專利名稱：用于表達(dá)黃病毒科蛋白的重組慢病毒載體及其作為疫苗的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于表達(dá)黃病毒科(Flaviviridae)蛋白質(zhì)的重組慢病毒載體以及它作為疫苗在預(yù)防和/或治療敏感物種(宿主或貯主)中受黃病毒科病毒感染中的應(yīng)用。
黃病毒科被劃分成三個屬黃病毒屬、瘟病毒屬和丙肝病毒或丙型肝炎病毒屬；黃病毒科是人和牲畜健康的重要問題，因為大量人畜疾病是由黃病毒科所誘發(fā)的。具體而言，例如，有70種以上的黃病毒，其中至少50％是人或牲畜疾病的病因。
黃病毒科是小的有包膜病毒。它們的基因組是正極性單鏈RNA分子，根據(jù)黃病毒科類型長度為9.5kb至12.5kb，含有單個開放閱讀框，在其旁側(cè)是5’和3’末端兩個短的非編碼區(qū)。此開放閱讀框被翻譯成多蛋白，它是在其N末端部分中結(jié)構(gòu)蛋白和在其C末端部分非結(jié)構(gòu)(NS)蛋白的前體。
更明確的說-就黃病毒屬而言，它的基因組是正極性的單鏈RNA分子，長度大約為10-12k堿基?；蚪MRNA與數(shù)拷貝的衣殼蛋白C結(jié)合以形成核衣殼；它被由來源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)膜的脂雙層組成的病毒包膜包圍，包膜中錨定了包膜蛋白E和膜蛋白M。黃病毒基因組RNA包含約10500個核苷酸的單個開放閱讀框，其旁側(cè)是5’和3’末端的兩個短的非編碼區(qū)?；蚪M被翻譯成大約3400個氨基酸的多蛋白，它是在其N末端部分中三種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)C、prM(M的細(xì)胞內(nèi)前體)和E、以及在其C末端部分中至少5種非結(jié)構(gòu)(NS)蛋白NS1至NS5的前體。因此觀察到以下結(jié)構(gòu)C-prM/M-E-NS1-NS2A/2B-NS3-NS4A/4B-NS5；-就瘟病毒屬而言，基因組RNA大于12k堿基，并且包含單個開放閱讀框，被翻譯成大約3900個氨基酸的多蛋白，它是11至13種瘟病毒蛋白的前體，其中4種是結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)觀察到以下結(jié)構(gòu)Npro-Cems-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A/4B-NS5A/5B，以及-就丙型肝炎病毒屬而言，基因組RNA含有大約9.5k堿基，并且包含單個開放閱讀框，被翻譯成大約3000個氨基酸的多蛋白，它是在其N末端部分中三種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)C、E1和E2、以及在其C末端中至少7種非結(jié)構(gòu)(NS)蛋白NS1至NS5的前體。觀察到的結(jié)構(gòu)如下C-E1-E2-NS1-NS2-NS3-NS4A/4B-NS5A/5B。
許多嚴(yán)重的人和動物疾病是由此科病毒誘導(dǎo)的；根據(jù)感染的病毒，通常觀察到的各種癥狀有發(fā)熱(周期性或非周期性)、出血熱、腹瀉、腦炎、肝炎或膿毒性休克。更確切的說，討論的各種病毒如下-黃病毒屬黃病毒中大部分通過蚊(庫蚊屬、伊蚊屬、按蚊屬或曼蚊屬)或蜱傳播給脊椎動物宿主(i)通過蚊子傳播的病毒登革熱病毒(1型至4型)、黃熱病毒(YFV)、日本腦炎病毒(JEV)、西尼羅病毒(WNV)、墨累山谷腦炎病毒(Murray Valley encephalitis virus，MVEV)、圣路易腦炎病毒(SLEV)和(ii)由蜱傳播的病毒蜱媒腦炎病毒(TBEV)、科薩努爾森林病病毒、鄂木斯克出血熱病毒和跳躍病病毒。
-瘟病毒屬邊界病病毒(BDV)、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)和典型豬瘟病毒(CSFV)或豬霍亂病毒。
-丙肝病毒屬丙型肝炎病毒和庚型肝炎病毒。
候鳥可以是某些這類病毒的貯主，尤其是西尼羅病毒，它還被注意到的是跨越了馬和人之間的物種屏障。
迄今為止研究者已提出了一定數(shù)目的疫苗策略(Gould EAFlavivirus Infectionsin Humans，Encyclopaedia of Life Sciences，2001；Pugazchev KV et al.，Internat.J.Parasitol，2003，33，567-582；Putnak R et al.，Advances in Virus Research 2003，61，445-468；Smith DB，Hepatitis C virus，Encyclopaedia of Life Sciences，2001)并且涉及-含有減毒活病毒或已滅活病毒的疫苗(Pugachev KV等，2003，同上；Gould EA，2001，同上；Brinton MA，Annu.Rev.Microbiol.，2002，56，371-402；Hamers C.等，Vet.Rec.，2003，153，8，236-240；Kovacs F.等，Vet.Microbiol.，2003，96，2，117-131)；-含有病毒亞基的疫苗；-含有一個或多個病毒來源抗原的疫苗(Wang T等，J.Immunol.，2001，167，5273-5277)-含有嵌合病毒的疫苗(Pugachev KV等，2003，同上)；或-DNA疫苗(Putnak R等，2003，同上；Turell MJ等，Emerging InfectiousDiseases，2003，9，9，1077-1081；Davis BS等，J.Virol.，2001，4040-4047；Pan CH等，J.Virol.，2001，75，23，11457-11463)；這些疫苗使用了各種各樣的載體。具體而言，上文提及的Putnak R等人在2003年提出為了進(jìn)行最適表達(dá)，應(yīng)選擇最適當(dāng)?shù)恼{(diào)控元件(啟動子和增強(qiáng)子)；至少就黃病毒而言，推薦使用含CMV啟動子(例如，pcDNA3質(zhì)粒，Invitrogen)或RSV啟動子并共表達(dá)prM和E基因以及任選的至少一種非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的質(zhì)粒載體。
例如，對于最近才在北半球、尤其是美國出現(xiàn)的WNV，目前提議用于抗擊西尼羅病毒感染的各種疫苗策略有如下幾種-在小鼠腦中生產(chǎn)的日本腦炎病毒，用甲醛溶液滅活(JE-VAX，Aventis-Pasteur；Monath等，Curr.Drug Targets Infect.Disord.，2001，1，37-50)；對于它能保護(hù)人或馬抵抗西尼羅病毒感染的交叉保護(hù)作用仍未得到證實并且是有爭議的(Monath，AM；Trop.Med.Hyg.，2002，66，113-114)。此外，小鼠的研究顯示交叉免疫可能在西尼羅病毒感染期間誘導(dǎo)腦發(fā)炎；-甲醛滅活的西尼羅病毒(國際專利申請WO 03/061555)；這種被提議用于免疫馬的疫苗已被發(fā)現(xiàn)在馬中無任何致病效果并且有效抵抗西尼羅病毒的感染；不過，由于體液應(yīng)答的量較低，需要進(jìn)行數(shù)次注射以及之后每年增強(qiáng)免疫；-來自黃熱病毒減毒株的嵌合病毒(17D株；ChimeriVaxTM-WN)；更確切的說，所述ChimeriVax-西尼羅嵌合病毒在減毒病毒YV 17D中包含了New York 1999株WNV的prM-E盒(國際專利申請WO 03/059384和Pletnev AG等，PNAS，2002，99，5，3036-3041；Monath TP等，Curr.Drug Targets Disord.，2001，1，1，37-50)；西尼羅病毒的prM和E基因被插入黃熱病毒或登革熱病毒中，因此其可用作載體。編碼核衣殼蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白的基因以及來源于17D或DEN4毒株的非翻譯末端區(qū)被用于重組嵌合病毒的復(fù)制。嵌合病毒在宿主內(nèi)象17D或DEN4病毒一樣進(jìn)行復(fù)制，但特異性針對西尼羅病毒免疫(Monath等，Curr.Drug Targets Infect.Disord.，同上)。用嵌合病毒進(jìn)行感染刺激了免疫應(yīng)答的各條途徑。此外，嵌合病毒顆粒包含完整的E蛋白，它具有冗余的中和表位。因此，嵌合病毒在宿主中復(fù)制誘導(dǎo)預(yù)防病毒早期傳播的高滴度中和抗體，而細(xì)胞毒性T免疫性則除去了已經(jīng)成功感染細(xì)胞的病毒。感染后記憶應(yīng)答是快速的并且比疫苗后應(yīng)答更強(qiáng)，它也有助于抵抗西尼羅病毒感染。已顯示用17D毒株預(yù)免疫不抑制嵌合病毒的感染，而相反的提高特異性抗體的生產(chǎn)。還已經(jīng)顯示，在小鼠和非人靈長類動物中，ChimeriVaxTM-JE嵌合疫苗的神經(jīng)毒性較17D毒株更低。此外，在體內(nèi)和細(xì)胞培養(yǎng)中重復(fù)傳代期間嵌合病毒基因組是穩(wěn)定的。ChimeriVaxTM-WN嵌合病毒來自已證實對人無害且有效的疫苗株，因為該疫苗株是65年前為人免疫接種所研發(fā)的并且已經(jīng)用于數(shù)百萬個體(Monath等，Curr.Drug Targets Infect.Disord.，同上)；然而使用嵌合的減毒活病毒產(chǎn)生了安全性問題，不同物種之間的非同源重組是可能的，就象天然存在的重組黃病毒所證明的那樣(Seligman SJ和Gould EA，Lancet，2004，363，2073-2075)。
-裸DNA(Davis等，J.Virol.，2001，754040-4047；Turell等，Emerg.Infect.Diseases，2003，9，1077-1081和國際專利申請WO 03/061555)；使用的裸DNA載體是含巨細(xì)胞病毒早期啟動子、來源于日本腦炎病毒編碼信號肽的序列、以及編碼西尼羅病毒prM和E蛋白的序列的載體pCBWN。已顯示簡單肌肉內(nèi)注射此質(zhì)粒在小鼠和馬中誘導(dǎo)針對西尼羅病毒感染的保護(hù)性免疫；-重組蛋白E(Wang等，J.Immunol.，2001，167，5273-5277)；以融合蛋白形式在大腸桿菌中表達(dá)并通過親和層析純化的完整E蛋白或缺失C末端區(qū)(殘基E1至E409)的E蛋白在小鼠中誘導(dǎo)抗E蛋白的中和抗體。缺失C末端區(qū)域的可溶性E蛋白在小鼠中誘導(dǎo)完全的保護(hù)作用，但用完整的E蛋白只觀察到部分的保護(hù)作用。
即使目前提議的大部分疫苗總體上是有效的，也仍然存在對新的預(yù)防性手段的需求，尤其是在有關(guān)黃病毒科的DNA疫苗領(lǐng)域；具體而言，確實需要有載體可用于人類醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)中預(yù)防由這些病毒誘發(fā)的疾病以及根除貯主中的這些病毒。
事實上，對于丙肝病毒屬，例如更具體地對于丙型肝炎，針對保護(hù)患者免于丙型肝炎而進(jìn)行的試驗失敗了，因為痘苗病毒被用于表達(dá)HCV病毒蛋白；現(xiàn)在，此病毒引起剪接，導(dǎo)致病毒蛋白被截短從而使保護(hù)有效性降低(Dumonceaux J等，J.Virol.，2003，77，24，13418-13424)。
此外，仍需要有只需不多次(一次或最多兩次)注射的疫苗，以便方便它們的使用，尤其是在較難建立被遵守的免疫計劃的國家。
令人驚奇的是，發(fā)明人已表明用于表達(dá)黃病毒科病毒的至少一種免疫原性蛋白的重組慢病毒載體有效的令其有可能在被免疫個體(人或動物)中誘發(fā)強(qiáng)免疫應(yīng)答，尤其是能保護(hù)所述個體抵抗此病毒的感染。
所述重組慢病毒載體能誘發(fā)抗高劑量西尼羅病毒攻擊的非常早期的、長期持續(xù)的、完全保護(hù)性免疫應(yīng)答。
發(fā)明人提供了第一個證據(jù)證明慢病毒載體是誘發(fā)抗病原體的體液保護(hù)性應(yīng)答的有效工具。這拓寬了慢病毒載體作為抗諸如黃病毒科病毒等的疫苗接種工具的適用性，其中中和性體液應(yīng)答是此免疫系統(tǒng)的一個活躍分支。
因此，本發(fā)明的一個主題是含有編碼黃病毒科病毒至少一種蛋白質(zhì)或所述蛋白質(zhì)中至少8個氨基酸的免疫原性肽的多核苷酸片段的重組慢病毒載體，制備免疫原性組合物的用途，用于預(yù)防和/或治療黃病毒科病毒對敏感物種的感染。
