專利名稱：：卵泡刺激素超激動(dòng)劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明總體上涉及具有超激動(dòng)劑活性的修飾的卵泡刺激素(FSH)，以及它們?cè)谥委熍c糖蛋白激素活性相關(guān)的病變中的用途。更具體地，本發(fā)明涉及與野生型FSH相比較含有兩個(gè)或多個(gè)氨基酸取代的修飾的FSH分子，其中這些修飾的FSH分子表現(xiàn)出比野生型FSH更強(qiáng)的藥物學(xué)性能。
背景技術(shù)：
：促卵泡素(卵泡刺激素，F(xiàn)SH)和促性腺激素絨毛膜促性腺激素(CG)、促黃體激素(黃體化激素，LH)以及促甲狀腺激素(甲狀腺激素刺激激素，TSH)構(gòu)成了糖蛋白激素家族。每種激素都是兩種共價(jià)連接的亞基(a和P)的異二聚體。在同一物種內(nèi)，所有激素的a亞基的氨基酸序列都是相同的，而P亞基的序列是激素特異的(Pierce,J.G.andParsons，T.F."Glycoproteinhormones:structureandflmction."Ann.Rev.Biochem.50:465-495(1981))。從魚(yú)到哺乳動(dòng)物的這些亞基序列都是高度保守的事實(shí)說(shuō)明這些激素都是由共同的祖先蛋白進(jìn)化而來(lái)的(FontaineY-A.andBurzawa-Gerard,E."Esquissede1'evolutiondeshormonesgonadotopesetthyreotropesdesvertebres."Gen.Comp.Endocrinol.32:341-347(1977))。重組促卵泡素已經(jīng)被用于某些治療，例如治療患有不育癥的患者(LathiandMilki，"Recombinantgonadotropins,"CurrWomensHealthRep.1(2):157-63(2001))。激素己經(jīng)被用于誘導(dǎo)女性排卵，和誘導(dǎo)男性的精子生成(Boulouxetal.,"Inductionofspermatogenesisbyrecombinantfollicle-stimulatinghormone(puregon)inhypogonadotropicazoospermicmenwhofailedtorespondtohumanchorionicgonado加pinalone，"JAndrol.24(4):604-11(2003》，改善被破壞的精子結(jié)構(gòu)(Haidletal.,"Drugtreatmentofmalefertilitydisorders,"AsianJAndrol.2(2):81-5(2000))，以及治療與睪酮水平降低相關(guān)的病變(見(jiàn)美國(guó)專利No.5,574，Oil和6,562，790，在此通過(guò)引用并入本申請(qǐng))。女性對(duì)外源性FSH治療的應(yīng)答已經(jīng)顯示出有所不同，一些女性對(duì)標(biāo)準(zhǔn)治療方案的應(yīng)答比較差(需要調(diào)整FSH劑量)，而其它女性表現(xiàn)出卵巢過(guò)度刺激綜合征(Perezetal.,"Ovarianresponsetofollicle-stimulatinghormone(FSH)stimulationdependsontheFSHreceptorgenotype,"JClinEndocrinolMetab.85(9):3365-9(2000))。需要的是具有增加活性的FSH的修飾的衍生物，以便有助于治療應(yīng)答差者，同時(shí)容許用更低劑量的治療方案治療有卵巢過(guò)度剌激傾向的患者。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明包括修飾的FSH蛋白和編碼相同蛋白的核酸，其中與野生型FSH相比較，顯著地提高了修飾的蛋白的體內(nèi)和體外的生物學(xué)活性。具體地，與野生型FSH相比較，本發(fā)明的修飾的類似物令人驚訝地表現(xiàn)出更強(qiáng)的藥物學(xué)性能，包括效力(potency)和Vmax(功效(efficacy))。此夕卜，本發(fā)明的修飾的類似物增加了所治療的動(dòng)物體內(nèi)的卵母細(xì)胞、胚泡和胚胎的數(shù)量和質(zhì)量。本發(fā)明的類似物因此為大量患有不育癥的患者提供了期待己久的解決方案，所述患者包括在體外受精(IVF)后應(yīng)答差的女性、已經(jīng)不能進(jìn)行IVF的女性、具有低數(shù)目的FSH受體的女性以及FSH突變導(dǎo)致不育癥的女性。本發(fā)明的修飾的FSH分子含有至少一個(gè)修飾a亞基，所述亞基含有至少兩種FSH周圍環(huán)中的突變的組合，這就形成了具有比野生型FSH更強(qiáng)效力的修飾的FSH或單獨(dú)包括所指出的突變的修飾蛋白。本發(fā)明的修飾的FSH蛋白通常具有比野生型FSH高約10倍的效力，以及優(yōu)選的oc亞基突在對(duì)應(yīng)于SEQIDNo.1中的位點(diǎn)13、14、16、17、20、21、22、66、68、73、74和81的位點(diǎn)上變包括至少兩個(gè)堿性氨基酸。本發(fā)明的修飾的FSH蛋白還可以包括修飾p亞基，具體地，修飾(3亞基在對(duì)應(yīng)于SEQIDNo.2的位點(diǎn)2、4、14、63、64、67和69中的任一位點(diǎn)上包括至少一個(gè)堿性氨基酸。本發(fā)明的修飾的FSH蛋白也可以具有比野生型FSH更長(zhǎng)的血漿半衰期或者比野生型FSH更短的血漿半衰期。通過(guò)聚乙二醇化、通過(guò)包含潛在的糖基化位點(diǎn)或通過(guò)其它方式都可以促進(jìn)血漿半衰期的延長(zhǎng)。本發(fā)明也包括輔助對(duì)象生殖的方法，包括使用輔助量的本發(fā)明的修飾的FSH，例如在體外受精方案或人工受精方案或其它需要誘導(dǎo)排卵或精子生成的方案。也包括診斷和治療女性體內(nèi)與糖蛋白激素活性相關(guān)的病變的方法，包括但不限于排卵異常、黃體期缺陷、限時(shí)懷孕、生長(zhǎng)卵泡中的FSH受體表達(dá)低下、FSH受體敏感性低下、FSH受體結(jié)合和/或偶合不足、垂體衰竭或損傷、原因不明的不育癥和卵巢癌。本發(fā)明的修飾的FSH蛋白特別適用于治療有卵巢過(guò)度刺激傾向的女性，其中可以在周期的早期應(yīng)用具有最長(zhǎng)半衰期的類似物，而具有更短半衰期的那些類似物可以應(yīng)用于周期的晚期，以便預(yù)防或減少卵巢過(guò)度刺激綜合征(OHHS)的可能性。也包括診斷和治療男性體內(nèi)的與糖蛋白激素活性相關(guān)的病變的方法，這包括但不限于男性因素的不育癥、垂體衰竭或損傷、男性型脫發(fā)癥、睪丸癌以及任何與睪酮生成水平缺陷相關(guān)的病變。圖1A-E是顯示比較如用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的CHO-FSHR細(xì)胞所測(cè)定到的各種單一突變?cè)隗w外對(duì)FSH生物學(xué)活性的影響(與野生型(WT)相比較)的圖。圖2是顯示PE4R突變對(duì)轉(zhuǎn)染CHO-FSHR細(xì)胞的hFSH生成的影響的圖。圖3A和3B是顯示了比較如用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的CHO-FSHR細(xì)胞所測(cè)定到的各種組合突變?cè)隗w外對(duì)FSH生物學(xué)活性的影響的圖。圖4A和4B是顯示比較大鼠和人LHR對(duì)FSH類似物和野生型FSH的交叉反應(yīng)性的圖。圖4A顯示了FSHTR-4402和大鼠黃體化激素受體之間的交叉反應(yīng)性。圖4B顯示了FSHTR-4402和人黃體化激素之間沒(méi)有交叉反應(yīng)性。圖5是FSH結(jié)構(gòu)的示意圖，顯示了a和p亞基中的環(huán)。圖6A和6B是顯示CHO細(xì)胞分別應(yīng)答于純化類似物TR-4402對(duì)野生型FSH、純化的類似物TR4401對(duì)野生型FSH的cAMP生成的圖。圖7是顯示KGN細(xì)胞應(yīng)答于純化類似物TR-4402對(duì)野生型FSH的cAMP生成的圖。圖8是顯示GLHR-15細(xì)胞應(yīng)答于純化類似物TR-4402對(duì)野生型FSH的cAMP生成的圖。圖9是顯示在體外卵泡生物檢測(cè)過(guò)程中所觀察到的在具有野生型hFSH(化合物#3)和類似物TR-4402(化合物斜)時(shí)的卵泡生存時(shí)間的圖。圖10是顯示在體外卵泡生物檢測(cè)過(guò)程中所觀察到的在具有野生型hFSH(化合物#3)和類似物TR-4402(化合物糾)時(shí)的卵泡竇(antrum)形成的圖。圖11A是顯示在體外卵泡生物檢測(cè)過(guò)程中所觀察到的在具有野生型hFSH(化合物約)和類似物TR-4402(化合物#4)時(shí)的COC粘液化的圖。圖llB是顯示在體外卵泡生物檢測(cè)過(guò)程中所觀察到的在具有野生型hFSH(化合物#3)和類似物TR-4402(化合物弁4)時(shí)的hCG刺激后的Q/。卵母細(xì)胞釋放的圖。圖12是顯示在體外卵泡生物檢測(cè)過(guò)程中所觀察到的在具有野生型hFSH(化合物約)和類似物TR44(^(化合物斜)時(shí)的用PB擠壓所測(cè)定到的卵母細(xì)胞核成熟的圖。圖13A和B是顯示在體外卵泡生物檢測(cè)過(guò)程中所觀察到的在具有野生型hFSH(化合物約)(13A)和類似物TR-4402(化合物存4)(13B)時(shí)的黃體酮生成的圖。圖14A-D顯示了利用不成熟的Sprague-Dawley雌鼠所進(jìn)行的Steelman-Pohley生物檢測(cè)的結(jié)果(SteelmanandPohley,1953)。圖14A、C和D中的圖顯示了與野生型(Follistim)相比較，應(yīng)答于TR-4402所測(cè)定到的卵巢重量的差異。圖14B中的圖比較了在生物檢測(cè)過(guò)程中的血清的TR-4402和野生型FSH水平。圖15是顯示了與經(jīng)類似物TR-4402處理過(guò)的鼠相比較，經(jīng)野生型FSH(Follistim)處理過(guò)的鼠的卵巢內(nèi)的雌二醇含量的圖。圖16是顯示用相應(yīng)劑量的野生型FSH(Follistim)和類似物TR-4402刺激之后的血清抑制素B水平的圖。圖17A和B是顯示與野生型FSH相比較的FSH類似物TR-4901、TR-4401和TR-4402的排出和吸收。圖18顯示了用于延長(zhǎng)FSH類似物的半衰期的N末端延伸(SEQIDNo.3、4、5、6、7、8、9、10、11、和12)。圖19是顯示與LAIFSH(FSH被修飾以增加FSH的血清半衰期)、TR-4402和野生型FSH相比較，CHO細(xì)胞應(yīng)答于LAl-4402(TR-4402被進(jìn)一步修飾以增加FSH的血清半衰期)的cAMP產(chǎn)生的圖。圖20是顯示與單獨(dú)的野生型FSH(Follistim)和hCG相比較，在體內(nèi)應(yīng)答于LAl-4402(TR-4402被進(jìn)一步修飾以增加FSH的血清半衰期)增加了所生成的被排卵的卵母細(xì)胞數(shù)目的圖。圖21是顯示與野生型FSH(GonalF)相比較，在體內(nèi)施用TR4401之后增加了所生成的卵母細(xì)胞總數(shù)的圖。圖22是顯示與野生型FSH(GonalF)相比較，在體內(nèi)施用TR"01之后增加了卵母細(xì)胞受精率的圖。圖23是顯示與野生型FSH(GonalF)相比較，在體內(nèi)施用TR4401之后增加了胚泡形成的圖。圖24是顯示與野生型FSH(GonalF)相比較，在體內(nèi)施用TR糾01之后增加了胚胎總數(shù)的圖。具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了修飾的"超活性的"FSH分子，與野生型FSH相比較，其顯示出令人驚訝的增強(qiáng)的效力。被"修飾的"意思是，雖然所述蛋白含有不同于野生型FSH的氨基酸序列，但是其序列并沒(méi)有被改變得以至于它與另一物種的己知FSH序列相同。用各種參數(shù)可以評(píng)價(jià)"超活性"，包括效力和功效。"效力(potency)"是用測(cè)定半最大應(yīng)答所確定出的生物學(xué)活性的參數(shù)。通過(guò)將FSH類似物在基線和最大值(EC50)之間的中間值的FSH應(yīng)答值與野生型FSH的FSH應(yīng)答值進(jìn)行比較，可以確定出"效力"的差異。可以用純化蛋白在體外測(cè)定出FSH應(yīng)答，或者可以在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染編碼修飾蛋白的核酸之后評(píng)估出FSH應(yīng)答。也可以在體內(nèi)(即在對(duì)所述FSH類似物有應(yīng)答的動(dòng)物體內(nèi))測(cè)定出FSH應(yīng)答。這些應(yīng)答包括任何FSH與其受體結(jié)合后的細(xì)胞的或生物學(xué)的以及定量的或定性的應(yīng)答，即cAMP生成、蛋白質(zhì)例如孕酮合成、受精率、胚泡形成率、每個(gè)受精卵母細(xì)胞的胚胎發(fā)育率等。"功效(efficacy)"(Vmax)或最大應(yīng)答是另一種生物學(xué)活性的參數(shù)。如在此所討論的，根據(jù)所檢測(cè)細(xì)胞株中的受體數(shù)目和受體結(jié)合力，生物學(xué)活性的參數(shù)可以有所不同。在具有低受體數(shù)目或結(jié)合較差的系統(tǒng)中，Vmax(功效)上的差異更為明顯。在受體過(guò)度表達(dá)的系統(tǒng)中，效力上的差異更為顯著?？梢杂脤?duì)于卵母細(xì)胞數(shù)目而言的最大有效劑量在體內(nèi)測(cè)定出定量和定性的參數(shù)例如卵母細(xì)胞的數(shù)量、受精率和胚泡及胚胎形成率。對(duì)于卵母細(xì)胞數(shù)目而言的最大有效劑量是對(duì)卵母細(xì)胞的質(zhì)量和數(shù)量而言為最佳量的超活性FSH。對(duì)于卵母細(xì)胞數(shù)目而言的最大有效劑量是依賴于動(dòng)物的體重和代謝率。例如，具有較慢代謝率的較大動(dòng)物的最大有效劑量要比具有較快代謝率的較小動(dòng)物的最大有效劑量更大。能經(jīng)驗(yàn)性地確定出每只動(dòng)物的最大有效劑量。但是，無(wú)論所用的系統(tǒng)如何，與野生型FSH比較，本發(fā)明的修飾超活性FSH蛋白的效力至少增加約10倍、更優(yōu)選地至少約20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或甚至增加約100倍，或者其最大功效比野生型FSH增加了約10%、更優(yōu)選地至少20%、30%、40%、50%、60°/。、70%、80%、90%、或甚至100%。本發(fā)明的超活性類似物也提供了比野生型FSH高出約5到10倍的效力或增加5%到10%的最大功效。本發(fā)明的一些修飾蛋白證實(shí)比野生型具有高出至少約30到50倍的效力或者高出30%到50%的最大功效。因此，本發(fā)明的修飾的FSH蛋白特別適用于治療具有低受體數(shù)目或受體應(yīng)答缺陷的患者，因?yàn)楸景l(fā)明的修飾蛋白甚至在低受體數(shù)目或弱應(yīng)答的系統(tǒng)中都保留了至少增加了10倍的效力或增加了10%的最大功效。修飾超活性FSH的吸收率可以造成作用持續(xù)時(shí)間的增加或縮短。具有吸收率增加以及作用持續(xù)時(shí)間縮短的修飾的FSH類似物都可以有利于治療高刺激綜合征高危的超敏患者。用Ka測(cè)定吸收率。用Ke測(cè)定排出率。本發(fā)明的修飾的FSH分子包括選自人、牛、馬、豬、養(yǎng)、小鼠、大鼠、兔、靈長(zhǎng)類動(dòng)物、魚(yú)等物種的修飾蛋白。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中可以使用魚(yú)FSH(也稱作GTH-1)，也就是為了圈養(yǎng)培育瀕臨滅絕的或其它的魚(yú)類。其它物種的修飾的FSH可以被用于農(nóng)業(yè)育種，或用于實(shí)驗(yàn)室以便測(cè)試不同的組合突變對(duì)各種雄性及雌性糖蛋白激素相關(guān)性病變的作用。