毒，HIV基因組主要位于核膜處，并在核內(nèi)幾乎完全沒有。由于Southern印跡DNA分布圖表明幾乎所有cPPT-DDNA都被阻斷為線性形式，所以我們能推定，這些與核膜相聯(lián)的HIV基因組是非整合的線性DNA分子。這種在感染細(xì)胞內(nèi)直接觀察病毒DNA分子證實(shí)，中心三鏈體突變體的病毒DNA與核膜相聯(lián)。我們的FISH實(shí)驗(yàn)提示，cPPT突變病毒在其基因組轉(zhuǎn)移通過NPC方面是缺陷性的。然而，通過突變病毒DNA定位于NPC胞質(zhì)側(cè)得到的轉(zhuǎn)移缺陷的明確證明不可能通過FISH實(shí)驗(yàn)獲得?？傊?，我們從這些結(jié)果得出結(jié)論，在逆轉(zhuǎn)錄過程中由中心起始和終止步驟產(chǎn)生的HIV-1的中心DNA三鏈體對于HIV-1PIC進(jìn)入宿主細(xì)胞核而言是重要的。沒有DNA三鏈體，病毒DNA向核輸入在HIV-1DNA轉(zhuǎn)移通過核孔之前即刻或過程中的一個階段被嚴(yán)重削弱。實(shí)施例8:中心DNA三鏈體對基于HIV-1的載體系統(tǒng)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響鑒定了中心DNA三鏈體是HIV-1向核輸入的關(guān)鍵決定因子后，我們測試了在前人描述的HRHIV-1載體(Naldini等，1996)中插入HIV-1的中心DNA三鏈體的影響(圖5A)。為了監(jiān)測基因轉(zhuǎn)導(dǎo)，還插入編碼綠色熒光蛋白(GFP)的基因。含有DNA三鏈體序列的載體稱為TRIPGFP。對照包括具有突變的cPPT或CTS和以反向無功能方向插入的野生型中心區(qū)域的類似結(jié)構(gòu)(TRIPinvGFP)。DNA三鏈體在逆轉(zhuǎn)錄TRIPGFP載體DNA中的存在，以及在HRGFP、TRIPinvGFP和含有突變版本中心三鏈體序列的載體中的缺乏，通過從轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞分離的HirtDNA的SI核酸酶切割來證實(shí)。瞬時轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的載體顆粒數(shù)在轉(zhuǎn)導(dǎo)前根據(jù)轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清中衣殼蛋白(p24)的水平、逆轉(zhuǎn)錄酶活性、和基因組載體RNA的量進(jìn)行標(biāo)化.獲得了各種病毒的類似的生產(chǎn)，三個標(biāo)化標(biāo)準(zhǔn)之間呈線性相關(guān)(數(shù)據(jù)未顯示).因此，HIV-1基因組中心區(qū)域插入到HR載體中不影響基因組RNA殼體化的比率。以等價量的HR-GFP或TRIP-GFP載體顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂或非分裂(蚜棲菌素處理的)HeLa細(xì)胞，并通過熒光定量監(jiān)測48小時后GFP的表達(dá)。由于融合載體顆粒直接遞送GFP蛋白至耙細(xì)胞產(chǎn)生的GFP活性假轉(zhuǎn)導(dǎo)這樣計(jì)算用HIV-1RT抑制劑(1pMNevirapin，BoehringerIngelheim)處理過的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，并從熒光信號中減去該背景。由于載體上清中鈣/磷酸DNA共沉淀引起的次級轉(zhuǎn)染導(dǎo)致的非特異性熒光通過在轉(zhuǎn)導(dǎo)前用DNaseI處理載體貯存液來消除。在這些條件下，在HIV載體中三鏈體序列的存在使GFP在HeLa細(xì)胞中的轉(zhuǎn)導(dǎo)增加了10倍以上(圖5B)。在其它耙細(xì)胞系如MT4或293T等中觀察到基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的類似的增強(qiáng)(數(shù)據(jù)未顯示)。如果三鏈體序列以相反方向插入(圖5B)或在cPPT中突變(數(shù)據(jù)未顯示)，則該效果喪失。實(shí)施例9:HIV-1載體中DNA三鏈體的存在增加載體基因組向核輸入的比率到野生型水平然后希望確定，HIV載體中插入三鏈體序列誘導(dǎo)的GFP熒光增加是否是由于其對載體DNA向核輸入的影響。為了回答這個問題，我們寸務(wù)改了細(xì)胞內(nèi)病毒DNA的定量Southern印跡分析以適應(yīng)載體系統(tǒng).