專利名稱：衍生自人bplp蛋白的肽、編碼所述肽的多核苷酸和針對(duì)所述肽的抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及BPLP蛋白所衍生的作為新的金屬外肽酶抑制劑的肽。本發(fā)明也涉及編碼所述肽的多核苷酸以及涉及針對(duì)所述肽的抗體。此外，本發(fā)明涉及人BPLP蛋白、其所衍生的肽及其模擬物、編碼人BPLP蛋白或其所衍生的肽的多核苷酸以及針對(duì)BPLP蛋白或其所衍生的肽的抗體的診斷性和治療性的用途。
在基因組研究中，已經(jīng)鑒定出了一種主要在成熟大鼠的頜下腺(SMG)和前列腺中表達(dá)的受雄激素調(diào)節(jié)的基因(Rosinski-Chupin等，1988和歐洲專利0394 424)?；蚓幋a前體蛋白頜下腺大鼠1蛋白(submandibular rat1protein，SMR1)，其生成了三種結(jié)構(gòu)上相關(guān)的肽，通過(guò)與成對(duì)堿性氨基酸轉(zhuǎn)化酶(pairedbasic amino acid-converting enzyme)對(duì)前體蛋白中的多個(gè)堿性位點(diǎn)的裂解可以在體內(nèi)選擇性地生成所述肽(Rougeot等，1994)。
在后基因組和生命組學(xué)的研究中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了為哺乳動(dòng)物體內(nèi)存在進(jìn)行細(xì)胞間聯(lián)絡(luò)的激素信使(即從SMR1前激素原所生成的最終的成熟肽，現(xiàn)在稱作為Sialorphin(序列QHNPR))提供證據(jù)的分子及功能基礎(chǔ)。因此，在雄鼠中，Sialorphin是一種外分泌的和內(nèi)分泌的肽信號(hào)，它的表達(dá)受活化作用的雄激素的調(diào)控，并且其的分泌是受應(yīng)答于環(huán)境應(yīng)激的雄激素介導(dǎo)的應(yīng)答所誘發(fā)的(Rougeot等，1997)。
在性成熟的雄鼠中，事實(shí)是應(yīng)答于環(huán)境急性應(yīng)激而急性地分泌受雄激素調(diào)節(jié)的Sialorphin，這就形成了一種假說(shuō)，即該信號(hào)傳導(dǎo)介質(zhì)可能在一些與生殖有關(guān)的生理和行為整合中起到了一定的作用。因此，相同的作者研究了Sialorphin在雄性性行為模式方面所誘導(dǎo)的影響，其包括發(fā)動(dòng)交配、插入和射精的頻率及潛伏期、以及社會(huì)-性(socio-sexual)的交互作用。所獲得的數(shù)據(jù)顯示Sialorphin具有在與生理循環(huán)水平相關(guān)的劑量上調(diào)控雄鼠的交配模式的能力，即以劑量依賴性模式實(shí)現(xiàn)了對(duì)性行為的雙重的促進(jìn)/抑制作用，雖然在所有的劑量上都能刺激表觀的性喚醒或沖動(dòng)。因此，提出了受內(nèi)源性雄激素調(diào)節(jié)的Sialorphin有助于調(diào)控作用于適當(dāng)?shù)男凼笮詰?yīng)答的刺激和抑制機(jī)制之間的平衡，這依據(jù)于背景情況。
國(guó)際專利申請(qǐng)WO 01/00221描述了SMR1的成熟產(chǎn)物用于治療人際關(guān)系和行為障礙性疾病的用途，所述疾病包括性障礙。
此外，這些作者發(fā)現(xiàn)SMR1成熟產(chǎn)物識(shí)別器官上的特異的靶向位點(diǎn)，這與礦物質(zhì)離子濃度緊密相關(guān)。國(guó)際專利申請(qǐng)WO 98/37100描述了SMR1的成熟產(chǎn)物用于預(yù)防或治療與人體內(nèi)的或動(dòng)物體內(nèi)的金屬離子失衡相關(guān)的疾病的用途。
作為對(duì)應(yīng)激性背景的應(yīng)答，Sialorphin被急性釋放、快速分布并被其全身性的膜相關(guān)靶點(diǎn)持續(xù)地?cái)z取(Rougeot等，1997)。作者已經(jīng)證實(shí)Sialorphin在體內(nèi)所結(jié)合的主要細(xì)胞表面分子是膜錨定的金屬外-內(nèi)肽酶NEP(神經(jīng)內(nèi)肽酶、Neprilysin EC 3.4.24.11)、或腦啡肽酶(Rougeot et l.，2003)。此外，Sialorphin表現(xiàn)出是NEP活性的體外的生理拮抗劑；在利用可溶性的純化的腎NEP和人工的產(chǎn)熒光的DGNPA(Dansyl-Gly-(pNO2)Phe-βAla)作為底物的體外檢測(cè)法中所測(cè)定到的NEP和Sialorphin之間的直接的相互作用為Sialorphin抑制NEP活性(Sialorphin的IC50為0.6μM)提供了直接證據(jù)。Sialorphin是至今在嚙齒類動(dòng)物中所鑒定到的第一個(gè)NEP-腦啡肽酶活性的生理抑制劑(Rougeot等，2003和歐洲專利申請(qǐng)EP 1 216 707)。
NEP位于神經(jīng)組織和全身組織的細(xì)胞表面，其中它起到了作為外酶的重要功能，即催化大量神經(jīng)肽和調(diào)節(jié)肽的分泌后加工或代謝。NEP的主要的生理相關(guān)底物是腦啡肽、P物質(zhì)和心房利鈉肽(ANP)。這些哺乳動(dòng)物信號(hào)肽主要涉及中樞性和周圍性痛覺(jué)、炎癥現(xiàn)象、動(dòng)脈張力和礦物質(zhì)穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)。從生理的以及生理病理的和治療的觀點(diǎn)看，它們的生理重要性以及NEP外酶在調(diào)控其功能效力中的關(guān)鍵作用使得通過(guò)內(nèi)源性抑制物來(lái)研究并獲知它們的可能的保護(hù)作用是重要的。
通過(guò)使用不同的分子和行為藥物學(xué)的模型，作者已經(jīng)顯示出生理介質(zhì)Sialorphin在體外能阻止脊髓和腎臟的NEP降解其兩種生理相關(guān)底物(P物質(zhì)和甲硫氨酸腦啡肽)。Sialorphin抑制P物質(zhì)降解的IC50值為0.4-1μM，并具有源自神經(jīng)組織(脊髓)或源自全身組織(腎臟、骨、牙齒、胎盤、前列腺、GSM、腸)的膜結(jié)合性NEP的競(jìng)爭(zhēng)性抑制物的作用。在體內(nèi)，靜脈內(nèi)Sialorphin在兩種損傷誘導(dǎo)的急性和張力性疼痛的行為鼠模型(針刺痛覺(jué)測(cè)試(機(jī)械性痛覺(jué))和福爾馬林測(cè)試(化學(xué)性痛覺(jué)))中都能引發(fā)出了強(qiáng)的抗傷害應(yīng)答。Sialorphin所誘導(dǎo)的鎮(zhèn)痛作用要求激活μ和δ阿片受體，這與腦啡肽能轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中要涉及到內(nèi)源性阿片受體相一致。事實(shí)上，這些受體參與了內(nèi)源性阿片能信號(hào)例如腦啡肽(NEP和氨肽酶APN可以滅活這些腦啡肽)以及外源性阿片例如嗎啡(主要與μ阿片受體相互作用)的轉(zhuǎn)運(yùn)。結(jié)論是，Sialorphin通過(guò)在體內(nèi)抑制外-腦啡肽酶而保護(hù)了在傷害性刺激之后所釋放出的內(nèi)源性腦啡肽，并因此強(qiáng)化了它們的鎮(zhèn)痛作用。另外，內(nèi)源性阿片系統(tǒng)(具體地是δ-阿片介導(dǎo)的途徑)也與抑郁行為的發(fā)生有關(guān)，例如通過(guò)使用分析絕望行為的模型(強(qiáng)迫游泳試驗(yàn))，作者表明Sialorphin在雄鼠中展示出了明顯的抗抑郁活性。Sialorphin是至今在哺乳動(dòng)物中所鑒定出的NEP活性的第一個(gè)天然的具有全身活性的調(diào)節(jié)劑。此外，還提供了它作為損害后痛覺(jué)的新的生理調(diào)控劑、以及可能作為假定的新的抗傷害劑和抗抑郁劑的新型治療分子的前體的證據(jù)(Rougeot等，2003、EP 1,343,519和EP 1,343,520)。
Sialorphin的強(qiáng)鎮(zhèn)痛作用與其完全阻止了腦啡肽降解酶對(duì)腦啡肽的滅活有關(guān)。在體內(nèi)，兩種外肽酶NEP和APN都以極高的效率(在數(shù)秒鐘內(nèi))滅活腦啡肽。與此相一致的是，第一個(gè)開發(fā)出的合成抑制劑僅僅是NEP特異的(例如Thiorphan)或者是APN特異的(例如Bestatin)抑制劑。它們只表現(xiàn)出不明顯的或弱的抗傷害作用。因此，大鼠Sialorphin是NEP和APN金屬外肽酶NEP和APN的生理的雙重抑制劑，此外，這個(gè)對(duì)應(yīng)激有著適應(yīng)性應(yīng)答的內(nèi)分泌性信號(hào)信使是鼠痛覺(jué)的強(qiáng)抑制劑，并且它的鎮(zhèn)痛作用比合成的雙重NEP/APN抑制劑(例如Kelatorphan，通過(guò)造型方法所開發(fā)出的抑制劑)的鎮(zhèn)痛作用更強(qiáng)。所以，從特異性和生物可利用性上看，Sialorphin非常適合于其靶點(diǎn)的構(gòu)象的和分布的特征，因此從一體化的觀點(diǎn)看，它是更為有效的。結(jié)合這些觀察，從功能性的和生理病理的以及治療的觀點(diǎn)看，鼠Sialorphin所調(diào)節(jié)的功能的生物學(xué)重要性使得研究和鑒定出人體內(nèi)的鼠Sialorphin的內(nèi)源性功能類似物是非常關(guān)鍵的。
Sialorphin是唯一一種在哺乳動(dòng)物中所能鑒定出的膜結(jié)合的腦啡肽酶活性的生理性具有全身活性的調(diào)節(jié)劑。這就提出了在人體唾液和血液中是否存在著這樣的內(nèi)源性NEP-外肽酶的抑制劑。利用高敏感性和特異性的放射免疫檢測(cè)法在男性人體唾液中檢測(cè)到了無(wú)免疫反應(yīng)性的QHNPR肽(Sialorphin)(Rougeot等，1994)。但是，綜合的數(shù)據(jù)使得我們推測(cè)在人體內(nèi)(特別是在人唾液內(nèi))存在著抑制NEP外肽酶活性的低分子量物質(zhì)(≤3000Da)。盡管沒(méi)有生化表征出這種(這些)唾液組分，但是在這種(這些)人腦啡肽降解外酶的抑制物的唾液生成上觀察到了性別相關(guān)的差異(Marini and Roda，2000)。令人驚訝的是，這種情況非常類似于發(fā)明者在雄鼠中所鑒定到的情況，其中頜下腺和唾液分別代表著Sialorphin的主要合成和分泌的部位。
編碼Sialorphin的SMR1前體的基因?qū)儆诙嗷蚣易?，在人體中已經(jīng)鑒定出了該家族的成員。但是，在人體中還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與鼠SMR1基因(編碼SMR1的VCSA1)同源的人類基因stricto sensu(cDNA克隆和人基因組分析)。此外，存在著鼠Sialorphin抗膜錨定的人NEP(人前列腺細(xì)胞株(LNCaP)所表達(dá)的)的抑制效力，但是比在抗嚙齒類動(dòng)物NEP(鼠、兔)所獲得的效力要低約10倍?？紤]到鼠和人NEP具有相當(dāng)高的氨基酸序列的類似性(約85％)的事實(shí)，鼠Sialorphin和NEP外酶之間的功能相互作用中的表觀選擇性至少是令人驚訝的。另外，編碼鼠Sialorphin的前體(SMR1)的基因所屬的多基因家族中的人類基因的特征顯示出在人體內(nèi)存在著該家族的一些基因，其中已經(jīng)表征出了三種基因即基因hPB、hPBI和BPLP，它們簇集在相同的染色體區(qū)域(即第4號(hào)染色體的q13-21區(qū))(Isemura，2000)(Isemura and Saitoh，1997)(Dickinson and Thiesse，1996)。