這樣的載體具有一定的優(yōu)勢并且尤其適于上述需要-它具有增加的免疫原能力；因此，單次施用于敏感物種就有效。此載體的有效性同時與以下方面有關(guān)(i)它對抗原呈遞細(xì)胞或APC如樹突細(xì)胞等的趨向性，尤其是當(dāng)它被皮下注射時；(ii)這些載體所攜帶的感興趣序列在細(xì)胞基因組中穩(wěn)定整合，使得抗原可以在體內(nèi)、尤其是樹突細(xì)胞內(nèi)長期持續(xù)表達(dá)，以及(iii)它刺激樹突細(xì)胞依賴型免疫應(yīng)答的能力。由此，抗原在樹突細(xì)胞中表達(dá)的持續(xù)時間就長于通常用脈沖處理的樹突細(xì)胞所獲得的時間，這有利地使得有可能免于重復(fù)施用所述載體，-它是非復(fù)制型的；因此，它很少有或不具有對敏感物種的致病能力并且無傳染能力，即，沒有在周圍環(huán)境中傳播的危險，-它是非致瘤性的，它導(dǎo)致感興趣序列穩(wěn)定整合于宿主細(xì)胞的基因組中而不引起任何致腫瘤作用，-它表現(xiàn)出無物種限制并且具有擴(kuò)展的細(xì)胞趨向性，尤其是由于這種事實它可能產(chǎn)生具有其它病毒的包膜蛋白的假型，所述包膜蛋白諸如水泡性口炎病毒(VSV)的、彈狀病毒科病毒如狂犬病毒的糖蛋白G、以及埃博拉病毒的糖蛋白G從而，它能有效的在任何敏感物種中用于預(yù)防和/或治療性免疫，并且-它使得應(yīng)用時有可能不必使用佐劑。
定義-多核苷酸片段術(shù)語“多核苷酸片段或多核苷酸”意指至少24個堿基或堿基對的DNA或RNA片段，優(yōu)選長度為24至5000個堿基或堿基對，尤其是cDNA或cDNA片段。
-免疫原性片段能在對黃病毒科感染敏感的物種內(nèi)誘發(fā)特異性體液和/或細(xì)胞應(yīng)答的肽片段。
-編碼至少一種黃病毒科蛋白或所述蛋白的至少8個氨基酸長的免疫原性肽的多核苷酸片段以上定義的多核苷酸編碼黃病毒科的一種或多種結(jié)構(gòu)或非結(jié)構(gòu)蛋白和/或一種或多種免疫原性片段。黃病毒科多蛋白的開放閱讀框(ORF)和所述ORF中包括的各種黃病毒科蛋白質(zhì)的編碼序列是本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的并且可通過數(shù)據(jù)庫或參考文獻(xiàn)獲得，尤其是NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的數(shù)據(jù)庫或者文獻(xiàn)，例如Virus Taxonomy.Classification and nomenclature of viruses.Sixth report of theInternational Committee on taxonomy of viruses(F.A.Murphy等，Archives of VirologySupplement 10，1995，Springer Verlag，Vienna，New York )。本發(fā)明包括任何黃病毒科的編碼序列以及所述編碼序列中一或多個核苷酸突變(插入、缺失、替換)或所述開放閱讀框移動一或兩個核苷酸(ORF+1和ORF+2)而產(chǎn)生的變體，只要所述突變基本上不改變所述蛋白質(zhì)或所述片段的抗原性和/或免疫原性即可。本發(fā)明尤其包括由于核苷酸突變(插入、缺失、替換)來自以上序列的多核苷酸變體，只要被修飾的核酸片段在高嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件下保持與衍生它們的修飾多核苷酸特異性雜交的能力。
-高嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件就本發(fā)明的目的而言，表述“高嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件”意指選定的溫度和離子強(qiáng)度條件，使其有可能維持互補(bǔ)性多核苷酸之間的特異性和選擇性雜交。舉例說來，用于定義以上多核苷酸目的的高嚴(yán)謹(jǐn)性條件有利地如下分兩步進(jìn)行DNA-DNA或DNA-RNA雜交(1)在含5×SSC(1×SSC對應(yīng)0.15M NaCl+0.015M檸檬酸鈉的溶液)、50％甲酰胺、7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、10×Denhardt’s、5％硫酸葡聚糖和1％鮭精DNA的磷酸鹽緩沖液(20mM，pH7.5)中42℃預(yù)雜交3小時；(2)42℃雜交20小時，隨后在2×SSC+2％SDS中20℃20分鐘洗滌兩次，在0.1×SSC+0.1％SDS中20℃20分鐘漂洗1次。最后在0.1×SSC+0.1％SDS中60℃洗滌30分鐘。
-敏感物種表述“對黃病毒科感染敏感的物種”意指能發(fā)生被黃病毒科所誘發(fā)的病理狀態(tài)的宿主物種，諸如人或非人哺乳動物，以及負(fù)責(zé)病毒傳播但不呈現(xiàn)癥狀的貯主物種，諸如尤其是鳥或爬行動物(鱷魚)。
-重組慢病毒載體術(shù)語“重組慢病毒載體”意指對應(yīng)慢病毒載體重組基因組的分離核酸分子，尤其包括質(zhì)粒(載體質(zhì)粒)，也意指包含所述重組基因組的重組慢病毒顆粒(載體顆粒)，它們在合適的細(xì)胞體系中產(chǎn)生，任選的具有其它病毒包膜蛋白的假型，諸如水泡性口炎病毒(VSV)、狂犬病毒和埃博拉病毒的糖蛋白G。
根據(jù)本發(fā)明，所述慢病毒載體選自以下來源HIV(人免疫缺陷性病毒)，例如HIV-1或HIV-2；CAEV(羊關(guān)節(jié)炎腦炎病毒)、EIAV(馬傳染性貧血病毒)、VMV(綿羊脫髓鞘性腦白質(zhì)炎/羊肺腺瘤病病毒)、SIV(猴免疫缺陷病毒)或FIV(貓免疫缺陷病毒)。本發(fā)明還包括來源于至少兩種不同慢病毒的嵌合慢病毒。慢病毒載體的選擇尤其依賴于敏感物種；例如，來源于HIV的載體有利地用于人免疫接種中。
慢病毒載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的；它們由重組核苷酸序列(重組慢病毒基因組)組成，其中包含(i)置于轉(zhuǎn)錄和表達(dá)調(diào)控信號控制下的感興趣序列(在本發(fā)明情況下是黃病毒科的編碼序列)，以及(ii)衣殼包裝、逆轉(zhuǎn)錄和病毒整合所必要和充分的慢病毒來源的調(diào)控序列，以及任選地針對Rev蛋白的調(diào)控序列(RRE或rev應(yīng)答元件)。特別可提及的是由Poznansky等人(J.Virol.，1991，65，532-536)和Naldini等人(Science，1996，272，263-267)所述的來自HIV的慢病毒載體、或者由Poeschla等人(Nature Medicine，1998，4，354-357)所述的來自FIV的慢病毒載體，還可提及的的是來源于以上病毒的最小載體，如國際專利申請WO 99/32646和WO98/17815中所述。
根據(jù)本發(fā)明，所述的慢病毒載體是在適當(dāng)?shù)募?xì)胞體系中能表達(dá)上文所定義的編碼序列的載體；所述的載體含有表達(dá)盒，其中包括合適的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件(啟動子、增強(qiáng)子、Kozak共有序列、多聚腺苷酸化信號，等等)，如上定義的編碼序列被插入在其控制下；所述的感興趣編碼序列包含細(xì)胞運輸所需要的信號，例如用于在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)轉(zhuǎn)位的信號，特別來源于在所述黃病毒科多蛋白中所述編碼序列之前的ORF。例如，以黃病毒科為例，當(dāng)所述編碼序列是E蛋白或所述蛋白質(zhì)的片段的編碼序列時，所述信號序列有利地來自M蛋白前體(prM)。有利的是，所述表達(dá)盒包含諸如巨細(xì)胞病毒(CMV)早期啟動子等的普遍存在的強(qiáng)啟動子或諸如延伸因子1α(EF1α)或磷酸甘油酸(PGK)啟動子等無增強(qiáng)子的啟動子。
此外，所述的載體還可以包含自殺基因，諸如1型皰疹胸苷激酶(HSV1-TK)等，以便通過用適當(dāng)藥物處理除去被轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，例如對于HSV1-TK用無環(huán)鳥苷。
本發(fā)明包括簡單表達(dá)載體和可以同時表達(dá)來自同一啟動子或不同啟動子的數(shù)個編碼序列的多重表達(dá)載體，所述的啟動子位于所述載體的同一區(qū)域或不同區(qū)域。
根據(jù)所述用途的優(yōu)選實施方案，所述的重組慢病毒載體是三重型的。
三重型的載體具體描述于Zennou等，Cell，2000，101，173-185以及國際專利申請WO 99/55892、WO 01/27304和WO 01/27300。
所述三重型載體的特征在于它們含有能在病毒逆轉(zhuǎn)錄期間形成三重結(jié)構(gòu)(或DNA三聚體)的DNA區(qū)域。此三重DNA區(qū)由用于中央起始的順式活性區(qū)、或聚嘌呤束(tract)(cPPT)、以及用于終止的順式活性區(qū)(CTS)，所述區(qū)域使得有可能起始其合成由位于慢病毒基因組中央的PTT區(qū)域啟動的+鏈的轉(zhuǎn)錄、并中斷其合成開始于慢病毒LTR上游3’PPT位點的+鏈的轉(zhuǎn)錄。慢病毒載體中此三重DNA區(qū)的存在通過刺激載體的核輸入速率而顯著改進(jìn)有絲分裂或非有絲分裂細(xì)胞中的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。
根據(jù)所述用途的另一優(yōu)選實施方案，所述的重組慢病毒載體包含3’LTR，其中啟動子和活化子已從U3區(qū)被刪除；此刪除提供了額外的安全特性。
根據(jù)所述用途的另一優(yōu)選實施方案，所述的重組慢病毒載體是具有另一種病毒的至少一種包膜蛋白的假型，優(yōu)選水泡性口炎病毒(VSV)糖蛋白G；VSV糖蛋白G有利地使得它有可能獲得高滴度的載體顆粒并產(chǎn)生具有廣泛細(xì)胞趨向性的載體顆粒，尤其能在有感染風(fēng)險的任何脊椎動物物種中轉(zhuǎn)導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞，如樹突細(xì)胞，所述動物包括馬、家禽和動物園動物。
根據(jù)本發(fā)明，如上文所指出，所述黃病毒科選自黃病毒屬、瘟病毒屬或丙型肝炎病毒屬。
根據(jù)所述用途的另一優(yōu)選實施方案，所述的黃病毒科選自西尼羅病毒、登革熱病毒、黃熱病毒和丙型肝炎病毒。
根據(jù)本發(fā)明，所述的多核苷酸，尤其是黃病毒科的cDNA或cDNA片段，編碼(i)一種或多種不同的結(jié)構(gòu)蛋白(C、prM、M、E、E1、E2)，和/或(ii)一種或多種不同的非結(jié)構(gòu)(NS)蛋白，和/或(iii)所述蛋白質(zhì)的一個或多個不同的免疫原性片段，所述蛋白質(zhì)或其片段來源于相同黃病毒科(單價疫苗)或來源于不同的黃病毒科和/或來源于同一黃病毒科的不同血清型或不同類型，用于制備多價疫苗。
所述cDNA還可通過開放閱讀框中一或兩個核苷酸的移動(核糖體移碼)來源于黃病毒科的編碼序列。這樣的cDNA是本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的，尤其是對于丙型肝炎病毒的C蛋白而言(Xu等，EMBO，2001，20，3840-3848；Roussel等，J.Gen.Virol.，2003，84，1751-1759；Vassilaki等，J.Biol.Chem.，2003，278，40503-40513；國際專利申請WO 99/63941)。
根據(jù)所述用途的另一優(yōu)選實施方案，所述的多核苷酸是與表1所列NCBI數(shù)據(jù)庫中的登錄號相對應(yīng)的黃病毒科編碼序列的片段
表1黃病毒科的編碼序列
各種黃病毒科蛋白質(zhì)編碼序列的位置被指示于與表1列出登記號相應(yīng)的序列中，其對應(yīng)所述多蛋白質(zhì)的cDNA或黃病毒科基因組的DNA等價物。
根據(jù)所述用途的另一優(yōu)選實施方案，所述的多核苷酸片段選自a)編碼西尼羅病毒或登革熱病毒的E蛋白、和任選地prM或M蛋白、和/或C蛋白、和/或非結(jié)構(gòu)蛋白的cDNA，以及編碼以上蛋白質(zhì)的至少8個氨基酸長的一種或多種免疫原性肽的cDNA，b)編碼丙型肝炎病毒的E1或E2蛋白或E1/E2異二聚體、和/或根據(jù)0、+1或+2閱讀框的C蛋白、和/或NS3蛋白的cDNA，以及編碼以上蛋白質(zhì)的至少8個氨基酸的一種或多種免疫原性肽的cDNA，和c)編碼登革熱病毒E蛋白的一種或多種不同結(jié)構(gòu)域III(第295至394位)的cDNA，分別對應(yīng)四種類型登革熱病毒(1型至4型或DEN-1至DEN-4)之一種，優(yōu)選編碼四種結(jié)構(gòu)域III(DEN-1至DEN-4)的cDNA，其序列由附錄中所附的序列表中的SEQ ID NOs.1-4代表。
根據(jù)所述用途的有利條件，所述的按照+1或+2閱讀框編碼C蛋白的cDNA選自序列SEQ ID NOs.5至14。
根據(jù)本發(fā)明，所述的膜蛋白(prM或M)和/或包膜蛋白(E、E1、E2)用如上所述的重組慢病毒載體表達(dá)，或者以膜形式定位于細(xì)胞表面的質(zhì)膜內(nèi)，或者以分泌形式，即從細(xì)胞輸出至細(xì)胞外培養(yǎng)基中。