栽體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的DNA用EcoNI和Avail消化產(chǎn)生內(nèi)部0.8kb片段，并用Xhol消化.使用剛好與EcoNI位點(diǎn)重疊的PCR產(chǎn)生的DNA探針，非整合線性栽體DNA、一和兩LTRDNA環(huán)特異的信號預(yù)計(jì)分別在1.2kb、1.4kb和2kb。轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞后在各時間點(diǎn)分析載體DNA的加工。對于含有或缺乏DNA三鏈體的載體，轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中合成的載體DNA的總量是可比較的(圖5C).同樣，以兩種方向在HR載體中插入cPPT和CTS序列不影響其基因組逆轉(zhuǎn)錄的速率.磷光成象(phosphorimage)定量后，我們發(fā)現(xiàn)HR-GFP和TRIPinv-GFP載體(圖5D)的DNA的細(xì)胞內(nèi)命運(yùn)與中心三鏈體缺陷病毒的DNA的細(xì)胞內(nèi)命運(yùn)非常類似，TRIP-GFP載體的DNA的命運(yùn)與野生型HIV-1LAI病毒的DNA的命運(yùn)相同(圖3C)。DNA向核輸入的缺陷在服-GFP和TRIPinv-GFP載體中明顯。來自這些載體的DNA的細(xì)胞內(nèi)命運(yùn)的特征是，非整合線性分子的強(qiáng)烈積累，伴隨少量整合的前病毒和一和兩LTR環(huán)。這種DNA分布圖使人強(qiáng)烈聯(lián)想到cPPT-D突變病毒的分布。在轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中載體DNA加工完成后，服-GFP和TRIPinv-GFP結(jié)構(gòu)的DNA的70-80%保持為非整合線性分子形式，而僅10-15%為LTR環(huán)上的非整合型，5-10%為整合的前病毒。這種低而可檢測量的整合載體DNA可解釋用HR-GFP或TRIPinv-GFP載體獲得的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。該定量測定分4斤還顯示HIVDNA的三鏈體序列以正確方向插入HR載體彌補(bǔ)了其向核輸入缺陷，達(dá)到野生型水平。轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中的TRIP-GFPDNA的最終狀態(tài)與用野生型HIV-1病毒所觀察到的類似50%或更多的載體DNA整合靶細(xì)胞的染色質(zhì)，相當(dāng)大一部分被環(huán)化，而很少分子保持非整合的線性DNA(比較圖5D和3C)。相反，三鏈體序列插入到HR載體中內(nèi)部CMV啟動子上游不影響轉(zhuǎn)錄水平的GFP表達(dá)。這通過用pHR-GFP、pTRIP-GFP和pTRIPinv-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞和熒光定量進(jìn)行了檢驗(yàn)(數(shù)據(jù)未顯示)。從這些結(jié)果可以推斷，用TRIP-GFP載體獲得的GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)增加完全是由于三鏈體的存在對其向核輸入的強(qiáng)烈刺激。實(shí)施例10:含有DNA三鏈體序列的HIV-1載體允許在造血干細(xì)胞中有效轉(zhuǎn)移基因圖7A和7B闡述了使用CD34+人臍帶血細(xì)胞所作的兩個成功轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。它們顯示，經(jīng)過20或60小時的短轉(zhuǎn)導(dǎo)程序后，分別有71.5%和大于90%的CD34+細(xì)胞強(qiáng)烈表達(dá)GFP報(bào)道蛋白，該表達(dá)反映了細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)，因?yàn)橹辽僭谙嗤壤贤ㄟ^對從祖細(xì)胞來源的細(xì)胞集落提取的DNA進(jìn)行PCR分析證實(shí)了病毒的整合，所述細(xì)胞集落是在克隆發(fā)生祖細(xì)胞分析中接種細(xì)胞后14天收集的.使用新鮮純化的CD34+細(xì)胞或純化后冷凍并在數(shù)周后解凍用于轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)的相同CD34+細(xì)胞獲得了相同的結(jié)果。