本發(fā)明者現(xiàn)在已經(jīng)鑒定出了新的肽，其被認(rèn)為是SMR1-五肽Sialorphin的功能性的人類類似物。
本發(fā)明者所收集到的大量數(shù)據(jù)都支持新肽(序列QRFSR)源自BPLP蛋白(“堿性富脯氨酸淚液蛋白(Basic Prolin-rich Lacrimal Protein)”)。
從Dickinson等(Dickinson and Thiesse，1996)所克隆并表征到的cDNA中可以預(yù)測(cè)出編碼201個(gè)氨基酸(具有潛在的分泌信號(hào)肽)的多肽序列的人類基因BPLP。人淚腺和頜下腺都表達(dá)基因BPLP。在所附的序列表中，SEQ IDNo.1表示編碼BPLP的cDNA序列，SEQ ID No.2表示BPLP的氨基酸序列。
本發(fā)明者依據(jù)對(duì)來(lái)自SMR1前體的鼠Sialorphin的成熟加工處理可以確定分泌型BPLP蛋白的最保守的N末端區(qū)(大鼠、小鼠和人之間)中的共同位點(diǎn)。
例如，這些共同位點(diǎn)被確定為具有信號(hào)肽酶所需序列的區(qū)域中的信號(hào)肽裂解位點(diǎn)，以及在具有R-R鍵的成對(duì)堿性殘基上的共同位點(diǎn)被識(shí)別為成對(duì)堿性氨基酸轉(zhuǎn)化酶的加工處理信號(hào)。
在這些共同位點(diǎn)上，本發(fā)明者已經(jīng)找到了結(jié)構(gòu)上與大鼠QHNPRSialorphin緊密相關(guān)的序列QRFSR。
合成該肽，并分析了其抑制生理性NEP底物(即P物質(zhì))的降解的能力。
然后該肽被鑒定為Sialorphin的人類的功能類似物。
本發(fā)明將人BPLP蛋白衍生的肽作為新的金屬外肽酶的抑制劑。
更具體地，本發(fā)明涉及BPLP蛋白的成熟產(chǎn)物，特別是QRFSR肽以及其肽衍生物和模擬物，所述肽及其衍生物和模擬物能增強(qiáng)神經(jīng)內(nèi)分泌肽信使的作用，所述信使控制疼痛的傳遞(例如腦啡肽)、健康和/或Na/Pi/Ca/H2O的主要的穩(wěn)態(tài)交換(例如利鈉肽)。
本發(fā)明也涉及編碼所述肽和肽衍生物的多核苷酸，以及涉及針對(duì)所述肽或其肽衍生物的抗體。
此外，本發(fā)明涉及人BPLP蛋白、人BPLP蛋白衍生的肽、和其肽衍生物及模擬物的診斷性和治療性用途，以及編碼人BPLP蛋白、人BPLP蛋白衍生的肽和其肽衍生物及模擬物的多核苷酸以及針對(duì)人BPLP蛋白、人BPLP蛋白衍生的肽和其肽衍生物的抗體的診斷性和治療性用途。
應(yīng)當(dāng)明白本發(fā)明的肽、蛋白、或核酸是分離的或純化的形式。
當(dāng)指的是蛋白或肽(包括抗體)或核苷酸序列時(shí)，“純化的和分離的”意味著所指示的分子基本上不和其它的生物分子一起存在。術(shù)語(yǔ)“純化的”在此優(yōu)選地表示存在至少75％重量的相同類型的生物分子，更優(yōu)選地至少85％重量、仍更優(yōu)選地至少95％重量、以及最優(yōu)選地至少98％重量?！胺蛛x的”或“純化的”編碼特殊多肽的核酸分子指的是基本上不含其它不編碼目標(biāo)多肽的核酸分子的核酸分子。但是，所述分子可以包括一些不會(huì)負(fù)面地影響組合物的基本特征的附加堿基或部分。
肽對(duì)于本發(fā)明的目的，“肽”是一種由經(jīng)肽鍵彼此線性排列連接的氨基酸殘基的線性陣列所構(gòu)成的分子。這些線性陣列可以任選地是環(huán)狀的，即例如通過(guò)化學(xué)鍵可以連接線性肽的末端或肽內(nèi)的氨基酸的側(cè)鏈。本發(fā)明的這些肽可以包括從約3個(gè)到約500個(gè)氨基酸，優(yōu)選地從約3個(gè)到100個(gè)氨基酸，以及更優(yōu)選地從約3個(gè)到約50個(gè)氨基酸，特別是從約3個(gè)到15個(gè)氨基酸，并且還可以包括二級(jí)、三級(jí)或四級(jí)結(jié)構(gòu)以及與其它肽或其他非肽分子的分子間結(jié)合。這些分子間的結(jié)合可以是通過(guò)，但不限于，共價(jià)鍵(例如通過(guò)二硫鍵)、或通過(guò)螯合、靜電相互作用、疏水性相互作用、氫鍵、離子偶極相互作用、或上述的任何組合。
在這些肽中，通過(guò)N末端的環(huán)化/去環(huán)化，可以互換Glp和Gln。
本發(fā)明的一個(gè)目的是肽，其衍生自人BPLP蛋白，并且對(duì)金屬外肽酶具有調(diào)節(jié)活性，特別是抑制活性。
“衍生自人BPLP蛋白”表示其包括BPLP蛋白片段、或基本上由BPLP蛋白片段構(gòu)成、或由BPLP蛋白片段構(gòu)成。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述肽是由3到約150個(gè)氨基酸構(gòu)成。最優(yōu)選地，所述肽是由少于100個(gè)氨基酸構(gòu)成。
具體地，本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是BPLP蛋白的成熟產(chǎn)物及其肽衍生物。
更具體地，本發(fā)明涉及肽，所述肽是堿性富脯氨酸淚液蛋白(BPLP)的成熟產(chǎn)物或所述成熟產(chǎn)物的肽衍生物，其中肽或肽衍生物表現(xiàn)出對(duì)金屬外肽酶(優(yōu)選地是NEP和/或APN，以及更優(yōu)選地是NEP)的抑制性能。
“成熟產(chǎn)物”是經(jīng)天然成熟酶或激素原轉(zhuǎn)化酶或相關(guān)的單個(gè)或成對(duì)堿性氨基酸裂解酶(例如furin、PC轉(zhuǎn)化酶或例如PACE4(Seidah，1995))對(duì)BPLP蛋白前體的裂解所得到的肽。
本發(fā)明的肽包括“肽衍生物”。
“肽衍生物”是具有對(duì)親本肽的氨基酸取代的肽，優(yōu)選地具有對(duì)親本肽的一個(gè)到兩個(gè)氨基酸取代，特別是當(dāng)所述親本肽含有少于15個(gè)氨基酸，以及優(yōu)選地含有少于10個(gè)氨基酸，但是其仍保留了親本肽的結(jié)合特異性和/或生理學(xué)活性。“保留親本肽的結(jié)合特異性”在此表示能與單克隆的或多克隆的能與BPLP成熟產(chǎn)物中的一種或BPLP成熟產(chǎn)物受體結(jié)合的抗體結(jié)合，其親和力至少是作為BPLP成熟產(chǎn)物的一種肽的親和力的十分之一，更優(yōu)選地至少是一半，以及更優(yōu)選地至少相同。優(yōu)選地在標(biāo)準(zhǔn)的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合免疫檢測(cè)條件下實(shí)施對(duì)這些親和力的測(cè)定?！氨Ａ粲H本肽的生理學(xué)活性”表示保留了任一BPLP成熟產(chǎn)物結(jié)合并調(diào)控金屬外肽酶(具體地是NEP和/或APN，更具體地是NEP)，據(jù)此優(yōu)化局部的和全身的疼痛、炎癥、抗抑郁、和/或?qū)?yīng)激的離子內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)應(yīng)答的能力。在本說(shuō)明書的下文中，更詳細(xì)地描述了對(duì)是否調(diào)控了這些活性的測(cè)定。
本發(fā)明的肽包括肽或肽衍生物，其包括序列X1-X2-Arg-Phe-Ser-Arg、基本上由序列X1-X2-Arg-Phe-Ser-Arg構(gòu)成、或由序列X1-X2-Arg-Phe-Ser-Arg構(gòu)成。其中，X1代表H原子或Tyr氨基酸，X2代表Gln或Glp(當(dāng)X1是H時(shí))，或者X2代表Gln(當(dāng)X1是Tyr或Cys時(shí))。當(dāng)本發(fā)明的肽包括或基本上由序列X1-X2-Arg-Phe-Ser-Arg構(gòu)成時(shí)，所述序列是本發(fā)明的肽的C末端部分。
本發(fā)明的優(yōu)選的肽包括序列QRFSR，基本上由序列QRFSR構(gòu)成，或由序列QRFSR構(gòu)成。
更具體地，本發(fā)明的肽是由序列QRFSR(SEQ ID No.3)構(gòu)成的肽。
本發(fā)明的另一種肽是由序列YQRFSR(SEQ ID No.4)構(gòu)成的肽。
本發(fā)明的仍另一種肽是由序列CQRFSR構(gòu)成的肽。
在全文中，Glp是焦谷氨酸；
Tyr或Y是酪氨酸；Gln或Q是谷氨酰胺；Arg或R是精氨酸；Phe或F是苯丙氨酸；Ser或S是絲氨酸；Cys或C是半胱氨酸。
通過(guò)在液相或固相中的經(jīng)所需整合的不同氨基酸殘基的連續(xù)連接(在液相中從N末端到C末端，或者在固相中從C末端到N末端)的肽合成，用常用方式制備出了本發(fā)明的肽，其中用常用基團(tuán)預(yù)先封閉了N末端和反應(yīng)性側(cè)鏈。
對(duì)于固相合成而言，具體地可以使用Merrifield所述的技術(shù)?；蛘?，也可以使用Houbenweyl在1974年所述的技術(shù)。
更多的細(xì)節(jié)可以參考WO 98/37100。
利用遺傳工程方法也可以獲得本發(fā)明的肽。
優(yōu)選的模擬物(包括肽模擬物)保留了如上所述的親本肽(包括肽衍生物)的結(jié)合特異性和/或生理學(xué)活性?！澳M物”在此是模擬了天然肽的一些性能(優(yōu)選地是其結(jié)合特異性和生理學(xué)活性)的分子。通過(guò)對(duì)本發(fā)明的肽的結(jié)構(gòu)修飾獲得了優(yōu)選的模擬物，優(yōu)選地使用非天然的氨基酸、D氨基酸取代L氨基酸、構(gòu)象限制、電子等排取代、環(huán)化作用、或其它修飾。其它優(yōu)選的修飾包括，但不限于那些其中用非酰胺鍵取代一個(gè)或多個(gè)酰胺鍵、和/或其中用不同的化學(xué)部分取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸側(cè)鏈、或其中用保護(hù)基團(tuán)保護(hù)了N末端、C末端中的一個(gè)或多個(gè)末端或一個(gè)或多個(gè)側(cè)鏈，和/或其中往氨基酸鏈中引入雙鍵和/或環(huán)狀作用和/或立體特異性以增加剛性和/或結(jié)合親和力的修飾。
根據(jù)本發(fā)明的肽所靶向的金屬外肽酶的結(jié)合區(qū)的晶體結(jié)構(gòu)，用計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)開發(fā)系統(tǒng)也可以得到模擬物(Oefner等(2000)；Gomeni等(2001)；Jones等(2002)；Kan(2002))。
仍其它優(yōu)選的修飾包括那些打算增強(qiáng)對(duì)酶降解的抗性、提高特別是神經(jīng)和性腺組織的生物利用度以及更普遍地改善藥物代謝動(dòng)力學(xué)性能的修飾，其特別包括-通過(guò)親脂醇的酯化作用(COOH)或通過(guò)酰胺化作用(COOH)和/或乙?；饔?NH2)或在NH2末端添加羧烷基或芳香族的疏水鏈保護(hù)NH2和COOH親水基團(tuán)；-CO-NH酰胺鍵的反向倒位異構(gòu)體或酰胺功能團(tuán)的甲基化作用(或酮亞甲基、甲氧基、羥乙烯基)；-L氨基酸對(duì)D氨基酸的取代。