其它物種的修飾的FSH分子在對(duì)應(yīng)于在此所述的修飾人FSH分子的那些位點(diǎn)的位點(diǎn)上具有取代，利用任一排列程序可以鑒定出這一點(diǎn)，所述排列程序包括但不限于DNASIS、ALIONment、SIM和GCG程序例如Gap、BestFit、FrameAlign禾口Compare。本發(fā)明的修飾的人FSH分子至少包括一個(gè)修飾的a亞基，其中oc亞基至少包括兩個(gè)堿性氨基酸，例如在對(duì)應(yīng)于野生型人FSHa(SEQIDNo.1)的位點(diǎn)13、14、16、17、20、21、22、66、68、73、74和81的位點(diǎn)上的堿性氨基酸。修飾的蛋白也可以含有修飾的I3亞基，其中(3亞基至少包括一個(gè)堿性氨基酸，例如在對(duì)應(yīng)于野生型人FSHp(SEQIDNo.2)的位點(diǎn)2、4、14、63、64、67和69的位點(diǎn)上的堿性氨基酸。本發(fā)明的修飾蛋白也可以含有更多的取代，特別是不會(huì)改變蛋白的增強(qiáng)了的性能的保守取代。但是，這些修飾蛋白在除上面所列的那些位點(diǎn)以外的其它位點(diǎn)上所含有的取代通常不會(huì)超過(guò)5個(gè)，且可以在除上面所列的位點(diǎn)以外的其它位點(diǎn)上具有與相應(yīng)的野生型FSHa和P亞基完全相同的氨基酸序列。堿性氨基酸包括氨基酸賴氨酸、精氨酸、和組氨酸、以及任一作為這三種氨基酸的修飾物的其它堿性氨基酸、正常在自然界中不能發(fā)現(xiàn)的合成的堿性氨基酸、任一在中性pH值條件下帶正電荷的其它氨基酸。其中，優(yōu)選的堿性氨基酸選自賴氨酸和精氨酸。示例的具有兩個(gè)堿性氨基酸取代的修飾的FSH類似物包括，但不限于在a亞基的14和66位點(diǎn)上具有取代的蛋白(具體地是E14R和N66R)、在a亞基的14和73位點(diǎn)上具有取代的蛋白(具體地是E14R和G73R)、在a亞基的16和20位點(diǎn)上具有取代的蛋白(具體地是P16R和Q20R)、在a亞基的20和21位點(diǎn)上具有取代的蛋白(具體地是Q20R和P21R)。本發(fā)明的修飾的FSH蛋白也可以具有包括三個(gè)堿性氨基酸取代的a亞基，所述取代位于選自位點(diǎn)13、14、16、17、20、21、22、66、68、73、74和81中的位點(diǎn)。這些修飾蛋白包括但不限于具有位點(diǎn)16、20和21(具體地是P16R、Q20R和P21R)、位點(diǎn)14、20和73(具體地是E14R、Q20R和G73R)、位點(diǎn)66、73和81(具體地是N66K、G73K和A81K)、位點(diǎn)14、66和73(具體地是E14R、N66R和G73R)、以及位點(diǎn)14、21和73(具體地是E14R、P21R和G73R)上的組合取代的蛋白。本發(fā)明的修飾的FSH蛋白也可以具有包括四個(gè)堿性氨基酸取代的a亞基，所述取代位于選自位點(diǎn)13、14、16、17、20、21、22、66、68、73、74和81中的位點(diǎn)。這些修飾蛋白包括但不限于具有位點(diǎn)13、14、16和20上的組合取代的蛋白，具體地是Q13R、E14R、P16R和Q20R的組合、以及Q13K、E14K、P16K和Q20K的組合。本發(fā)明的修飾的FSH蛋白也可以具有包括五個(gè)堿性氨基酸取代的a亞基，所述取代位于選自位點(diǎn)13、14、16、17、20、21、22、66、68、73、74和81中的位點(diǎn)。這些修飾蛋白包括但不限于具有位點(diǎn)14、20、21、66和73上的組合取代(具體地是E14R、Q20R、P21R、N66R和G73R)、以及位點(diǎn)14、16、20、66和73上的組合取代(具體地是E14R、P16R、Q20R、N66R和G73R)的蛋白。本發(fā)明的修飾的FSH蛋白也可以具有包括六個(gè)堿性氨基酸取代的a亞基，所述取代位于選自位點(diǎn)13、14、16、17、20、21、22、66、68、73、74和81中的位點(diǎn)。這些修飾蛋白包括但不限于具有位點(diǎn)13、14、16、20、66和73上的組合取代(具體地是Q13K、E14K、P16K、Q20K、N66K和G73K)、以及位點(diǎn)14、16、20、21、66和73上的組合取代(具體地是E14R、P16R、Q20R、P21R、N66R和G73R)的蛋白。本發(fā)明的特別有效的修飾P亞基在對(duì)應(yīng)于SEQIDNo.2的位點(diǎn)4的位點(diǎn)上包括一個(gè)堿性氨基酸(更具體地是E4R)。該突變?cè)斐闪薋SH效力和表達(dá)水平的顯著增加。本發(fā)明者己經(jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)與其它在此所述的取代組合使用時(shí)，該突變?cè)斐闪酥亟MFSH的產(chǎn)生增加了2到3倍。FSH超激動(dòng)劑的設(shè)計(jì)通過(guò)與其它物種比較相關(guān)FSH的oc和p的氨基酸序列鑒定出其它物種的FSH蛋白中的基礎(chǔ)殘基可以設(shè)計(jì)出本發(fā)明所包括的超激動(dòng)齊U。在美國(guó)專利.6，361，992中闡述了這些方法，在此通過(guò)引用其全部?jī)?nèi)容將其并入本申請(qǐng)。對(duì)于所選定的用于比較和取代的物種，要結(jié)合考慮不同物種的相對(duì)的FSH的生物學(xué)活性。此外，可以用基于相關(guān)糖蛋白激素的結(jié)構(gòu)同源性模型鑒定出表面暴露出的氨基酸殘基。因此，本發(fā)明也提供了比同一物種的野生型FSH具有更高效力的修飾的FSH蛋白，其中修飾的FSH包括堿性氨基酸取代，所述氨基酸取代位于對(duì)應(yīng)于其它物種的比野生型FSH蛋白具有更高效力的FSH蛋白中的相同氨基酸位點(diǎn)的位點(diǎn)。被修飾增加其效力的糖蛋白可以來(lái)自非人的物種。例如，可以比較豬FSH和牛FSH，設(shè)計(jì)出在豬和牛序列有所不同的位點(diǎn)上具有氨基酸取代的豬FSH蛋白，構(gòu)建出具有所選變化的豬FSH蛋白，并給豬動(dòng)物施用所修飾的豬FSH。同樣的，被修飾的FSH可以是牛FSH。本發(fā)明也提供了具有比同一物種的野生型FSH更高效力的修飾的FSH，其中修飾的FSH包括堿性氨基酸取代，所述取代位于對(duì)應(yīng)于來(lái)自同一物種的具有比野生型糖蛋白激素更高效力的不同的糖蛋白激素中的相同氨基酸位點(diǎn)的位點(diǎn)。例如，可以比較人FSH和人絨毛膜促性腺激素的(3亞基，并且可以根據(jù)任一序列兼并性對(duì)FSH(3亞基進(jìn)行氨基酸取代。天然地，僅僅預(yù)期了那些普遍增加了修飾的FSH的效力的變化，因?yàn)槿孕枰３旨に氐氖荏w特異性。為了修飾附加的氨基酸位點(diǎn)，利用標(biāo)準(zhǔn)的計(jì)算機(jī)軟件程序例如DNASIS(HitachiSoftwareEngineeringCo.Ltd.)或任一上面所列的其它排列程序(包括但不限于LIONment、SIM和GCG程序例如Gap、BestFit、FrameAlign和Compare)都可以排列來(lái)自人和非人的糖蛋白激素序列。然后利用上面所提及的技術(shù)可以取代在人和非人的糖蛋白激素之間的有所不同的氨基酸殘基，并用其中一種在此所提及的檢測(cè)法檢測(cè)所形成的糖蛋白激素的效力。本發(fā)明也包括具有超激動(dòng)劑或拮抗劑活性的在此所述的類似物的片段。例如，可以單獨(dú)地或聯(lián)合P鏈的片段或全長(zhǎng)P鏈?zhǔn)褂帽景l(fā)明的修飾a鏈的片段生成超激動(dòng)劑化合物。同樣，可以單獨(dú)地或聯(lián)合a鏈的片段或全長(zhǎng)a鏈?zhǔn)褂帽景l(fā)明的修飾P鏈的片段生成超激動(dòng)劑化合物。在一些情況中，本發(fā)明的修飾的FSH分子的片段可以被用作措抗劑，例如在施用治療性FSH之后限制其活性的持續(xù)時(shí)間的拮抗劑。本發(fā)明也包括單鏈類似物和整合由在此所述的類似物的突變區(qū)的嵌合蛋白。例如，本發(fā)明者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在雙活性促性腺激素的a亞基內(nèi)整合超強(qiáng)的取代可以使得促黃體生成素和促卵泡生成素的活性都增加了3到5倍，這說(shuō)明通過(guò)組合本發(fā)明的取代可以進(jìn)一步地強(qiáng)化雙活性促性腺激素的內(nèi)在活性。在美國(guó)專利4,237,224中描述了雙活性促性腺激素的構(gòu)建，在此通過(guò)引用其全部?jī)?nèi)容將其并入本申請(qǐng)。FSH超激動(dòng)劑的表征用多種方法可以確認(rèn)在此所述的對(duì)野生型FSH的修飾作用。例如，可以測(cè)定促經(jīng)編碼修飾的糖蛋白的核酸所轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的環(huán)AMP(cAMP)的產(chǎn)生，并將其與經(jīng)編碼野生型糖蛋白激素的核酸所轉(zhuǎn)染的相似細(xì)胞中的cAMP的產(chǎn)生進(jìn)行比較。同樣，可以測(cè)定出經(jīng)修飾的糖蛋白所轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的孕酮的產(chǎn)生，并將其與經(jīng)野生型糖蛋白激素所轉(zhuǎn)染的相似細(xì)胞中的孕酮的產(chǎn)生進(jìn)行比較。同樣的，可以從受體結(jié)合檢測(cè)、胸腺嘧啶攝取檢測(cè)或T4分泌檢測(cè)中確定出修飾的糖蛋白激素的活性。在此所含的實(shí)施例部分中列出了用于確定修飾的糖蛋白激素的活性的這些檢測(cè)法的特殊實(shí)例。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以容易地確定出任一合適的用于確定野生型或修飾的糖蛋白激素的活性的檢測(cè)法。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，修飾的糖蛋白激素具有比野生型糖蛋白激素的效力增加至少約IO倍的效力。用上面所提及的以及在此所含的實(shí)施例中所述的任一技術(shù)、或者用本領(lǐng)域人員所能容易確定出的任何其它合適的檢測(cè)法都可以檢測(cè)出所增加的效力。所增加的效力在不同檢測(cè)法之間或不同細(xì)胞株之間并不一定都保持一致，顯而易見(jiàn)將會(huì)有所不同。利用表達(dá)不同水平的應(yīng)答性FSH受體的細(xì)胞株，本發(fā)明的修飾的FSH分子將具有比野生型高至少約20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、卯倍或甚至100倍的效力。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，修飾的糖蛋白激素具有比野生型糖蛋白計(jì)算的最大功效高至少約10%的最大功效。用上面所提及的以及在此所含的實(shí)施例中所述的任一技術(shù)、或者用本領(lǐng)域人員所能容易確定出的任何其它合適的撿測(cè)法都可以檢測(cè)出所增加的最大功效。所增加的功效在不同檢測(cè)法之間或不同細(xì)胞株之間并不一定都保持一致，顯而易見(jiàn)將有所不同。利用表達(dá)不同水平的應(yīng)答性FSH受體的細(xì)胞株，本發(fā)明的修飾的FSH分子將具有比野生型高至少約10%、至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%的最大功效。在PCT/US99/05908中描述了適用于表征在此所述的類似物的其它檢測(cè)法，在此通過(guò)引用將其全部?jī)?nèi)容并入本申請(qǐng)。例如，可以施用各種免疫檢測(cè)法，其包括但不限于利用技術(shù)例如放射免疫檢測(cè)法、ELISA、三明治免疫檢測(cè)法、免疫放射測(cè)定法、凝膠擴(kuò)散沉淀反應(yīng)、免疫擴(kuò)散檢測(cè)法、原位免疫檢測(cè)法、Western印跡法、沉淀反應(yīng)法、凝集檢測(cè)法、補(bǔ)體固定檢測(cè)法、免疫熒光檢測(cè)法、蛋白A檢測(cè)法和免疫電泳檢測(cè)法等競(jìng)爭(zhēng)性和非競(jìng)爭(zhēng)性檢測(cè)系統(tǒng)。用體外和體內(nèi)檢測(cè)法都可以檢測(cè)出卵母細(xì)胞的質(zhì)量和數(shù)量上的提高。常見(jiàn)的是，利用體外受精過(guò)程中的不同終點(diǎn)例如卵母細(xì)胞形成、卵母細(xì)胞受精、和胚泡形成確定出卵母細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量上的提高。體外受精試驗(yàn)可以按照"超排卵方案"，其中用本發(fā)明的超活性FSH類似物處理對(duì)象，造成多個(gè)卵母細(xì)胞的釋放和成熟。在體外受精試驗(yàn)中，可以與hCG—起施用FSH(超活性FSH和重組野生型FSH)以便引發(fā)排卵。可以使用對(duì)照動(dòng)物，其僅僅接受hCG或孕馬血清促性腺激素(PMSG)。通過(guò)增加動(dòng)物體內(nèi)的受精率可以提高卵母細(xì)胞的質(zhì)量。通過(guò)比較用超活性FSH所獲得的受精率和用相同數(shù)量的重組野生型FSH所獲得的受精率可以在體內(nèi)或體外確定出超活性卵泡剌激素的受精率。也可以使用接受hCG的對(duì)照動(dòng)物。通過(guò)每一卵母細(xì)胞總數(shù)所發(fā)育出的雙細(xì)胞胚胎可以測(cè)定出受精率。如果受精發(fā)生在體外，可以在受精皿中計(jì)數(shù)雙細(xì)胞胚胎。在小鼠中，在受精后近24個(gè)小時(shí)后發(fā)育出雙細(xì)胞胚胎。根據(jù)所施用的超活性FSH的量，受精率可以有所不同。動(dòng)物可以接受多劑量的超活性FSH。以對(duì)于卵母細(xì)胞數(shù)目而言的最大有效劑量施用超活性FSH造成了受精率增加了至少約10%。以對(duì)于卵母細(xì)胞數(shù)目而言的最大有效劑量施用超活性FSH造成了受精率增加至少約20%、優(yōu)選地至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。超活性卵泡刺激素通過(guò)提高每個(gè)受精卵母細(xì)胞的胚泡形成率可以提高卵母細(xì)胞的質(zhì)量。通過(guò)確定出形成胚泡的雙細(xì)胞胚胎的百分比可以測(cè)定出胚泡形成率。無(wú)論在體內(nèi)或體外形成胚泡，都增加了胚泡形成率。胚泡形成率依賴于所施用的超活性卵泡剌激素的量。以對(duì)于卵母細(xì)胞數(shù)目而言的最大有效劑量施用超活性卵泡刺激素造成了胚泡形成率增加了至少約10°/。。以對(duì)于卵母細(xì)胞數(shù)目而言的最大有效劑量施用超活性FSH造成了胚泡形成率增加至少約20%、優(yōu)選地至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90°/?；?00%。超活性卵泡刺激素通過(guò)提高每個(gè)受精卵母細(xì)胞的胚胎總數(shù)可以提高卵母細(xì)胞的質(zhì)量。無(wú)論體內(nèi)或體外發(fā)生受精，都增加了每個(gè)受精卵母細(xì)胞的胚胎總數(shù)。每個(gè)受精卵母細(xì)胞的胚胎總數(shù)的增加依賴于所施用的超活性卵泡刺激素的量。以對(duì)于卵母細(xì)胞數(shù)目而言的最大有效劑量施用超活性卵泡刺激素造成了每個(gè)受精卵母細(xì)胞的胚胎總數(shù)增加了至少約10%。以對(duì)于卵母細(xì)胞數(shù)目而言的最大有效劑量施用超活性FSH造成了每個(gè)受精卵母細(xì)胞的胚胎總數(shù)增加至少約20%、優(yōu)選地至少30%、40%、50%、60%、70°/。、80%、90%或100%?？梢杂贸钚訤SH提高動(dòng)物的卵母細(xì)胞的質(zhì)量和數(shù)量，所述動(dòng)物包括但不限于人、小鼠、大鼠、靈長(zhǎng)類動(dòng)物、兔、豬、馬、羊、和狗。優(yōu)選地，所施用的超活性FSH是人FSH。具有增加半衰期的FSH類似物本發(fā)明的修飾的FSH蛋白還可以被進(jìn)一步地修飾，使得半衰期比野生型FSH的半衰期更長(zhǎng)。