我們還使用另一種造血干細(xì)胞來源，即在細(xì)胞因子刺激后經(jīng)cytapheresis收集的外周血mobilized干細(xì)胞(PBMC)，獲得了可比的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。另外，或者在純化后即刻或者在冷凍/解凍步驟后轉(zhuǎn)導(dǎo)CD34+PBMC，獲得了相同的結(jié)果。采用長期培養(yǎng)(LTC)和NOD-SCID種群恢復(fù)(repopulating)實(shí)驗(yàn)，我們顯示，我們轉(zhuǎn)化了具有淋巴-骨髓多潛能(multiplely即ho-myeloidpotentialities)和移植后4個月種群恢復(fù)NOD-SCID鼠骨髓能力的細(xì)胞。這些功能實(shí)驗(yàn)代表目前已有的評價人造血干細(xì)胞功能的最終實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例11:在慢病毒載體中DNA三鏈體序列的存在強(qiáng)烈刺激向造血干細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移圖8中報(bào)道的劑量/反應(yīng)實(shí)驗(yàn)(代表3個實(shí)驗(yàn))被設(shè)計(jì)用于比較含有或缺乏DNA三鏈體序列的HIV-1載體在人造血干細(xì)胞中的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。我們首先將獲得的CD34+eGFP+細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)作為用于轉(zhuǎn)導(dǎo)的載體濃度的函數(shù)作圖(A),我們觀察到，無論載體為何種劑量，TRIP+載體都比TRIP-載體更有效，對于每個載體500ng病毒P24/ml,分別有平均40±19%和15.4±12.5%的CD34+細(xì)胞是eGFP十的(n=3個實(shí)驗(yàn))。用TRIP-GFP載體轉(zhuǎn)導(dǎo)后獲得的GFP+細(xì)胞的最終百分?jǐn)?shù)比用HR-GFP載體轉(zhuǎn)導(dǎo)后獲得的結(jié)果增加4-6倍。當(dāng)將熒光強(qiáng)度對病毒劑量作圖時，兩種載體之間效率的差別也很明顯.TRIP-(HR-GFP)載體在劑量為100ngP24/ml時達(dá)到平臺，而對于TRIP+載體，轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中熒光強(qiáng)度隨載體劑量的增加而增加.這可能反映了TRIP-載體整合前形式的向核輸入的限制，以及用增加劑量的TRIP-GFP載^轉(zhuǎn)導(dǎo)后每個細(xì)胞整合拷貝數(shù)增加。第三個閨合并了兩個方面，并顯示DNA三鏈體序列對人HSC中GFP熒光活性產(chǎn)生的影響.正如所顯示的，在HIV載體中DNA三鏈體序列的存在誘導(dǎo)HSC中GFP生產(chǎn)增加IO倍以上.實(shí)施例12:—小部分整合拷貝的HIV載體基因組在人造血轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中保持沉默有可能發(fā)生整合的轉(zhuǎn)基因的失活。當(dāng)用通過PCR分析整合慢病毒載體確定的轉(zhuǎn)導(dǎo)祖先細(xì)胞來源的細(xì)胞集落的百分?jǐn)?shù)來評價時，轉(zhuǎn)移效率總是比用轉(zhuǎn)導(dǎo)程序結(jié)束后48小時通過FACS分析確定的〔034+/60+細(xì)胞百分?jǐn)?shù)評價時更好。這反映了由于其整合位點(diǎn)或在細(xì)胞增殖和分化時漸進(jìn)和隨機(jī)的前病毒失活出現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄上失活的前病毒我們已觀察到來自單個骨髓克隆發(fā)生祖先的集落，一些亞克隆可以是GFP光亮的，而其它是陰性的，反映了在該表現(xiàn)型均一的克隆祖先中整合轉(zhuǎn)基因的隨機(jī)轉(zhuǎn)錄失活。實(shí)施例13:含有U3區(qū)缺失版本的LTR和內(nèi)部EFlct的HIV載體是轉(zhuǎn)導(dǎo)造血干細(xì)胞的更有效系統(tǒng)在圖9中，我們比較了包含DNA三鏈體序列的HIV-1來源的各種載體轉(zhuǎn)導(dǎo)人臍帶血CD34+細(xì)胞的能力。