所有的這些變體在本領(lǐng)域都是已知的。因此，給定在此所述的肽序列，本領(lǐng)域人員能設(shè)計(jì)并生成具有與這些性能類似的或更優(yōu)越的結(jié)合特征和/或生理學(xué)活性的模擬物(見(jiàn)例如，Horwell等，(1996)、Liskamp等，(1994)、Gante等，(1994)、Seebach等，(1996))。
術(shù)語(yǔ)“BPLP肽”在此指的是本發(fā)明的BPLP蛋白、衍生于BPLP的肽、BPLP成熟肽、和肽衍生物及模擬物(包括肽模擬物)。
本發(fā)明也涉及分子復(fù)合物，其包括-金屬外肽酶受體、特別是NEP受體或APN受體、特別是NEP受體的BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物(例如QRFSR)的結(jié)合位點(diǎn)；-BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物，例如QRFSR。
核酸、表達(dá)方法和檢測(cè)方法當(dāng)考慮到遺傳密碼的簡(jiǎn)并性時(shí)，編碼如上定義的肽(包括肽衍生物)的核酸(也稱作多核苷酸)例如DNA或RNA分子也是本發(fā)明的一部分。
因此，本發(fā)明提供了編碼衍生自人BPLP蛋白的肽及其肽衍生物的核酸。
具體地，本發(fā)明提供了編碼肽的核酸，所述肽包括如上定義的序列X1-X2-Arg-Phe-Ser-Arg、基本上由序列X1-X2-Arg-Phe-Ser-Arg構(gòu)成、或由序列X1-X2-Arg-Phe-Ser-Arg構(gòu)成。當(dāng)本發(fā)明的肽包括或基本上由序列X1-X2-Arg-Phe-Ser-Arg構(gòu)成時(shí)，所述序列是本發(fā)明的肽的C末端部分。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了編碼肽的核酸，所述肽包括序列QRFSR、或基本上由序列QRFSR構(gòu)成、或由序列QRFSR構(gòu)成。在最優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了編碼QRFSR的核酸或編碼YQRFSR的核酸。
本發(fā)明的核酸包括在標(biāo)準(zhǔn)的雜交條件(優(yōu)選地為高嚴(yán)格性條件)下可雜交于任一上述序列或其互補(bǔ)序列的序列。
當(dāng)單鏈形式的核酸分子能在合適的溫度和溶液離子強(qiáng)度的條件(見(jiàn)Sambrook等，1989)下與其它核酸分子退火在一起時(shí)，認(rèn)為核酸分子“可雜交于”另一種核酸分子。溫度和離子強(qiáng)度的條件確定了雜交的“嚴(yán)格性”。對(duì)于初篩同源核酸，可以使用對(duì)應(yīng)于Tm(解鏈溫度)為55℃的低嚴(yán)格的雜交條件，例如是5xSSC、0.1％SDS、0.25％奶粉、以及沒(méi)有甲酰胺；或者是30％甲酰胺、5xSCC、0.5％SDS。中等嚴(yán)格的雜交條件對(duì)應(yīng)于更高的Tm，例如40％甲酰胺和5x或6xSSC。高嚴(yán)格的雜交條件對(duì)應(yīng)于最高的Tm，例如50％甲酰胺、5x或6xSCC。SCC是0.15M NaCl、0.015M檸檬酸鈉。雜交還需要兩種核酸含有互補(bǔ)序列，盡管依賴于雜交的嚴(yán)格性，堿基之間的錯(cuò)配是可能的。雜交核酸的合適的嚴(yán)格性依賴于核酸的長(zhǎng)度以及互補(bǔ)的程度，變異在本領(lǐng)域是公知的。兩個(gè)核苷酸序列之間的相似性或同源性的程度更大，具有這些序列的核酸分子的雜交的Tm值就更高。核酸雜交的相對(duì)穩(wěn)定性(對(duì)應(yīng)于更高的Tm)依照下面的次序減低RNA∶RNA、DNA∶RNA、DNA∶DNA。對(duì)于長(zhǎng)度超過(guò)100個(gè)核苷酸的雜交，已經(jīng)得到了計(jì)算Tm的公式(見(jiàn)Sambrook等，見(jiàn)上，9.50-9.51)。對(duì)于更短核酸(即寡核苷酸)的雜交，錯(cuò)配的位點(diǎn)變得更為重要，并且寡核苷酸的長(zhǎng)度決定了其特異性(見(jiàn)Sambrook等，見(jiàn)上，11.7-11.8)?？呻s交核酸的最小長(zhǎng)度為至少約10個(gè)核苷酸，優(yōu)選地至少約15個(gè)核苷酸。
在特異的實(shí)施方式中，術(shù)語(yǔ)“標(biāo)準(zhǔn)雜交條件”指的是Tm為55℃，并使用上面所設(shè)定的條件。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，Tm是60℃。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，Tm是65℃。在特異的實(shí)施方式中，“高嚴(yán)格性”指的是在68℃、0.2xSSC下，在42℃、50％甲酰胺、4xSSC下，或者在賦予等價(jià)于那些在這兩種條件下所觀察到雜交水平的條件下的雜交和/或洗滌條件。
本發(fā)明還涉及用于克隆和/或表達(dá)的包括本發(fā)明的核酸序列的載體，以及涉及包括本發(fā)明的核酸或所述載體的宿主細(xì)胞，即其中轉(zhuǎn)移了其中至少一種載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的表達(dá)載體包括編碼本發(fā)明的肽(包括肽衍生物)或蛋白的核酸序列，所述核酸序列與容許其表達(dá)的元件可操縱地連接。所述載體優(yōu)選含有啟動(dòng)子序列，用于啟動(dòng)和終止翻譯的信號(hào)、以及調(diào)節(jié)翻譯的合適區(qū)域。其在宿主細(xì)胞內(nèi)的插入可以是臨時(shí)的或穩(wěn)定的。所述載體也可以含有用于分泌所翻譯蛋白的特異信號(hào)。
根據(jù)宿主細(xì)胞可以選擇出這些不同的信號(hào)，并且可以將其插入到在所選宿主細(xì)胞內(nèi)能自我復(fù)制的載體內(nèi)，或插入到可以整合到所述宿主的基因組內(nèi)的載體內(nèi)。
宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，包括但不限于細(xì)菌、酵母菌、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括商品化可獲得的細(xì)胞株。宿主細(xì)胞的優(yōu)選實(shí)例是COS-1、HEK細(xì)胞、293細(xì)胞或CHO細(xì)胞。
本發(fā)明的一個(gè)目的也是用于生成重組BPLP肽的方法，其中用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染所述宿主細(xì)胞，并且在容許BPLP肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞。利用任何標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)例如電穿孔或磷酸鈣沉淀或脂染_可以進(jìn)行對(duì)宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。
然后用熟知的純化方法可以收集并純化蛋白或肽用方法例如HPLC色譜法、特異抗體的免疫親和技術(shù)等可以從裂解液或細(xì)胞提取液、從培養(yǎng)基的上清液中純化出重組肽或蛋白。
本發(fā)明還涉及體外預(yù)測(cè)和/或診斷的方法，其中用本發(fā)明的核酸序列或衍生于此的探針或引物檢測(cè)異常合成，包括異常的高合成或低合成，或BPLP基因水平上的遺傳異常。
本發(fā)明因此提供了用于預(yù)測(cè)和/或診斷涉及BPLP或它的任一成熟產(chǎn)物的產(chǎn)生的改變的病變，所述方法包括檢測(cè)測(cè)試對(duì)象的生物學(xué)樣品中的BPLP基因或其轉(zhuǎn)錄物的質(zhì)量和/或數(shù)量的異常。
術(shù)語(yǔ)“預(yù)測(cè)”指的是確定或確認(rèn)發(fā)生疾病或病變的可能性。
本發(fā)明更具體地涉及檢測(cè)BPLP基因的異常的方法，其包括以下步驟—在容許生物學(xué)樣品中所含的DNA與引物雜交的條件下，將含有DNA的生物學(xué)樣品與容許擴(kuò)增全部或部分BPLP基因的特異的寡核苷酸接觸，其中已經(jīng)使得樣品中所含的DNA成為可接近的，適當(dāng)時(shí)是可雜交的；
-擴(kuò)增所述DNA；-檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物；-將所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物與用正常對(duì)照的生物學(xué)樣品所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行比較，據(jù)此檢測(cè)出BPLP基因中的可能的異常。
本發(fā)明的方法也被應(yīng)用于檢測(cè)BPLP基因的轉(zhuǎn)錄物中的異常，通過(guò)例如用RT-PCR擴(kuò)增出生物學(xué)樣品中所含由的mRNA。
因此，本發(fā)明的另一個(gè)目的是用于檢測(cè)BPLP轉(zhuǎn)錄物中的異常的方法，如先前所定義的，其包括步驟-從生物學(xué)樣品中所含的mRNA中生成cDNA；-在容許引物與所述cDNA雜交的條件下，將所述cDNA與容許擴(kuò)增所有或部分BPLP基因的轉(zhuǎn)錄物的特異寡核苷酸接觸；-擴(kuò)增所述cDNA；-檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物；-將所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物與用正常對(duì)照的生物學(xué)樣品所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行比較，據(jù)此檢測(cè)出BPLP基因轉(zhuǎn)錄物中的可能的異常。
從生物學(xué)樣品中所獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物與從正常生物學(xué)樣品中所獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物之間的這種比較是定量的比較和/或定性的比較。在后一種情況中，例如通過(guò)特異探針雜交、通過(guò)測(cè)序或通過(guò)限制性位點(diǎn)分析可以實(shí)施比較。
本領(lǐng)域技術(shù)人員非常清楚地知道用于分析生物學(xué)樣品所含有的DNA以及用于診斷遺傳疾病的方法?？梢缘玫蕉喾N進(jìn)行基因型分析的策略。
優(yōu)選地，可以用DGGE方法(變性梯度凝膠電泳)、或SSCP方法(單鏈構(gòu)象多態(tài)性)檢測(cè)BPLP基因中的異常。優(yōu)選地，緊跟在這些方法之后的是直接測(cè)序。可以優(yōu)先用RT-PCR法檢測(cè)BPLP轉(zhuǎn)錄物中的異常，因?yàn)樗苡^察到剪切突變例如外顯子跳躍或隱含位點(diǎn)的激活所造成的混亂剪切的后果。同樣，在該方法之后的是直接測(cè)序。最近開發(fā)的利用DNA芯片的技術(shù)也可以被優(yōu)先地應(yīng)用于檢測(cè)BPLP基因中的異常。
用于檢測(cè)BPLP基因或其轉(zhuǎn)錄物中的異常的這些方法特別適用于鑒定造成無(wú)功能的BPLP蛋白或成熟產(chǎn)物的突變，以及優(yōu)先地適用于體外預(yù)測(cè)和/或診斷疾病，其中所述疾病涉及BPLP基因。