此外，當(dāng)黃病毒prM和E蛋白同時在轉(zhuǎn)導(dǎo)了重組載體(體外或體內(nèi))的細(xì)胞中表達(dá)時，它們組裝成病毒假顆粒(或病毒樣顆粒，VLP)分泌到胞外培養(yǎng)基中。這樣的顆粒特別具有免疫原性并誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體。
編碼所述膜形式的cDNA包含編碼成熟蛋白質(zhì)的序列，前面是編碼在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中轉(zhuǎn)位的信號肽的序列，該序列包括在其5’末端的翻譯起始密碼子(ATG)。對于黃病毒屬，所述的信號序列優(yōu)選來自M蛋白前體(prM)。編碼所述分泌形式的cDNA包含編碼截短的成熟蛋白質(zhì)的序列，其中的膜錨定區(qū)已被刪除并且前面是如上所述的信號肽。
例如，對于西尼羅病毒-成熟E蛋白對應(yīng)多蛋白質(zhì)序列第291至791位，參考Genbank序列AAL87234；相應(yīng)的核苷酸序列位于西尼羅病毒基因組序列的第967至2469位，參考Genbank序列AF481864；-膜錨定區(qū)已從中被刪除的截短的成熟E蛋白特別對應(yīng)西尼羅病毒多蛋白序列的第291至732位，參考Genbank序列AAL87234；相應(yīng)的核苷酸序列位于西尼羅病毒基因組的第967至2292位，參考Genbank序列AF481864；-來源于M蛋白前體的內(nèi)部信號肽對應(yīng)多蛋白質(zhì)序列的第275至290位，參考Genbank序列AAL87234；相應(yīng)的核苷酸序列位于西尼羅病毒基因組序列的第919至966位，參考Genbank序列AF481864。
因此，編碼西尼羅病毒的膜形式E蛋白、分泌形式E蛋白以及prM和E蛋白的cDNA分別對應(yīng)如上定義的所述病毒基因組序列中的第919至2469、919至2292和399至2469位。
本發(fā)明還有一個主題是包含編碼黃病毒科的至少一種結(jié)構(gòu)蛋白或所述蛋白質(zhì)至少8個氨基酸長的免疫原性肽的多核苷酸的重組慢病毒載體；此外，正如上文中所指出的在利用這樣的載體時，所述的載體優(yōu)選還包含編碼一種或多種非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)和/或所述蛋白質(zhì)的一種或多種免疫原性片段的cDNA。所述的多核苷酸片段特別選自如上所指出的序列中。優(yōu)選的，所述的重組慢病毒載體是三重型載體。此外，所述的重組慢病毒載體優(yōu)選能包含其中啟動子和激活子已從U3區(qū)被刪除的3’LTR。優(yōu)選它是具有另一病毒的至少一種包膜蛋白的假型，優(yōu)選水泡性口炎病毒(VSV)糖蛋白G。
根據(jù)所述載體的優(yōu)選實施方案，它包含編碼西尼羅病毒或登革熱病毒的至少一種E蛋白、和任選地prM或M蛋白、和/或C蛋白、和/或非結(jié)構(gòu)蛋白的cDNA，或者編碼以上蛋白質(zhì)的至少8個氨基酸長的一種或多種免疫原性肽的cDNA。
根據(jù)所述載體的另一優(yōu)選實施方案，它包含編碼丙型肝炎病毒的E1或E2蛋白或E1/E2異二聚體、和/或根據(jù)0、+1或+2閱讀框的C蛋白、以及任選地NS3蛋白的cDNA，或者編碼以上蛋白質(zhì)至少8個氨基酸長的一種或多種免疫原性肽的cDNA。
根據(jù)所述載體的有利條件，所述的根據(jù)+1或+2閱讀框編碼C蛋白的cDNA選自SEQ ID NOs.5至14的序列。
根據(jù)所述載體的另一優(yōu)選實施方案，它包含編碼登革熱病毒E蛋白的結(jié)構(gòu)域III(第295至394位)或數(shù)種不同結(jié)構(gòu)域III的cDNA，分別對應(yīng)四種類型登革熱病毒(1至4型或DEN-1至DEN-4)之一，優(yōu)選它包含編碼四種結(jié)構(gòu)域III(DEN-1至DEN-4)的cDNA，其序列由附錄序列表中的SEQ ID NOs.1-4代表。
根據(jù)所述載體的另一優(yōu)選實施方案，它是被稱為pTRIPΔU3.CMV-sE(WNV)的載體質(zhì)粒，包含編碼西尼羅病毒IS-98-ST1株分泌形式E蛋白的cDNA，該載體包含在微生物中，該微生物于2003年8月27日保藏于國家微生物培養(yǎng)物保藏中心(theCollection Nationale de Cultures de Microorganismes[National Collection ofCultures of Microorganisms]，25 rue du Docteur Roux，75724 Paris Cedex 15)，保藏號為I-3076。
本發(fā)明包含如上所述的載體質(zhì)粒以及來源于以上載體顆粒的載體顆粒，尤其是具有另一種病毒的至少一種包膜蛋白的假型載體顆粒，諸如特別是水泡性口炎病毒(VSV)糖蛋白G。
可用常規(guī)方法并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案制備上述重組慢病毒載體，這些方法本身是已知的，所述標(biāo)準(zhǔn)方案例如描述于Current Protocols in Molecular Biology(Frederick M.AUSUBEL，2000，Wiley and son Inc.，Library of Congress，USA)。
更確切的說，可用特異于黃病毒科基因組的引物通過PCR或RT-PCR擴(kuò)增由黃病毒科基因組RNA或mRNA或者來源于它們的cDNA或DNA片段組成的基質(zhì)，或者通過用限制性酶消化黃病毒科cDNA，或者通過完全或部分的化學(xué)合成獲得所述的多核苷酸片段。
將由此獲得的多核苷酸片段克隆入含慢病毒載體基因組的載體質(zhì)粒中，以便產(chǎn)生重組載體質(zhì)粒。
用如上定義的重組載體質(zhì)粒、反式提供病毒顆粒的結(jié)構(gòu)蛋白和酶的衣殼包裝質(zhì)粒、以及任選地用于表達(dá)諸如VSV等病毒的包膜糖蛋白以便產(chǎn)生假型顆粒的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，來產(chǎn)生重組慢病毒載體的顆粒(載體顆粒)。
本發(fā)明的另一主題是免疫原性組合物，其特征在于它包含至少一種如上所述的重組載體。
根據(jù)所述組合物的優(yōu)選實施方案，它包含藥用可接受的賦形劑以及任選的載體物質(zhì)(carrier substance)。
所述的藥用可接受賦形劑和載體物質(zhì)是常規(guī)所用的此類物質(zhì)。
載體物質(zhì)優(yōu)選自單層脂質(zhì)體、多層脂質(zhì)體、皂角苷膠團(tuán)或含糖或含金的固態(tài)微球。
根據(jù)所述組合物的另一優(yōu)選實施方案，它包含所述重組慢病毒載體的顆粒(載體顆粒)，優(yōu)選具有另一病毒包膜蛋白的假型，優(yōu)選具有水泡性口炎病毒糖蛋白G。
根據(jù)所述組合物的另一優(yōu)選實施方案，它包含如上所述三重型重組慢病毒載體。
根據(jù)所述組合物的有利條件，它包含對應(yīng)所述三重型重組慢病毒載體重組基因組的分離核酸分子，該核酸分子包含(i)用于衣殼包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合的調(diào)控序列以及用于中央起始(或聚嘌呤束cPPT)和終止(CTS)慢病毒起點的順式作用序列，和任選地Rev蛋白的調(diào)控序列(RRE或Rev響應(yīng)元件)以及(ii)編碼黃病毒科蛋白或如上定義所述蛋白質(zhì)的至少8個氨基酸長的免疫原性肽的多核苷酸。
根據(jù)本發(fā)明，所述三重型載體包含表達(dá)盒，其中包括合適的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件(啟動子、增強(qiáng)子、Kozak共有序列、多聚腺苷酸化信號，等等)，如上定義的編碼序列被插入在其控制下，且所述感興趣編碼序列任選地包含細(xì)胞運輸所需要的信號。
根據(jù)本發(fā)明的免疫原性或疫苗組合物可一般性施用(口服、肌肉內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi))、局部施用(鼻施用，其它粘膜途徑)或經(jīng)這些途徑的組合施用于如上定義的敏感物種(人或非人哺乳動物宿主，或貯主(鳥、爬行動物))。
為了靶向諸如樹突細(xì)胞等的抗原呈遞細(xì)胞，以便延長抗原在這些細(xì)胞中的表達(dá)，優(yōu)選地皮下施用這些組合物。
作為替代，利用根據(jù)本發(fā)明的免疫原性或疫苗組合物修飾宿主物種的自體細(xì)胞，尤其是諸如樹突細(xì)胞等的抗原呈遞細(xì)胞。然后將修飾過的細(xì)胞再次施加于宿主；這種用途尤其有利于治療人或非人宿主哺乳動物內(nèi)的黃病毒科感染。
載體的劑量根據(jù)施用途徑不同而變化，也根據(jù)待治療物種(人或動物)及其重量而變化。
本發(fā)明的另一主題是用如上定義重組載體修飾的細(xì)胞。優(yōu)選地，所述細(xì)胞是用所述重組載體穩(wěn)定修飾的真核細(xì)胞；這樣的穩(wěn)定表達(dá)黃病毒科的至少一種蛋白質(zhì)或一種抗原性肽的細(xì)胞可用于-生產(chǎn)所述重組慢病毒載體的顆粒(載體顆粒)，-生產(chǎn)黃病毒科重組病毒蛋白質(zhì)、所述蛋白質(zhì)的免疫原性片段、以及黃病毒科病毒類型的病毒假顆粒(VLP或病毒樣顆粒)，其來源于黃病毒科的包膜蛋白和/或膜蛋白，尤其是來自黃病毒prM和E蛋白；假顆粒優(yōu)選通過免疫捕獲受感染個體生物液中存在的特異性免疫球蛋白而用作診斷黃病毒科感染的試劑，-篩選抗病毒化合物，以及-用作診斷試劑。
根據(jù)本發(fā)明，根據(jù)以下步驟有可能產(chǎn)生黃病毒科的病毒蛋白質(zhì)和/或所述蛋白質(zhì)的免疫原性片段或者病毒假顆粒a)培養(yǎng)如上定義的已修飾細(xì)胞，培養(yǎng)條件允許表達(dá)由所述重組慢病毒載體編碼的黃病毒科的一種或多種病毒蛋白質(zhì)和/或所述蛋白質(zhì)的一種或多種免疫原性片段，和b)用任何合適方法從a)的培養(yǎng)上清或所述細(xì)胞中分離所述的蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段或假顆粒。
根據(jù)此方法，可通過常規(guī)技術(shù)從被如上定義重組載體修飾的細(xì)胞的培養(yǎng)上清或裂解物中純化病毒蛋白質(zhì)或片段，所用的常規(guī)技術(shù)諸如.親和層析然后將標(biāo)簽如編碼多組氨酸尾的核苷酸序列引入載體中，并用鎳凝膠(瓊脂糖等)柱純化所述蛋白質(zhì)；.免疫親和層析感興趣病毒序列在C末端或N末端與編碼肽表位的核苷酸序列融合，所述序列還包含適于用諸如凝血酶等酶切割的位點，以便隨后將表位序列從蛋白質(zhì)中分離；有用的表位是，例如，C9表位(TETSQVAPA)(Mirzabekov T.等，J.Biol.Chem.，1999，274，28745-28750)或myc表位。將表達(dá)的蛋白質(zhì)用已連接特異于所述表位的抗體(1D14針對C9表位或9E10針對myc表位)的親和柱純化并通過用凝血酶切割分離感興趣蛋白質(zhì)；.用諸如聚乙二醇等沉淀劑沉淀，然后離心回收沉淀中的蛋白質(zhì)。
根據(jù)此方法，通過常規(guī)技術(shù)從用如上定義重組載體修飾的細(xì)胞的培養(yǎng)上清中純化黃病毒科病毒類型的顆粒，所用的常規(guī)技術(shù)諸如.用諸如聚乙二醇等沉淀劑沉淀，然后離心回收沉淀中的假顆粒，和.連續(xù)或不連續(xù)梯度離心，尤其是用蔗糖梯度。
本發(fā)明的另一主題是篩選抗病毒化合物的方法，其特征在于，它包括-將用上述重組載體修飾，尤其是用包含編碼諸如NS3(解螺旋酶或蛋白酶)或NS5(聚合酶)等黃病毒科非結(jié)構(gòu)蛋白的cDNA的載體修飾的真核細(xì)胞與待測試庫中的各種化合物接觸，和-在存在或缺乏所述化合物的條件下用任何合適的方法測量所述蛋白質(zhì)的活性(解螺旋酶、蛋白酶、聚合酶)，和-選擇能調(diào)節(jié)(激活或抑制)所述活性的化合物。
用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法評估此活性，例如尤其是以下文獻(xiàn)中所述的方法Borowski等，Acta Biochimica Polonica，2002，49，597-614；Steffens等，J.Gen.Virol.，1999，80，2583-2590；Ryan等，J.Gen.Virol.，1998，79，947-959；Bretner等，Antivir.Chem.Chemother.，2004，15，35-42。
優(yōu)選的，對特異性靶組織，尤其是樹突細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞或肝細(xì)胞進(jìn)行篩選。