分析了缺失3，LTR大部分U3區(qū)域?qū)FP在CD34+細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)和表達(dá)的影響。在CMV內(nèi)部啟動子或EFloc內(nèi)部啟動子(Kim等，1990)驅(qū)動GFP報(bào)道基因表達(dá)的條件下進(jìn)行含完整HIV-1LTR或U3缺失版本的載體的比較。在用針對P24(衣殼蛋白)HIV-1抗原的市售ELISA分析(D叩ont)對載體貯藏液標(biāo)化后，所有轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)都使用相同濃度的載體顆粒(500ngP24/ml)。在24小時轉(zhuǎn)導(dǎo)期后48小時(圖9A)或120小時(圖9B)進(jìn)行流式細(xì)胞測定分析(FACS)。有趣的是，在所有情況下，在HIV-1載體中缺失LTR的U3區(qū)誘導(dǎo)了GFP陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)輕微增加。當(dāng)在48小時分析時該增加為中等。此時，假轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制可能負(fù)責(zé)小部分的GFP陽性細(xì)胞。假轉(zhuǎn)導(dǎo)是通過融合逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒直接遞送GFP蛋白到靶細(xì)胞，而不需逆轉(zhuǎn)錄病毒載體基因組的實(shí)際整合。用U3缺失版本HIV-1載體轉(zhuǎn)導(dǎo)后GFP陽性百分?jǐn)?shù)的增加在轉(zhuǎn)導(dǎo)后120小時變得更顯著(圖9B).此時，用TRIP△U3-EFla-GFP載體轉(zhuǎn)導(dǎo)后看到，與用含完整HIV-1LTR的等價載體獲得的結(jié)果相比，GFP陽性相比百分?jǐn)?shù)增加達(dá)兩倍.更重要的是，HIV-1三鏈體載體中HIV-1LTR的U3區(qū)的缺失誘導(dǎo)了GFP報(bào)道蛋白的更好表達(dá)。對于U3缺失版本，當(dāng)用FACS分析時轉(zhuǎn)導(dǎo)的人HSC中熒光強(qiáng)度平均值總是比用含完整HIV-1LTR的栽體獲得的相應(yīng)值高3到5倍。無論CMV或EFla啟動子用作HIV-l載體結(jié)構(gòu)中的內(nèi)部啟動子，都觀察到GFP表達(dá)的該增強(qiáng)。解釋轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中GFP蛋白表達(dá)增強(qiáng)的分子機(jī)制還不清楚。HIV-1LTR中一些序列可能對內(nèi)部啟動子驅(qū)動的表達(dá)有負(fù)影響。或者，HIV-1LTR起始的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄可能干擾內(nèi)部啟動子處轉(zhuǎn)錄的起始。該研究還顯示，在人HSC中EFlot啟動子是比CMV啟動子更好的啟動子。在圖9B中，對于EFla啟動子，GFP熒光強(qiáng)度平均值比CMV啟動子相應(yīng)值好3到5倍。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明了，在本發(fā)明的實(shí)施中可以進(jìn)行各種修改和改變，而不脫離本發(fā)明的范圍或精神。本發(fā)明還公開了以下內(nèi)容1.分離的或純化的核酸，含有至少一個拷貝的逆轉(zhuǎn)錄病毒cPPT和CTS順式作用區(qū)域，其中該cPPT和CTS區(qū)域誘導(dǎo)三鏈DNA結(jié)構(gòu)。2.項(xiàng)目l的核酸，其中逆轉(zhuǎn)錄病毒是慢病毒。3.項(xiàng)目2的核酸，其中逆轉(zhuǎn)錄病毒是人免疫缺陷病毒(HIV)。4.項(xiàng)目3的核酸，其中HIV是HIV-1或HIV-2。5.項(xiàng)目2的核酸，其中慢病毒是VISM、EIAV、FIV、或CAEV。6.項(xiàng)目1的核酸，其含有單個拷貝的逆轉(zhuǎn)錄病毒cPPT和CTS區(qū)域。7.項(xiàng)目1的核酸，其中三鏈結(jié)構(gòu)含有逆轉(zhuǎn)錄病毒的cPPT和CTS順式作用序列。8.項(xiàng)目1的核酸，還含有異源核酸序列。9.項(xiàng)目8的核酸，其中異源核酸序列編碼肽、多肽、或蛋白質(zhì)。10.項(xiàng)目9的核酸，其中異源核酸序列編碼治療性蛋白質(zhì)。