這些疾病的實(shí)例是在“治療應(yīng)用”章節(jié)中所引用的疾病。
抗體和檢測(cè)方法本發(fā)明還提供了特異地針對(duì)(即特異性識(shí)別)BPLP蛋白的抗體。本發(fā)明還提供了特異地針對(duì)(即特異性識(shí)別)上面所述的肽(包括肽衍生物)的抗體。
因此，本發(fā)明提供了針對(duì)衍生自人BPLP蛋白的肽及其肽衍生物的抗體。
更具體地，本發(fā)明提供了針對(duì)肽的抗體，所述肽包括如上定義的序列X1-X2-Arg-Phe-Ser-Arg、基本上由序列X1-X2-Arg-Phe-Ser-Arg構(gòu)成、或由序列X1-X2-Arg-Phe-Ser-Arg構(gòu)成。當(dāng)本發(fā)明的肽包括或基本上由序列X1-X2-Arg-Phe-Ser-Arg構(gòu)成時(shí)，所述序列是本發(fā)明的肽的C末端部分。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了針對(duì)(即特異性識(shí)別)肽的抗體，所述肽包括序列QRFSR、或基本上由序列QRFSR構(gòu)成、或由序列QRFSR構(gòu)成。在最優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了針對(duì)(即特異性識(shí)別)QRFSR的抗體或針對(duì)(即特異性識(shí)別)YQRFSR的抗體或針對(duì)(即特異性識(shí)別)CQRFSR的抗體。
不同形式的術(shù)語(yǔ)“抗體”在此指的是免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫學(xué)活性部分，即含有抗體結(jié)合位點(diǎn)或互補(bǔ)位的分子。示例的抗體分子是完整的免疫球蛋白分子、基本上完整的免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的一部分，包括本領(lǐng)域已知的部分例如Fab、Fab′、F(ab′)2和F(v)。
抑制BPLP成熟產(chǎn)物或其肽衍生物與其受體的相互作用的抗體是特別有用的。
雖然可以使用多克隆抗體，但是優(yōu)選地使用單克隆抗體，因?yàn)樗鼈冊(cè)陂L(zhǎng)期的使用中具有更高的可重復(fù)性。
用于生成多克隆抗體的方法也是公知的。一般地，通過(guò)給新西蘭白兔皮下施用本發(fā)明的蛋白或肽(包括綴合肽)可以生成這些抗體，所述白兔先前已經(jīng)被放血以便獲得免疫前血清?？梢栽谑畟€(gè)不同的部位或者至少5個(gè)不同的部位，注射每個(gè)部位總體積為50μl的抗原。然后在首次注射后5周，給兔子放血，并且根據(jù)免疫應(yīng)答的質(zhì)量，每6周給兔子皮下施用比初次注射的最大量低5倍濃度的相同抗原進(jìn)行定期強(qiáng)化3次。然后在強(qiáng)化后的每10天收集血清樣品。然后利用相應(yīng)的捕獲抗體的抗原，通過(guò)親和色譜法從血清中回收多克隆抗體。在E.Harlow，et.al.，editors，AntibodiesA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，New York(1988)中闡述了這種用于生成多克隆抗體的方法和其它方法。
不同語(yǔ)法形式的“單克隆抗體”指的是僅含有一種能與特殊表位免疫反應(yīng)的抗體結(jié)合位點(diǎn)的一群抗體分子。單克隆抗體因此常常表現(xiàn)出與其所免疫反應(yīng)的任一表位的單一的結(jié)合親和力。單克隆抗體因此可以含有具有多個(gè)抗體結(jié)合位點(diǎn)的抗體分子，每個(gè)結(jié)合位點(diǎn)免疫特異于不同的表位(即雙特異的單克隆抗體)。
用于制備單克隆抗體的實(shí)驗(yàn)室方法在本領(lǐng)域是公知的(見(jiàn)，例如Harlow等，見(jiàn)上)。通過(guò)免疫哺乳動(dòng)物例如小鼠、鼠、兔、山羊、人等可以制備針對(duì)純化BPLP蛋白、BPLP成熟產(chǎn)物或其肽衍生物(包括綴合的BPLP肽)的單克隆抗體(Mab)。分離出免疫哺乳動(dòng)物體內(nèi)的產(chǎn)抗體的細(xì)胞，并將其與骨髓瘤或異骨髓瘤細(xì)胞融合，以便生成雜交細(xì)胞(雜交瘤)。產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞被當(dāng)作所需單克隆抗體的來(lái)源。
雖然用雜交瘤培養(yǎng)可以生成Mab，但是本發(fā)明并不受此限制。也預(yù)期的是通過(guò)表達(dá)從雜交瘤中克隆到的核酸所產(chǎn)生的Mab的用途。即，表達(dá)雜交瘤所分泌的分子的核酸可以被轉(zhuǎn)移到另一種細(xì)胞株內(nèi)，以生成轉(zhuǎn)化體。轉(zhuǎn)化體在基因型上不同于最初的雜交瘤，但是它也能生成本發(fā)明的抗體分子，包括整個(gè)抗體分子的免疫活性片段，其對(duì)應(yīng)于雜交瘤所分泌的分子。另外，文獻(xiàn)提供了形成嵌合抗體、人源化抗體、單鏈抗體等基于基礎(chǔ)的免疫反應(yīng)性抗體片段的變體的方法。所有的這些都被認(rèn)為是在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，并被作為一種類型，闡述并要求了抗體的特異性，無(wú)論本領(lǐng)域人員所能構(gòu)建出的精確的變異結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明還涉及一種用于體外診斷、預(yù)測(cè)或確定病變的進(jìn)展的方法，所述病變涉及BPLP或它的任一成熟產(chǎn)物的產(chǎn)生的改變(即產(chǎn)生比對(duì)照對(duì)象減少或增加)。方法包括檢測(cè)或定量測(cè)試對(duì)象的生物學(xué)樣品中的BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物(特別是QRFSR)，并將其與對(duì)照對(duì)象的生物學(xué)樣品中的相同物質(zhì)進(jìn)行比較。
這些病變的實(shí)例是在“治療性應(yīng)用”章節(jié)中所提到的疾病。
“生物學(xué)樣品”是對(duì)象的一種液體，包括血清、血液、脊髓液、腦脊液、尿液、乳汁、唾液或組織提取物，或者是組織或器官活檢例如腦、脊髓、骨組織、腎臟、前列腺、胎盤、牙組織、胃的腺體粘膜、腸、唾液腺組織、乳腺等。
“對(duì)象”或“患者”是脊椎動(dòng)物，例如哺乳動(dòng)物，優(yōu)選地是人，不論其年齡、性別和一般狀況。也包括兒童和嬰兒。測(cè)試對(duì)象可以沒(méi)有癥狀，可以被認(rèn)為可能發(fā)生疾病或病變。也可以測(cè)試被懷疑患有靶疾病的對(duì)象或者已經(jīng)顯示出疾病或病變的癥狀的對(duì)象。
“對(duì)照對(duì)象”可以是健康對(duì)象或沒(méi)有任何表觀疾病的對(duì)象，所述疾病可以涉及BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物中的一種。為了確定涉及BPLP或其成熟產(chǎn)物中的一種的病變的進(jìn)展，測(cè)試對(duì)象的BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物的表達(dá)以及通過(guò)例如在數(shù)周之后第二次測(cè)試對(duì)象來(lái)監(jiān)視藥物的療效或病變的播散都是特別有用的。對(duì)于第二個(gè)測(cè)試結(jié)果與第一次測(cè)試結(jié)果比較，以及一般也就是與在“健康”對(duì)象中所得到的結(jié)果的比較的情況?！皩?duì)照對(duì)象”指的是相同的測(cè)試對(duì)象或者指的是“健康對(duì)象”。
術(shù)語(yǔ)“診斷”指的是確定或確認(rèn)對(duì)象體內(nèi)的疾病或病變。
術(shù)語(yǔ)“預(yù)測(cè)(prognosis)”指的是確定或確認(rèn)生成疾病或病變的可能性。
通過(guò)檢測(cè)BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物可以確定“BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物的表達(dá)或產(chǎn)生”。
這些檢測(cè)方法包括將生物學(xué)樣品與能選擇性地與樣品中所含有的BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物(特別是QRFSR)相互作用的結(jié)合伴侶接觸。結(jié)合伴侶通常是抗體，其可以是多克隆或單克隆抗體，優(yōu)選地是單克隆抗體。
用于生產(chǎn)如上所述的基于治療的抗體的方法也可以被輕易地適用于生成能用于本發(fā)明的診斷或預(yù)測(cè)方法中的抗體。
例如，通過(guò)將生物學(xué)樣品與特異性識(shí)別BPLP蛋白的抗體或者特異性識(shí)別其成熟產(chǎn)物(特別是QRFSR)的抗體一起孵育可以檢測(cè)出BPLP蛋白或它的任一成熟產(chǎn)物、或蛋白的成熟形式或成熟產(chǎn)物的存在或產(chǎn)生，例如使用標(biāo)準(zhǔn)的電泳或液體的或固體的免疫診斷技術(shù)，其包括免疫檢測(cè)法例如競(jìng)爭(zhēng)型、直接反應(yīng)型、或三明治型檢測(cè)法。這些檢測(cè)法包括，但不限于Western印跡法、凝集試驗(yàn)、酶標(biāo)記的和介導(dǎo)的免疫檢測(cè)法例如ELISA、生物素/抗生物素蛋白型檢測(cè)法、放射免疫檢測(cè)法例如利用放射性碘標(biāo)記的或氚標(biāo)記的BPLP蛋白或它的任一成熟產(chǎn)物(特別是QRFSR)的免疫檢測(cè)法、免疫電泳、免疫沉淀等。反應(yīng)通常包括顯示標(biāo)記例如熒光、化學(xué)發(fā)光、放射性、酶標(biāo)記或染料分子、或其它用于檢測(cè)抗原和與之反應(yīng)的抗體之間的復(fù)合物的形成的方法。
前面所提及的檢測(cè)法通常涉及將未結(jié)合的BPLP蛋白或它的未結(jié)合的成熟產(chǎn)物(特別是未結(jié)合的QRFSR)與和固定于固相中的特異抗體相結(jié)合的BPLP蛋白或成熟產(chǎn)物(特別是QRFSR)分離開?？梢杂糜诒景l(fā)明實(shí)踐的固相支持物包括支持物例如硝基纖維素(例如膜或微量滴定孔形式)、聚氯乙烯(例如片或微量孔)、聚苯乙烯乳膠(例如珠或微量滴定板)、聚偏二氟乙烯、重氮化紙、尼龍膜、活化珠、磁反應(yīng)珠等等。
因此，在一個(gè)特殊的實(shí)施方式中，用本領(lǐng)域人員已知的方法，利用第二種結(jié)合物可以從生物學(xué)樣品中容易地檢測(cè)出結(jié)合BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物(特別是QRFSR)的存在，所述第二種結(jié)合物包括另一種抗體，所述抗體被綴合于可檢測(cè)的酶標(biāo)記例如辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶或尿素酶。然后用合適的酶底物生成可檢測(cè)信號(hào)例如發(fā)色的或產(chǎn)熒光的信號(hào)。在其它的相關(guān)實(shí)施方式中，利用本領(lǐng)域人員已知的方法可以實(shí)施競(jìng)爭(zhēng)型ELISA技術(shù)。