本發(fā)明的另一主題是用來自敏感物種個體的生物液樣品診斷黃病毒科感染的方法，其特征在于至少包括以下步驟a)使所述的生物樣品與表達(dá)至少一種以上定義黃病毒科抗原(C、E、E1、E2、prM、M、NS(尤其是NS1))的已修飾真核細(xì)胞接觸，任選已透化的，b)用任何合適的方法顯示(a)中所形成的抗原-抗體復(fù)合物，例如用EIA、ELISA或RIA或者通過免疫熒光。
本發(fā)明的另一主題是適于用來自敏感物種個體的生物學(xué)液體樣品診斷黃病毒科感染的方法，其特征在于至少包含以下步驟a)使所述的生物學(xué)樣品接觸用如上所述表達(dá)至少一種膜蛋白和/或包膜蛋白的慢病毒載體修飾的細(xì)胞培養(yǎng)物上清產(chǎn)生的病毒假顆粒，并b)用任何合適的方法使(a)中所形成的抗原-抗體復(fù)合物顯色，例如用EIA、ELISA或RIA或者通過免疫熒光。
本發(fā)明的另一主題是用于實施如上定義方法的試劑盒，其特征在于它至少包含如上定義的已修飾細(xì)胞。
本發(fā)明的另一主題是抗黃病毒科的免疫方法，其特征在于，它包括單次施加如上定義的重組載體，優(yōu)選皮下注射。
除了提供以上之外，本發(fā)明還包含提供其它，這將從以下有關(guān)制備根據(jù)本發(fā)明的重組載體的實施例和利用所述載體進(jìn)行免疫接種的用途的實施例和衍生的修飾細(xì)胞用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的用途的實施例以及有關(guān)附圖中出現(xiàn)，其中-

圖1是對應(yīng)序列SEQ ID NO.15的載體質(zhì)粒pTRIPΔU3CMV-sE(WNV)的示意圖，其中含有編碼西尼羅病毒的截短E蛋白(E1-411)(SEQ ID NO.17)的cDNA(SEQ ID NO.16)。
-圖2描述用ELISA或中和測試分析用單次腹膜內(nèi)注射1μg TRIPΔU3CMV-sE(WNV)載體顆粒免疫的小鼠的血清。
-圖3代表感染西尼羅病毒的VERO細(xì)胞的裂解物的免疫沉淀，用來自用1μgTRIPΔU3CMV-sE(WNV)載體顆粒免疫小鼠的血清與對照血清相比較。
泳道1至10感染了西尼羅病毒的VERO細(xì)胞的裂解物與以下血清沉淀-泳道1用TRIPΔU3CMV-GFP載體免疫后14天的血清，-泳道2用TRIPΔU3CMV-GFP載體免疫后23天的血清，-泳道3多克隆抗西尼羅病毒(IS-98-ST1株)腹水，-泳道4非免疫血清，-泳道5用TRIPΔU3CMV-sE(WNV)載體免疫后14天的血清，-泳道6用TRIPΔU3CMV-sE(WNV)載體免疫后23天的血清，-泳道7來自用TRIPΔU3CMV-sE(WNV)載體免疫14天的小鼠的攻擊后22天(10LD50的IS-98-ST1株)的血清，-泳道8來自用TRIPΔU3CMV-sE(WNV)載體免疫14天的小鼠的攻擊后30天(10LD50的IS-98-ST1株)的血清，-泳道9來自用TRIPΔU3CMV-sE(WNV)載體免疫30天的小鼠的攻擊后22天(100LD50的IS-98-ST1株)的血清，-泳道10 用淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒免疫的小鼠的血清。
泳道11和12未感染的VERO細(xì)胞的裂解物用以下血清沉淀-泳道11 多克隆抗西尼羅病毒(IS-98-ST1株)腹水，-泳道12 來自用TRIPΔU3CMV-sE(WNV)載體免疫30天的小鼠的攻擊后22天(IS-98-ST1株的100LD50)的血清。
-圖4代表腹膜內(nèi)免疫小鼠并隨后經(jīng)相同途徑攻擊的小鼠的存活曲線，或者在免疫2周后用10LD50的IS-98-ST1株攻擊(A)，或者在免疫4周后用100LD50的IS-98-ST1株攻擊(B)?！び肈PBS接種的對照小鼠?！?μg TRIPΔU3CMV-EGFP載體顆粒免疫的對照小鼠?！鲇?μg TRIPΔU3CMV-sE(WNV)載體顆粒免疫的小鼠。
-圖5表示從用表達(dá)西尼羅病毒prM和E蛋白的重組慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的真核細(xì)胞上清中純化病毒假顆粒。
-圖6表示在接種TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)的129只小鼠血清中檢測抗WNV-sE抗體。將來自WNV感染的Vero細(xì)胞的放射性標(biāo)記裂解物用來自慢病毒載體接種的129只小鼠的合并免疫血清進(jìn)行免疫沉淀。(A)WNV攻擊前血清。(B)攻擊后血清。HMAF＝超免疫小鼠腹水液。對照血清＝未免疫血清。MV抗血清＝麻疹病毒的抗血清。TRIP/WNsE＝TRIPΔU3.CMVsE(WNV)。TRIP/GFP＝TRIPΔU3.CMV-GFP。
-圖7表示用流式細(xì)胞儀分析熱處理對重組慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的影響。將293T細(xì)胞與已在70℃熱滅活10分鐘(加熱的TRIP/GFP)或未滅活(TRIP/GFP)的TRIPΔU3.CMV-GFP載體顆粒一起保溫。未感染的293T細(xì)胞(偽)用作對照。在48小時的時候，測量GFP熒光強(qiáng)度；指出GFP陽性細(xì)胞的百分率。
實施例1TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)重組載體的制備1)pTRIPΔU3.CMV-sE(WNV)載體質(zhì)粒的構(gòu)建用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增代表西尼羅病毒IS-98-ST1株基因組第967至2292位核苷酸序列(專利申請F(tuán)R 0104599和Genbank登記號AF481864的序列)并且對應(yīng)多蛋白第291至732位氨基酸(申請F(tuán)R 0104599和Genbank登記號AAL87234)的cDNA，所用的正義引物為5’-TATCGTACGATGAGAGTTGTGTTTGTCGTGCTA-3’(SEQ ID NO.18)，含有下劃線標(biāo)示的BsiWI位點；反義引物為5’-ATAGCGCGCTTAGACAGCCCTTCCCAACTGA-3’(SEQ ID NO.19)，含有下劃線標(biāo)示的BssH II位點。此cDNA對應(yīng)附錄序列表中的序列SEQ ID NO.16，邊界是5’位置的BsiWI位點和3’位置的BssH II位點。SEQ ID NO.16的序列從5’至3’依次包含ATG，編碼來源于M蛋白前體的信號肽的序列(prM 151-166)和編碼截短的E蛋白的序列(E1-441)，膜錨定區(qū)已從中被刪除。它編碼分泌到胞外介質(zhì)中的E蛋白(sE蛋白)；來源于prM蛋白的信號肽用于E蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的轉(zhuǎn)位以及在分泌泡中運輸?shù)劫|(zhì)膜上，在那里它們被釋放入胞外介質(zhì)中。
消化慢病毒載體質(zhì)粒pTRIPΔU3.CMV-EGFP(專利申請WO 01/27302)以切除EGFP基因，然后將線性化質(zhì)粒與含BsiW I和BssH II位點的連接子連接，從而得到被稱為pTRIPΔU3.CMV-BsiW I-BssH II的質(zhì)粒。將以上獲得cDNA的1.4kb長的BsiW I-BssH II片段，包括sE蛋白構(gòu)建體在內(nèi)，克隆入質(zhì)粒pTRIPΔU3.CMV-BsiW I-BssH II的相同位點中，得到被稱為pTRIPΔU3.CMV-sE(WNV)或pTRIPΔU3.CMV-sE(WNV)的重組慢病毒載體質(zhì)粒(圖1和SEQ ID NO.15)。用pTRIPΔU3.CMV-sE(WNV)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)菌的培養(yǎng)物于2003年8月27日以編號I-3076保藏于國家微生物培養(yǎng)物保藏中心(the CollectionNationale de Cultures de Microorganismes[National Collection of Cultures ofMicroorganisms]，25 rue du Docteur Roux，75724 Paris Cedex 15)。
通過限制性酶切以及測序?qū)?yīng)sE蛋白構(gòu)建體的插入片段證實pTRIPΔU3.CMV-sE(WNV)重組載體質(zhì)粒的正確性。
1.4kb長的BsiW I-BssH II插入片段對應(yīng)附錄序列表中的核苷酸序列SEQ IDNO.16；它編碼被稱為sE的分泌E蛋白，對應(yīng)附錄中序列表內(nèi)的氨基酸序列SEQ IDNO.17。
2)具有水泡性口炎病毒包膜糖蛋白(VSV-G)假型的TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)載體的病毒顆粒的制備在添加10％胎牛血清(FCS)的Dulbecco’s改進(jìn)Eagle培養(yǎng)基(DMEM)Glutamax(GIBCO)中培養(yǎng)人成纖維細(xì)胞293T(ATCC)。具有水泡性口炎病毒包膜糖蛋白(VSV-G)假型的TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)載體的病毒顆粒也被稱為TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)載體顆粒，是通過磷酸鈣共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞系產(chǎn)生的，用于共轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒是以上定義的pTRIPΔU3.CMV-sE(WNV)載體質(zhì)粒、反式提供病毒顆粒結(jié)構(gòu)蛋白和酶的衣殼包裝質(zhì)粒(pCMVΔR8.2Naldini等，Science，1996，272，263-267；pCMVΔR8.91或p8.7Zufferey等，Nat.Biotechnol.，1997，15，871-877)和用于表達(dá)VSV病毒包膜糖蛋白的質(zhì)粒(pHCMV-GYee等，P.N.A.S.，1994，91，9564-9568)，如描述于Zennou等，Cell.，2000，101，173-185。
3)用重組TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)載體表達(dá)分泌形式的WNVE糖蛋白(WNV-sE)通過間接免疫熒光檢測慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的293T細(xì)胞中WNV-sE的表達(dá)。簡而言之，用TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)培養(yǎng)于8室Glass-Labteks(NUNC)上的人293T細(xì)胞。48小時后，用PBS配制的3％多聚甲醛(PFA)固定20分鐘并用配制于PBS中的0.1％Triton X-100透化4分鐘。將細(xì)胞與1∶100稀釋于PBS中的抗WNV HMAF一起保溫1小時。用溶于PBS的0.2％BSA封閉后，將細(xì)胞進(jìn)一步與1∶500稀釋于PBS 0.2％BSA中的Cy3-偶聯(lián)的抗小鼠IgG抗體(AMERSHAMPHARMACIA)一起保溫。用DAPI顯現(xiàn)細(xì)胞核。用具ApoTome系統(tǒng)的Zeiss Axioplan顯微鏡觀察玻片。
轉(zhuǎn)導(dǎo)后48小時，高比率的細(xì)胞被免疫染色。免疫染色模式表明WNV-sE通過分泌途徑遷移。
4)重組TRIPΔU3.CMV-sE(MVV)載體的滴定4.1)材料和方法a)通過ELISA進(jìn)行p24抗原滴定用商業(yè)HIV-1 p24 ELISA試劑盒(PERKIN ELMER LIFESCIENCES)進(jìn)行濃縮載體顆粒的p24抗原含量的定量。
b)定量PCR引物和探針由PROLIGO合成。為了檢測慢病毒載體中U5-R序列，使用如下的引物和探針(Brussel A和Sonigo P，J.Virol.，2003，77，10119-10124)(SEQ ID NO20 to 27)-探針(3’熒光素(PITC)或被磷酸化(P))LTR-FL5’-CACAACAGACGGGCACACACTACTTGA-FITC-3’LTR-LC5’-RED640-CACTCAAGGCAAGCTTTATTGAGGC-P-3’-引物AA55M5’-GCTAGAGATTTTCCACACTGACTAA-3’M6675’-GGCTAACTAGGGAACCCACTG-3’.
為檢測CD3，所用的引物和探針序列如下-探針CD3-P15’-GGCTGAAGGTTAGGGATACCAATATTCCTGTCTC-FITC-3’，CD3-P25’RED705-CTAGTGATGGGCTCTTCCCTTGAGCCCTTC-P-3’
-引物CD3-in-F5’-GGCTATCATTCTTCTTCAAGGTA-3’CD3-in-R5’-CCTCTCTTCAGCCATTTAAGTA-3’.