11.含有項(xiàng)目1的核酸的栽體。12.項(xiàng)目ll的載體，其是表達(dá)載體、穿梭載體、整合栽體、轉(zhuǎn)座子、或逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。13.項(xiàng)目ll的載體，其是pTRIPAU3EFlctGFP。14.含有項(xiàng)目ll的栽體的重組細(xì)胞。15.含有項(xiàng)目1的核酸的病毒。16.項(xiàng)目15的病毒，其是逆轉(zhuǎn)錄病毒。17.項(xiàng)目16的逆轉(zhuǎn)錄病毒，其是慢病毒。18.含有項(xiàng)目l的核酸的重組細(xì)胞。19.項(xiàng)目18的重組細(xì)胞，其中該細(xì)胞是HeLa細(xì)胞或造血細(xì)胞。20.項(xiàng)目19的重組細(xì)胞，其是造血干細(xì)胞。21.將目的核酸插入至耙細(xì)胞的核內(nèi)的方法，所述方法包括在允許攝取目的核酸至靶細(xì)胞內(nèi)的條件下將含有至少一個拷貝的逆轉(zhuǎn)錄病毒cPPT和CTS順式作用區(qū)域的分離或純化的核酸暴露給靶細(xì)胞，其中cPPT和CTS區(qū)域^秀導(dǎo)三鏈DNA結(jié)構(gòu)。22.項(xiàng)目21的方法，其中核酸插入至靶細(xì)胞核內(nèi)的效率是30%或更高。23.項(xiàng)目21的方法，其中目的核酸存在于載體上。24.項(xiàng)目21的方法，其中目的核酸含有異源核酸序列。25.項(xiàng)目22的方法，其中異源核酸編碼肽、多肽、或蛋白質(zhì)。26.項(xiàng)目25的方法，其中蛋白質(zhì)是治療性蛋白質(zhì)。27.項(xiàng)目21的方法，其中靼細(xì)胞是非分裂細(xì)胞。28.項(xiàng)目21的方法，其中靶細(xì)胞是HeLa細(xì)胞或造血細(xì)胞。29.體外表達(dá)目的基因的方法，所述方法包括a)在允許攝取核酸至靶細(xì)胞內(nèi)的條件下，將靶細(xì)胞暴露給含有目的基因和至少一個拷貝的逆轉(zhuǎn)錄病毒cPPT和CTS順式作用區(qū)域的分離或純化的核酸，其中cPPT和CTS區(qū)域誘導(dǎo)三鏈DNA結(jié)構(gòu)，和b)在允許至少部分核酸轉(zhuǎn)移至該重組細(xì)胞的細(xì)胞核和允許目的基因表達(dá)的條件下培養(yǎng)重組細(xì)胞。30.項(xiàng)目29的方法，其中核酸存在于載體上。31.項(xiàng)目29的方法，其中在組織培養(yǎng)物中表達(dá)目的基因。32.項(xiàng)目29的方法，還包括純化或分離目的基因的表達(dá)產(chǎn)物。33.體內(nèi)表達(dá)目的基因的方法，所述方法包括將含有項(xiàng)目10的核酸的重組細(xì)胞施用給個體，并允許重組細(xì)胞在該個體體內(nèi)表達(dá)該核酸。34.項(xiàng)目33的方法，其中重組細(xì)胞是造血干細(xì)胞。35.體內(nèi)表達(dá)目的基因的方法，所述方法包括給個體施用足以導(dǎo)致目的基因在該個體體內(nèi)表達(dá)的量和形式的項(xiàng)目IO的核酸。36.項(xiàng)目35的方法，其中目的基因在靶組織中表達(dá)。37.項(xiàng)目35的方法，其中目的基因存在于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體內(nèi)。38.治療患有，或很有可能發(fā)展，具有遺傳基礎(chǔ)的疾病或病癥的個體的方法，所述方法包括給所述個體施用含有a)編碼治療性蛋白質(zhì)的核酸和b)至少一個拷貝的逆轉(zhuǎn)錄病毒cPPT和CTS順式作用區(qū)域的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中cPPT和CTS區(qū)域i秀導(dǎo)三鏈DNA結(jié)構(gòu)，施用的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的量足以導(dǎo)致所述治療性蛋白質(zhì)以足以治療所述疾病或病癥的量表達(dá)。39.項(xiàng)目38的方法，其中所述治療是預(yù)防性的、改善性的、或治療性的。40.項(xiàng)目38的方法，其中該方法治療血液疾病或病癥、腦或神經(jīng)系統(tǒng)疾病或病癥、或發(fā)育疾病或病癥。41.試劑盒，其包含至少一個含有分離或純化的核酸的容器，所述核酸含有至少一個拷貝的逆轉(zhuǎn)錄病毒cPPT和CTS順式作用區(qū)域，其中該cPPT和CTS區(qū)域誘導(dǎo)三鏈DNA結(jié)構(gòu)。