例如，本發(fā)明的修飾的FSH蛋白還可以包括至少一個(gè)具有潛在的糖基化位點(diǎn)的序列，所述序列包括在a或P鏈上包括N-糖基化和/或O-糖基化位點(diǎn)的序列。提供潛在的糖基化識(shí)別位點(diǎn)的序列可以是a或p鏈的N末端或C末端延伸。示例的修飾蛋白在其a鏈上含有N末端延伸，所述延伸選自ANITV(SEQIDNo.3)和ANITVNITV(SEQIDNo.4)。其它示例的修飾蛋白在所述的p鏈上含有一個(gè)其它的修飾，所述修飾選自Y58N和V78N。通過(guò)聚乙二醇化或綴合其它合適的化學(xué)基團(tuán)或通過(guò)構(gòu)建具有增加半衰期的融合蛋白或任一其它的方法也可以提供半衰期的增加。這些方法在本領(lǐng)域是已知的，例如在美國(guó)專利5,612,034、美國(guó)專利6,225,449、和美國(guó)專利6,555,660中所述的方法，在此通過(guò)引用將其全部?jī)?nèi)容并入本申請(qǐng)。通過(guò)增加分子內(nèi)的帶負(fù)電荷殘基的數(shù)目(例如谷氨酸和/或天冬氨酸)的數(shù)目也可以增加半衰期。通過(guò)定點(diǎn)誘變方法可以實(shí)現(xiàn)這些改變，優(yōu)選的改變選自a亞基取代A85E和A85D等。通過(guò)往所述修飾的FSH中插入含有一個(gè)或多個(gè)帶負(fù)電荷殘基的氮基酸序列也可以實(shí)現(xiàn)這些改變，所述插入物包括選自GEFT(SEQIDNo.5)和GEFTT(SEQIDNo.6)等中的插入物。在一個(gè)實(shí)施方式中，插入位于a亞基內(nèi)，以及它選自APD-GEFT-VQDC(SEQIDNo.7)禾QAPD-GEFTT-QDC(SEQIDNo.8)等。蛋白的半衰期是蛋白穩(wěn)定性的測(cè)定值，它說(shuō)明了蛋白濃度降低一半所需的時(shí)間。通過(guò)任一適用于測(cè)定一段時(shí)間內(nèi)的對(duì)象樣品中的FSH水平可以確定出在此所述的修飾的FSH分子的血清半衰期，所述方法例如，但不限于，是利用抗FSH抗體的免疫檢測(cè)法測(cè)定在施用修飾的FSH—段時(shí)間后所取得的血清樣品中的FSH水平，或者通過(guò)檢測(cè)在施用標(biāo)記FSH后所取得的對(duì)象血清樣品中的標(biāo)記FSH分子即放射性標(biāo)記的分子。FSH超激動(dòng)劑的表達(dá)和/或合成本發(fā)明也包括編碼本發(fā)明的修飾的FSH的a和J3亞基的核酸，以及用于表達(dá)核酸的載體和宿主細(xì)胞。用于在不同宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)核酸的合適的啟動(dòng)子在本領(lǐng)域是公知的，根據(jù)用于表達(dá)的載體-宿主系統(tǒng)容易將其互換。在美國(guó)專利6,361,992中描述了示例的載體和宿主細(xì)胞，在此通過(guò)引用將其全部?jī)?nèi)容并入本申請(qǐng)。例如，一旦構(gòu)建、修飾、或分離出編碼相關(guān)的特殊糖蛋白激素的核酸、或核酸的一個(gè)區(qū)域時(shí)，核酸可以被克隆到合適的載體內(nèi)，所述載體可以指導(dǎo)野生型和/或修飾的糖蛋白激素的體內(nèi)或體外合成。預(yù)期載體具有指導(dǎo)和調(diào)節(jié)所插入基因或雜交基因的轉(zhuǎn)錄所必需的功能元件。這些功能元件包括，但不限于啟動(dòng)子、啟動(dòng)子的上游或下游區(qū)域、復(fù)制起點(diǎn)、有助于克隆鄰近啟動(dòng)子的插入物的合適的限制性位點(diǎn)、用于選擇含有載體的細(xì)胞或含有插入物的載體的抗生素耐藥基因或其它標(biāo)記物、RNA剪切連接物、轉(zhuǎn)錄終止區(qū)、或任何有助于表達(dá)插入基因或雜交基因的其它區(qū)域。(一般見(jiàn)于，Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，第2版(19S9))。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知多種能用于表達(dá)所插入的核酸的大腸桿菌表達(dá)載體。其它適用的微生物宿主包括桿菌例如枯草桿菌、和其它腸道細(xì)菌例如沙門氏菌、靈桿菌、和各種假單胞菌屬。在這些原核宿主中，也可以制備表達(dá)載體，它通常含有與宿主細(xì)胞相兼容的表達(dá)控制序列(例如復(fù)制起點(diǎn))。此外，還可以存在任何數(shù)目的各種公知的啟動(dòng)子，例如乳酸啟動(dòng)子系統(tǒng)、色氨酸(Trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)、(3-內(nèi)酰胺酶啟動(dòng)子系統(tǒng)、或噬菌體、的啟動(dòng)子系統(tǒng)。啟動(dòng)子通?？刂票磉_(dá)，任選地具有操縱子序列，并且具有例如啟動(dòng)和完成轉(zhuǎn)錄和翻譯的核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列。如果需要，通過(guò)插入5'的Met密碼子以及骨架內(nèi)插入下游核酸都可以提供氨基末端的甲硫氨酸。利用標(biāo)準(zhǔn)的寡核苷酸誘變方法可以去除核酸插入物中的羧基末端延伸。另外，可以使用酵母表達(dá)。使用酵母表達(dá)系統(tǒng)具有一些優(yōu)點(diǎn)。首先，事實(shí)表明酵母分泌系統(tǒng)中所產(chǎn)生的蛋白具有正確的二硫鍵配對(duì)。其次，用酵母分泌系統(tǒng)可以有效地實(shí)施翻譯后的糖基化。常規(guī)用釀酒酵母前a因子原前導(dǎo)區(qū)(MF"-1基因編碼)指導(dǎo)酵母分泌蛋白。(Brake,etal.，"varies.-Factor-DirectedSynthesisandSecretionofMatureForeignProteinsinSaccharomycescerevisiae."Proc.NatAcad.Sci.,81:4642-4646(1984))。前a因子原的前導(dǎo)區(qū)含有一個(gè)信號(hào)肽和一個(gè)包括KEX2基因所編碼的酵母蛋白酶的識(shí)別序列的前片段該酶在Lys-Arg二肽裂解信號(hào)序列的羧基側(cè)裂解前體蛋白?？梢詫SH編碼序列與前oc因子原的前導(dǎo)區(qū)骨架融合。然后將該構(gòu)建體放置在強(qiáng)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子例如乙醇脫氫酶I啟動(dòng)子或糖酵解啟動(dòng)子的控制之下。核酸編碼序列之后的是轉(zhuǎn)錄終止密碼子，其之后是轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。同樣，核酸編碼序列可以與第二種蛋白編碼序列樹(shù)如SJ26或f3半乳糖苷酶融合，所述第二種蛋白可以有助于親和色譜法純化融合蛋白。用于分離融合蛋白組分的蛋白酶裂解位點(diǎn)的插入可以應(yīng)用于在酵母中表達(dá)的構(gòu)建體。用桿狀病毒系統(tǒng)也可以實(shí)現(xiàn)重組蛋白的有效的翻譯后糖基化和表達(dá)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞容許在有利于重要的翻譯后修飾環(huán)境中表達(dá)蛋白，所述修飾包括折疊和半胱氨酸配對(duì)、添加復(fù)雜的糖水化合物結(jié)構(gòu)、以及分泌活性蛋白。用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)活性蛋白的載體的特征是在強(qiáng)病毒啟動(dòng)子和多腺苷酸化信號(hào)之間插入蛋白編碼序列。載體可以含有賦予潮霉素耐藥性、慶大霉素耐藥性的基因、或其它適用為選擇性標(biāo)記物的基因或表型、或甲氨蝶呤耐藥性基因擴(kuò)增的基因或表型。利用編碼甲氨蝶呤耐藥性的載體可以將嵌合蛋白編碼序列引入到中國(guó)倉(cāng)鼠(CHO)細(xì)胞株內(nèi)，或者利用合適的選擇標(biāo)記物將嵌合蛋白編碼序列引入到其它細(xì)胞株內(nèi)。用Southern印跡分析可以確定出載體DNA在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的存在。用Northern印跡分析可以確定出對(duì)應(yīng)于插入編碼序列的RNA的產(chǎn)生。在本領(lǐng)域已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了大量的其它適合的能分泌完整的人類蛋白的宿主細(xì)胞株，其包括CHO細(xì)胞株、HeLa細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞株、Jurkat細(xì)胞等。這些細(xì)胞的表達(dá)載體可以包括表達(dá)控制序列例如復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子以及必需的信息加工處理位點(diǎn)，例如核糖體結(jié)合位點(diǎn)、RNA剪切位點(diǎn)、多腺苷酸化位點(diǎn)、和轉(zhuǎn)錄終止序列。示例的表達(dá)控制序列是源自免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳頭狀瘤病毒等的啟動(dòng)子。用公知的方法可以將含有相關(guān)核酸片段的載體轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞內(nèi)，所用的方法根據(jù)細(xì)胞宿主的類型而有所不同。例如，氯化鈣轉(zhuǎn)化常常被用于原核細(xì)胞，而磷酸鈣、DEAE葡聚糖、或脂染介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或電穿孔可以用于其它的細(xì)胞宿主?？梢圆捎糜糜谠诓溉閯?dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)基因的其它載體，那些與被開(kāi)發(fā)用于表達(dá)人rf擾素、組織纖溶酶原激活劑、凝血因子VIII、乙型肝炎病毒表面抗原、蛋白酶Nexinl、和嗜酸性粒細(xì)胞的主要堿性蛋白的載體相似的載體。此外，載體可以包括CMV啟動(dòng)子序列和適用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如C0S-7)內(nèi)表達(dá)所插入的核酸的多腺苷酸化信號(hào)。可以在體內(nèi)或體外表達(dá)基因或雜交基因。體外合成包括轉(zhuǎn)化作為載體的宿主細(xì)胞的原核或真核細(xì)胞。同樣，可以在體外表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行基因表達(dá)。例如，可以商業(yè)化獲得體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，其可被常規(guī)地用于合成相當(dāng)大量的mRNA。在這些體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中，將編碼糖蛋白激素的核酸克隆到鄰近于轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的表達(dá)載體內(nèi)。例如，BluescriptII克隆和表達(dá)載體含有多個(gè)克隆位點(diǎn)，其側(cè)面是強(qiáng)的原核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子。(StratageneCloningSystems,LaJolla，Calf.)可以獲得含有所有從DNA模板例如Bluescript載體體外合成RNA所必需的試劑的試劑盒(StratageneCloningSystems,LaJolk,Calf.)。然后可以在體外翻譯系統(tǒng)在體外所生成的RNA，以生成所需的糖蛋白激素(StratageneCloningSystems,LaJolla，Calf.)。生成糖蛋白激素的另一種方法是用蛋白化學(xué)技術(shù)將兩種肽或多肽連接在一起。例如，利用目前可獲得實(shí)驗(yàn)室設(shè)備，利用Fmoc(芴甲氧羰基)或Boc(叔丁氧羥基)化學(xué)可以化學(xué)地合成肽或多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地知道用標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)反應(yīng)可以合成對(duì)應(yīng)于雜交糖蛋白激素的肽或多肽。例如，肽或多肽可以被合成并且不將其從合成樹(shù)脂中裂解下來(lái)，而雜交肽的其它片段可以被合成并隨后從樹(shù)脂中解離下來(lái)，據(jù)此暴露出在其它片段中被功能封閉的末端基團(tuán)。通過(guò)肽縮合反應(yīng)，這兩種片段可以分別經(jīng)其羧基和氨基末端的肽鍵共價(jià)地連接在一起，以便形成雜交肽。(Grant,G.A.，"SyntheticPeptides:AUserGuide，"W.H.FreemanandCo.,N.Y.(1992)andBodansky，MandTrost，B.,Ed""PrinciplesofPeptideSynthesis，"Springer-VeriagInc.,N.Y.(1993))。同樣，如上所述可以體內(nèi)獨(dú)立地合成肽或多肽。一旦分離出肽或多肽，經(jīng)相似的肽縮合反應(yīng)可以將這些獨(dú)立的肽或多肽連接在一起形成糖蛋白激素。例如，所克隆的或合成的肽片段的酶的或化學(xué)的連接可以容許相對(duì)短的肽片段連接在一起，生成更大的肽片段、多肽或整個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)域。(Abmhmsen,L.,etal.,Biochemistry,30:4151(1991);Dawson,etal,，"SynthesisofProteinsbyNativeChemicalLigation,"Science,266:776-779(1994))。本發(fā)明也提供了具有超激動(dòng)劑或拮抗劑活性的修飾的糖蛋白激素的片段。本發(fā)明的多肽片段可以是通過(guò)將編碼多肽的核酸克隆到能生成多肽片段的表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)所獲得的重組蛋白。例如，可以確定出修飾的FSH蛋白的活性結(jié)構(gòu)域，其與(3亞基一起可以與糖蛋白激素受體相互作用，并引起與糖蛋白激素相關(guān)的生物效應(yīng)。在一個(gè)實(shí)例中，可以刪除所發(fā)現(xiàn)的不會(huì)影響糖蛋白激素的活性或結(jié)合特異性或親和力的氨基酸，且不會(huì)丟失相應(yīng)的活性。例如，可以依次去除天然或修飾的糖蛋白激素中的氨基或羧基末端的氨基酸，并用如上所述的其中一種可獲得的檢測(cè)法測(cè)試相應(yīng)的活性。在另一個(gè)實(shí)例中，可以用多肽片段或其它基序(例如生物素)取代本發(fā)明的修飾蛋白中的氨基末端或羧基末端或者甚至激素的內(nèi)在區(qū)域的一部分，所述多肽片段或其它基序可以有助于修飾的糖蛋白激素的純化。例如，通過(guò)將編碼兩種多肽片段的相應(yīng)的核酸克隆到表達(dá)載體內(nèi)使得編碼區(qū)的表達(dá)生成雜交多肽的肽化學(xué)可以將修飾的糖蛋白與麥芽糖結(jié)合蛋白融合。通過(guò)將雜交多肽流經(jīng)過(guò)親和柱可以親和純化雜交多肽，然后通過(guò)用特異的蛋白酶因子X(jué)a裂解雜交多肽可以將修飾的糖蛋白與麥芽糖結(jié)合區(qū)分離開(kāi)來(lái)。(見(jiàn)例如，NewEnglandBiolabsProductCatalog,1996，164頁(yè))。也可以直接地合成或者可以通過(guò)化學(xué)地或機(jī)械地分裂更大的糖蛋白激素獲得本發(fā)明的FSH分子的活性片段?；钚云伪欢x為源自天然存在的氨基酸序列的至少約5個(gè)連續(xù)氨基酸的氨基酸序列，其具有相關(guān)的活性例如結(jié)合或調(diào)節(jié)活性。