為了實(shí)施上面所述的免疫檢測(cè)法，可以提供具有合適的說(shuō)明書和其它試劑的包括上面所述的檢測(cè)試劑(包括抗體)的試劑盒。根據(jù)所用的具體的免疫檢測(cè)法，試劑盒也可以含有合適的標(biāo)記物和其它包裝好的試劑和材料(例如洗滌緩沖液等)。利用這些試劑盒可以實(shí)施上面所述的標(biāo)準(zhǔn)的免疫檢測(cè)法。
基因治療根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)修飾(即增加或減少)患者細(xì)胞中的以及從中所釋放出的BPLP蛋白、其成熟產(chǎn)物的量，或者表達(dá)及可能釋放出如上面所定義的肽(包括肽衍生物)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)膜金屬外肽酶的調(diào)控。通過(guò)用BPLP表達(dá)載體或表達(dá)BPLP蛋白、BPLP成熟產(chǎn)物或如上定義的肽(包括肽衍生物)的載體(例如裸DNA或病毒載體的形式)可以實(shí)現(xiàn)患者細(xì)胞內(nèi)的以及從中可能釋放出的BPLP蛋白或成熟產(chǎn)物的量的增加、表達(dá)及可能釋放出如上面所定義的肽(包括肽衍生物)優(yōu)選地，本發(fā)明的核酸形成了載體的一部分。這些載體是包括與序列可操縱地連接的編碼序列的核酸，所述序列控制了載體所轉(zhuǎn)染的細(xì)胞內(nèi)的蛋白或肽的表達(dá)。
這樣一種載體的應(yīng)用使得它可能提高核酸向?qū)ο蠹?xì)胞內(nèi)(特別是所處理的細(xì)胞內(nèi))的轉(zhuǎn)移，并且能增加核酸在所述細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性，這使得獲得持久的治療作用成為可能。此外，可能將一些核酸序列引入到相同的載體內(nèi)，這也增加了治療的療效。
所用的載體可以是不同來(lái)源的，只要它能轉(zhuǎn)化動(dòng)物細(xì)胞(優(yōu)選地是人類細(xì)胞)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所用的病毒載體可以選自腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺相關(guān)病毒(AAV)、慢病毒、皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒(CMV)、痘苗病毒等。在文獻(xiàn)中已經(jīng)描述了整合了異源核酸序列的源自腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或AAV、HIV衍生的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的載體。
本發(fā)明因此也涉及任一重組病毒，其包括被插入到其基因組內(nèi)的編碼BPLP蛋白、BPLP成熟產(chǎn)物或如上所定義的肽(包括肽衍生物)的核酸序列。
優(yōu)選地，本發(fā)明的重組病毒是缺陷病毒，其至少缺乏在感染細(xì)胞內(nèi)復(fù)制所述病毒所必需的序列。
特別優(yōu)選地施用整合于腺病毒、AAV或缺陷重組逆轉(zhuǎn)錄病毒內(nèi)形式的本發(fā)明的核酸序列。
在1995年10月出版的國(guó)際專利文獻(xiàn)WO 95/28494中描述了靶向基因轉(zhuǎn)運(yùn)。
或者，通過(guò)脂染可以將在體內(nèi)引入載體。在過(guò)去的十年間，已經(jīng)增加了脂質(zhì)體在體外包裝和轉(zhuǎn)染核酸方面中的應(yīng)用。在本發(fā)明的“藥物組合物”章節(jié)也提供了關(guān)于脂質(zhì)體的信息。
在體內(nèi)引入裸DNA質(zhì)粒形式的載體也是可能的。
用本領(lǐng)域已知的方法可以將用于基因治療的裸DNA載體引入到所述的宿主細(xì)胞內(nèi)，例如轉(zhuǎn)染、電穿孔、微注射、轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸鈣沉淀、Lipofectamine_、使用基因槍、或使用DNA載體轉(zhuǎn)運(yùn)體。
藥物組合物可以將BPLP-肽(即指的是BPLP蛋白、衍生于BPLP的肽、成熟產(chǎn)物、如上定義的肽、包括肽衍生物和模擬物)或編碼這些BPLP-肽的核酸以及針對(duì)所述BPLP-肽的抗體與藥用可接受的載體一起制劑成藥物組合物。例如，藥物組合物適合于局部、口服、舌下、腸外、鼻內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、經(jīng)皮或經(jīng)眼給藥等。
本發(fā)明的一個(gè)主題也是包括所述BPLP-肽或其模擬物的聚合物的藥物組合物。
優(yōu)選地，核酸形成了表達(dá)所述核酸的載體的一部分。
優(yōu)選地，藥物組合物含有可被藥用地用于能被注射的劑型中的載體。
合適的藥物組合物具體地是等張的、無(wú)菌的、鹽溶液(磷酸氫一鈉或二鈉、氯化鈉、鉀、鈣或鎂等或這些鹽的混合物)、或干的(特別是凍干的)組合物，在這種情況中，需要加入無(wú)菌水或生理鹽水以便容許形成可注射溶液。
能用于施用的BPLP-肽、抗體或核酸的劑量可以作為不同參數(shù)的函數(shù)，特別是作為所用的施用模式、相關(guān)病理、或所需治療的持續(xù)時(shí)間的函數(shù)。
為了制備用于肽治療的藥物組合物，可以將有效量的BPLP-肽溶解或分散于藥用可接受的載體或水介質(zhì)中。
下面提供了藥物配方的實(shí)例。
藥物組合物包括藥用可接受的載體或水介質(zhì)中的有效量的BPLP-肽、核酸或抗體。
“藥用的”或“藥用可接受的”指的是當(dāng)按需施用給動(dòng)物(包括人)時(shí)不會(huì)產(chǎn)生不良的、過(guò)敏的或其它不利的反應(yīng)的分子實(shí)體和組合物。
“藥用可接受的載體”在此包括任何的和所有的溶劑、分散介質(zhì)、涂層劑、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等張劑和延遲吸收劑等。這些介質(zhì)和試劑作為藥用活性物的用途在本領(lǐng)域是已知的。本發(fā)明預(yù)期了除任何與活性組分不相兼容的常用介質(zhì)或試劑外的試劑在藥物組合物中的應(yīng)用?？梢詫⑤o助的活性組分整合到組合物內(nèi)。
適用于注射用途的藥物形式包括無(wú)菌的水溶液或分散相，制劑包括芝麻油、花生油或水性丙二醇、以及臨時(shí)制備無(wú)菌注射溶液或分散相的無(wú)菌粉末。在所有情況中，制劑必須是無(wú)菌的，必須被液體化到出現(xiàn)容易注射器化的程度。它在生產(chǎn)和儲(chǔ)存的條件下必須是穩(wěn)定的，并且可以被抗微生物例如細(xì)菌和真菌污染地保藏。
可以在與表面活性劑例如羥丙纖維素適當(dāng)混合的水中制備出作為游離堿或藥用可接受的鹽的活性化合物的溶液。也可以在甘油、液態(tài)聚乙二醇、和其混合物以及油中制備出分散相。在一般的儲(chǔ)存和應(yīng)用條件下，這些制劑含有防止微生物生長(zhǎng)的防腐劑。
載體也可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、和液態(tài)聚乙二醇等)、其合適混合物、以及植物油的溶劑或分散媒介。通過(guò)使用涂層(例如卵磷脂)、通過(guò)保持所需的顆粒大小(對(duì)于分散相而言)以及通過(guò)使用表面活性劑可以保持合適的流動(dòng)性。用各種抗細(xì)菌劑和抗真菌劑例如尼泊金、三氯叔丁醇、苯酚、山梨糖醇酐、硫柳汞等可以預(yù)防微生物的行為。在多種情況中，優(yōu)選地包括等張劑例如蔗糖或氯化鈉。通過(guò)在組合物中使用延遲吸收劑例如單硬脂酸鋁和凝膠可以延長(zhǎng)注射組合物的吸收。
通過(guò)在合適的溶劑中整合所需量的活性化合物以及各種上面所列的其它組分，以及隨后的過(guò)濾消毒可以制備出無(wú)菌的注射溶液。通過(guò)將各種無(wú)菌的活性組分整合到含有基本的分散介質(zhì)以及所需的上面所列的其他組分的無(wú)菌載體內(nèi)可以制備出分散相。對(duì)于用于制備無(wú)菌的注射溶液的無(wú)菌粉末而言，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥技術(shù)，其生成了活性組分加上前面的它的無(wú)菌過(guò)濾溶液中的任一附加的所需組分的粉末。
在配制之后，可以以與劑量制劑相適合的方式以及以治療有效的量施用溶液?？梢匀菀椎厥┯酶鞣N劑量形式的制劑，例如上面所述的注射溶液類型，但是也可以采用藥物釋放膠囊等。
對(duì)于水溶液的腸外施用，例如如果需要，應(yīng)當(dāng)將溶液適當(dāng)?shù)鼐彌_化，并且首先用足夠的鹽或葡萄糖使得液態(tài)稀釋劑成為等張溶液。這些特殊的水溶液特別適合于靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下和腹腔內(nèi)給藥。在這種情況中，可以采用的無(wú)菌的水介質(zhì)對(duì)于與本說(shuō)明書相關(guān)的領(lǐng)域中的熟練人員是已知的。例如，可以將1個(gè)劑量溶解于1ml等張的NaCl溶液中，并且可以將其加入到1000ml皮下灌注液中或者注射到輸注的目標(biāo)位置上，(見(jiàn)，例如“Remington′sPharmaceutical Sciences”，15版，第1035到1038頁(yè)和第1570到1580頁(yè))。根據(jù)所治療的對(duì)象的病變，必然會(huì)發(fā)生劑量上的一些變異。無(wú)論如何，負(fù)責(zé)給藥的人將為個(gè)體對(duì)象確定合適的劑量。
相關(guān)的BPLP-肽可以被制劑成治療混和物，每個(gè)劑量包括約0.0001到100毫克、或約0.001到0.1毫克、或約0.1到1.0或甚至約1mg到10mg或甚至約10到100mg。也可以施用多個(gè)劑量。優(yōu)選的劑量是從約0.1μg/kg到約1mg/kg，更優(yōu)選地從1μg/kg到約100μg/kg，以及最優(yōu)選地從約10μg/kg到100μg/kg。
除了用于腸外給藥(例如靜脈內(nèi)或肌肉內(nèi)注射)的劑型，其他藥用可接受的形式包括例如用于口服給藥的片劑或其他固體、脂質(zhì)體劑型、緩釋膠囊、或任何其他常用的形式包括乳膏。
預(yù)期了其他的給藥途徑，包括鼻溶液或噴霧劑、氣霧劑或吸入劑、或陰道或直腸栓劑以及陰道栓劑或乳膏、以及長(zhǎng)效轉(zhuǎn)運(yùn)聚合物。
在某些實(shí)施方式中，預(yù)期了脂質(zhì)體和/或毫微粒用于將BPLP-肽試劑以及核酸載體或抗體引入到宿主細(xì)胞內(nèi)的用途。
本發(fā)明也涉及上面所定義的藥物組合物，其包括與BPLP-肽協(xié)同作用的第二種藥劑。
治療性應(yīng)用上面所述的BPLP-肽、抗所述BPLP-肽的抗體或編碼所述BPLP-肽的核酸能用于預(yù)防或治療疾病或病癥，其中尋求對(duì)膜金屬外肽酶活性的調(diào)控，更具體地是對(duì)膜-鋅金屬肽酶(例如NEP和APN)的活性的調(diào)控。
天然的NEP底物主要是肽激素腦啡肽、P物質(zhì)、緩激肽、血管緊張素II和心房利鈉肽，它們?cè)诳刂浦袠行院椭車酝从X(jué)、炎癥現(xiàn)象、礦物質(zhì)交換和/或動(dòng)脈張力方面都起到了關(guān)鍵作用(Roques等，1993)。