項(xiàng)目41的試劑盒，其中核酸還包含編碼治療性蛋白質(zhì)的異源核酸序列。43.項(xiàng)目41的試劑盒，其中核酸存在于載體上。參考文獻(xiàn)這里所引用的所用參考文獻(xiàn)特此完整地引入作為參考。Barbosa,P"Charneau^P.，Dumey，N"andClavel，F(xiàn).(1994).KineticanalysisofHIV-1earlyreplicarivestepsinacoculturesystem.AIDSResearch&HumanRetroviruses.53-59.Bonnerot，C'，Rocancourt^D.，BriandjP.，Grimber，G.，andNicolas，J.(1987).Abeta-galactosidasehybridproteintargetedtonucleiasamarkerfordevelopmentstudies.Proc.Natl.AcacLofSci.USA5<6795-9.Bonoto-Esoda，K，andBoone，L.(1991).EquineinfectiousanemiavirusandhumanimmunodeficiencyvirusDNAsynthesisinvitro:characterizationoftheendogenousreversetranscriptasereaction.JournalofVirology65，1952-1959.Bowerman，B.，Brown,P-，Bishop,J.，andVarmus,H、(1989).AnucleoprateincomplexmediatestheintegrationofretroviralDNA.GenesandDevelopment3，469-78.Bukrinskaya,A-，Brichacek^B.，Mann^A"andStevenson,M.(1998).Establishmentofafunctionalhumanimmunodeficiencyvirustype1(HIY-1)reversetranscriptioncomplexinvolvesthecytoskeleton.JournalofExperimentalMedicine〗SS，2113-25.Bukrinsky,ML，SharovN"Dempsey,M.P"Stanwick,T.L.，BukrinskayaA,G"Haggcrty,S"andStevenson^M,(1992).Activenuclearimportofhumanimmunodeficiencyvimstype1preintegrationcomplexes,ProcNatlAcadSci狄65806584.Bukrinsky,M"Sharova,N"McDonald^T"Pushkarskay^T.,Taipley,W"andStevcilsoiijM.(1993a),Associationofintegrase，matrix,andreversetranscriptaseantigensofhumanimmunodeficiencyvirustype1withviralnucleicacidsfollowingacuteinfection.Proc.Natl.Acad,ofSci.USA卯，6125-9.Bukrinsky,M.i.,Haggerty,S.,Dempsey,M.P.,Sharova,N"Adzhubel,A.，Spitz,L"Lewis,P"Goldfarb，D"Emenn叫M.andStevensonM(1993b).AnuclearlocalizationsignalwithinHIV-1matrixproteinthatgovernsi:ifectionofnon-dividingcells.Nature3(J，666~669.CaseSS.PriceMA.JordanCT.YuXJ.WangL.BauerG.HaasDL.XuD.StripeckeR.NaldidL.KohnDB.CrooksGM.StabletransductionofquiescentCD34(+)CD38(-)humanhematopoieticcellsbyHIV-l-basedlentivira]vectors.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica.96(6):2988-93，1999.Chanieau，P.,andClavel,F.(1991).Asingle-strandedgapinhumanimmunodeficiencyvirus■unintegratedlinearDNAdefinedbyacentralcopyofthepolypurinetract.JournalofVirologyChameau^P.