無(wú)論是否與其它的序列相連接，片段也可以包括插入、缺失、取代、或其它所選的對(duì)特殊區(qū)域或特異氨基酸殘基的修飾，只要肽的活性與修飾的糖蛋白的活性相比較沒(méi)有被顯著地改變或削弱。這些修飾可以提供一些附加的性能，例如去除能形成二硫鍵的氨基酸以便增加其生物壽命等。在任何情況中，肽必須具備生物學(xué)活性的性能，例如結(jié)合活性、調(diào)節(jié)結(jié)合區(qū)域的結(jié)合的活性等。通過(guò)對(duì)激素的特異區(qū)域的誘變作用，以及隨后的對(duì)所表達(dá)多肽的表達(dá)及測(cè)試可以鑒定出糖蛋白激素的功能的或活性的區(qū)域。這些方法對(duì)于本領(lǐng)域人員是顯而易見(jiàn)的，并且包括對(duì)編碼受體的核酸的位點(diǎn)特異性的誘變作用(Zoller,M丄etal.)。本發(fā)明也包括包括在此所述的突變的融合蛋白和嵌合蛋白，例如包括與LH或CG蛋白的CTEP區(qū)的融合。通過(guò)用本領(lǐng)域已知的方法彼此連接編碼所需氨基酸序列的合適的核酸序列的合適的編碼框，并用上面所述的任一方法表達(dá)融合蛋白，可以生成這樣一種融合蛋白。同樣，用蛋白合成激素例如用肽合成儀可以生成這樣一種融合蛋白。本發(fā)明的單鏈類似物和嵌合蛋白可以在其a和p亞基之間或在嵌合蛋白的不同部分之間整合有肽連接物。治療方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的修飾的FSH超激動(dòng)劑可以用于治療任一與糖蛋白激素活性相關(guān)的病變。"與糖蛋白激素活性相關(guān)的"病變是完全或部分由改變了的糖蛋白激素應(yīng)答性所引起的病變，或者能從施用糖蛋白激素中獲益的病變。例如，這些病變包括，但不限于排卵功能障礙、黃體期缺陷、原因不明的不育癥、雄性因素的不育癥、限時(shí)懷孕、FSH受體低表達(dá)、FSH受體低敏感性、FSH受體結(jié)合缺陷、FSH受體偶合缺陷、低睪酮生成、男性型脫發(fā)癥、和垂體衰竭或損傷。具體地，通過(guò)給動(dòng)物施用在此所述的超活性FSH類似物可以提高卵母細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量。例如，如在此所報(bào)道的那樣，申請(qǐng)人驚奇地發(fā)現(xiàn)通過(guò)施用含有位點(diǎn)13、14、16和20上具有堿性氨基酸的取代的a亞基的超活性FSH獲得了卵母細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量的顯著增加。通過(guò)增加超活性FSH的FSH血清半衰期可以進(jìn)一步增強(qiáng)超活性FSH對(duì)卵母細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量的作用。通過(guò)進(jìn)一步地修飾超活性FSH可以增加FSH血清半衰期?？梢杂酶嗟男揎?包括但不限于前面所述的那些修飾)增加FSH血清半衰期。例如，可以用AMTV(SEQIDNo.3)延伸來(lái)延長(zhǎng)FSH血清半衰期。根據(jù)美國(guó)專利5,574,011，在此通過(guò)引用將其全部?jī)?nèi)容并入本申請(qǐng)，F(xiàn)SH刺激性腺生成類固醇例如睪酮。因此，可以用本發(fā)明的FSH類似物治療任一與低類固醇生成相關(guān)的病變，特別是與低睪酮生成相關(guān)的病變。根據(jù)美國(guó)專利6,562，790，在此通過(guò)引用將其并入本申請(qǐng)，可用睪酮治療冠狀動(dòng)脈堵塞。因此，可以用本發(fā)明的類似物提高患有冠狀動(dòng)脈疾病的患者體內(nèi)的睪酮水平。也可以在男性或女性對(duì)象的輔助生殖的治療方案中施用本發(fā)明的類似物，包括給對(duì)象施用輔助量的修飾的FSH。在這些方法中，可以單獨(dú)地施用或聯(lián)合其它的治療藥物施用類似物，其它的治療藥物例如包括但不限于枸櫞酸氯米芬、GnRH(促性腺釋放激素)和LH(黃體化激素)。例如，在患有單一性促性腺激素缺陷癥(IGD)的患者中，可以給對(duì)象施用修飾的FSH和LH,以便恢復(fù)正常的性腺功能。本領(lǐng)域所廣泛認(rèn)同的是，糖蛋白激素(例如FSH和LH)在雌性生殖生理中是一個(gè)整體，可以給對(duì)象施用糖蛋白激素以便克服大量的生殖疾病并據(jù)此輔助生殖。本發(fā)明的類似物特別適合于治療有卵巢過(guò)度剌激癥傾向的女性，例如通過(guò)在聯(lián)合方案中施用具有不同血清半衰期的類似物。這些方法包括(a)施用輔助量的第一種本發(fā)明的修飾的FSH，其中所述的第一種修飾的FSH的血漿半衰期要比野生型FSH長(zhǎng)，和(b)隨后施用輔助量的本發(fā)明的第二種修飾的FSH，其中所述的第二種修飾的FSH的血槳半衰期要比所述的第一種修飾的FSH的半衰期短。例如，比野生型FSH具有更短半衰期的類似物(TR-4401)可以用于治療有過(guò)度卵巢剌激癥傾向的女性。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以容易地確定出所施用的有效量的糖蛋白激素，這將依據(jù)于因素例如體重、大小、特殊病變的嚴(yán)重度、和對(duì)象本身的類型。通過(guò)常規(guī)的優(yōu)化方法可以容易地確定出治療有效量。本發(fā)明提供了具有比野生型糖蛋白激素更強(qiáng)效力的糖蛋白激素。這些修飾的糖蛋白激素將容許本領(lǐng)域人員施用比野生型糖蛋白激素更小劑量的修飾的糖蛋白激素，以獲得相似的治療效果，或者施用與野生型糖蛋白激素相似劑量的修飾的糖蛋白激素可以獲得更高的治療療效。根據(jù)是否口服、腸外或其它方式施用糖蛋白激素，所施用的前列腺素可以是固體、半固體形式或液體劑量形式，例如片劑、丸劑、膠囊、粉末、液體、乳膏和懸浮液等，優(yōu)選地是適用于給予精確劑量的單位劑量形式。糖蛋白激素可以包括與藥用可接受的載體組合的有效量的所選的糖蛋白激素，另外還可以包括其它的藥劑、藥物、載體、佐劑、稀釋劑等。"藥用可接受的"意思是非生物的或非必需的物質(zhì)，即可以與所選的糖蛋白激素一起給個(gè)體施用且不引起不可接受的生物效應(yīng)或以不可接受的方式與糖蛋白激素相互作用的物質(zhì)。制備這些劑量形式的實(shí)際方法對(duì)于本領(lǐng)域人員是已知的或者是顯而易見(jiàn)的，例如見(jiàn)最新版的Remington'sPharmaceuticalSciences(MackPublishingCo.，Eastern,Pa.)?；蛑委熓怯帽景l(fā)明的修飾的糖蛋白激素治療激素疾病的另一種方法。在這種方法中，可以將編碼修飾的糖蛋白激素的基因引入到細(xì)胞內(nèi)，例如生殖系細(xì)胞或體細(xì)胞，使得在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)所述基因，以及這些細(xì)胞的后面的子代都能表達(dá)所引入的基因。例如，編碼本發(fā)明的修飾的FSH蛋白的核酸可以被插入到卵巢細(xì)胞、或其前體細(xì)胞內(nèi)，以增強(qiáng)排卵。轉(zhuǎn)運(yùn)編碼序列的合適載體在本領(lǐng)域是公知的。例如，載體可以是病毒載體例如腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或非病毒的載體例如陽(yáng)離子脂質(zhì)體。本發(fā)明的類似物具有比野生型蛋白更高的活性，因此特別適用于將作用物(agent)轉(zhuǎn)運(yùn)到表達(dá)糖蛋白激素受體的細(xì)胞內(nèi)。因此，本發(fā)明還提供了一種利用本發(fā)明的修飾的糖蛋白激素將作用物轉(zhuǎn)運(yùn)到所需治療的對(duì)象體內(nèi)的表達(dá)糖蛋白受體的細(xì)胞內(nèi)。將作用物轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)的方法(即靶向轉(zhuǎn)運(yùn))可以采用任何合適的試劑，依賴于對(duì)象的疾病或可疑疾病的性能。作用物可以是細(xì)胞保護(hù)性化合物、抗體、藥物、增敏劑、生物應(yīng)答修飾劑、放射性核素、毒素或其組合物。在某些實(shí)施方式中，靶向轉(zhuǎn)運(yùn)的方法被用于治療患有與異常糖蛋白受體表達(dá)相關(guān)的疾病或可疑疾病的對(duì)象。在某些實(shí)施方式中，靶向轉(zhuǎn)運(yùn)的方法被用于診斷或檢測(cè)與異常糖蛋白受體表達(dá)相關(guān)的疾病。在某些實(shí)施方式中，可以與其它治療性方法、診斷性方法或臨床方式(包括放療和/或手術(shù))一起使用靶向轉(zhuǎn)運(yùn)方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，提供了靶向轉(zhuǎn)運(yùn)作用物的方法，其中作用物是細(xì)胞保護(hù)性化合物。細(xì)胞保護(hù)性化合物是那些作用為保護(hù)或減少細(xì)胞損傷的發(fā)生率或嚴(yán)重性的化合物。商品化可獲得的細(xì)胞保護(hù)性化合物包括美司鈉(MESNEX,Bristol-MyersSquib)、阿米福汀(ETHYOL,Alza)、右丙亞胺(ZINECARD,Phaimacia&Upjohn)和四氫葉酸鈣(多個(gè)產(chǎn)家)。在一個(gè)實(shí)施方式中，作用物可以是任何用于治療各種形式癌癥的藥物，例如天然的或合成的雌激素、雌激素受體調(diào)節(jié)劑、黃體酮、雄激素、促性腺激素釋放激素、雄激素抑制劑、二磷酸鹽、糖皮質(zhì)激素、甲狀腺素、抗甲狀腺藥物、碘藥物、溴隱停、烷化劑、抗代謝藥、抗有絲分裂劑、鬼臼乙叉甙、抗腫瘤性抗生素、抗腫瘤性激素、鉑配位絡(luò)合物、anthracenediones、取代尿素、丙卡巴肼衍生物、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、類視黃醛、porfimer、米托坦或其組合。在一個(gè)實(shí)施方式中，作用物可以是任一用于治療男性或女性生殖系統(tǒng)癌癥(例如，子宮內(nèi)膜癌、子宮癌、宮頸癌、乳腺癌、睪丸癌)的藥物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，作用物可以是氯米芬、非那司提、丙基硫氧嘧啶、甲硫咪唑、博萊霉素、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、順鉑、絲裂霉素、異環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺、阿霉素、紫杉醇、氟尿嘧啶、卡鉑、表柔比星、六甲密胺、長(zhǎng)春瑞濱、米托蒽醌、強(qiáng)的松或其組合。也可以使用已知能增強(qiáng)某些抗癌藥物以及放射性藥物的細(xì)胞毒作用的藥物。這些藥物一般被稱作增敏劑。增強(qiáng)各種治療性藥物(例如抗癌藥物)的增敏劑的示例是丁硫氨酸亞礬胺和鈣離子通道拮抗劑例如維拉帕米、和地爾硫卓。(見(jiàn)，美國(guó)專利No.4,628，047和ImportantAdvancesinOncology1986,DeVita，al.，Eds.,J.B.LippincottCo.,Philadelphia,pages146-157(1986)，在此通過(guò)引用將其全部?jī)?nèi)容并入本申請(qǐng))。本領(lǐng)域已知的其它增敏劑是甲硝唑、迷索硝唑、某些2-氨磺酰-6-硝基苯甲酸衍生物、3-硝基吡唑的2.6-雙取代衍生物、和某些isoindoledione化合物(見(jiàn)，美國(guó)專利No.4,647,588、4,654,369、4,609,659和4,494,547，在此通過(guò)引用將其全部?jī)?nèi)容并入本申請(qǐng))。在某些實(shí)施方式中，作用物可以是生物應(yīng)答修飾劑?？梢允褂迷诒绢I(lǐng)域范圍內(nèi)的任一生物應(yīng)答修飾物。本發(fā)明的方法中所用的生物應(yīng)答修飾物的實(shí)例包括，但不限于ct干擾素、J3干擾素、Y干擾素、腫瘤壞死因子、淋巴細(xì)胞毒素、白介素-1、白介素-2、白介素-3、白介素-4、白介素-5、白介素-6或其組合。在某些實(shí)施方式中，作用物可以是抗體。抗體可以是單克隆或多克隆抗體。在某些實(shí)施方式中，抗體可以是人源化抗體、嵌合抗體、或功能性抗體片段包括例如Fabl、Fab2等。可以應(yīng)用于本發(fā)明的方法中的毒素的實(shí)例是蓖麻毒素、相思豆毒素、白喉毒素、假單胞菌外毒素A、核糖體滅活蛋白、和真菌毒素例如單端孢霉烯族毒素。單端孢霉烯族毒素是一種不完全真菌型的土壤真菌所生成的或從Baccharusmegapotamica中所分離到的真菌毒素(Bamburg,Proc.Molec.SubcellBio.1983,8:41-110，JarvisandMazzola，Acc.Chem.Res.1982,15:338-395，在此通過(guò)引用將其全部?jī)?nèi)容并入本申請(qǐng))?？梢允┯弥委熡行У男揎椂舅鼗蚱淦危缤ㄟ^(guò)遺傳工程或蛋白工程所生成的毒素?？梢葬娪萌魏螌⒆饔梦锱c修飾的糖蛋白激素相結(jié)合或連接的方法。例如，先前已經(jīng)描述了大量的不同的可裂解的連接物。見(jiàn)，美國(guó)專利No.4，618,492、4,542,225、和4,625,014，在此通過(guò)引用將其全部?jī)?nèi)容并入本申請(qǐng)。從這些連接物基團(tuán)中釋放出作用物的機(jī)制包括照射不耐光鍵、以及酸催化水解。美國(guó)專利No.5,563，250(在此通過(guò)引用將其全部?jī)?nèi)容并入本申請(qǐng))闡述了包括特異化學(xué)結(jié)構(gòu)的連接物的免疫綴合物，其中體外裂解連接物，釋放出天然形式的化合物(放射性藥物、藥物、毒素等)。連接物對(duì)輕微酸性pH下的裂解敏感，相信它在被轉(zhuǎn)運(yùn)到靶細(xì)胞的細(xì)胞漿內(nèi)的過(guò)程中可以被降解，據(jù)此在靶細(xì)胞內(nèi)釋放出生物學(xué)活性的化合物。美國(guó)專利No.4，671,958(在此通過(guò)引用將其全部?jī)?nèi)容并入本申請(qǐng))包括對(duì)免疫綴合物的描述，所述免疫綴合物包括在靶細(xì)胞內(nèi)被患者補(bǔ)體系統(tǒng)的蛋白裂解酶體內(nèi)裂解的連接物。已經(jīng)描述了其它方式的結(jié)合或連接。例如，連接物分子是商品化獲得的，例如從PierceChemicalCompany,Rockford，Illinois中獲得的那些連接物分子(見(jiàn)Pierce1986-87GeneralCatalog,pages313-354，在此通過(guò)引用將其全部?jī)?nèi)容并入本申請(qǐng))。與抗體結(jié)合的方法(見(jiàn)，例如美國(guó)專利4,671,958和4,659,839，在此通過(guò)引用將其全部?jī)?nèi)容并入本申請(qǐng))和連接或結(jié)合放射性核素金屬螯合劑、毒素及藥物和蛋白的方法是已知的。見(jiàn)，例如歐洲專利申請(qǐng)文獻(xiàn)No.188,256、美國(guó)專利No.4,671,958、4,659,839、4,414,148、4,699,784、4,680,338、4,569，789、和4，5卯，071;Borlinghausetal.Cane,Res.47:4071-4075,Aug.l,1987;Foran,BestPract.Res.Clin.Haematol.2002,15(3):449-65和Fotiou,etal"Eur.J.Gynaecol.Oncol.1988:9(4):304-7，在此通過(guò)引用將其全部?jī)?nèi)容并入本申請(qǐng)。對(duì)于更多的所報(bào)道的能將各種放射診斷性化合物、放射性藥物、藥物、毒素、及其它作用物與蛋白結(jié)合的方法，本領(lǐng)域人員能確定出用于連接給定的作用物和修飾的糖蛋白的合適方法。顯像方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的類似物具有比野生型蛋白更強(qiáng)的活性，因此特別適合于用于顯像表達(dá)糖蛋白激素受體的細(xì)胞。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明還提供了利用本發(fā)明的修飾的糖蛋白激素顯像包括糖蛋白激素受體的細(xì)胞的方法。