更具體地，神經(jīng)內(nèi)肽酶NEP 24-11分布于哺乳動(dòng)物的神經(jīng)組織和周圍組織中，在周圍組織中，其主要分布在腎臟和胎盤。在這些組織中，細(xì)胞表面的金屬肽酶NEP參與了神經(jīng)肽、全身性免疫調(diào)節(jié)肽和肽激素的分泌后加工和代謝。通過(guò)控制循環(huán)的或分泌的調(diào)節(jié)肽的活性水平，NEP調(diào)控了它們的生理性受體介導(dǎo)的作用。因此，膜錨定的NEP參與調(diào)控了下面物質(zhì)的活性強(qiáng)的血管活性肽例如P物質(zhì)、緩激肽(BK)、心房利鈉肽(ANP)、和血管緊張素II(AII)；強(qiáng)的炎性/免疫調(diào)節(jié)肽例如P物質(zhì)和BK和fMet-Leu-Phe(fMLP)；強(qiáng)的阿片類神經(jīng)肽例如Met和Leu-腦啡肽(Enk)以及強(qiáng)的礦物質(zhì)交換和液體穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)肽例如ANP、C型利鈉肽(CNP)和B型利鈉肽(BNP)。但是，僅僅在強(qiáng)烈釋放出這些肽或者其中刺激觸發(fā)了肽的釋放的這些區(qū)域內(nèi)，通過(guò)NEP誘導(dǎo)的形成/降解可以改變這些肽的水平。
從一體化的觀點(diǎn)看，NEP生物學(xué)活性是控制涉及動(dòng)脈張力調(diào)節(jié)、炎癥顯像和水-礦物質(zhì)穩(wěn)態(tài)、以及控制疼痛加工處理的肽能形態(tài)的活性水平。從臨床觀點(diǎn)上看，這證實(shí)了NEP是各種疾病狀態(tài)中的一種重要的藥物靶點(diǎn)的事實(shí)。例如，通過(guò)抑制NEP，據(jù)此增加了中樞性或周圍性內(nèi)源性阿片的作用的水平和持續(xù)時(shí)間，就可以獲得鎮(zhèn)痛作用或抗抑郁作用?；蛘咄ㄟ^(guò)抑制內(nèi)源性AII的形成和P物質(zhì)、BK和ANP滅活，就可以獲得抗高血壓、利鈉和利尿的藥物。通過(guò)使用NEP抑制劑來(lái)修飾內(nèi)源性肽的濃度的主要優(yōu)點(diǎn)是僅僅在天然效應(yīng)物所刺激的受體上才會(huì)誘導(dǎo)藥理作用，并且它主要依賴于在環(huán)境、行為和病理生理的應(yīng)激狀態(tài)之后所發(fā)生的天然效應(yīng)物的張力或刺激誘發(fā)的釋放(Roques等，1993)。
除了NEP以外的哺乳動(dòng)物膜金屬肽酶的實(shí)例是ECE(內(nèi)皮素轉(zhuǎn)化酶)(特別是ECE1和ECE2)、紅細(xì)胞細(xì)胞表面受體抗原KELL和與X連鎖的低磷酸鹽血癥性佝僂病相關(guān)的PEX基因的產(chǎn)物、以及ACE(血管緊張素轉(zhuǎn)化酶)和APN(氨肽酶N)。
對(duì)ACE和/或ECE的抑制在治療高血壓和預(yù)防及治療動(dòng)脈粥樣硬化方面有著重要應(yīng)用。
對(duì)APN聯(lián)合NEP的抑制在治療疼痛和抑郁癥方面有著重要應(yīng)用。
對(duì)相關(guān)膜金屬肽酶的抑制在治療腫瘤(如卵巢、直結(jié)腸、腦、肺、胰腺、胃和黑色素癌)、減少轉(zhuǎn)移、動(dòng)脈粥樣硬化和/或高血壓的發(fā)生率方面有著治療作用。對(duì)相關(guān)膜金屬肽酶的抑制在疼痛控制方面也有治療作用。對(duì)急性疼痛的這些抗傷害作用是鎮(zhèn)痛作用，但是對(duì)慢性炎性疼痛例如關(guān)節(jié)炎或炎性腸病也有作用。
此外，對(duì)細(xì)菌或病毒金屬肽酶的抑制預(yù)期具有抗感染作用。
金屬肽酶在病原體對(duì)宿主組織的侵襲以及免疫和炎性過(guò)程方面都起到了重要作用，例如化膿性鏈球菌、銅綠假單胞菌、牙齦卟啉單胞菌和嗜肺性軍團(tuán)菌。
此外，細(xì)菌金屬肽酶(特別是鋅金屬肽酶)在蛋白裂解性毒素所引起的疾病方面有著重要作用，所述毒素例如是炭疽桿菌的毒素(炭疽致死因子)和破傷風(fēng)及肉毒菌的神經(jīng)毒素。
其他金屬肽酶在各種感染例如HIV所引起的感染方面起到了重要作用(FR 2 707 169)。
J.Potempa和J.Travis可能發(fā)現(xiàn)了蛋白酶抑制劑在治療細(xì)菌或病毒性在疾病中的重要性。
在Turner等，2001、Kenny等，1977、Kenny等，1987、Beaumont等，1996中闡述了金屬肽酶的各種作用。
本發(fā)明的一個(gè)目的是上面所述的治療性肽或核酸作為鎮(zhèn)痛劑或抗抑郁劑的用途，其通過(guò)抑制周圍的、脊髓和/或脊髓上水平中的NEP和APN，據(jù)此增加了中樞性或周圍性內(nèi)源性阿片(包括腦啡肽)的作用的水平及持續(xù)時(shí)間。
本發(fā)明預(yù)期了對(duì)疼痛的預(yù)防或治療，特別是急性和慢性疼痛、內(nèi)臟炎性及神經(jīng)性疼痛。
對(duì)任何水-礦物質(zhì)失衡的預(yù)防或治療也是本發(fā)明的目標(biāo)。在靶向疾病中，可以包括由水-礦物質(zhì)失衡所引起的骨、牙、腎臟、甲狀旁腺、胰腺、腸、胃粘膜、前列腺和唾液腺疾病。
具體地，疾病可以選自高或低甲狀旁腺血癥、骨質(zhì)疏松、胰腺炎、頜下腺結(jié)石、腎結(jié)石和骨營(yíng)養(yǎng)不良。
對(duì)人際關(guān)系及行為障礙性疾病的預(yù)防或治療也是相關(guān)的。在WO02/05 1434中描述了各種精神疾病。
具體地，本發(fā)明涉及任何選自以下的疾病回避障礙(avoidance disorder)、感知減退障礙(decreased awareness disorder)、孤獨(dú)癥、兒童多動(dòng)癥(attentiondeficit hyperactivity disorder)、Hospitalism、人際關(guān)系功能障礙以及與外界的關(guān)系障礙(impaired interpersonal functioning and relationship to the externalworld)、精神分裂樣人格障礙、精神分裂癥、對(duì)環(huán)境的興趣降低(decreasedinterest in environment)、與性相關(guān)的社交活動(dòng)障礙、和性行為障礙(包括早瀉和性欲亢進(jìn))構(gòu)成。
所尋求的疾病(其中調(diào)控膜金屬肽酶的疾病)也包括高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、腫瘤、炎性關(guān)節(jié)炎和腸病。
也包括對(duì)感染的治療。特別是，在J.Potempa和Travis中可以發(fā)現(xiàn)蛋白酶抑制劑在治療細(xì)菌和病毒性疾病中的重要性。
上面所述的BPLP-肽、抗體或核酸也能用于控制免疫-炎癥應(yīng)答。
如上定義的BPLP-肽、抗體或核酸也能用作為利鈉劑或利尿劑。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是上面所定義的肽或核酸作為治療藥物濫用(主要是嗎啡類藥物濫用)中的替代品的用途。
事實(shí)上，研究已經(jīng)表明藥物濫用的易感性以及獎(jiǎng)賞(reward)和藥物依賴性的發(fā)生至少部分是內(nèi)源性阿片系統(tǒng)的先前存在的或誘導(dǎo)的改變和/或缺陷的結(jié)果。在這個(gè)方面，利用能增強(qiáng)內(nèi)源性腦啡肽的作用的BPLP-肽或核酸將減少因阻斷慢性嗎啡或海洛因給藥所產(chǎn)生的各種副作用(藥物撤退的軀體體征)。
根據(jù)本發(fā)明，需要減少BPLP-肽對(duì)NEP的抑制作用，例如通過(guò)使用抗BPLP蛋白或肽的抗體。這種NEP活性的增強(qiáng)在治療神經(jīng)退行性疾病例如與淀粉樣變性病相關(guān)的疾病或病癥方面是特別有利的。事實(shí)上，已經(jīng)顯示合成抑制劑如Neprilysin(神經(jīng)內(nèi)肽酶，NEP或腦啡肽)的抑制劑增加了淀粉樣蛋白β水平(Newell等，2003)。Leissring等，2003還報(bào)道了Neprilysin在神經(jīng)元中的轉(zhuǎn)基因的過(guò)度表達(dá)顯著地降低了Aβ水平，延遲或完全阻止了淀粉樣蛋白斑的形成以及與之相關(guān)的細(xì)胞病理，并且解救了在淀粉樣蛋白前體蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠中所具有的早死現(xiàn)象。
當(dāng)在疾病所影響的組織中或其鄰近部位發(fā)現(xiàn)了淀粉樣蛋白的沉積或淀粉樣蛋白斑時(shí)，或者疾病的特征是不可溶性的或可成為不可溶性的蛋白的過(guò)量產(chǎn)生時(shí)，認(rèn)為疾病或病癥與淀粉樣變有關(guān)。淀粉樣蛋白斑通過(guò)已知的或未知的機(jī)制可以直接地或間接地引發(fā)病理作用。淀粉樣變疾病的實(shí)例包括但不限于全身疾病例如慢性炎性病、多發(fā)性骨髓瘤、巨球蛋白血癥、家族性淀粉樣變多神經(jīng)病(Portuguese)和心肌病變(Danish)、全身性老年型淀粉樣變、家族性淀粉樣變多發(fā)腎臟病變(Iowa)、家族性淀粉樣變(Finnish)、Gerstmann-Straussler-Scheinker綜合征、伴蕁麻疹和耳聾的家族性淀粉樣變神經(jīng)病(Muckle-Wells綜合征)、甲狀腺髓樣癌、孤立性心房淀粉樣變、和血液透析相關(guān)的淀粉樣變(HAA)、和神經(jīng)退行性疾病。
術(shù)語(yǔ)“神經(jīng)退行性疾病”指的是神經(jīng)系統(tǒng)的疾病或病癥，具體地涉及到腦部，其表現(xiàn)未腦或神經(jīng)功能不全的癥狀特征，例如短期或長(zhǎng)期的記憶遺忘或缺陷、癡呆、認(rèn)知功能缺陷、平衡和協(xié)調(diào)問(wèn)題、情緒和行為缺陷。本發(fā)明更具體地涉及與淀粉樣變相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病。當(dāng)從表現(xiàn)出這些癥狀的對(duì)象的腦組織的組織病理(活檢)樣品中發(fā)現(xiàn)淀粉樣蛋白斑形成時(shí)，就認(rèn)為這些疾病是“與淀粉樣變相關(guān)”。因?yàn)閺幕铙w對(duì)象中取得腦的活檢標(biāo)本(特別是人腦)非常苦難，或者根據(jù)就不可能，癥狀或神經(jīng)退行性疾病的癥狀與淀粉樣變的相關(guān)性常常依據(jù)于不同于活檢樣品中存在淀粉樣蛋白沉積例如蛋白斑或纖維的標(biāo)準(zhǔn)。
在本發(fā)明的特異的實(shí)施方式中，神經(jīng)退行性疾病是阿耳茨海默病(AD)。在其他的實(shí)施方式中，疾病可能是罕見(jiàn)的Swedish病，特征是淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)中鄰近APP的PAP部分的氨基末端的兩個(gè)KM到NL突變。另一個(gè)這種疾病是伴有淀粉樣變的遺傳性腦出血(HCHA或HCHWA)-荷蘭型。本領(lǐng)域已知的以及在本發(fā)明的范圍之內(nèi)的其他這種疾病包括，但不限于散發(fā)性大腦淀粉樣血管病、遺傳性大腦淀粉樣血管病、Down綜合征、關(guān)島的帕金森-癡呆、以及年齡相關(guān)的無(wú)癥狀的淀粉樣變血管病。
在另一個(gè)方面，神經(jīng)退行性疾病是亞急性海綿狀腦病，例如但不限于瘋羊病、Creutzfeldt-Jakob病、Gerstmann-Straussler病、庫(kù)魯病、長(zhǎng)耳鹿和麇鹿的慢性廢用性疾病、牛的牛海綿狀腦病、以及貂的可傳染性腦病。