，AlizorijM"andClavel,F.(1992).Asecondoriginofplusstrandsynthesisis■requiredforoptimalHTVreplication.JournalofVirology66,2814*2820.ChameaAP.，Mirambeau,G"Roux^P"Paulous，S"Buc,H"andClavel,F.(1994).HTVMreversetranscription:aterminationstepatthecenterofthegenome.JournalofMolecularBiology2仏651-662.Croisille,L.etal.(1994).Hydrocortisonedifferentiallyaffectstheabilityofmurinestromalcellsandhumanmairow^derivedadherentcellstopromotethedifferentiationofCd34++/CD38-long-termcul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21ttttaaacgcaaaggtggt13<210>22<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列說明HIV-1cPPT序列的突變肽<400>22AsnPheLysArgArgGlyGly15《210>23<211><212>DNA<213>人工序列<220〉<223〉人工序列說明將突變引入HIV-lcPPT編碼序列中<4GO:>23t仁仁taaaagaagaggggggis<210>24<:211〉19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說明將突變引入HIV-1cPPT編碼序列中"00>24ctt:caagcgccgcggtgg亡權(quán)利要求1.逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其包含a)分離的或純化的核酸，包含至少一個拷貝的逆轉(zhuǎn)錄病毒cPPT和CTS順式作用區(qū)域，其中該cPPT和CTS區(qū)域可誘導(dǎo)三鏈DNA結(jié)構(gòu)，及b)異源核酸序列，其中所述逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR的U3啟動子和增強(qiáng)子被缺失。2.權(quán)利要求l的栽體，其是慢病毒栽體。3.權(quán)利要求2的載體，其是衍生自HIV-1的載體。4.權(quán)利要求1至3中任意一項(xiàng)的載體,其是表達(dá)載體或整合載體。5.權(quán)利要求1至4中任意一項(xiàng)的載體，其是置換型載體，其中兩個LTR之間的整個逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒編碼序列被缺失。6.權(quán)利要求1至5中任意一項(xiàng)的栽體，其中所述包含至少一個拷貝的cPPT和CTS區(qū)域的核酸是慢病毒的。7.權(quán)利要求6的栽體，其中所述包含至少一個拷貝的cPPT和CTS區(qū)域的核酸是人免疫缺陷病毒(HIV)的。8.權(quán)利要求7的栽體，其中所述包含至少一個拷貝的cPPT和CTS區(qū)域的核酸是HIV-1或HIV-2的。9.權(quán)利要求6的載體，其中所述包含至少一個拷貝的cPPT和CTS區(qū)域的核酸是VISNA、EIAV、FIV或CAEV的。10.權(quán)利要求1至9的載體，含有單個拷貝的逆轉(zhuǎn)錄病毒cPPT和CTS區(qū)域。11.權(quán)利要求1至10中任意一項(xiàng)的栽體，其中所述異源核酸序列可操作地或物理地連接到所述包含至少一個拷貝的cPPT和CTS區(qū)域的核酸。12.權(quán)利要求1至11中任意一項(xiàng)的栽體，其中所述異源核酸序列編碼肽、多肽或蛋白質(zhì)。13.權(quán)利要求12的栽體，其含有一個拷貝的cPPT-CTS順式作用區(qū)域、在EFlct啟動子控制下的GFP報(bào)告基因、和除去了其啟動子和增強(qiáng)子的LTR的U3序列，且其是pTRIPAU3EFlccGFP。14.權(quán)利要求12的載體，其中所述異源核*列編碼治療性蛋白質(zhì)。15.含有權(quán)利要求1至14中任意一項(xiàng)的載體的重組細(xì)胞。16.