顯像及檢測(cè)激素的方法可以是本領(lǐng)域人員已知的任一方法。商品化所用的顯像方法包括例如磁共振顯像(MRI)、X光片、計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)、正電子發(fā)射斷層掃描(PET)、乳腺成像和超聲波。已經(jīng)描述了利用基本的放射學(xué)技術(shù)顯像對(duì)象的方法，例如"TextbookofRadiologyandlmaging"，SuttonandLivingstone,7thEdition,(2Volumeset),ChurchillLivingstone(ElsevierSciences),London,2002;"AConciseTextbookofRadiology"，ArmstrongandWastie(eds.)ArnoldPublishing(TheThomsonCorporation),Scarborough,Ontario,Canada,2001;"Walter&Miller'sTextbookofRadiotherapy",BomfordandKnuckler,6thEdition,ChurchillLivingstone(ElsevierSciences),London,2001，在此通過(guò)引用將其全部?jī)?nèi)容并入本申請(qǐng)。也見(jiàn)于，Bottomley，Comput.Radiol.1984，8(2):57-77;Dixon，Radiology1984，153(1):189-94;DaleyandCohen，CancerRes.1989,49(4):770-9;Ellis，etal"Clin.Radiol.2001，56(9):691-9;Paushter，etal"Med.Clin.NorthAm.1984,68(6):1393-421;Blecher，Aust.Fam.Physician1983，12(6):449-50,452;Bragg,Cancer1977,40(1Suppl):500-8;Moseley,Br.Med.J.(Clin.Res.Ed.)1982，284(6323):1141-4;LentleandAldrich,Lancet1997,350(卯73):280-5;Weber,etal.，StrahlentherOnkol.1999，75(8):356-73;Hanbidge，Can.J.Gastroenterol.2002,16(2):10卜5;Miles,Bur.Radiol.2003,S卿lS:M134-8;Prigent陽(yáng)LeJeune,etal"Eur.J.Nucl.Med.Mol.Imaging2004,Feb19[Epubaheadofprint];DeSimone,etal"Gynecol.Oncol.2003,89(3):543-8和Goldenberg,etal"J.Clin.Oncol,1987,5(11):1827-35;在此通過(guò)引用將其全部?jī)?nèi)容并入本申請(qǐng)。主要根據(jù)于對(duì)象的疾病或可疑疾病的性質(zhì)、所顯像的組織以及是否需要功能性(生理性)或結(jié)構(gòu)性(解剖性)圖像，可以采用任一合適的顯像或檢測(cè)方法。在一些實(shí)施方式中，顯像方法提供了通過(guò)檢測(cè)對(duì)象體內(nèi)的所標(biāo)記的修飾的糖蛋白激素的量或檢測(cè)對(duì)象體內(nèi)的修飾的糖蛋白激素所增加的水平，可以說(shuō)明自身免疫性疾病或癌癥性疾病的存在，所述癌癥選自卵巢癌、子宮癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、睪丸癌或垂體腫瘤。顯像方法通?？梢员环诸惓赡切┨峁?duì)象的結(jié)構(gòu)或解剖方面的信息的方法或者那些提供對(duì)象的功能或生理學(xué)方面的信息的方法。結(jié)構(gòu)顯像提供了骨骼或組織成分的形狀，以便確定出是否存在異常信息或者某些元件的破壞。腫瘤或癌細(xì)胞的存在可以表現(xiàn)為結(jié)構(gòu)變化。更新類型的結(jié)構(gòu)顯像提供了組織內(nèi)的不同部分的化學(xué)組成，以便確定出是否存在正在進(jìn)行的損害或異常的生物化學(xué)過(guò)程(例如癌細(xì)胞的存在或生長(zhǎng))。見(jiàn)，例如Bonilha，etal.,Med.Sci.Monit.2004,10(3):RA40-6,epub2004Mar01;Ballmaier，etal,,PsychiatryRes.2004,15;130(1):43-55;Ballmaier,etal"Biol.Psychiatry,2004，55(4):382-9;Cha，Magn.Reson.ImagingClin.N.Am.2003，11(3):403-13和Kopelman，etal"Hippocampus,2003;13(8):879-91，在此通過(guò)引用將其全部?jī)?nèi)容并入本申請(qǐng)。功能顯像是一種相當(dāng)新的技術(shù)，它能查明特殊的組織或器官是否正在進(jìn)行特殊的功能任務(wù)。該技術(shù)能計(jì)算出多種生理過(guò)程，包括例如血流以及活性相關(guān)的血流變化(例如腫瘤的存在或生長(zhǎng))，以及監(jiān)視對(duì)化療的應(yīng)答。見(jiàn)，例如Takeuchi，etal"J.Med.Invest2004,51(1-2):59-62;Otsuka,etal"J.Med.Invest.2004,51(1-2):14-9;Martincich,etal"BreastCancerRes.Treat.2004,83(1):67-76;CohenandGoadsby,CumNeurol.Neurosci.Rep.2004，4(2):105-10禾卩Lewis,etal"Eur.J.Neurosci.2004，19(3):755-60，在此通過(guò)引用將其全部?jī)?nèi)容并入本申請(qǐng)。一般而言，放射學(xué)方法例如磁共振顯像(MRI)、X光片、計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)、乳腺成像和超聲波提供了對(duì)象的結(jié)構(gòu)或解剖的信息。放射學(xué)方法例如核醫(yī)學(xué)、放射性核素顯像以及正電子放射斷層掃描(PET)提供了對(duì)象的功能或生理學(xué)的信息。兩種結(jié)構(gòu)的和功能的顯像都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，顯像方法提供了修飾的糖蛋白激素是被標(biāo)記的(即使用了造影劑)。可以施用任一標(biāo)記或造影劑。見(jiàn)，例如Minato，etal.J.Comput.Assist.Tomogr.2004，28(1):46-51;Antoch,etal"JAMA2003，290(24):3199-206;Brinker,Rev.Caxdiovasc,Med.2003;4Suppl5:S19-27;el-Diasty,etal.,J.Urol.2004，171(1):31-4;Williams,etal.,Int.J.OralMaxillofac.Surg.2003，32(6):651-2;Follen,etal"Cancer2003,98(9Suppl):2028-38;Behrenbruch,etal"Med.ImageAnal.2003，7(3):311-40;Knopp,etal.,Mol.CancerTher.2003，2(4):419-26,在此通過(guò)引用將其全部?jī)?nèi)容并入本申請(qǐng)。標(biāo)記可以是本領(lǐng)域人員已知的任一標(biāo)記。在一個(gè)實(shí)施方式中，標(biāo)記可以是放射線所不能穿透的標(biāo)記、放射性標(biāo)記、熒光標(biāo)記或順磁標(biāo)記。放射性核素一般發(fā)射貝塔(P)或伽馬(力射線。1131發(fā)射約90%的P射線以及約10%的丫粒子，其物理學(xué)半衰期約為8天。Tc99m發(fā)射y射線，其半衰期約為6小時(shí)。在施用例如Tc99m標(biāo)記的蛋白之后，利用已知的方法通過(guò)用伽馬照相機(jī)掃描患者可以檢測(cè)出放射性核酸的生物分布。因此，容易顯像出Tc99m在耙臥位點(diǎn)上的蓄積。見(jiàn)，Toohey,Radiographics.2000;20:533-546;Kostakoglu,etal.,RadioGraphics2003，23:315-340;Saremi,etal"RadioGraphics2002，22:477-490;Inte腦，etal.,RadioGraphics2001，21:957-964;Ranger,RadioGraphics1999,19:481-502;Simpkin，RadioGraphics1999,19:155-167;JanokiandKerekes,ActaPhysio.Hung.1992，79(2):183-96;Hoefnagel,AnticancerDrugs1991,2(2):107-32;Hoefnagel,Eur.J.Nucl.Med.1991,18(6):408-31;Gatley,etaLActaRadiol.Suppl.1990，374:7誦11;Ott，Br.J.Radiol.1989，62(737):421-32;Andersen,Cerebrovasc.BrainMetab.Rev.1989，1(4):288畫(huà)318和Miraldi,Int.J.RadiatOncol.Biol.Phys.l986，12(7):1033-9，在此通過(guò)引用將其全部?jī)?nèi)容并入本申請(qǐng)。除了1131或Tc99m之外，在本發(fā)明的方法中可以采用任一本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的放射性同位素。其他的放射性核素和螯合劑可以包括例如Co57、Co58、Cr51、F18FDG、Ga67、氯化Inlll、三胺五乙酸(DTPA)Inlll、Inllloxyquinoline(oxine)、Inlll卡羅單抗噴地肽、InlllImciromapentetate、1123、1125碘肽酸鹽、1125人血白蛋白(RISA)、1131碘馬尿酸鹽、1131odomethylnorcholestero1(NP-59)、1131間碘節(jié)胍(MIBG)、Kr81m氣體、P32磷酸鉻、P32磷酸鈉、Ru82、Sml53lexidronam(Sm-153EDTMP)、Sr89、T1201和Xe133。診斷性檢測(cè)法本發(fā)明還提供了對(duì)干擾本發(fā)明的修飾的糖蛋白激素與糖蛋白激素受體結(jié)合的分析物的檢測(cè)。在一個(gè)實(shí)施方式中，提供了用于檢測(cè)生物樣品中的干擾修飾的糖蛋白激素受體的結(jié)合的分析物的方法，所述方法包括(i)將樣品與本發(fā)明的修飾的糖蛋白激素接觸；和(ii)檢測(cè)信號(hào)，其中所檢測(cè)到的信號(hào)的存在或量說(shuō)明了是否存在干擾修飾的糖蛋白激素與糖蛋白受體結(jié)合的分析物。在一個(gè)實(shí)施方式中，用于檢測(cè)分析物的方法是競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合撿測(cè)法。競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合撿測(cè)法是基于反應(yīng)物中的標(biāo)記的和未標(biāo)記的配體與受體結(jié)合物(例如抗體、受體、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)之間的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的檢測(cè)法。IUPACCompendiumofChemicalTerminology,1997，2ndedition,"CompetitiveProteinBindingAssays"OdellandDaughaday，W.H.Lippincott,1972禾口"PrinciplesofCompetitiveProtein-bindingAssays"OdellandFranchimont,P.JohnWiley&SonsInc.,1983，在此通過(guò)引用將其全部?jī)?nèi)容并入本申請(qǐng)。也見(jiàn)于美國(guó)專利No.6,537,1760，在此通過(guò)引用將其全部?jī)?nèi)容并入本申請(qǐng)。在某些實(shí)施方式中，信號(hào)是表示與樣品中的糖蛋白受體結(jié)合的修飾的糖蛋白激素的存在或量的信號(hào)。在某些實(shí)施方式中，方法采用了檢測(cè)第二信號(hào)，例如檢測(cè)cAMP或類固醇(例如孕酮)的存在或量。在某些實(shí)施方式中，方法采用了生物樣品中的整個(gè)細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中，方法僅僅采用部分細(xì)胞，例如細(xì)胞膜。在某些實(shí)施方式中，可以在溶液中進(jìn)行檢測(cè)。在某些實(shí)施方式中，可以將一種或多種檢測(cè)中的組分固定于固相上。可以將塑料表面、微粒、磁性顆粒、濾膜、多聚體凝膠材料以及其他的固相底物用作固相。見(jiàn)，例如6,664,114、6，589，798、6，479，296和6,294,342，在此通過(guò)引用將其全部?jī)?nèi)容并入本申請(qǐng)。使得本發(fā)明所提供的檢測(cè)方法自動(dòng)化是有可能的。利用FSH超激動(dòng)劑設(shè)計(jì)糖蛋白受體激動(dòng)劑和拮抗劑的方法本發(fā)明也提供了依據(jù)本發(fā)明的FSH蛋白和同種受體之間的相互作用設(shè)計(jì)新的受體激動(dòng)劑和拮抗劑的方法。這些方法包括預(yù)測(cè)本發(fā)明的FSH蛋白中的帶電基序與同種受體中的互補(bǔ)氨基酸殘基之間的相互作用。例如，這種方法可以包括比較FSH與來(lái)自進(jìn)化遠(yuǎn)源物種的受體(例如人LH和鼠LH受體)的結(jié)合和生物學(xué)活性方面的相互作用的差異；定位出僅僅存在于兩個(gè)受體序列其中之一中的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域和/或細(xì)胞外環(huán)中的帶電氨基酸；進(jìn)行丙氨酸掃描以及電荷逆轉(zhuǎn)誘變，以便進(jìn)一步地驗(yàn)證給定的預(yù)測(cè)；建立整合了所驗(yàn)證的相互作用的激素-受體復(fù)合物的模型；以及利用模型設(shè)計(jì)出新的激素類似物和受體拮抗劑。新的激素類似物包括那些利用本模型預(yù)測(cè)將與受體結(jié)合的類似物。新的拮抗劑包括那些利用本模型預(yù)測(cè)將與FSH類似物結(jié)合的從受體蛋白的結(jié)構(gòu)域或環(huán)中設(shè)計(jì)出來(lái)的拮抗劑。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的其中一種類似物(TR-4402，包括ct取代(E14R+Q20R+G73R)+卩E4R)與高濃度的鼠LH受體(SEQIDNo.23,NCBIAccessionNo.NP—037110)相互作用，但不與人LH受體(SEQIDNo.24,NCBIAccessionNo.NP—000224，數(shù)據(jù)沒(méi)有顯示)相互作用。根據(jù)TR-4402與這些受體的特異性上的差異，Argl4、Arg20和Arg73應(yīng)當(dāng)與鼠LH受體中的帶負(fù)電荷殘基Asp和Glu相互作用。在鼠受體中存在的但人受體所不具有的帶負(fù)電荷殘基是Asp312和Glu314(根據(jù)具有信號(hào)肽的人LH受體氨基酸序列)使人LH受體中分別是Ser和Lys)。人FSH受體(SEQIDNo.22，NCBIAccessionNo.AAA52477)中的相應(yīng)殘基是Glu316、Asp317和Glu319。因此，預(yù)測(cè)該酸性氨基酸簇與TR-4402的a亞基中的Arg14、Arg20和Arg73相互作用。該信息容許為糖蛋白激素的相關(guān)作用更好地建模，并且將有助于設(shè)計(jì)新的糖蛋白激素，包括含有對(duì)應(yīng)于人FSH受體的298-338的序列以及包括Glu300及Asp302的肽/蛋白拮抗劑。