在轉(zhuǎn)導(dǎo)后48小時用QIAampDNA Blood Mini試劑盒(QIAGEN)從大約3×106個慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的293T細(xì)胞中分離基因組DNA。為了進(jìn)行實時PCR分析，將5μLDNA與15μL PCR預(yù)混液混合，其由1X JumpstartTMTaq ReadyMixTM(SIGMA)、1.9mM MgCl2、1.5μM正向和反向引物(AA55M/M667或CD3-in-F/CD3-in-R)、200nM探針(LTR-FL/LTR-LC或CD3-P1/CD3-P2)和1.5單位的Taq DNA聚合酶(Invitrogen)組成。用95℃3分鐘一個循環(huán)，然后40個循環(huán)的95℃5秒、55℃15秒和72℃10秒進(jìn)行擴(kuò)增?？紤]到載體貯液的可能質(zhì)粒污染，總是平行檢測用熱滅活(70℃10分鐘)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的293T細(xì)胞的DNA。用來自未轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的5μL基因組DNA作為陰性對照。各DNA樣品均為雙份檢測，然后報告平均值。10倍系列稀釋的已知濃度質(zhì)粒pTripCD3，其含相關(guān)序列U5-R和CD3，與DNA樣品一起平行擴(kuò)增生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。
通過對293T細(xì)胞數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化U5-R拷貝數(shù)來計算每個細(xì)胞的總載體拷貝數(shù)，正如用相同基因組DNA樣品上CD3分子的拷貝數(shù)進(jìn)行定量，然后扣除獲自用熱滅活載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞的拷貝數(shù)。
4.2)結(jié)果首先用抗p24 HIV-1衣殼蛋白的商品化ELISA檢測評估此實驗所用載體貯液中物理顆粒的數(shù)目。測定濃度是每微升58ng p24。
用定量PCR實驗、基于載體DNA向靶細(xì)胞轉(zhuǎn)移計算載體貯液的實際滴度。對載體特異性序列(U5)和細(xì)胞基因座(CD3)二者的定量給出了每個細(xì)胞的平均DNA載體拷貝數(shù)。這使得在用限定濃度的載體顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)后可以計算載體制備物的滴度。在本研究中所用TRIPΔU3.CMV-sE載體貯液在人293T細(xì)胞中被滴定為每毫升5.2×107個轉(zhuǎn)導(dǎo)單位(TU)。換言之，1ng來自此TRIPΔU3.CMV-sE載體制備物的p24抗原可轉(zhuǎn)導(dǎo)900個人293T細(xì)胞。
為了簡單起見，以下部分中使用的載體顆粒的量將表示為p24抗原的ng數(shù)。
實施例2在BALB/c小鼠中TRIPΔU3.CMV-sE載體致免疫能力的分析1)材料和方法1.1)免疫/疫苗接種方案用如實施例1所述制備的含1μg TRIPΔU3.CMV-sE載體顆粒的0.1mlDulbecco’s PBS(DPBS)腹膜內(nèi)注射接種6周大的BALB/c小鼠(2組，每組6只小鼠；Janvier breeding colony)。對動物進(jìn)行單次疫苗注射。
對照組是在相同條件下用與TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)載體顆粒相似方式制備的1μg TRIPΔU3.CMV-GFP載體顆粒(2組，每組3只小鼠)或者只用DPBS緩沖液(2組，每組3只小鼠)進(jìn)行接種。
在注射疫苗14天(D14)和23天(D23)后取小鼠血清并在測量抗體應(yīng)答前將其在56℃熱滅活30分鐘。
1.2)西尼羅病毒株、純化和滴定所用的西尼羅病毒株是IS-98-ST1株，描述于專利申請F(tuán)R 0104599；它在伊蚊細(xì)胞(AP61系)上生產(chǎn)并根據(jù)文獻(xiàn)Desprès等，Virol.，1993，196，209-219所述的方案純化。更確切的說，以0.4的感染復(fù)數(shù)用西尼羅病毒IS-98-ST1株感染AP61細(xì)胞。感染三天后，用PEG 6000(7％)沉淀培養(yǎng)物上清中存在的病毒顆粒，然后用不連續(xù)30-60％蔗糖梯度和線性10-50％蔗糖梯度進(jìn)行純化。由此獲得的病毒粒子保存于-80℃的蔗糖(30％)中。
通過病灶免疫測試(Focus ImmunoAssay，F(xiàn)IA)在AP61細(xì)胞上滴定西尼羅病毒，而感染性滴度表示為病灶形成單位(FFUAP61/ml)，根據(jù)上述文獻(xiàn)中Desprès等人所述的方案進(jìn)行。
純化后病毒制劑的感染滴度大約為1010FFUAP61/ml。
1.3)抗-WNV的超免疫腹水通過用WNV IS-98-ST1株重復(fù)免疫以及隨后用肉瘤180接種成年小鼠獲得抗WNV超免疫小鼠腹水(HMAF)。如前文所述用103FFU的IS-98-ST1免疫成年WNV-抗性BALB/c-MBT同系小鼠獲得小鼠多克隆抗WNV抗體(Mashimo等，PNAS，2002，99，11311-11316)。在初次免疫一個月后收集WNV-免疫血清。
1.4)ELISA根據(jù)文獻(xiàn)Mashimo等，PNAS，2002，99，11311-11316中所述方案用1.2段落中所述的蔗糖梯度純化的WN IS-98-ST1病毒顆粒作為抗原(每個96孔微量滴定板為106FFUAP61)通過ELISA檢測抗E總抗體滴度。將1∶4000稀釋的偶聯(lián)過氧化物酶的抗小鼠免疫球蛋白(H+L)(JACKSON IMMUNO RESEARCH)、1∶20,000稀釋的偶聯(lián)過氧化物酶的抗小鼠IgM(μ-鏈特異性)(SIGMA)或者1∶20,000稀釋的偶聯(lián)過氧化物酶的抗小鼠IgG(γ-鏈特異性)(Sigma)用作二級抗體。如上定義，按照對應(yīng)光密度(OD)值至少是對照動物血清兩倍的血清最終稀釋度來測定滴度。也可用已描述的亞型特異性ELISA檢測抗-E IgG和IgM抗體(Despres P等，J.Infect.Dis.，2005，191，207-214)。
1.5)免疫沉淀(RIP測試)實驗方案如Desprès等人所述(J.Virol.，1995，69，7345-7348)。更確切的說，用西尼羅病毒IS-98-ST1株以感染復(fù)數(shù)5 FFUAP61/細(xì)胞感染VERO細(xì)胞。感染后20小時，用Tran35Slabel(ICN；100μCi/ml)標(biāo)記所述細(xì)胞蛋白質(zhì)3小時。用冷PBS洗滌3次后，將細(xì)胞在RIPA緩沖液(50mM Tris-Cl，pH8.0，150mM NaCl，10mMEDTA，0.1％SDS，0.5％脫氧膽酸鈉，1％Triton X-100，補(bǔ)充25μg/ml aprotinin)(SIGMA)中+4℃放置10分鐘。然后將細(xì)胞裂解物在+4℃10,000rpm離心5分鐘使其澄清。然后將裂解物與1∶100最終稀釋度的待測血清在蛋白A Sepharose存在下一起保溫。然后在非還原條件下用SDS-15％PAGE膠分析免疫沉淀產(chǎn)物并通過放射自顯影法顯影。
1.6)中和試驗被免疫小鼠血清對于西尼羅病毒IS-98-ST1株的中和活性通過在VERO細(xì)胞(ATCC)上病毒復(fù)制灶的減少來檢測。更確切的說，將56℃滅活30分鐘的血清的系列稀釋液(0.1ml)與西尼羅病毒IS-98-ST1株接種物(0.1ml中有100FFUAP61)一起保溫。然后用混合物在37℃感染VERO細(xì)胞(12孔板的每個孔中有1.5×105個細(xì)胞)2小時，感染兩天后計算病毒復(fù)制灶。血清的中和性抗體滴度，稱為TNRF90(病毒復(fù)制灶減少90％的中和試驗)，是通過中和每孔中所接種100FFU病毒的至少90的血清的最終稀釋度來測定的。
2)結(jié)果2.1)有關(guān)西尼羅病毒的來自被免疫動物的血清反應(yīng)性的ELISA分析用純化的西尼羅病毒作為抗原，通過注射TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)載體顆粒后14天和23天所采集血清經(jīng)ELISA檢測證實抗西尼羅病毒E蛋白的抗體的生產(chǎn)。
圖2給出的結(jié)果顯示，在注射疫苗后14天和23天，用TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)載體顆粒免疫的小鼠血清的特異性抗體滴度分別是1/10000和1/20000。
2.2)用免疫沉淀分析被免疫動物血清的特異性通過免疫沉淀證實用TRIPΔU3.CMV-sE載體免疫的動物的血清的特異性。來自用TRIPΔU3.CMV-sE載體免疫小鼠的血清與西尼羅病毒的包膜蛋白E反應(yīng)；疫苗接種后第23天的反應(yīng)性比第14天的反應(yīng)性更強(qiáng)(圖3)。
2.3)有關(guān)西尼羅病毒的免疫動物血清的中和活性分析通過測量VERO細(xì)胞上病毒復(fù)制灶的減少(TNRF90)從實驗上證實單次注射TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)載體顆粒免疫小鼠血清對于西尼羅病毒的中和活性。注射疫苗后第14天和第23天的滴度分別是10和20(圖2)。
實施例3BALB/c小鼠中TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)載體保護(hù)能力的分析在WNV相關(guān)性腦炎的小鼠模型中測試用TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)載體顆粒免疫小鼠后產(chǎn)生的抗E蛋白抗體的保護(hù)作用(Deubel等，Ann.N.Y.Acad.Sci.，2001，951，195-206；Mashimo等，2002，前已引用；國際專利申請WO 02/081511；Ceccaldi等，F(xiàn)EMS Microbiol.Lett.，2004，233，1-6)。因此，通過腹膜內(nèi)注射10LD50(使50％的小鼠致死的劑量)或100LD50的高神經(jīng)侵入性和神經(jīng)毒性的西尼羅病毒IS-98-ST1株攻擊免疫小鼠。
更確切的說，使用了兩種攻擊方案(i)第一組按實施例2中所述免疫的6只小鼠在注射疫苗15天后接受10LD50的IS-98-ST1株病毒；(ii)第二組按實施例2中所述免疫的6只小鼠在注射疫苗30天后(D30)接受100 LD50的IS-98-ST1株病毒。攻擊病毒稀釋于補(bǔ)充0.2％牛血清白蛋白(Sigma)的DPBS(pH7.5)中；1LD50相當(dāng)于10FFUAP61/ml。
第一組小鼠的存活曲線(圖4A)顯示用DPBS或用TRIPΔU3.CMV-EGFP載體接種的所有對照小鼠在接種攻擊劑量病毒后13天死亡。另一方面，用TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)載體免疫的6只小鼠可以抗致死劑量并且未顯示出發(fā)病。
攻擊后22天，通過ELISA發(fā)現(xiàn)抗性小鼠具有的抗西尼羅病毒抗體效價(1.7±0.1，稀釋度1∶104)高于攻擊前獲得的值。在攻擊1個月后，來自被攻擊小鼠的血清與西尼羅病毒的E蛋白強(qiáng)烈反應(yīng)(圖3)，且中和抗體效價為100。
第二組小鼠的存活曲線(圖4B)顯示用DPBS或TRIPΔU3.CMV-EGFPs載體(DPBS)接種的對照小鼠在接種攻擊劑量病毒后9天內(nèi)死亡。另一方面，用TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)載體免疫的6只小鼠可抗致死劑量并且未顯示出發(fā)病。與第一組的小鼠一樣，在攻擊1個月后，來自攻擊免疫小鼠的血清與西尼羅病毒的E蛋白強(qiáng)反應(yīng)(圖3)，且中和抗體效價為100。
此外，對于西尼羅病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白(圖3)，被攻擊小鼠缺乏抗體反應(yīng)性，表明TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)載體所誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫足以防止攻擊病毒的感染。
結(jié)果顯示，在成年小鼠中單次注射小量TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)載體顆粒在免疫兩周后誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體并且使其具有抵抗外周接種西尼羅病毒的致死攻擊的保護(hù)性免疫力。
實施例4用TRIPΔU3.CMV-prM-E(WNV)重組載體制備病毒假顆粒1)TRIPΔU3.CMV-prM-E(WNV)載體的制備如實施例1所述構(gòu)建三重型重組HIV載體，其中含有編碼西尼羅病毒IS-98-ST1株的prM和E蛋白的cDNA，這對應(yīng)其基因組序列的第399至2469位(專利申請F(tuán)R 0104599和Genbank AF481864)。如實施例1所述獲得用TRIPΔU3.CMV-prM-E(WNV)重組載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的穩(wěn)定細(xì)胞系。
2)病毒假顆粒或VLP的制備收獲用TRIPΔU3.CMV-prM-E(WNV)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞培養(yǎng)上清并用PEG 6000(Fluka，7％W/V)在4℃溫和攪拌沉淀4至5小時。所獲得的沉淀在4℃以9000rpm離心30分鐘，將含VLP的沉淀收集于4mlTNE(20mMTris-HCl，pH8.0；150mMNaCl；2mM EDTA)中并鋪在不連續(xù)蔗糖梯度(溶于1×TNE的20％-60％蔗糖)。將所述梯度液在39000rpm離心2小時并收獲20-60％界面的乳白色條帶，鋪在線性梯度(溶于1×TNE中的11-55％蔗糖)上并在35000rpm離心16小時。收集梯度組分(11組0.5ml組分)并隨后用抗WNV免疫血清(1∶20)通過ELISA進(jìn)行分析，通過SDS-PAGE凝膠電泳和考馬斯藍(lán)染色進(jìn)行分析，以及用抗WNV免疫血清通過Western印跡進(jìn)行分析。如圖5所示，ELISA的結(jié)果表明在所述梯度的組分6至10存在純化的VLP。
實施例5在129小鼠中分析TRIPΔU3.CMV-sE載體的致免疫能力和保護(hù)能力1)材料和方法1.1)免疫/疫苗接種方案用如實施例1所述制備的不同劑量TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)載體顆粒經(jīng)腹膜內(nèi)注射接種6至8周大的129小鼠(6組，每組6只小鼠)，所述載體顆粒稀釋于補(bǔ)充0.2％牛血清白蛋白(BSA)的0.1ml Dulbecco’s PBS(DPBS；pH7.5)中。
對動物進(jìn)行單次疫苗注射。
對照組是在同樣條件下用以與TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)載體顆粒相似方式制備的500ng p24抗原當(dāng)量的TRIPΔU3.CMV-GFP載體顆粒(1組6只小鼠)或者只用DPBS緩沖液(1組6只小鼠)進(jìn)行接種。
在免疫后6、13、20或27天(D6，D13，D20，D27)從小鼠眼窩周圍放血并如實施例2所述在測量抗WNV總抗體，IgG和IgM，以及體外中和活性之前將合并血清在56℃熱滅活30分鐘。
通過腹膜內(nèi)注射接種如實施例2所述制備的神經(jīng)毒性WNV株IS-98-ST1進(jìn)行WNV攻擊。隨后在免疫后第7天或第14天腹膜內(nèi)注射1000LD50(腹膜內(nèi)注射LD50＝10FFU)的WNV株IS-98-ST1對動物進(jìn)行攻擊。在長達(dá)21天的時間內(nèi)每日監(jiān)測被攻擊小鼠的發(fā)病或死亡跡象。
1.2)流式細(xì)胞儀測試用已在70℃熱滅活10分鐘或未處理(陽性對照)的TRIPΔU3.CMV-GFP載體顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)培養(yǎng)于25cm2瓶的293T細(xì)胞。48小時后，將細(xì)胞分離、洗滌并用2％PFA固定。用FACSscan檢測GFP熒光強(qiáng)度并用CellQuest軟件進(jìn)行分析。