權(quán)利要求15的重組細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是HeLa細(xì)胞或造血細(xì)胞。>17.權(quán)利要求15的重組細(xì)胞，其是造血干細(xì)胞。18.體外增加異源核酸序列向靶細(xì)胞核輸入的比率的方法，所述方法包括在允許攝取所述載體至所述靶細(xì)胞中的條件下暴露權(quán)利要求1至14中任意一項(xiàng)的栽體。19.權(quán)利要求18的方法，其中所述異源核酸序列被輸入到多于30%的宿主細(xì)胞，優(yōu)選多于50%的宿主細(xì)胞，及更優(yōu)選多于80%的宿主細(xì)月包的沖亥內(nèi)。20.權(quán)利要求18至19中任意一項(xiàng)的方法，其中所述異源核酸序列編碼肽、多肽或蛋白質(zhì)。21.權(quán)利要求20的方法，其中所述蛋白質(zhì)是治療性蛋白質(zhì)。22.權(quán)利要求18至21中任意一項(xiàng)的方法，其中所述靶細(xì)胞是分裂細(xì)胞或非分裂細(xì)胞。23.權(quán)利要求18至21中任意一項(xiàng)的方法，其中所述靶細(xì)胞是HeLa細(xì)月包或造血細(xì)胞。24.權(quán)利要求18至21中任意一項(xiàng)的方法，其中所述靶細(xì)胞是造血干細(xì)l包。25.體外表達(dá)異源核酸序列的方法，所述方法包括a)在如下條件下將靶細(xì)胞暴露給權(quán)利要求1至14中任意一項(xiàng)的載體，所述條件允許攝取所述含有異源核酸序列的載體至靶細(xì)胞中，以產(chǎn)生重組細(xì)胞，及b)在表達(dá)異源核酸序列的條件下培養(yǎng)所述重組細(xì)胞。26.權(quán)利要求25的方法，其中所述異源核酸序列在組織培養(yǎng)中表達(dá)。27.權(quán)利要求25至26中任意一項(xiàng)的方法，還包括純化或分離所述異源核酸序列的表達(dá)產(chǎn)物。28.含有權(quán)利要求1至14中任意一項(xiàng)的栽體的重組細(xì)胞在生產(chǎn)使所述重組細(xì)胞能在個體體內(nèi)表達(dá)異源核酸序列的治療性化合物中的應(yīng)用。29.權(quán)利要求28的應(yīng)用，其中所述細(xì)胞是造血干細(xì)胞。30.權(quán)利要求1至14中任意一項(xiàng)的載體在生產(chǎn)治療性化合物中的應(yīng)用，其中所述異源核^列取足以導(dǎo)致所述目的基因在個體體內(nèi)表達(dá)的量和形式。31.權(quán)利要求30的應(yīng)用，其特征在于所述異源核酸在靶組織中表達(dá)。32.權(quán)利要求1至14中任意一項(xiàng)的載體在生產(chǎn)用于治療患有、或很有可能發(fā)展具有遺傳基礎(chǔ)的疾病或病癥的個體的藥物中的應(yīng)用，其中所述載體的量足以導(dǎo)致所述異源核酸表達(dá)，所述異源核酸表達(dá)的量足以治療所述疾病或病癥。33.權(quán)利要求32在生產(chǎn)用于預(yù)防性治療、改善性治療或治愈性治療的藥物中的應(yīng)用。34.權(quán)利要求33應(yīng)用，用于治療血液疾病或病癥、腦或神經(jīng)系統(tǒng)疾病或病癥、或發(fā)育性疾病或病癥。35.試劑盒，其含有至少一個含有權(quán)利要求1至14中任意一項(xiàng)的載體的容器。36.權(quán)利要求35的試劑盒，其中所述異源核酸序列編碼治療性蛋白質(zhì)。全文摘要本發(fā)明提供含有三鏈體結(jié)構(gòu)，如那些由在HIV-1線性DNA基因組中心處HIV-1逆轉(zhuǎn)錄的中心起始和終止產(chǎn)生的三鏈體結(jié)構(gòu)，的核酸、載體、病毒和重組細(xì)胞。這些三鏈體結(jié)構(gòu)可充當(dāng)HIV-1DNA向核輸入的順式?jīng)Q定因子，允許感染非分裂靶細(xì)胞。一方面，在HIV載體中存在DNA三鏈體序列強(qiáng)烈刺激在造血干細(xì)胞中的基因轉(zhuǎn)移。本發(fā)明還提供使用這些三鏈體結(jié)構(gòu)制備重組細(xì)胞的方法，以及使用這些重組細(xì)胞體內(nèi)和體外表達(dá)目的蛋白的方法。文檔編號A61K31/7088GK101363029SQ20081021383公開日2009年2月11日申請日期2000年10月10日優(yōu)先權(quán)日1999年10月12日發(fā)明者A·司爾溫,庫皮爾施密特A·杜巴特,F·皮弗魯米歐,P·查尼奧,V·贊諾申請人:巴斯德研究所;國家健康醫(yī)學(xué)研究所