提供了描述和舉例說(shuō)明本發(fā)明的下面的實(shí)施例。這些實(shí)施例不應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是限制了本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域人員將認(rèn)識(shí)到許多其他的實(shí)施方式也可以在如上面所描述過(guò)的以及權(quán)利要求書(shū)中所定義的本發(fā)明的范圍之內(nèi)。實(shí)施例實(shí)施例l:FSH超激動(dòng)劑的產(chǎn)生和表征定點(diǎn)誘變利用Stratagene的QuickChange誘變?cè)噭┖袑?duì)人a亞基(SEQIDNo.1)和FSHp亞基(SEQIDNo.2)cDNA進(jìn)行定點(diǎn)誘變。根據(jù)美國(guó)專利No.6,361,992所述的方法設(shè)計(jì)出類似物，在此通過(guò)引用將其全部?jī)?nèi)容并入本申請(qǐng)。在被亞克隆到表達(dá)載體內(nèi)之后，測(cè)序所有構(gòu)建體的整個(gè)PCR產(chǎn)物，以便驗(yàn)證突變以及排除任何非所需的聚合酶錯(cuò)誤。瞬時(shí)表達(dá)在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO-K1)細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)類似物。利用基于脂質(zhì)體劑型(LipofectAMINE試齊lj，GibcoBRL)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方案，在60或100mm培養(yǎng)皿中，用野生型和突變體亞基cDNA(a和FSH卩亞基)瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在常規(guī)培養(yǎng)基中復(fù)原12個(gè)小時(shí)之后，將所轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在CHO-無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)72個(gè)小時(shí)。隨后，收集條件培養(yǎng)基，其包括來(lái)自用無(wú)基因插入物的表達(dá)載體的模擬轉(zhuǎn)染的對(duì)照培養(yǎng)基，用CentriprepIO濃縮器(Amicon,Beverly,MA)濃縮，并儲(chǔ)存在-70。C。用一組不同的識(shí)別不同F(xiàn)SH表位的單克隆和多克隆抗體定性類似物。FSH生物學(xué)活性檢測(cè)法通過(guò)類似物誘導(dǎo)表達(dá)hFSH受體的CHO細(xì)胞生成cAMP的能力評(píng)價(jià)出類似物的促卵泡活性。將穩(wěn)定表達(dá)hFSH受體的CHO細(xì)胞在96孔組織培養(yǎng)板中生長(zhǎng)到融合。隨后，在37°C、5%C02下，將細(xì)胞孵育在無(wú)鹽條件培養(yǎng)基(2h)或具有系列稀釋的野生型及突變體FSH的生理培養(yǎng)基(lh)以及來(lái)自模擬轉(zhuǎn)染的對(duì)照培養(yǎng)基中。用放射免疫檢測(cè)法測(cè)定出所生成的cAMP的量。選擇在體外具有最高生物學(xué)活性以及對(duì)FSH生成沒(méi)有副作用的FSH突變用于組合菌株。圖1包括了顯示出比較如瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CHO-FSHR細(xì)胞所測(cè)定到的各種單個(gè)突變?cè)隗w外對(duì)FSH生物學(xué)活性的作用的圖。顯示出最高效力的單個(gè)突變包括a位點(diǎn)Q13、E14、V68、P21和G73以及j3位點(diǎn)E4上的堿性取代。F18上的精氨酸取代造成了生物學(xué)活性的減低。(3E4R特別地造成了FSH生成的增加(見(jiàn)圖2)。在圖3中顯示出了一些組合取代對(duì)生物學(xué)活性的協(xié)同作用?？偣矞y(cè)試了a亞基中的26個(gè)單一突變以及(3亞基上的23個(gè)單一突變，選擇每個(gè)亞基中的頭幾個(gè)突變，以便構(gòu)建出具有組合取代的領(lǐng)先類似物。下面的表1顯示了在體外證實(shí)具有增強(qiáng)的生物學(xué)活性的組合突變。表1造成效力增強(qiáng)的組合取代。<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>如本領(lǐng)域已知的那樣，根據(jù)所用的系統(tǒng)，具體的藥物可以表現(xiàn)出不同的效肯g。見(jiàn)，Kenakin,"PredictingTherapeuticValueintheLeadOptimizationPhaseofDrugDisclovery,"NatureRev.2:429-38(2003)。因此，也用表達(dá)少量FSH受體的鼠顆粒細(xì)胞(GLHR-15細(xì)胞)測(cè)試了本發(fā)明的類似物的生物學(xué)活性。如圖4所示，與野生型FSH和游離ct鏈(沒(méi)有顯示出顯著的劑量依賴性應(yīng)答)相比較，本發(fā)明的類似物仍造成了顯著的cAMP應(yīng)答。實(shí)施例2:類似物TR-4402的純化和表征選擇TR-4402進(jìn)行純化和進(jìn)一步的表征。TR-4402是FSH類似物，其含有兩個(gè)aLI環(huán)中的突變(aE14R和aQ20R)、一個(gè)aL3環(huán)中的突變(aG73R)、以及一個(gè)PL1環(huán)中的突變(E4R)。見(jiàn)圖5。通過(guò)脂染胺方法將含有人a亞基cDNA以及二氫葉酸還原酶(DHFR)基因的修飾pED載體、以及含有經(jīng)IRES序列以及擴(kuò)增基因標(biāo)記物腺苷酸脫氨酶(ADA)所分開(kāi)的FSHP亞基cDNA的修飾pIRES載體共轉(zhuǎn)染到CHO-DHRF(-)細(xì)胞內(nèi)，建立了產(chǎn)TR-4402的細(xì)胞株。將所轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)在選擇培養(yǎng)基(缺乏核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸的含10%透析過(guò)的FBS的aMEM)中。為了在CHO雙缺失突變體(dhEr-/dhEr-)中穩(wěn)定地生成hFSH類似物，CHO-DG44細(xì)胞株由L.Chasin博士(ColumbiaUniversity,NewYork,N.Y.)惠贈(zèng)。將分泌FSH斜402的克隆細(xì)胞株培養(yǎng)在遞增濃度的甲氨蝶呤(MTX)(最大濃度為2jaM)中。DHFR擴(kuò)增依據(jù)于沒(méi)有添加核苷酸的培養(yǎng)基中的MTX的系統(tǒng)的增加。在恢復(fù)了細(xì)胞的多邊形形態(tài)之后(2到3周)，篩選出用于下面的擴(kuò)增步驟的細(xì)胞。因?yàn)镸TX濃度增加約800倍(從0.005laM至U約4.0iiM)，擴(kuò)增過(guò)程花費(fèi)了約4個(gè)月。具有最大分泌水平的克隆也被用于進(jìn)行第二次處理，包括用脫氧柯福霉素定向擴(kuò)增ADA標(biāo)記物基因。利用所建立的用于檢測(cè)FSH#4402的FSH免疫檢測(cè)法測(cè)試單個(gè)克隆的表達(dá)。選擇出經(jīng)pED-analoga+pIRES-ADA-analogb(a:b的摩爾比=1:5，5mg總DNA)所轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定細(xì)胞株(克隆編碼為H-2-3)，并將其在加有10%透析過(guò)的牛血清(Gibco,CatNo:26400-044)和2mM甲氨蝶呤(MTX;ICN,CatNo:102299，Aurora,Ohio)的oc最小必需培養(yǎng)基(a-MEM:Cat#:12561-056,Lot#1141509,具有L-谷氨酰胺，不含核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸)；GIBCO,GrandIsland,N.Y.)中進(jìn)行繁殖。生物反應(yīng)器接種物的制備當(dāng)500cm2的T瓶中的〉90。/qCHO-DG44細(xì)胞都融合時(shí)，用胰蛋白酶處理細(xì)胞，在4°C、400g離心5分鐘。通過(guò)將細(xì)胞懸浮液加液到2L塑料瓶?jī)?nèi)，將所有細(xì)胞(1.6'109/500mla-MEM培養(yǎng)基)都接種到CelligenplusBioreacto內(nèi)。在擴(kuò)增之后，將產(chǎn)生最大量FSH#4402的細(xì)胞株生長(zhǎng)在多個(gè)瓶?jī)?nèi)。然后利用灌注模式在具有內(nèi)在的停留設(shè)備(籃)和垂直混和系統(tǒng)的3.5L生物反應(yīng)器Packed-BedBioreactor(CelligenPlus,NewBrunswickScientific,Edison，NJ)內(nèi)進(jìn)一步繁殖細(xì)胞。細(xì)胞被捕捉到位于停留設(shè)備內(nèi)的Fibracd盤上。所溶解的氧氣被保持在50%飽和度。溫度為37°C。攪拌速度為100rpm。用四氣混和系統(tǒng)以及自動(dòng)注射碳酸氫鈉可以保持pH值為7.2。調(diào)整灌注，以保持葡萄糖水平高于1.5g/L以及乳酸低于1.5g/L。Celligenplusbioreactor中的FBS斷離方法以及FSH-TR4402類似物的產(chǎn)生。用加有次黃嘌呤-胸腺嘧啶補(bǔ)充物(Gibco,100')、青霉素-鏈霉素(Gibco,100';Cat#:15140-122，LotNo.:1161387)、谷氨酰胺-1(Gibco，100';Cat#:35050-61，LotNo.:1163550)、10%pluronicF-68(Gibco,100';Cat#:24040-032，LotNo.:1153058)禾卩1%透析過(guò)的胎牛血清(Gibco)的CHOIIIA(Gibco,FormulaNo.:97-0147DK，LotNo.:1147268)進(jìn)行生物反應(yīng)器中的血清斷離。在生物反應(yīng)器處理的第17天，我們將CHO-IIIA培養(yǎng)基更換成無(wú)CHO蛋白、無(wú)動(dòng)物成分的培養(yǎng)基(Sigma,Cat#:C-8730;LotNo.:122K8401),直到第23天(見(jiàn)概述生物反應(yīng)器運(yùn)行的SLIDE)。收集生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)基，離心，過(guò)濾(0.45pM膜)并用Millipore濃縮器進(jìn)行濃縮。純化用免疫親和(MaineBiotechnologyServices,Inc.的單克隆抗體ME.112)及疏水作用色譜法純化丁11-4402。用SDS-PAGE(-85%)評(píng)價(jià)純度。利用采用表達(dá)人FSH受體的CHO、人顆粒細(xì)胞樣腫瘤(KGN)和鼠顆粒(GLHR-15)細(xì)胞株以及以總cAMP產(chǎn)生為終點(diǎn)的體外撿測(cè)法表征修飾的類似物TR-4402(見(jiàn)圖6-8)。利用CHO-FSHR細(xì)胞，TR-4402表現(xiàn)出比Follistim(野生型FSH)的效力高30倍以及Vmax增加17%。利用KGN-FSHR，TR-4402的效力也比野生型FSH高30倍。也測(cè)試了TR-4402與LH和TSH受體的結(jié)合，以確認(rèn)FSH類似物的特異性，采用等電聚焦確認(rèn)碳水化合物鏈的異質(zhì)性，即存在著a和卩亞基(數(shù)據(jù)沒(méi)有顯示)。利用EggCentris的體外卵泡生物檢測(cè)法也測(cè)試了TR-4402在體外對(duì)小鼠卵泡的作用(與野生型FSH相比較)。該檢測(cè)法研究了早期竇前期卵泡的生長(zhǎng)和發(fā)育，直到排卵期。整個(gè)過(guò)程在體外接近模擬了體內(nèi)卵泡形成的生理過(guò)程。培養(yǎng)系統(tǒng)開(kāi)始于分離出直徑在100和130pM之間的同源類型的小鼠的竇前期卵泡。將卵泡單個(gè)鋪板，并將其與l、3和9mlU/mL野生型("化合物3")禾nTR-4402("化合物4")一起培養(yǎng)12天。卵泡生物檢測(cè)說(shuō)明與Follistim(野生型)相比較，暴露于TR-4402之后能提高卵母細(xì)胞的質(zhì)量，如增強(qiáng)卵泡生存(圖9)、增強(qiáng)卵泡竇形成(圖10)、增強(qiáng)COC的粘液化(圖11)、增強(qiáng)核成熟(圖12)和增強(qiáng)孕酮生成(圖13)所顯示的那樣。。這些不同與卵母細(xì)胞膜上的FSH受體的存在及抗凋亡作用相關(guān)(例如，見(jiàn)Medurietal"J.Clin.Endocrinol..Metab.87(5):2266-76)，并說(shuō)明本發(fā)明的修飾超激動(dòng)劑可以被用于提高尋求輔助生殖治療的患者體內(nèi)的卵母細(xì)胞的性能。實(shí)施例3:利用TR-4402的體內(nèi)研究利用不成熟的21天大的Sprague-Dawley雌鼠進(jìn)行TR-4402的體內(nèi)研究。每日一次皮下注射FSH共3天(第0、24和48小時(shí))。收集第72h時(shí)的血液樣品并進(jìn)行尸解。測(cè)定兩個(gè)卵巢的重量。用ICN-IRMAFSH免疫檢測(cè)法確定出血清中的FSH和抑制素B的水平。在對(duì)卵巢進(jìn)行勻漿化之后，用CT17j3雌二醇試劑盒(ICNPharmaceuticals,Inc.)確定出卵巢內(nèi)的雌二醇含量。先前已經(jīng)顯示卵巢重量的增加與所注射的FSH劑量有關(guān)(StedmanandPohley，1953)。FSH剌激卵泡生長(zhǎng)(顆粒細(xì)胞增殖、充血、雌二醇和抑制素B生成)。觀察到了在用相應(yīng)劑量的TR-4402和Follistim刺激之后的卵巢重量(圖14A、C和D)、卵巢內(nèi)雌二醇含量(圖15)和血清抑制素B水平(圖16)的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。觀察到了TR-4402在卵巢腫瘤、抑制素和雌二醇產(chǎn)量方面優(yōu)于野生型FSH的優(yōu)點(diǎn)，盡管在每個(gè)試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，仍保留在血清中的TR-4402水平比Follistim低40-50%。因?yàn)閲X動(dòng)物的研究常常被認(rèn)為是FSH制劑在人體中的臨床療效的好的指示物，因此預(yù)計(jì)TR-4402在治療人類患者方面應(yīng)當(dāng)能顯示出相當(dāng)多的優(yōu)于Follistim的優(yōu)點(diǎn)。此外，具有更快清除率的超活性FSH(例如TR-4402)在IVF方案的第二階段應(yīng)當(dāng)會(huì)有直接的應(yīng)用，并造成卵巢過(guò)度刺激綜合征(OHSS)發(fā)生率的降低。實(shí)施例4:比較FSH類似物與野生型FSH的體外受精、胚胎發(fā)育、和活產(chǎn)的研究。在試驗(yàn)的第1天，23天大的B6D2F1雌鼠(5組)接受皮下注射10IUTR-4402、10IUTR-4901、10IU野生型FSH(Follistim)、或20IU野生型FSH(Follistim)。作為對(duì)照，給至少一只動(dòng)物腹腔內(nèi)注射施用排卵劑量的hCG。在FSH注射后72個(gè)小時(shí)之后，收集精子和卵母細(xì)胞，并發(fā)生受精。從年齡大于2個(gè)月的雄性B6D2和CB6F1鼠中收集到精子。通過(guò)頸脫位法處死雄鼠。在下腹部位置打開(kāi)一個(gè)切口，切下附睪和輸精管，并將其放置于精子盤內(nèi)。切割附睪和輸精管3到5次，將精子從器官內(nèi)輕輕地?cái)D壓到精子盤內(nèi)。