本發(fā)明還涉及調(diào)控內(nèi)源性BPLP蛋白或成熟產(chǎn)物(例如QRFSR)和膜金屬肽酶之間的相互作用的藥物在制備用于預(yù)防或治療疾病的治療性組合物的用途，在所述疾病中，需要調(diào)控所述膜金屬肽酶的活性。
篩選方法下面描述了容許本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇并純化出與相同的靶點(diǎn)結(jié)合并具有BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物(例如QRFSR肽)的激動(dòng)劑或拮抗劑的生物學(xué)活性的候選化合物的方法。
候選組合物可以是蛋白、肽、激素、抗體或合成組合物，它可以是肽或非肽分子，例如用常規(guī)的有機(jī)化學(xué)方法所能合成的任一化合物。
本發(fā)明提供了一種用于在體外篩選化合物的結(jié)合NEP上的結(jié)合BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物(例如QRFSR肽)的結(jié)合位點(diǎn)的能力的方法，其包括以下步驟a)在存在BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物(例如QRFSR肽)、或任一保留了BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物(例如YQRFSR肽)的結(jié)合特異性或生理學(xué)活性的肽時(shí)，將候選化合物與表達(dá)NEP的細(xì)胞孵育；b)確定候選化合物與BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物(例如QRFSR肽)或保留了BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物(例如YQRFSR肽)的結(jié)合特異性或生理學(xué)活性的肽競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合NEP的能力。
通常在4℃到25℃或37℃進(jìn)行候選化合物的結(jié)合檢測(cè)。
表達(dá)NEP的細(xì)胞可以是細(xì)胞培養(yǎng)物例如融合的單層的靶細(xì)胞培養(yǎng)物、或靶向器官標(biāo)本或組織樣品(例如冰凍切片、切片、膜制品或粗勻漿液)，其含有NEP上的結(jié)合BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物(例如QRFSR肽)的結(jié)合位點(diǎn)。
在本發(fā)明的篩選方法中所用的優(yōu)選的組織樣品是哺乳動(dòng)物脊髓的膜制品或切片，它是已知的適用于NEP活性測(cè)定的組織。
在本發(fā)明的篩選方法中所用的其他優(yōu)選的組織樣品是已知富含NEP肽酶和/或作為BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物(例如QRFSR肽)的靶點(diǎn)的所有周圍組織制備物。例如，可以使用哺乳動(dòng)物腎臟的外髓、胎盤、睪丸、前列腺和骨、例如，這些方法可以應(yīng)用于小鼠、大鼠或人來(lái)源的組織和/或細(xì)胞或經(jīng)金屬外肽酶cDNA(特別是NEP cDNA，特別是人NEP cDNA)所轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。
例如用放射性的(32P、35S、3H、125I等)或非放射性的標(biāo)記(異羥基洋地黃毒甙元、CyDye-銪、螢光素等)優(yōu)選地標(biāo)記BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物(或保留了BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物的結(jié)合特異性或生理學(xué)活性的肽)。然后在能發(fā)生特異性結(jié)合的條件下，將其與表達(dá)NEP的細(xì)胞孵育一段足以發(fā)生特異性結(jié)合的時(shí)間。
然后定量在不同濃度的所述候選化合物(例如從10-10到10-5M)時(shí)的與細(xì)胞特異性結(jié)合的標(biāo)記。
因此，本發(fā)明還提供了用于篩選與NEP上的結(jié)合BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物的結(jié)合位點(diǎn)特異性結(jié)合的化合物的方法，其包括以下步驟a)制備含有NEP上的結(jié)合BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物的結(jié)合位點(diǎn)的細(xì)胞培養(yǎng)物或器官標(biāo)本或組織樣品(例如冰凍切片或切片或膜制品或粗勻漿液)；b)加入待測(cè)試的候選化合物，以測(cè)試其與半飽和濃度的標(biāo)記蛋白或其成熟產(chǎn)物(或保留了BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物的結(jié)合特異性或生理學(xué)活性的肽)的競(jìng)爭(zhēng)性；c)在存在候選化合物時(shí)，在能發(fā)生特異性結(jié)合的條件下，將步驟a)的細(xì)胞培養(yǎng)物、器官標(biāo)本或組織樣品孵育一段足以發(fā)生特異性結(jié)合的時(shí)間；d)定量在不同濃度(從10-10到10-5M)的候選化合物時(shí)的與細(xì)胞培養(yǎng)物、器官標(biāo)本或組織樣品特異性結(jié)合的標(biāo)記。
在所述的上面的方法中，半飽和濃度是標(biāo)記的BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物(例如QRFSR肽)(或保留了BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物的結(jié)合特異性或生理學(xué)活性的肽)與50％NEP結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合時(shí)的濃度。
該方法也容許確定候選化合物與BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物(例如QRFSR肽)的親和力(或保留了BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物的結(jié)合特異性或生理學(xué)活性的肽)相比較的相對(duì)親和力。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是一種用于確定與NEP上的結(jié)合BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物(或保留了BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物的結(jié)合特異性或生理學(xué)活性的肽)的結(jié)合位點(diǎn)特異性結(jié)合的配體化合物的相對(duì)親和力的方法，所述方法包括上面用于每種候選化合物的方法中的步驟a)、b)、c)和d)，以及還包括步驟e)比較在步驟d)中所定量的每種候選混和物與其他一種候選化合物的親和力。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是一種用于確定與NEP上的結(jié)合BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物的結(jié)合位點(diǎn)特異性結(jié)合的化合物的親和力的方法，其包括以下步驟a)制備含有NEP上的結(jié)合BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物的結(jié)合位點(diǎn)的細(xì)胞培養(yǎng)物或器官標(biāo)本或組織樣品(例如冰凍切片或切片或膜制品或粗勻漿液)；b)加入先前已經(jīng)標(biāo)記了放射性或非放射性標(biāo)記的候選化合物；c)在存在標(biāo)記的候選化合物時(shí)，在能發(fā)生特異性結(jié)合的條件下，孵育步驟a)的細(xì)胞培養(yǎng)物、器官標(biāo)本或組織樣品一段足以發(fā)生特異性結(jié)合的時(shí)間；和d)定量在不同濃度(從10-10到10-5M)的候選化合物時(shí)的與細(xì)胞培養(yǎng)物、器官標(biāo)本或組織樣品特異性結(jié)合的標(biāo)記。
例如用放射性的(32P、35S、3H、125I等)或非放射性的標(biāo)記(異羥基洋地黃毒甙元、CyDye-銪、螢光素等)優(yōu)選地標(biāo)記候選化合物。然后在能發(fā)生特異性結(jié)合的條件下，將其與表達(dá)NEP的細(xì)胞孵育一段足以發(fā)生特異性結(jié)合的時(shí)間。
還可以比較所定量的每種候選化合物與其他一種候選化合物的親和力，使得確定與NEP上的結(jié)合BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物(例如QRFSR肽)結(jié)合位點(diǎn)特異性結(jié)合的候選化合物的相對(duì)親和力。
本發(fā)明還提供了一種在體外篩選化合物作為BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物對(duì)NEP活性的激動(dòng)劑或拮抗劑的能力的方法，所述方法包括步驟a)在存在(i)BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物(例如QRFSR肽)、或任一保留了BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物(例如YQRFSR肽)的結(jié)合特異性或生理學(xué)活性的肽和(ii)NEP底物時(shí)，將候選化合物與表達(dá)NEP的細(xì)胞孵育；b)確定NEP對(duì)NEP底物的內(nèi)切蛋白酶解作用，其中如果存在候選化合物時(shí)的內(nèi)切蛋白酶解與不存在候選化合物時(shí)的內(nèi)切蛋白酶解相比是增加的，說(shuō)明所述化合物具有拮抗劑活性；而如果存在候選化合物時(shí)的內(nèi)切蛋白酶解與不存在候選化合物時(shí)的內(nèi)切蛋白酶解相比是減少的，說(shuō)明所述化合物具有激動(dòng)劑活性。
BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物的激動(dòng)劑在此是一種具有抑制金屬外肽酶活性(特別是NEP或APN活性)的能力的分子。
BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物的拮抗劑在此是一種具有增加金屬外肽酶活性(特別是NEP或APN活性)的能力的分子。
此外，在確定該候選化合物所誘導(dǎo)的代謝改變中，可以評(píng)價(jià)候選化合物的激動(dòng)劑或拮抗劑活性，所述代謝改變是例如作為經(jīng)蛋白激酶或腺苷酸環(huán)化酶的傳導(dǎo)信號(hào)的結(jié)果的初級(jí)或二級(jí)信使代謝的合成和/或釋放、以及G家族蛋白的活化。