2)結(jié)果為了考慮個體間免疫應(yīng)答的變異性，選擇比BALB/c純系性更低的129小鼠用于評估由表達(dá)WNV-sE的慢病毒載體誘導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)。
2.1)腹膜內(nèi)注射TRIPΔU3.CMV-sE載體顆粒后的強(qiáng)抗體應(yīng)答在用相當(dāng)于500ng p24抗原的單劑量TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)載體顆粒免疫的129成年小鼠中，早在免疫后6天時就可檢測到抗WNV的總抗體，盡管存在的濃度較低。相比較而言，在TRIPΔU3.CMV-GFP免疫小鼠的血清中則未檢測到抗WNV抗體。正如在此時間點所預(yù)期的，體液應(yīng)答對應(yīng)于IgM而非IgG抗體?？偪贵w應(yīng)答在第13天增加10倍達(dá)到平臺期，然后隨時間維持。在這些稍后的時間點(第13、20、27天)，IgM抗體消失，被IgG所取代(表2)。
表2.小鼠對TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)疫苗接種的抗體應(yīng)答
a.用相當(dāng)于500ng p24抗原量的慢病毒載體顆粒腹膜內(nèi)接種成年129小鼠組b.用ELISA對合并的熱滅活血清進(jìn)行測定c.FRNT感染灶減少中和試驗將WNV的FFU數(shù)減少至少90％的最高血清稀釋度。
RIP測試證明這些抗體與來自感染IS-98-ST1的Vero細(xì)胞裂解物的WNVE-糖蛋白有反應(yīng)性(圖6A)。感染灶減少中和試驗(FRNT)顯示來自TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)免疫小鼠的血清早在免疫后6天時就含有可檢測水平的WNV中和抗體(表2)。這些數(shù)據(jù)合起來表明在用TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)載體顆粒免疫的小鼠中發(fā)生了早期的和特異性抗WNV抗體免疫應(yīng)答。
2.2)TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)疫苗接種賦予小鼠抗高劑量WNV攻擊的早期保護(hù)作用用相當(dāng)于500ng p24抗原的單次劑量TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)載體顆粒免疫的小鼠早在免疫后7天時就能完全保護(hù)小鼠對抗高病毒劑量攻擊，因為在該組中未觀察到發(fā)病或死亡(表3)。
表3TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)抗WNV感染的快速保護(hù)作用
a.用相當(dāng)于500ng p24抗原的單次劑量慢病毒載體顆?；蛴肈PBS腹膜內(nèi)接種成年129小鼠組。
b.在攻擊日，用1,000個腹膜內(nèi)LD50的WNV株IS-98-ST1腹膜內(nèi)接種小鼠。記錄21天中的存活。
c.用ELISA對合并的熱滅活血清進(jìn)行測定。
ND未檢測。
選擇的病毒攻擊中所用感染性病毒劑量相當(dāng)于蚊子叮咬所能傳播的最大病毒接種量。據(jù)估計此劑量相當(dāng)于10,000個體外FFU(Despres等，J.Infect.Dis.，2005，191，207-214；Mashimo等，2002，前已引用)，它自身相當(dāng)于經(jīng)腹膜內(nèi)途徑的1000個體內(nèi)LD50。
用對照載體TRIPΔU3.CMV-GFP或用DPBS免疫的所有小鼠在攻擊后11天內(nèi)全部死亡(表3)。有趣的是，抗WNV總抗體在攻擊后提高了10倍，表明TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)免疫小鼠中發(fā)生了有效的二次應(yīng)答(表3)。在BALB/c小鼠中也獲得了相同的結(jié)果。這些結(jié)果表明TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)疫苗接種使小鼠具有抗高WNV攻擊的非常迅速且完全的保護(hù)性免疫應(yīng)答。這在疾病爆發(fā)急需保護(hù)敏感物種的情況下可具有重要的價值。
2.3)慢病毒載體疫苗所賦予的免疫是殺滅性的。
為了確定在已接種疫苗的動物內(nèi)在攻擊時是否會發(fā)生WNV初次感染，換言之，所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答是否賦予個體殺滅性(sterilizing)保護(hù)性免疫，對在WNV攻擊之前和之后21天收集的免疫小鼠的合并血清進(jìn)行RIP測試。在用相當(dāng)于500ng p24抗原的單次劑量TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)載體顆粒免疫后第13、20和27天獲得的血清能與WNV的E蛋白反應(yīng)。不過，在免疫后第6天獲得的血清則不與此蛋白反應(yīng)(圖6A)。由于RIP測試不能檢測IgM，這與ELISA的結(jié)果是一致的，后者顯示在免疫后第6天只有抗WNV的IgM而無IgG存在。來自TRIPΔU3.CMV-GFP免疫小鼠的血清則不與WNVE蛋白反應(yīng)。
有趣的是，在來自TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)免疫小鼠的攻擊后血清中未檢測到除WNVE之外抗其它任何病毒蛋白質(zhì)的抗體(圖6B)。這種抗WNV非結(jié)構(gòu)蛋白抗體的缺失強(qiáng)烈表明在所有的TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)接種小鼠中未發(fā)生病毒復(fù)制。因此，TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)接種賦予小鼠完全殺滅性免疫力。
如果該疫苗用于鳥類免疫，這一點就可能具有重要的優(yōu)勢。實際上，盡管馬、人和其它哺乳動物被認(rèn)為是WNV感染的死端宿主，但已知鳥類是擴(kuò)增宿主并且參與流行病的維持(Dauphin等，Comp.Immunol.Microbiol.Infect.Dis.，2004，27，343-355)。
2.4)單次免疫TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)所提供的保護(hù)作用是長期待續(xù)的。
為了確定用基于TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)慢病毒載體的疫苗單次免疫是否具有引起抗WNV的長期保護(hù)性免疫的潛能，在注射TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)疫苗3個月后，通過ELISA和FRNT檢測來自129免疫小鼠的合并血清。
用相當(dāng)于500ng p24抗原的單次劑量TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)載體顆粒免疫小鼠的抗體水平在注射3個月后仍然相當(dāng)高(1∶30,000)并且中和抗體是持久的(表4)。
表4通過TRIP/sEWNV獲得的抗WNV感染的長期保護(hù)作用
a)相當(dāng)于500ng p24抗原的ngb)用ELISA對合并的熱滅活血清進(jìn)行測定c)FRNT感染灶減少中和試驗使WNV的FFU數(shù)減少至少90％的最高血清稀釋度。
d)免疫后3個月，用1000LD50的WNV株IS-98-ST1腹膜內(nèi)接種小鼠。記錄21天中的生存。
在用TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)免疫并隨后腹膜內(nèi)注射1000LD50劑量IS-98-ST1WNV進(jìn)行攻擊的小鼠內(nèi)即未觀察到發(fā)病也未觀察到死亡，而所有的對照小鼠都死亡(表4)。攻擊后總抗體效價以及中和抗體都有所增加，表明用TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)免疫的小鼠早在三個月前已建立了有效的二次應(yīng)答(表4)。這表明用編碼WNV-sE的慢病毒載體進(jìn)行單次免疫足以在小鼠內(nèi)提供長期持續(xù)的保護(hù)性免疫。
2.5)單次小劑量的TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)足以提供完全和快速的保護(hù)。
為了計算獲得完全的保護(hù)性免疫所需的載體最小劑量，用逐漸降低劑量的TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)腹膜內(nèi)注射免疫幾組129小鼠，用500ng劑量的TRIPΔU3.CMV-GFP載體顆粒免疫小鼠作為對照。7天后，用1000LD50IS-98-ST1攻擊所有小鼠。正如所預(yù)期的，接受對照載體的所有小鼠在攻擊的11-13天內(nèi)死亡。結(jié)果表明完全保護(hù)小鼠所需的TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)最小劑量是相當(dāng)于50ngp24抗原的載體顆粒量(表5)。
表5TRIP/sEWNV對抗WNV感染的劑量依賴性保護(hù)
a)用單次劑量的慢病毒載體顆粒接種成年129小鼠組。
b)初次免疫后一周用1,000個腹膜內(nèi)LD50的WNV株IS-98-ST1腹膜內(nèi)接種小鼠。記錄21天中存活。
c)通過ELISA對合并的熱滅活血清進(jìn)行測定。
d)慢病毒載體顆粒在70℃熱滅活10分鐘。
較低劑量只提供部分保護(hù)，由此可計算50％的保護(hù)劑量是相當(dāng)于6.2ng p24抗原的載體顆粒。應(yīng)注意的是，這些劑量保護(hù)實驗是在最嚴(yán)謹(jǐn)?shù)墓魲l件下進(jìn)行的，在接種后第7天早期攻擊并且是高病毒攻擊接種量(1000LD50)。由于在第7天和第15天之間總抗體濃度增加了10倍，所以如果在僅一周后計算，50％保護(hù)劑量就可能甚至低于6.2ng。來自接受了相當(dāng)于50ng p24的TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)載體顆粒的小鼠的免疫血清沒有可檢測到的抗WNV抗體。假定這樣低的TRIPΔU3.CMV-sE劑量可以在初次免疫一周后使小鼠完全被保護(hù)，那么可以預(yù)期基于慢病毒載體的疫苗必須產(chǎn)生啟動抗WNV的先天免疫的信號。
此外，重要的是要注意完全保護(hù)性免疫所需的劑量可能由于所用的模型而被低估了。實際上，資料已顯示與包括人細(xì)胞在內(nèi)的其它哺乳動物細(xì)胞相比，小鼠細(xì)胞對于慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)具有較低的允許度(Giannini等，Hepatology，2003，38，114-122；Nguyen等，Mol.Ther.，2002，6，199-209).鳥類細(xì)胞顯示出比小鼠細(xì)胞更好的轉(zhuǎn)導(dǎo)允許度，使得我們可以預(yù)計在家禽內(nèi)微小的慢病毒載體疫苗劑量就有效。
為了確定獲得的保護(hù)性是特別由于實際的載體介導(dǎo)的WNV-sE抗原表達(dá)造成的而非由于殘余WNV-sE蛋白或污染載體貯液的載體質(zhì)粒DNA造成的，因此，用熱滅活的(70℃10分鐘)TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)載體顆粒免疫小鼠，熱滅活是終止轉(zhuǎn)導(dǎo)的一種處理方法(圖7)。用WNV攻擊后，所有注射了熱滅活TRIPΔU3.CMV-sE(WNV)的小鼠死亡(表5)。因此不可能是游離的裸DNA在保護(hù)中起作用。
此外，憑借用于使載體顆粒假型化的VSV-G衣殼普遍存在的向性，慢病毒載體疫苗理論上可以不經(jīng)修飾用于任何有感染危險的脊椎動物物種，包括人和動物，如馬、家禽和動物園哺乳動物。
這些結(jié)果證明，微小劑量的載體顆粒足以在小鼠內(nèi)獲得快速和完全的保護(hù)性免疫。這使得該候選疫苗大大節(jié)省成本，并且可以在家禽養(yǎng)殖場或馬場中建立大規(guī)模接種疫苗的方案。
序列表<110>巴斯德研究所國家科學(xué)研究中心菲利普·德普雷斯皮埃爾·沙爾諾弗雷德里克·坦吉馬里-帕斯卡萊·弗倫凱爾<120>用于表達(dá)黃病毒科蛋白的重組慢病毒載體及其作為疫苗的應(yīng)用<130>226PCT112<160>27<170>PatentIn version3.3<210>1<211>100<212>PRT<213>黃病毒屬(Flavivirus sp.)<400>1Lys Gly Met Ser Tyr Val Met Cys Thr Gly Ser Phe Lys Leu Glu Lys1 5 10 15Glu Val Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Val Leu Val Gln Val Lys Tyr20 25 30Glu Gly Thr Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser Thr Gln Asp Glu35 40 45Lys Gly Val Thr Gln Asn Gly Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Ile Val50 55 60Thr Asp Lys Glu Lys Pro Ile Asn Ile Glu Thr Glu Pro Pro Phe Gly65 70 75 80Glu Ser Tyr Ile Ile Val Gly Ala Gly Glu Lys Ala Leu Lys Leu Ser85 90 95Trp Phe Lys Arg100<210>2<211>100<212>PRT<213>黃病毒屬(Flavivirus sp.)<400>2Lys Gly Met Ser Tyr Ser Met Cys Thr Gly Lys Phe Lys Val Val Lys1 5 10 15Glu Ile Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Ile Val Ile Arg Val Gln Tyr20 25 30
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Glu Gly Ala Gly Ala Pro Cys Lys Val Ile Glu Ile Arg Asp Val Asn35 40 45Lys Glu Lys Val Val Gly Arg Ile Ile Ser Ser Thr Pro Leu Ala Glu50 55 60Asn Thr Asn Ser Val Thr Asn Ile Glu Leu Glu Arg Pro Leu Gly Asp65 70 75 80Ser Tyr Ile Val Ile Val Gly Gly Asn Ser Ala Leu Thr Leu His Trp85 90 95Phe Arg Lys<210>5<211>98<212>PRT<213>丙型肝炎病毒<400>5Ala Gln Tle Leu Asn Leu Lys Glu Lys Pro Asn Val Thr Pro Thr Ala1 5 10 15Ala His Arg Thr Leu Ser Ser Arg Val Ala Val Arg Ser Leu Ala Glu20 25 30Phe Thr Cys Cys Arg Ala Gly Ala Pro Asp Trp Val Cys Ala Arg Leu35 40 45Gly Arg Leu Pro Ser Gly Arg Ser Leu Val Glu Gly Ala Ser Leu Ser50 55 60Pro Arg Tle Ala Gly Pro Arg Ala Gly Pro Gly Leu Ser Pro Gly Thr65 70 75 80Leu Gly Pro Ser Met Ala Met Arg Val Ala Gly Gly Gln Asp Gly Ser85 90 95Cys Pro<210>6<211>98<212>PRT<213>丙型肝炎病毒<400>6Ala Arg Ile Leu Asn Leu Lys Glu Lys Pro Asn Val Thr Pro Thr Val1 5 10 15