將含有精子的精子盤放置在37t:和5。/。C02的孵育箱內(nèi)，并容許催熟30到90分鐘。通過(guò)處死雌鼠并切割下輸卵管，從接受TR-4401、TR-4901或野生型FSH(Follistim)的超排卵的雌鼠中收集到卵母細(xì)胞。將輸卵管放置在一滴HTF培養(yǎng)基內(nèi)，并撕裂a(bǔ)mpulae以便釋放出eggclutches。將完整的eggdutches轉(zhuǎn)移到受精盤內(nèi)并計(jì)數(shù)。表2提供了每組5只動(dòng)物的卵母細(xì)胞的數(shù)目:10IU劑量的FSH類似物TR-4401和TR-4901比10IU和20IU劑量的重組野生型FSH(Follistem)生成了更多的卵母細(xì)胞。在將卵母細(xì)胞放置到受精盤內(nèi)之后，往每個(gè)受精盤內(nèi)加入一部分精子(lxlOlU2xl()S個(gè)精子/ml)。將受精盤放置在37匸和5%C02的孵育箱內(nèi)最少4個(gè)小時(shí)，以便容許發(fā)生受精。在孵育4個(gè)小時(shí)之后，將受精過(guò)的卵從受精盤中轉(zhuǎn)移到洗滌盤內(nèi)，其中它們?cè)?50]LiLHTF培養(yǎng)基滴中洗滌至少2次，以去除碎片。將盤中HTF滴中的卵母細(xì)胞在37。C和5%C02的孵育箱內(nèi)儲(chǔ)存過(guò)夜。受精后24個(gè)小時(shí)，從孵育箱中取出細(xì)胞。計(jì)數(shù)雙細(xì)胞胚胎(表2，題為"雙細(xì)胞胚胎的數(shù)目"的列)，并用發(fā)育成雙細(xì)胞胚胎的卵母細(xì)胞的百分比計(jì)算出受精率(表2，題為"％雙細(xì)胞胚胎"的列)。在經(jīng)FSH類似物TR-4401和TR-4901所處理過(guò)的小鼠組中所生成的雙細(xì)胞胚胎的數(shù)目更多。所有組(FSH類似物和重組野生型FSH)中的受精率都是高的。隨后將雙細(xì)胞胚胎轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿內(nèi)進(jìn)行進(jìn)一步的發(fā)育(表2，題為"培養(yǎng)中剩余的雙細(xì)胞胚胎的數(shù)目"的列)或?qū)⑵渲踩氲郊僭械拇剖髢?nèi)(表2，題為"所轉(zhuǎn)移的雙細(xì)胞胚胎的數(shù)目"的列)。在受精后的第4天，觀察到了仍剩余在培養(yǎng)皿中的胚胎出現(xiàn)了胚泡形成。在表2的題為"發(fā)育胚泡的數(shù)目"的列中提供了發(fā)育胚泡的數(shù)目。表2提供了胚泡的總數(shù)和孵化胚泡的數(shù)目。被植入用于受精的雙細(xì)胞胚胎被植入到6和8周大之間的CD1雌鼠內(nèi)。每個(gè)測(cè)試組的3只小鼠內(nèi)都被植入了60個(gè)雙細(xì)胞胚胎，除了在TR-4401組中被植入到40個(gè)雙細(xì)胞胚胎。通過(guò)腹腔內(nèi)注射氯胺酮/zylazine溶液麻醉小鼠。一旦被麻醉后，給每只小鼠備皮，并在肋架尾部以及在腹部到背部的側(cè)面的頭l/3處打開(kāi)小的切口(0.5cm)。在體壁上打開(kāi)另一個(gè)切口，以便提供到達(dá)腹腔的通路。用鑷子夾住卵巢脂肪墊并輕輕地將卵巢、輸卵管、和子宮的近端經(jīng)體壁拉到體外。將卵巢和輸卵管放置到棉花拭子上，使得卵巢-輸卵管連接處產(chǎn)生一個(gè)角度。在立體顯微鏡下鑒定出漏斗，并用超細(xì)鑷子在粘液囊上打開(kāi)一個(gè)桐。通過(guò)往漏斗內(nèi)滴入最小體積的含有胚胎的M2培養(yǎng)基，以轉(zhuǎn)移胚胎。然后將器官?gòu)?fù)位到體壁內(nèi)，并用一針或兩針縫線縫合。用一個(gè)或兩個(gè)閉合夾關(guān)閉皮膚切口。每日觀察小鼠。在10天之后，檢測(cè)受體鼠的妊娠情況。表2中的題為"雙細(xì)胞胚胎轉(zhuǎn)移的妊娠"的列提供了每個(gè)測(cè)試組的所形成的妊娠的數(shù)目。FSH類似物TR-4901生成了最多的妊娠。利用分娩作為終點(diǎn)，進(jìn)行了比較TR-4401與重組野生型FSH的相似試驗(yàn)。給雌鼠(3只小鼠/組)注射1IUhCG以及3IU妊娠母馬血清促性腺激素(PMSG)(作為對(duì)照)、1IU野生型FSH(GonalF)、3IU野生型FSH(GonalF)、1IUTR-4401、或3IUTR-4401。在48個(gè)小時(shí)之后，給小鼠注射排卵劑量的5IUhCG。在注射排卵劑量24個(gè)小時(shí)之后，計(jì)數(shù)卵母細(xì)胞并如前所述的容許發(fā)生體外受精。隨后，將20個(gè)雙細(xì)胞胚胎植入到假孕母體內(nèi)。表3提供了該試驗(yàn)的結(jié)果。接受1IU或3IUTR-4401的測(cè)試組比對(duì)照組以及經(jīng)重組野生型FSH治療的測(cè)試組獲得了更高的卵母細(xì)胞計(jì)數(shù)，更高的胚泡發(fā)育率、以及更高的分娩率。表2:比較TR-4401和TR-4901與重組野生型FSH(Follistim)的體外受精及胚胎轉(zhuǎn)移的試驗(yàn)。<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>實(shí)施例5:來(lái)自經(jīng)TR-4401FSH類似物和重組野生型FSH(GonalF)治療的小鼠的卵母細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量的比較如表4所示的，在用對(duì)照或不同劑量的野生型FSH或FSH類似物TR-4401體內(nèi)治療治療之后，定量和定性地評(píng)價(jià)來(lái)自B6CBAF1小鼠的卵母細(xì)胞。根據(jù)先前所述的方案，體外受精發(fā)生在第l天(處理后72個(gè)小時(shí))。表4:治療組(3只小鼠/組)<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>發(fā)現(xiàn)TR-4401的處理顯著地增加了所產(chǎn)的卵母細(xì)胞的數(shù)目。圖21提供了在精子洗滌時(shí)的每組中的卵母細(xì)胞的總數(shù)(在體外受精前即刻)。圖顯示了所有劑量的TR-4401(0.5IU、1IU和3IU)都比經(jīng)重組野生型卵泡剌激素處理過(guò)的測(cè)試組生成了更多的卵母細(xì)胞。TR-4401的處理增加了體外受精所生成的胚胎的總數(shù)。圖24提供了每組中的雙細(xì)胞胚胎的總數(shù)。圖顯示了所有劑量的TR-4401(0.5IU、1IU和3IU)都比經(jīng)重組野生型FSH處理過(guò)的測(cè)試組生成了更多的雙細(xì)胞胚胎。在相似的試驗(yàn)中，測(cè)試組接受了聯(lián)合1IUhCG的3個(gè)劑量的0.5IU、1IU或3IUTR-4401或重組野生型FSH(GonalF)。對(duì)照組接受了3個(gè)劑量的lIUhCG。在第3天，所有組都接受了一個(gè)排卵劑量的15IUhCG。如前所述的，在小鼠中進(jìn)行體外受精。圖22顯示經(jīng)所有劑量(3x(0.5、1、3IU)+1IUhCG)的TR-4401FSH類似物處理過(guò)的小鼠比經(jīng)重組野生型FSH(GonalF)或?qū)φ仗幚磉^(guò)的小鼠表現(xiàn)出了更高的受精率。此外，來(lái)自經(jīng)最小劑量TR-4401(3x0.5TR-4401+1IUhCG)處理過(guò)的小鼠的卵母細(xì)胞比來(lái)自更高劑量TR-4401處理過(guò)的小鼠的那些卵母細(xì)胞表現(xiàn)出了更高的受精率。圖23顯示來(lái)自經(jīng)TR-4401FSH類似物(所有劑量)處理過(guò)的小鼠的胚胎比來(lái)自經(jīng)重組野生型FSH處理過(guò)的測(cè)試組的胚胎表現(xiàn)出更高的胚泡形成率。來(lái)自經(jīng)最小劑量TR-4401(3c0.5TR-4401+lIUhCG)處理過(guò)的小鼠的胚胎比來(lái)自更高劑量TR-4401處理過(guò)的小鼠的胚胎表現(xiàn)出了更高的胚泡形成率。實(shí)施例6:FSH類似物的藥物動(dòng)力學(xué)比較進(jìn)行藥物動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)確定出與野生型FSH相比較的FSH類似物TR-4401、TR-4402和TR-401的吸收率和排出率。進(jìn)行FSH清除檢測(cè)法確定出與重組野生型FSH相比較的在一定時(shí)間內(nèi)的TR-4401、TR-4402和TR-4901的血清FSH的量(IU/ml)。圖17A提供了檢測(cè)的結(jié)果。圖顯示了FSH類似物TR-4401的清除比TR-4402和TR-4901有所延遲。FSH類似物TR-4402比其他的類似物表現(xiàn)出更短的作用持續(xù)時(shí)間。相似地，圖17B顯示了與重組野生型FSH相比較的FSH類似物TR-4401、TR-4402和TR-4901的排出率(一定時(shí)間內(nèi)的血清FSHmIU/ml)。TR-4402比其他類似物和重組野生型FSH(Follistim)被排出的更快。表5提供了藥物動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)的數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)確認(rèn)了FSH類似物TR-4402的排出率(Ke)和吸收率(Ka)是最高的。和預(yù)期的一樣，與其他的類似物和重組野生型FSH相比較，TR-4402的血清半衰期(Tl/2)是最低的。表5:FSH類似物TR-4901、TR-4401、和TR-4402和重組野生型FSH(Follistem)的藥物動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。_<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>藥物動(dòng)力學(xué)對(duì)于患者對(duì)FSH類似物的應(yīng)答有著顯著的影響。對(duì)過(guò)度刺激綜合征高危的高敏患者可能從FSH類似物例如TR-4402中獲益，因?yàn)樗绕渌念愃莆镒饔玫酶煲约案痰某掷m(xù)時(shí)間。其他患者將可能從FSH類似物例如TR-4401中獲益，因?yàn)樗C實(shí)具有延長(zhǎng)的藥物動(dòng)力學(xué)作用。進(jìn)行了其他的藥物動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)比較TR-4401和重組野生型FSH(GonalF)。在一個(gè)實(shí)施方式中，給小鼠注射單一劑量的重組野生型FSH或TR-4401。在注射后68個(gè)小時(shí)(尸解時(shí))確定出末梢血水平。TR4401的末梢血FSH值比重組野生型FSH高出5到6倍。表6提供了劑量和末梢血FSH數(shù)據(jù)。表6:FSH的末梢血FSH數(shù)據(jù)。<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>實(shí)施例7:增加FSH類似物的血清半衰期的修飾如前所述的用N末端延伸進(jìn)一步地修飾的FSH類似物TR-4402，以增強(qiáng)血清半衰期。圖18提供了可以增強(qiáng)FSH類似物的血清半衰期的進(jìn)一步修飾實(shí)例。實(shí)施利用CHO細(xì)胞的體外cAMP刺激研究，以比較N末端修飾TR-4402(LAl-4402)、"野生型"N末端修飾的FSH(LA1-Wt)、TR-4402和重組野生型FSH(Follistem)。圖19顯示修飾延長(zhǎng)了FSH類似物TR-4402和重組野生型FSH的FSH血清半衰期。在雜交B6D2F1小鼠中進(jìn)行體內(nèi)排卵檢測(cè)，以標(biāo)記N末端修飾TR-4402和重組野生型FSH。經(jīng)0.5IU、l.OIU、2.5IU、5扁、和10IU劑量的N末端修飾TR-4402處理過(guò)的小鼠比經(jīng)重組野生型FSH或hCG(對(duì)照)處理過(guò)的那些小鼠生成了更多的卵母細(xì)胞。圖20顯示了試驗(yàn)的結(jié)果。通過(guò)引用將在本申請(qǐng)中所討論過(guò)的所有文獻(xiàn)、專利和專利申請(qǐng)一同并入本申請(qǐng)。雖然在前面的說(shuō)明書(shū)中，已經(jīng)根據(jù)某些優(yōu)選的實(shí)施方式描述了本發(fā)明，并且為了舉例說(shuō)明的目的已經(jīng)設(shè)定了許多細(xì)節(jié)，但是顯而易見(jiàn)的是，本領(lǐng)域人員明白本發(fā)明還將包括其他的實(shí)施方式，以及與在此所述的某些細(xì)節(jié)可以有著相當(dāng)?shù)牟煌灰鼈儾幻撾x本發(fā)明的基本原則。權(quán)利要求1.一種修飾的卵泡刺激素(FSH)，其含有不同于野生型FSH的氨基酸序列，所述修飾的FSH包括修飾的α亞基，其中所述修飾的FSH的效力比野生型FSH增加至少約10倍。2.權(quán)利要求1的修飾的FSH，其中所述修飾的FSH的效力比野生型FSH增加至少約30倍。3.權(quán)利要求1的修飾的FSH，其中所述修飾的糖蛋白激素的效力比野生型FSH增加至少約50倍。4.權(quán)利要求1的修飾的FSH，其中所述修飾的FSH選自人、牛、馬、豬、羊、鼠、靈長(zhǎng)類、魚(yú)等的FSH。5.權(quán)利要求4的修飾的FSH，其中所述修飾的FSH是人FSH。6.權(quán)利要求5的修飾的FSH，其中所述修飾的a亞基在對(duì)應(yīng)于SEQIDNo.1的位點(diǎn)13、14、16、17、20、21、22、66、68、73、74和81的位點(diǎn)上包括至少兩個(gè)堿性氨基酸。7.權(quán)利要求6的修飾的FSH，其中所述a亞基的堿性氨基酸位于位點(diǎn)14和66。8.權(quán)利要求7的修飾的FSH，其中所述堿性氨基酸是E14R和N66R。9.權(quán)利要求6的修飾的FSH，其中所述a亞基的堿性氨基酸位于位點(diǎn)14和73。10.權(quán)利要求9的修飾的FSH,其中所述堿性氨基酸是E14R和G73R。11.權(quán)利要求6的修飾的FSH，其中所述a亞基的堿性氨基酸位于位點(diǎn)16和20。12.權(quán)利要求11的修飾的FSH，其中所述堿性氨基酸是P16R和Q20R。13.權(quán)利要求6的修飾的FSH，其中所述a亞基的堿性氨基酸位于位點(diǎn)20和21。14.權(quán)利要求13的修飾的FSH，其中所述堿性氨基酸是Q20R和P21R。15.權(quán)利要求6的修飾的FSH，所述a亞基在選自位點(diǎn)13、14、16、17、20、21、22、66、68、73、74和81中的一個(gè)位點(diǎn)上還包括第三個(gè)堿性氨基酸。16.權(quán)利要求15的修飾的FSH，其中所述a亞基的堿性氨基酸位于位點(diǎn)16、20和21。17.權(quán)利要求16的修飾的FSH，其中所述堿性氨基酸是P16R、Q20R禾口P21R。18.權(quán)利要求15的修飾的FSH，其中所述a亞基的堿性氨基酸位于位點(diǎn)14、20和73。19.權(quán)利要求18的修飾的FSH，其中所述堿性氨基酸是E14R、Q20R和G73R。20.權(quán)利要求15的修飾的FSH，其中所述a亞基的堿性氨基酸位于位點(diǎn)66、73和81。21.權(quán)利要求20的修飾的FSH，其中所述堿性氨基酸是N66K、G73K禾CIA81K。22.權(quán)利要求15的修飾的FSH，其中所述a亞基的堿性氨基酸位于位點(diǎn)14、66和73。23.權(quán)利要求22的修飾的FSH，其中所述堿性氨基酸是E14R、N66R和G73R。24.權(quán)利要求15的修飾的FSH，其中所述a亞基的堿性氨基酸位于位點(diǎn)14、21和73。25.權(quán)利要求24的修飾的FSH,其中所述堿性氨基酸是E14R、P21R禾口G73R。26.權(quán)利要求15的修飾的FSH，所述a亞基在選自位點(diǎn)13、14、16、17、20、21、22、66、68、73、74和81中的一個(gè)位點(diǎn)上還包括第四個(gè)堿性氨基酸。27.權(quán)利要求26的修飾的FSH，其中所述a亞基的堿性氨基酸位于位點(diǎn)13、14、16和20。28.