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<400>12Ala Arg Ile Leu Asn Leu Lys Glu Lys Pro Asn Val Thr Pro Thr Ala1 5 10 15Ala Gln Trp Thr Leu Ser Ser Arg Val Val Ala Arg Ser Leu Ala Glu20 25 30Phe Thr Cys Cys Arg Ala Gly Ala Pro Asp Trp Val Cys Ala Arg Leu35 40 45Gly Arg Leu Arg Ser Gly Arg Asn Leu Val Glu Asp Ala Asn Leu Ser50 55 60Pro Arg Arg Val Asp Pro Arg Glu Gly Pro Gly His Asn Gln Asp Ile65 70 75 80His Gly Leu Phe Thr Val Met Arg Val Val Gly Gly Gln Asp Gly Ser85 90 95Cys Pro<210>13<211>98<212>PRT<213>丙型肝炎病毒<400>13Ala Gln Ile Leu Asn Leu Lys Glu Lys Pro Asn Val Thr Pro Thr Ala1 5 10 15Ala His Arg Thr Ser Ser Ser Arg Ala Val Val Arg Ser Leu Val Glu20 25 30Phe Thr Cys Cys Arg Ala Gly Ala Pro Gly Trp Val Cys Ala Arg Leu35 40 45Gly Arg Leu Pro Ser Gly Arg Asn Leu Val Glu Gly Asp Asn Leu Ser50 55 60Pro Arg Phe Ala Gly Pro Arg Ala Gly Pro Gly Leu Ser Pro Gly Thr65 70 75 80Leu Gly Pro Ser Met Ala Met Arg Val Trp Gly Gly Gln Asp Gly Ser85 90 95Cys His<210>14<211>160<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒<400>14Ala Arg Ile Leu Asn Leu Lys Lys Lys Thr Asn Val Thr Pro Thr Val1 5 10 15Ala His Arg Thr Ser Ser Ser Arg Val Ala Val Arg Ser Leu Val Glu20 25 30Phe Thr Cys Cys Arg Ala Gly Ala Leu Asp Trp Val Cys Ala Arg Arg35 40 45Glu Arg Leu Pro Ser Gly Arg Asn Leu Glu Val Asp Val Ser Leu Ser50 55 60Pro Arg Leu Val Gly Pro Arg Ala Gly Pro Gly Leu Ser Pro Gly Thr65 70 75 80Leu Gly Pro Ser Met Ala Met Arg Ala Ala Gly Gly Arg Asp Gly Ser85 90 95Cys Leu Pro Val Ala Leu Gly Leu Ala Gly Ala Pro Gln Thr Pro Gly100 105 110Val Gly Arg Ala Ile Trp Val Arg Ser Ser Ile Pro Leu Arg Ala Ala115 120 125Ser Pro Thr Ser Trp Gly Thr Tyr Arg Ser Ser Ala Pro Leu Leu Glu130 135 140Ala Leu Pro Gly Pro Trp Arg Met Ala Ser Gly Phe Trp Lys Thr Ala145 150 155 160<210>15<211>4555<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>質(zhì)粒<400>15tggaagggct aattcactcc caacgaagac aagatatcct tgatctgtgg atctaccaca60cacaaggcta cttccctgat tagcagaact acacaccagg gccagggatc agatatccac120tgacctttgg atggtgctac aagctagtac cagttgagcc agagaagtta gaagaagcca180acaaaggaga gaacaccagc ttgttacaac ctgtgagcct gcatgggatg gatgacccgg240agagagaagt gttagagtgg aggtttgaca gccgcctagc atttcatcac ggtggcccga300gagctgcatc cggagtactt caagaactgc tgatatcgag cttgctacaa gggactttcc360gctgggggac tttccaggga ggcgtggcct gggcgggact ggggagtggc gagccctcag420atcctgcata taagcagctg ctttttgcct gtactgggtc tctctggtta gaccagatct480
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<210>16<211>1393<212>DNA<213>黃病毒屬(Flavivirus sp.)<220>
<221>CDS<222>(7)..(1386)<400>16cgtacg atg aga gtt gtg ttt gtc gtg cta ttg ctt ttg gtg gcc cca48Met Arg Val Val Phe Val Val Leu Leu Leu Leu Val Ala Pro1 5 10gct tac agc ttc aac tgc ctt gga atg agc aac aga gac ttc ttg gaa 96Ala Tyr Ser Phe Asn Cys Leu Gly Met Ser Asn Arg Asp Phe Leu Glu15 20 25 30gga gtg tct gga gca aca tgg gtg gat ttg gtt ctc gaa ggc gac agc 144Gly Val Ser Gly Ala Thr Trp Val Asp Leu Val Leu Glu Gly Asp Ser35 40 45tgc gtg act atc atg tct aag gac aag cct acc atc gat gtg aag atg 192Cys Val Thr Ile Met Ser Lys Asp Lys Pro Thr Ile Asp Val Lys Met50 55 60atg aat atg gag gcg gtc aac ctg gca gag gtc cgc agt tat tgc tat 240Met Asn Met Glu Ala Val Asn Leu Ala Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr65 70 75ttg gct acc gtc agc gat ctc tcc acc aaa gct gcg tgc ccg acc atg 288Leu Ala Thr Val Ser Asp Leu Ser Thr Lys Ala Ala Cys Pro Thr Met80 85 90gga gaa gct cac aat gac aaa cgt gct gac cca gct ttt gtg tgc aga 336Gly Glu Ala His Asn Asp Lys Arg Ala Asp Pro Ala Phe Val Cys Arg95 100 105 110caa gga gtg gtg gac agg ggc tgg ggc aac ggc tgc gga tta ttt ggc 384Gln Gly Val Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly115 120 125aaa gga agc att gac aca tgc gcc aaa ttt gcc tgc tct acc aag gca 432Lys Gly Ser Ile Asp Thr Cys Ala Lys Phe Ala Cys Ser Thr Lys Ala130 135 140ata gga aga acc atc ttg aaa gag aat atc aag tac gaa gtg gcc att 480Ile Gly Arg Thr Ile Leu Lys Glu Asn Ile Lys Tyr Glu Val Ala Ile145 150 155ttt gtc cat gga cca act act gtg gag tcg cac gga aac tac tcc aca 528Phe Val His Gly Pro Thr Thr Val Glu Ser His Gly Asn Tyr Ser Thr160 165 170cag gtt gga gcc act cag gca ggg aga ttc agc atc act cct gcg gcg 576Gln Val Gly Ala Thr Gln Ala Gly Arg Phe Ser Ile Thr Pro Ala Ala175 180 185 190cct tca tac aca cta aag ctt gga gaa tat gga gag gtg aca gtg gac 624Pro Ser Tyr Thr Leu Lys Leu Gly Glu Tyr Gly Glu Val Tnr Val Asp195 200 205tgt gaa cca cgg tca ggg att gac acc aat gca tac tac gtg atg act 672Cys Glu Pro Arg Ser Gly Ile Asp Thr Asn Ala Tyr Tyr Val Met Thr210 215 220
gtt gga aca aag acg ttc ttg gtc cat cgt gag tgg ttc atg gac ctc720Val Gly Thr Lys Thr Phe Leu Val His Arg Glu Trp Phe Met Asp Leu225 230 235aac ctc cct tgg agc agt gct gga agt act gtg tgg agg aac aga gag768Asn Leu Pro Trp Ser Ser Ala Gly Ser Thr Val Trp Arg Asn Arg Glu240 245 250acg tta atg gag ttt gag gaa cca cac gcc acg aag cag tct gtg ata816Thr Leu Met Glu Phe Glu Glu Pro His Ala Thr Lys Gln Ser Val Ile255 260 265 270gca ttg ggc tca caa gag gga gct ctg cat caa gct ttg gct gga gcc864Ala Leu Gly Ser Gln Glu Gly Ala Leu His Gln Ala Leu Ala Gly Ala275 280 285att cct gtg gaa ttt tca agc aac act gtc aag ttg acg tcg ggt cat912Ile Pro Val Glu Phe Ser Ser Asn Thr Val Lys Leu Thr Ser Gly His290 295 300ttg aag tgt aga gtg aag atg gaa aaa ttg cag ttg aag gga aca acc960Leu Lys Cys Arg Val Lys Met Glu Lys Leu Gln Leu Lys Gly Thr Thr305 310 315tat ggc gtc tgt tca aag gct ttc aag ttt ctt ggg act ccc gca gac1008Tyr Gly Val Cys Ser Lys Ala Phe Lys Phe Leu Gly Thr Pro Ala Asp320 325 330aca ggt cac ggc act gtg gtg ttg gaa ttg cag tac act ggc acg gat1056Thr Gly His Gly Thr Val Val Leu Glu Leu Gln Tyr Thr Gly Thr Asp335 340 345 350gga cct tgc aaa gtt cct atc tcg tca gtg gct tca ttg aac gac cta1104Gly Pro Cys Lys Val Pro Ile Ser Ser Val Ala Ser Leu Asn Asp Leu355 360 365acg cca gtg ggc aga ttg gtc act gtc aac cct ttt gtt tca gtg gcc1152Thr Pro Val Gly Arg Leu Val Thr Val Asn Pro Phe Val Ser Val Ala370 375 380acg gcc aac gct aag gtc ctg att gaa ttg gaa cca ccc ttt gga gac1200Thr Ala Asn Ala Lys Val Leu Ile Glu Leu Glu Pro Pro Phe Gly Asp385 390 395tca tac ata gtg gtg ggc aga gga gaa caa cag atc aat cac cat tgg1248Ser Tyr Ile Val Val Gly Arg Gly Glu Gln Gln Ile Asn His His Trp400 405 410Cac aag tct gga agc agc att ggc aaa gcc ttt aca acc acc ctc aaa1296His Lys Ser Gly Ser Ser Ile Gly Lys Ala Phe Thr Thr Thr Leu Lys415 420 425 430gga gcg cag aga cta gcc gct cta gga gac aca gct tgg gac ttt gga1344Gly Ala Gln Arg Leu Ala Ala Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly435 440 445tca gtt gga ggg gtg ttc acc tca gtt ggg aag gct gtc taa tgcgcgc1393Ser Val Gly Gly Val Phe Thr Ser Val Gly Lys Ala Val450 455<210>17<211>459<212>PRT<213>黃病毒屬(Flavivirus sp.)<400>17
Met Arg Val Val Phe Val Val Leu Leu Leu Leu Val Ala Pro Ala Tyr1 5 10 15Ser Phe Asn Cys Leu Gly Met Ser Asn Arg Asp Phe Leu Glu Gly Val20 25 30Ser Gly Ala Thr Trp Val Asp Leu Val Leu Glu Gly Asp Ser Cys Val35 40 45Thr Ile Met Ser Lys Asp Lys Pro Thr Ile Asp val Lys Met Met Asn50 55 60Met Glu Ala Val Asn Leu Ala Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr Leu Ala65 70 75 80Thr Val Ser Asp Leu Ser Thr Lys Ala Ala Cys Pro Thr Met Gly Glu85 90 95Ala His Asn Asp Lys Arg Ala Asp Pro Ala Phe Val Cys Arg Gln Gly100 105 110Val Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly115 120 125Ser Ile Asp Thr Cys Ala Lys Phe Ala Cys Ser Thr Lys Ala Ile Gly130 135 140Arg Thr Ile Leu Lys Glu Asn Ile Lys Tyr Glu Val Ala Ile Phe Val145 150 155 160His Gly Pro Thr Thr Val Glu Ser His Gly Asn Tyr Ser Thr Gln Val165 170 175Gly Ala Thr Gln Ala Gly Arg Phe Ser Ile Thr Pro Ala Ala Pro Ser180 185 190Tyr Thr Leu Lys Leu Gly Glu Tyr Gly Glu Val Thr Val Asp Cys Glu195 200 205Pro Arg Ser Gly Ile Asp Thr Asn Ala Tyr Tyr Val Met Thr Val Gly210 215 220Thr Lys Thr Phe Leu Val His Arg Glu Trp Phe Met Asp Leu Asn Leu225 230 235 240Pro Trp Ser Ser Ala Gly Ser Thr Val Trp Arg Asn Arg Glu Thr Leu245 250 255Met Glu Phe Glu Glu Pro His Ala Thr Lys Gln Set Val Ile Ala Leu260 265 270