權(quán)利要求27的修飾的FSH，其中所述堿性氨基酸是Q13R、E14R、P16R和Q20R。29.權(quán)利要求28的修飾的FSH，其中所述堿性氨基酸是Q13K、E14K、P16K和Q20K。30.權(quán)利要求26的修飾的FSH，所述a亞基在選自位點(diǎn)13、14、16、17、20、21、22、66、68、73、74和81中的一個(gè)位點(diǎn)上還包括第五個(gè)堿性氨基酸。31.權(quán)利要求30的修飾的FSH，其中所述a亞基的堿性氨基酸位于位點(diǎn)14、20、21、66和73。32.權(quán)利要求31的修飾的FSH，其中所述堿性氨基酸是E14R、Q20R、P21R、畫(huà)R和G73R。33.權(quán)利要求30的修飾的FSH，其中所述a亞基的堿性氨基酸位于位點(diǎn)14、16、20、66和73。34.權(quán)利要求33的修飾的FSH，其中所述堿性氨基酸是E14R、P16R、Q20R、N66R禾QG73R。35.權(quán)利要求30的修飾的FSH，所述a亞基在選自位點(diǎn)13、14、16、17、20、21、22、66、68、73、74和81中的一個(gè)位點(diǎn)上還包括第六個(gè)堿性氨基酸。36.權(quán)利要求35的修飾的FSH，其中所述a亞基的堿性氨基酸位于位點(diǎn)13、14、16、20、66和73。37.權(quán)利要求36的修飾的FSH，其中所述堿性氨基酸是Q13K、E14K、P16K、Q20K、N66K和G73K。38.權(quán)利要求35的修飾的FSH，其中所述a亞基的堿性氨基酸位于位點(diǎn)14、16、20、21、66和73。39.權(quán)利要求36的修飾的FSH，其中所述堿性氨基酸是E14R、P16R、Q20R、P21R、N66R禾卩G73R。40.權(quán)利要求6的修飾的FSH，其中所述堿性氨基酸選自賴氨酸和41.權(quán)利要求1的修飾的FSH，還包括修飾的(3亞基。42.權(quán)利要求41的修飾的FSH，其中所述修飾的P亞基在對(duì)應(yīng)于SEQIDNo.2的位點(diǎn)2、4、14、63、64、67和69的位點(diǎn)上包括至少一個(gè)堿性氨基酸。43.權(quán)利要求42的修飾的FSH，其中所述堿性氨基酸是E4R。44.一種核酸，其編碼權(quán)利要求l的修飾的FSHa亞基。45.—種載體，其包括權(quán)利要求44的核酸，其中所述載體適合于表達(dá)所述核酸。46.—種宿主細(xì)胞，其包括權(quán)利要求45的載體，其中所述宿主細(xì)胞適合于表達(dá)所述核酸。47.權(quán)利要求6的修飾的FSH，其中所述修飾的FSH在所述a亞基的不同于位點(diǎn)13、14、16、17、20、21、22、66、68、73、74和81的位點(diǎn)上具有少于5個(gè)的氨基酸取代。48.權(quán)利要求6的修飾的FSH，其中所述修飾的FSH在所述oc亞基的不同于位點(diǎn)13、14、16、17、20、21、22、66、68、73、74和81的位點(diǎn)上具有少于4個(gè)的氮基酸取代。49.權(quán)利要求6的修飾的FSH，其中所述修飾的FSH在所述a亞基的不同于位點(diǎn)13、14、16、17、20、21、22、66、68、73、74和81的位點(diǎn)上具有少于3個(gè)的氨基酸取代。50.權(quán)利要求6的修飾的FSH，其中所述修飾的FSH在所述a亞基的不同于位點(diǎn)13、14、16、17、20、21、22、66、68、73、74和81的位點(diǎn)上具有少于2個(gè)的氨基酸取代。51.權(quán)利要求6的修飾的FSH，其中所述修飾的FSH在所述cc亞基的不同于位點(diǎn)13、14、16、17、20、21、22、66、68、73、74和81的位點(diǎn)上具有與相應(yīng)野生型FSH完全相同的氨基酸序列。52.權(quán)利要求1的修飾的FSH，其血漿半衰期與野生型FSH相比是增加的。53.權(quán)利要求52的修飾的FSH，其中所述修飾的FSH還包括至少一個(gè)具有潛在的糖基化位點(diǎn)的序列，所述序列選自包括N-糖基化位點(diǎn)的序列和包括O-糖基化位點(diǎn)的序列。54.權(quán)利要求53的修飾的FSH，其中所述至少一個(gè)具有潛在的糖基化識(shí)別位點(diǎn)的序列是所述a鏈上的N末端延伸。55.權(quán)利要求54的修飾的FSH，其中所述N末端延伸選自ANITV(SEQIDNo.3)和ANIT糧TV(SEQIDNo.4)。56.權(quán)利要求53的修飾的FSH，其中所述至少一個(gè)具有潛在的糖基化識(shí)別位點(diǎn)的序列是所述(3鏈中的取代。57.權(quán)利要求56的修飾的FSH，其中所述取代選自Y58N和V78N。58.權(quán)利要求52的修飾的FSH，其中所述修飾的FSH是聚乙二醇化的。59.權(quán)利要求52的修飾的FSH，其中所述修飾的FSH被改變以增加分子內(nèi)帶負(fù)電荷殘基的數(shù)目，以增加血漿半衰期。60.權(quán)利要求59的方法，其中所述帶負(fù)電荷殘基選自谷氮酸和天冬氨酸。61.權(quán)利要求60的修飾的FSH，其中所述改變選自a亞基取代A85E禾口A85D。62.權(quán)利要求59的修飾的FSH，其中所述改變是在所述修飾的FSH中插入含有一個(gè)或多個(gè)帶負(fù)電荷殘基的氨基酸序列。63.權(quán)利要求62的修飾的FSH，其中所述插入選自GEFT(SEQIDNo.5)和GEFTT(SEQIDNo.6)。64.權(quán)利要求63的修飾的FSH，其中所述插入位于a亞基內(nèi)。65.權(quán)利要求64的修飾的FSH，其中所述插入伴有一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失。66.權(quán)利要求64的修飾的FSH，其中所述插入選自APD-GEFT-VQDC(SEQIDNo.7)和APD畫(huà)GEFTT陽(yáng)QDC(SEQIDNo.8)。67.—種輔助對(duì)象生殖的方法，其包括施用輔助量的權(quán)利要求1的修飾的FSH。68.—種診斷和/或治療與患者體內(nèi)的糖蛋白激素活性相關(guān)的病變的方法，其包括給患者施用有效量的權(quán)利要求1的修飾的FSH。69.權(quán)利要求68的方法，其中所述病變是排卵功能障礙。70.權(quán)利要求68的方法，其中所述病變是黃體期缺陷。71.權(quán)利要求68的方法，其中所述病變是原因不明的不育癥。72.權(quán)利要求68的方法，其中所述病變是男性因素不育癥。73.權(quán)利要求68的方法，其中所述病變是限時(shí)受孕。74.權(quán)利要求68的方法，其中患者表現(xiàn)為生長(zhǎng)卵泡中的FSH受體低表達(dá)。75.權(quán)利要求68的方法，其中患者表現(xiàn)為FSH受體低敏感性。76.權(quán)利要求68的方法，其中患者表現(xiàn)為FSH受體結(jié)合缺陷。77.權(quán)利要求68的方法，其中患者表現(xiàn)為FSH受體偶合缺陷。78.權(quán)利要求68的方法，其中患者表現(xiàn)為男性型脫發(fā)癥。79.權(quán)利要求68的方法，其中患者表現(xiàn)為睪酮產(chǎn)生水平不足。80.權(quán)利要求68的方法，其中患者表現(xiàn)為垂體衰竭或損傷。81.權(quán)利要求68的方法，其中所述病變是卵巢癌。82.權(quán)利要求68的方法，其中所述病變是睪丸癌。83.減輕進(jìn)行輔助生殖治療的患者的過(guò)度刺激綜合征的方法，其包括(a)施用輔助量的權(quán)利要求1的第一種修飾的FSH，其中所述第一種修飾的FSH的血漿半衰期比野生型FSH的半衰期長(zhǎng)；和(b)隨后施用輔助量的權(quán)利要求1的第二種修飾的FSH，其中所述第二種修飾的FSH的血漿半衰期比所述第一種修飾的FSH的半衰期短，其中與在輔助生殖治療期間僅僅給患者施用所述第一種修飾的FSH相比，卵巢過(guò)度刺激得以減輕。84.提高動(dòng)物體內(nèi)的卵母細(xì)胞的質(zhì)量的方法，其包括給所述動(dòng)物施用有效量的超活性卵泡刺激素，其中所述超活性卵泡剌激素含有a亞基，所述a亞基在選自位點(diǎn)13、14、16和20中的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)上具有堿性氨基酸。85.權(quán)利要求84的方法，其中所述卵母細(xì)胞的質(zhì)量提高的特征是與接受相同量的重組野生型FSH的相似動(dòng)物相比較，所述動(dòng)物體內(nèi)的卵母細(xì)胞的受精率提高。86.權(quán)利要求85的方法，其中以對(duì)于卵母細(xì)胞數(shù)目而言的最大有效劑量施用所述超活性卵泡刺激素使得受精卵母細(xì)胞率增加了至少約10%。87.權(quán)利要求84的方法，其中所述卵母細(xì)胞的質(zhì)量提高的特征是與接受相同量的重組野生型FSH的類似動(dòng)物相比較，所述動(dòng)物體內(nèi)的每個(gè)受精卵母細(xì)胞的胚泡形成率提高。88.權(quán)利要求87的方法，其中以對(duì)于卵母細(xì)胞數(shù)目而言的最大有效劑量施用所述超活性卵泡剌激素使得胚泡形成率增加了至少約io%。89.權(quán)利要求84的方法，其中所述卵母細(xì)胞的質(zhì)量提高的特征是與接受相同量的重組野生型FSH的類似動(dòng)物相比較，動(dòng)物體內(nèi)的每個(gè)受精卵母細(xì)胞的胚胎總數(shù)提高。90.權(quán)利要求89的方法，其中以對(duì)于卵母細(xì)胞數(shù)目而言的最大有效劑量施用所述超活性卵泡刺激素使得每個(gè)受精卵母細(xì)胞的胚胎總數(shù)增加了至少約10%。91.權(quán)利要求84的方法，其中a亞基的堿性氨基酸是精氨酸、賴氨酸、組氨酸、或其修飾物。92.權(quán)利要求84的方法，其中a亞基的堿性氨基酸在中性pH值條件下帶正電荷。93.權(quán)利要求84的方法，其中所述超活性FSH在位點(diǎn)13、14、16和20上含有精氨酸。94.權(quán)利要求84的方法，其中所述超活性卵泡剌激素在位點(diǎn)13、14、16和20上含有賴氨酸。95.權(quán)利要求84的方法，其中oc亞基含有延長(zhǎng)半衰期的修飾。96.權(quán)利要求95的方法，其中延長(zhǎng)半衰期的修飾是ANITV延伸。97.權(quán)利要求84的方法，其中所述超活性卵泡刺激素是人類超活性卵泡剌激素。98.權(quán)利要求84的方法，其中動(dòng)物選自人、小鼠、大鼠、靈長(zhǎng)類、兔、豬、牛、馬、羊和狗。99.權(quán)利要求84的方法，其中經(jīng)注射或攝取而施用所述超活性卵泡刺激素。100.權(quán)利要求84的方法，還包括施用hCG。101.權(quán)利要求84的方法，其中所述超活性卵泡刺激素含有野生型a亞基。102.權(quán)利要求84的方法，其中所述超活性卵泡刺激素含有在位點(diǎn)4上具有堿性氨基酸的a亞基。103.權(quán)利要求102的方法，其中所述堿性氨基酸是精氨酸、賴氨酸、組氨酸、或其修飾物。104.—種誘導(dǎo)動(dòng)物體內(nèi)的超排卵的方法，其包括給所述動(dòng)物施用有效量的超活性卵泡刺激素，其中所述超活性卵泡刺激素含有a亞基，所述a亞基在選自位點(diǎn)13、14、16、和20中的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)上具有堿性氨基酸。105.權(quán)利要求104的方法，其中超排卵的特征是與接受相同量的重組野生型FSH的類似動(dòng)物相比較卵母細(xì)胞數(shù)目增加。106.權(quán)利要求105的方法，其中以對(duì)于卵母細(xì)胞數(shù)目而言的最大有效劑量施用所述超活性卵泡剌激素使得平均卵母細(xì)胞數(shù)目增加至少約10%。107.權(quán)利要求104的方法，其中a亞基的堿性氨基酸是精氨酸、賴氨酸、組氨酸、或其修飾物。108.權(quán)利要求104的方法，其中a亞基中的堿性氨基酸在中性pH值條件下帶正電荷。109.權(quán)利要求104的方法，其中所述超活性FSH在位點(diǎn)13、14、16、和20上含有精氨酸。110.權(quán)利要求104的方法，其中所述超活性卵泡刺激素在位點(diǎn)13、14、16、和20上含有賴氨酸。111.權(quán)利要求104的方法，其中a亞基含有延長(zhǎng)半衰期的修飾。112.權(quán)利要求111的方法，其中延長(zhǎng)半衰期的修飾是ANITV(SEQIDNo.3)延伸。113.權(quán)利要求104的方法，其中所述超活性卵泡刺激素是人類超活性卵泡刺激素。114.權(quán)利要求104的方法，其中動(dòng)物選自人、小鼠、大鼠、靈長(zhǎng)類、兔、豬、牛、馬、羊和狗。115.權(quán)利要求104的方法，其中經(jīng)注射或攝取而施用超活性卵泡剌激素。116.權(quán)利要求104的方法，還包括施用hCG。117.權(quán)利要求104的方法，其中所述超活性卵泡刺激素含有野生型a亞基。118.權(quán)利要求104的方法，其中所述超活性卵泡刺激素含有在位點(diǎn)4上具有喊性氨基酸的a亞基。119.權(quán)利要求118的方法，其中堿性氨基酸是精氨酸、賴氨酸、組氨酸、或其修飾物。120.增強(qiáng)體外受精的方法，其包括給所述動(dòng)物施用有效量的超活性卵泡刺激素，其中所述超活性卵泡剌激素含有a亞基，所述a亞基在選自位點(diǎn)13、14、16、和20中的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)上具有堿性氨基酸。121.權(quán)利要求120的方法，其中a亞基的堿性氨基酸是精氨酸、賴氨酸、組氨酸、或其修飾物。122.權(quán)利要求120的方法，其中a亞基中的堿性氨基酸在中性pH值條件下帶正電荷。123.權(quán)利要求120的方法，其中所述超活性FSH在位點(diǎn)13、14、16、和20上含有精氨酸。124.權(quán)利要求120的方法，其中所述超活性卵泡剌激素在位點(diǎn)13、14、16、和20上含有賴氨酸。125.權(quán)利要求120的方法，其中a亞基含有延長(zhǎng)半衰期的修飾。126.權(quán)利要求125的方法，其中延長(zhǎng)半衰期的修飾是ANITV(SEQIDNo.3)延伸。127.權(quán)利要求120的方法，其中所述超活性卵泡刺激素是人類超活性卵泡刺激素。128.權(quán)利要求120的方法，其中動(dòng)物選自人、小鼠、大鼠、靈長(zhǎng)類、兔、豬、牛、馬、羊和狗。129.權(quán)利要求120的方法，其中經(jīng)注射或攝取而施用超活性卵泡刺激素。130.權(quán)利要求120的方法，還包括施用hCG。131.權(quán)利要求120的方法，其中所述超活性卵泡剌激素含有野生型a亞基。132.權(quán)利要求120的方法，其中所述超活性卵泡剌激素含有在位點(diǎn)4上具有堿性氨基酸的a亞基。133.權(quán)利要求132的方法，其中堿性氨基酸是精氨酸、賴氨酸、組氨酸、或其修飾物。134.權(quán)利要求1的修飾的FSH，其中與野生型FSH相比較，其血漿半衰期是降低的。135.權(quán)利要求1的修飾的FSH，其中與野生型FSH相比較，其吸收減少。136.權(quán)利要求1的修飾的FSH，其中與野生型FSH相比較，其吸收增加。137.權(quán)利要求1的修飾的FSH，其中與野生型FSH相比較，其與FSH受體的結(jié)合親和力增加。全文摘要本發(fā)明提供了在體外和體內(nèi)具有比野生型FSH更高的生物學(xué)活性的FSH的超活性類似物。具體地，本發(fā)明的類似物具有比野生型蛋白至少高10倍的效力或者至少高10％的最大功效。所述類似物特別適合于治療具有FSH受體低表達(dá)或FSH受體弱應(yīng)答性的對(duì)象，并適合于治療任何與糖蛋白激素活性相關(guān)的病變。文檔編號(hào)C07K14/575GK101189259SQ200580015850公開(kāi)日2008年5月28日申請(qǐng)日期2005年3月18日優(yōu)先權(quán)日2004年3月19日發(fā)明者布魯斯·D.·溫特勞布,馬里烏茲·W.·斯茲庫(kù)德林斯基申請(qǐng)人:特羅弗根公司