Gly Ser Gln Glu Gly Ala Leu His Gln Ala Leu Ala Gly Ala Ile Pro275 280 285Val Glu Phe Ser Ser Asn Thr Val Lys Leu Thr Ser Gly His Leu Lys290 295 300Cys Arg Val Lys Met Glu Lys Leu Gln Leu Lys Gly Thr Thr Tyr Gly305 310 315 320Val Cys Ser Lys Ala Phe Lys Phe Leu Gly Thr Pro Ala Asp Thr Gly325 330 335His Gly Thr Val Val Leu Glu Leu Gln Tyr Thr Gly Thr Asp Gly Pro340 345 350Cys Lys Val Pro Ile Ser Ser Val Ala Ser Leu Asn Asp Leu Thr Pro355 360 365Val Gly Arg Leu Val Thr Val Asn Pro Phe Val Ser Val Ala Thr Ala370 375 380Asn Ala Lys Val Leu Ile Glu Leu Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr385 390 395 400Ile Val Val Gly Arg Gly Glu Gln Gln Ile Asn His His Trp His Lys405 410 415Ser Gly Ser Ser Ile Gly Lys Ala Phe Thr Thr Thr Leu Lys Gly Ala420 425 430Gln Arg Leu Ala Ala Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Val435 440 445Gly Gly Val Phe Thr Ser Val Gly Lys Ala Val450 455<210>18<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>18tatcgtacga tgagagttgt gtttgtcgtg cta 33<210>19<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物
<400>19atagcgcgct tagacagccc ttcccaactg a 31<210>20<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>LTR-FL探針<400>20cacaacagac gggcacacac tacttga 27<210>21<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>LTR-LC探針<400>21cactcaaggc aagctttatt gaggc25<210>22<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>AA55M引物<400>22gctagagatt ttccacactg actaa25<210>23<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>M667引物<400>23ggctaactag ggaacccact g21<210>24<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CD3-P1探針<400>24ggctgaaggt tagggatacc aatattcctg tctc 34<210>25<211>30<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>CD3～P2探針<400>25ctagtgatgg gctcttccct tgagcccttc 30<210>26<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CD3-in-F引物<400>26ggctatcatt cttcttcaag gta 23<210>27<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CD3-in-R引物<400>27cctctcttca gccatttaag ta
權(quán)利要求
1.包含多核苷酸片段的重組慢病毒載體的用途，所述多核苷酸片段編碼黃病毒科病毒至少一種蛋白質(zhì)或編碼所述蛋白質(zhì)的至少8個氨基酸長的免疫原性肽，用于制備預(yù)防和/或治療敏感物種中黃病毒科感染的免疫原性組合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其特征在于所述重組慢病毒載體是三重型的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的用途，其特征在于所述重組慢病毒載體包含其中啟動子和激活子已從U3區(qū)被刪除的3’LTR。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項的用途，其特征在于所述重組慢病毒載體被用另一種病毒的至少一種包膜蛋白質(zhì)假型化。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的用途，其特征在于所述包膜蛋白質(zhì)是水泡性口炎病毒糖蛋白G。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項的用途，其特征在于所述多核苷酸片段編碼黃病毒科的至少一種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)或所述蛋白質(zhì)的至少8個氨基酸長的免疫原性肽。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的用途，其特征在于所述結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)是膜蛋白或包膜蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項的用途，其特征在于所述多核苷酸片段編碼黃病毒科的至少一種非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)或所述蛋白質(zhì)的至少8個氨基酸長的免疫原性肽。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項的用途，其特征在于所述多核苷酸片段即編碼黃病毒科的至少一種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)或所述蛋白質(zhì)的至少8個氨基酸長的免疫原性肽，也編碼同一黃病毒科的至少一種非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)或所述蛋白質(zhì)的至少8個氨基酸長的免疫原性肽。
10.權(quán)利要求1至9中任一項的用途，其特征在于所述免疫原性肽由多種黃病毒科的免疫原性片段的組合和/或同一黃病毒科不同血清型的組合組成。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項的用途，其特征在于所述黃病毒科選自西尼羅病毒、登革熱病毒、黃熱病毒和丙型肝炎病毒。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項的用途，其特征在于所述多核苷酸片段選自-編碼西尼羅病毒或登革熱病毒的E蛋白、和任選地prM或M蛋白、和/或C蛋白、和/或非結(jié)構(gòu)蛋白的cDNA，以及編碼以上蛋白質(zhì)的至少8個氨基酸長的一種或多種免疫原性肽的cDNA，-編碼丙型肝炎病毒的E1或E2蛋白或E1/E2異二聚體、和/或根據(jù)0、+1或+2閱讀框的C蛋白、和/或NS3蛋白的eDNA，以及編碼以上蛋白質(zhì)的至少8個氨基酸長的一種或多種免疫原性肽的eDNA，-編碼登革熱病毒E蛋白的一種或多種不同結(jié)構(gòu)域III(第295至394位)的cDNA，分別對應(yīng)于四種類型登革熱病毒中的一種。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的用途，其特征在于所述cDNA編碼所述四種結(jié)構(gòu)域III，其序列由附錄所附序列表中的SEQ ID NOs.1-4代表。
14.根據(jù)權(quán)利要求12的用途，其特征在于所述的根據(jù)+1或+2閱讀框編碼C蛋白的cDNA選自序列SEQ ID NOs.5至14。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項的用途，其特征在于所述多核苷酸是黃病毒科編碼序列的片段，其對應(yīng)選自以下的NCBI數(shù)據(jù)庫中登記號M23027，M19197，M93130，M14931，M12294，AF481864，M18370，X03700，U27495，M73835，M31182，M31768，J04358，M62321，D90208和M58335。
16.如權(quán)利要求1至6和8至15中任一項所定義的重組慢病毒載體，如權(quán)利要求6中所定義，該載體包含編碼至少一種結(jié)構(gòu)蛋白或所述蛋白的片段、以及任選地非結(jié)構(gòu)蛋白或所述蛋白的片段的多核苷酸。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的重組載體，其特征在于它是三重型的。
18.根據(jù)權(quán)利要求16或17的重組慢病毒載體，其特征在于它包含選自以下的cDNA-編碼西尼羅病毒或登革熱病毒的E蛋白、和任選地prM或M蛋白、和/或C蛋白、和/或非結(jié)構(gòu)蛋白的cDNA，以及編碼以上蛋白質(zhì)的至少8個氨基酸長的一種或多種免疫原性肽的cDNA，-編碼丙型肝炎病毒的E1或E2蛋白或E1/E2異二聚體、和/或根據(jù)0、+1或+2閱讀框的C蛋白、和/或NS3蛋白的cDNA，以及編碼以上蛋白質(zhì)的至少8個氨基酸長的一種或多種免疫原性肽的cDNA，和-編碼登革熱病毒E蛋白的結(jié)構(gòu)域III(第295至394位)或幾種不同結(jié)構(gòu)域III的cDNA，每種分別對應(yīng)于四種類型登革熱病毒中的一種。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的重組慢病毒載體，其特征在于所述的根據(jù)+1或+2閱讀框編碼C蛋白的cDNA選自序列SEQ ID NOs.5至14。
20.根據(jù)權(quán)利要求18的重組慢病毒載體，其特征在于所述cDNA編碼四種結(jié)構(gòu)域III，其序列由SEQ ID NOs.1-4代表。
21.根據(jù)權(quán)利要求18的重組慢病毒載體，其特征在于它包含編碼登革熱病毒或西尼羅病毒的E蛋白和prM蛋白的cDNA。
22.根據(jù)權(quán)利要求18的重組慢病毒載體，其特征在于它包含西尼羅病毒IS-98-ST1株的分泌形式的E蛋白，該載體包含于微生物中，該微生物于2003年8月27日保藏于國家微生物培養(yǎng)物保藏中心(the Collection Nationale de Cultures deMicroorganismes[National Collection of Cultures of Microorganisms])，25rue duDocteur Roux，75724 Paris Cedex 15，保藏號為I-3076。
23.根據(jù)權(quán)利要求16至22中任一項的重組慢病毒載體，其特征在于所述多核苷酸片段處于CMV啟動子的控制下。
24.免疫原性組合物，其特征在于它包含如權(quán)利要求1至23中所定義的至少一種重組慢病毒載體。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的組合物，其特征在于它包含藥用可接受賦形劑和任選地載體物質(zhì)。
26.根據(jù)權(quán)利要求24或25的組合物，其特征在于所述重組慢病毒載體是三重型的。
27.根據(jù)權(quán)利要求24至26中任一項的組合物，其特征在于它包含用另一種病毒的包膜蛋白假型化的所述重組慢病毒載體的病毒顆粒.
28.根據(jù)權(quán)利要求27的組合物，其特征在于所述包膜蛋白是水泡性口炎病毒糖蛋白G。
29.根據(jù)權(quán)利要求26的組合物，其特征在于它包含對應(yīng)所述三重型慢病毒載體的重組基因組的分離核酸分子，所述核酸分子包含(i)用于衣殼包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合的調(diào)控序列以及用于慢病毒原點的中央起始和終止的順式作用序列以及任選地Rev蛋白的調(diào)控序列，以及(ii)編碼如上在權(quán)利要求1和6至15中任一項所定義的黃病毒科蛋白質(zhì)或所述蛋白質(zhì)至少8個氨基酸長的免疫原性肽的多核苷酸片段。
30.細(xì)胞，優(yōu)選真核細(xì)胞，用如權(quán)利要求1至23所定義的重組慢病毒載體修飾的。
31.用于生產(chǎn)黃病毒科病毒蛋白質(zhì)和/或所述蛋白質(zhì)的免疫原性片段或者病毒假顆粒的方法，其特征在于它至少包括以下步驟a)培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求30的修飾細(xì)胞，其培養(yǎng)條件允許由所述重組慢病毒載體編碼的黃病毒科的一種或多種病毒蛋白質(zhì)和/或所述蛋白質(zhì)的一種或多種免疫原性片段的表達(dá)，和b)從a)中細(xì)胞中或培養(yǎng)上清中分離所述蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段或病毒假顆粒。
32.篩選抗病毒化合物的方法，其特征在于，它包括-使根據(jù)權(quán)利要求30的修飾真核細(xì)胞，尤其是用包含編碼諸如NS3或NS5等的黃病毒科非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的cDNA的載體修飾的真核細(xì)胞，與待測試庫的各種化合物接觸，-在所述化合物存在或缺失的條件下測量所述蛋白質(zhì)的活性，和-選擇能調(diào)節(jié)所述活性的化合物。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其特征在于所述真核細(xì)胞選自樹突細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞和肝細(xì)胞。
34.用來自敏感物種個體的生物液樣品診斷黃病毒科感染的方法，其特征在于它至少包括以下步驟a)使所述生物學(xué)樣品與如權(quán)利要求30所定義表達(dá)至少一種黃病毒科抗原的修飾真核細(xì)胞接觸，和b)顯示(a)中形成的抗原-抗體復(fù)合物。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其特征在于a)中所述的修飾真核細(xì)胞被透化。
36.用來自敏感物種個體的生物液樣品診斷黃病毒科感染的方法，其特征在于它至少包括以下步驟a)使所述生物樣品接觸用如權(quán)利要求7、9至12、15至18和21至23中任一項所定義的表達(dá)至少一種膜蛋白和/或包膜蛋白的慢病毒載體修飾過的細(xì)胞的培養(yǎng)上清產(chǎn)生的病毒假顆粒，和b)顯示(a)中形成的抗原-抗體復(fù)合物。
37.用于實施根據(jù)權(quán)利要求31至36的方法的試劑盒，其特征在于它至少包含根據(jù)權(quán)利要求30的修飾細(xì)胞。
全文摘要
包含編碼黃病毒科病毒的至少一種蛋白質(zhì)或所述蛋白質(zhì)至少8個氨基酸長的免疫原性肽的多核苷酸片段的重組慢病毒載體，用于制備藥用組合物以預(yù)防和/或治療敏感物種中黃病毒科感染的用途。
文檔編號C07K14/18GK1981043SQ200580015744
公開日2007年6月13日 申請日期2005年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月17日
發(fā)明者菲利普·德普雷斯, 皮埃爾·沙爾諾, 弗雷德里克·坦吉, 馬里-帕斯卡萊·弗倫凱爾 申請人:巴斯德研究所, 國家科學(xué)研究中心