在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明也涉及一種篩選作為BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物的激動(dòng)劑的化合物的方法，其包括以下步驟a)制備含有NEP上的結(jié)合BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物的結(jié)合位點(diǎn)的細(xì)胞培養(yǎng)物或器官標(biāo)本或組織樣品(例如冰凍切片或切片或膜制品或粗勻漿液)；b)孵育步驟a)中的細(xì)胞培養(yǎng)物、器官標(biāo)本和組織樣品(濃度為容許在存在候選化合物時(shí)能檢測(cè)到NEP酶活性(優(yōu)選為地從10-10到10-5M))、半飽和濃度的BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物(或任一保留了BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物的結(jié)合特異性或生理學(xué)活性的肽)和NEP底物一段足以在初始速度條件下發(fā)生NEP底物的內(nèi)切蛋白酶解的時(shí)間；
c)分別通過(guò)測(cè)定在存在或不存在候選化合物以及在存在或不存在BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物或保留了BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物的結(jié)合特異性或生理學(xué)活性的肽時(shí)NEP底物內(nèi)切蛋白酶解的水平，以便定量步驟a)中的生物學(xué)材料中所具有的NEP活性。
在所述的上面的方法中，半飽和濃度是造成NEP底物的降解減少一半的BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物的濃度。
本發(fā)明的另一個(gè)目的包括一種篩選作為BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物的拮抗劑的化合物的方法，其包括以下步驟a)制備含有NEP上的結(jié)合BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物的結(jié)合位點(diǎn)的細(xì)胞培養(yǎng)物或器官標(biāo)本或組織樣品(例如冰凍切片或切片或膜制品或粗勻漿液)；b)孵育步驟a)中的細(xì)胞培養(yǎng)物、器官標(biāo)本和組織樣品(濃度為容許在存在次最大濃度的BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物(或或任一保留了BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物的結(jié)合特異性或生理學(xué)活性的肽)時(shí)，在初始速度條件下檢測(cè)到NEP酶活性的濃度)、NEP底物和候選化合物一段足以在初始速度條件下發(fā)生NEP底物的內(nèi)切蛋白酶解的時(shí)間；c)分別通過(guò)測(cè)定在存在或不存在候選化合物以及在存在或不存在BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物或保留了BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物的結(jié)合特異性或生理學(xué)活性的肽時(shí)的NEP底物內(nèi)切蛋白酶解的水平，以便定量出步驟a)中的生物學(xué)材料中所具有的NEP活性。
在所述的上面方法的優(yōu)選的實(shí)施方式中，次最大濃度是造成底物降解減少至少50％或優(yōu)選地至少75％的肽的濃度。
下面的實(shí)施例和附圖舉例說(shuō)明了本發(fā)明，其不限制本發(fā)明的范圍。


圖1顯示了3H-YQRFSR標(biāo)記物加入到對(duì)應(yīng)于2.5ml人唾液的2.5ml唾液甲醇-酸提取物中所得到的代表性的陽(yáng)離子交換HPLC譜。主要的放射性峰的回收率被測(cè)定為75-84％(點(diǎn)狀欄)。
圖2顯示了從7ml人唾液中獲得的唾液甲醇-酸提取物的代表性的陽(yáng)離子交換HPLC譜。分析了各個(gè)級(jí)分的抑制人外-內(nèi)肽酶活性對(duì)P物質(zhì)的內(nèi)切蛋白酶解的能力(LNCaP細(xì)胞株)。
圖3是主要HPLC-EC活性13-14級(jí)分的代表性的反相HPLC譜(點(diǎn)狀欄)。分析了該級(jí)分抑制人外-內(nèi)肽酶活性內(nèi)切蛋白酶解P物質(zhì)的能力(LNCaP細(xì)胞株)。
圖4是主要HPLC-RP活性級(jí)分的代表性的反相HPLC譜(點(diǎn)狀欄)。分析了該級(jí)分抑制人外-內(nèi)肽酶活性內(nèi)切蛋白酶解P物質(zhì)的能力(黑欄)，以及它們?cè)?74nm處的吸光度(黑線)。
圖5顯示了BPLP-QRFSR肽對(duì)人外-內(nèi)肽酶活性降解P物質(zhì)的影響(LNCaP細(xì)胞株)，QRFSR肽的有效濃度范圍是從1到25μM，半最大濃度為11μM。
圖6顯示了hBPLP-QRFSR肽的YQRFSR衍生物對(duì)人外-內(nèi)肽酶活性降解P物質(zhì)的影響(LNCaP細(xì)胞株)，YQRFSR肽的有效濃度范圍是從5到50μM，半最大濃度為30μM。
圖7顯示了hBPLP-QRFSR肽的YQRFSR衍生物對(duì)鼠NEP外-內(nèi)肽酶活性降解P物質(zhì)的影響(腎臟組織)，YQRFSR肽的有效濃度范圍是從5到75μM，半最大濃度為38μM。
圖8是對(duì)YQRFSR肽的RP-HPLC色譜分析。YQRFSR肽(175μM)在體外不受人細(xì)胞表面內(nèi)肽酶的代謝，同時(shí)它抑制了70％的人外內(nèi)肽酶所介導(dǎo)的P物質(zhì)的內(nèi)切蛋白酶解。RP-HPLC色譜特征發(fā)現(xiàn)1/YQRFSR肽不受含有NEP的人細(xì)胞膜的代謝，回收了93％的完整肽，在沒(méi)有代謝膜時(shí)，回收了94％。
2/在相同的試驗(yàn)條件下，YQRFSR肽抑制了70％的這些人細(xì)胞膜對(duì)P物質(zhì)的內(nèi)切蛋白酶解。
圖9顯示了QRFSR肽對(duì)重組人NEP降解P物質(zhì)的抑制作用。QRFSR肽對(duì)可溶性重組人NEP活性的濃度依賴性的抑制作用，以及QRFSR肽對(duì)可溶性重組hDPPIV活性對(duì)P物質(zhì)的內(nèi)切蛋白酶解沒(méi)有作用。
圖10顯示了QRFSR肽對(duì)細(xì)胞表面人APN降解APN合成底物的抑制作用。QRFSR肽濃度依賴性地抑制了細(xì)胞表面的HEK-hAPN對(duì)Ala-pNA顯色底物的降解。
圖11顯示了QRFSR肽對(duì)細(xì)胞表面人NEP降解NEP合成底物的抑制作用。QRFSR肽濃度依賴性地抑制了細(xì)胞表面的HEK-hAPN對(duì)Mca-BK2產(chǎn)熒光底物的降解。
圖12顯示了YQRFSR肽在體內(nèi)對(duì)鼠花費(fèi)在舔爪(經(jīng)福爾馬林注射過(guò)的后爪)上的時(shí)間的影響。平均值±SEM。
圖13顯示了YQRFSR肽在體內(nèi)對(duì)后爪注射福爾馬林之后的痛性痙攣的次數(shù)的影響。平均值±SEM。
圖14顯示了YQRFSR肽在體內(nèi)對(duì)在注射福爾馬林后60分鐘后的痛性痙攣指數(shù)的影響。QRFSR衍生肽所誘導(dǎo)的鎮(zhèn)痛作用需要激活內(nèi)源性阿片受體。
實(shí)施例本研究被設(shè)計(jì)用于搜索天然的金屬外肽酶(特別是NEP和/或APN)的抑制物，特別是在人體唾液分泌物中。對(duì)該產(chǎn)物的檢測(cè)和分離的策略是依據(jù)于對(duì)唾液低分子量組分的分離，該組分抑制了表達(dá)膜錨定人NEP的人體細(xì)胞對(duì)NEP敏感性底物的內(nèi)切蛋白酶解。本發(fā)明者已經(jīng)開發(fā)出了功能檢測(cè)(表達(dá)NEP的LNCaP和HEK人類細(xì)胞的膜制品)和分子分離(HPLC色譜系統(tǒng))的模型，其被用于通過(guò)序列分析人體中的天然的內(nèi)源性NEP外肽酶抑制物即鼠Sialorphin的內(nèi)源性的唾液功能類似物所進(jìn)行的鑒定。
實(shí)施例1人體唾液制劑建立了臨床研究方案，其為巴斯德研究院的“centre de recherche Vaccinaleet Biomedicale”，編號(hào)為2045，該研究方案獲得了CCPPRB委員會(huì)(PARIS-COCHIN)的同意，并得到了10名健康男性志愿者的人體唾液，該研究開始于2003年5月，繼續(xù)進(jìn)行于2003年10月。將唾液收集到先前冷卻的含有抑肽酶(1000KIU/ml)、Pefabloc(0.4mM)和HCl(0.1N)(終濃度)的“microsorp”管內(nèi)，預(yù)期該培養(yǎng)基能抑制蛋白裂解活性。因此，將唾液樣品儲(chǔ)存于-80℃，直到進(jìn)行甲醇提取操作。
實(shí)施例2NEP抑制的材料和試驗(yàn)?zāi)Ｐ?-人外肽酶NEP和APN的來(lái)源已經(jīng)描述了一些表達(dá)NEP和金屬外肽酶家族的其它成員的人細(xì)胞株，其中這些細(xì)胞株是成骨細(xì)胞細(xì)胞株MG-63(骨肉瘤)、滋養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞株BeWo(胎盤絨毛膜癌)、前列腺上皮細(xì)胞株LNCaP(腺癌)、和腸細(xì)胞細(xì)胞株Caco-2(直結(jié)腸癌)。首先開發(fā)出給定培養(yǎng)基中的用于細(xì)胞藥理學(xué)分析的培養(yǎng)條件。其次，本發(fā)明者已經(jīng)用Northern印跡和免疫細(xì)胞化學(xué)分子確定LNCaP和BeWo是唯一能在給定的培養(yǎng)條件下(即含有胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和硒的RPMI，GIBCO)以及分別在DHT(二氫睪酮)和forskolin的誘導(dǎo)之后能表達(dá)NEP(ARNm和細(xì)胞表面蛋白)的細(xì)胞株。最后，在靜態(tài)孵育源自這些細(xì)胞的膜制品的試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，本發(fā)明者已經(jīng)確定了容許在初始速度測(cè)定的條件(即100pM/分鐘/μg LNCaP細(xì)胞膜蛋白)下分析人NEP介導(dǎo)的對(duì)P物質(zhì)的內(nèi)切蛋白酶解的參數(shù)(比BeWo的特異活性低10倍)。在存在特異的合成NEP抑制物(例如thiorphan)時(shí)，抑制了LNCaP膜活性(500nM達(dá)到了62％的最大抑制力)。相反的，分別阻斷氨肽酶(APN、APB)和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)活性的bestatin(25μM)和卡托普利(10μM)不能抑制細(xì)胞表面外肽酶對(duì)P物質(zhì)的水解，因此說(shuō)明在試驗(yàn)條件下，P物質(zhì)的細(xì)胞外降解主要是由位于這些細(xì)胞表面上的NEP內(nèi)肽酶活性所引起的。
另外，也已經(jīng)開發(fā)出了利用經(jīng)人NEP cDNA或人APN cDNA(HEK細(xì)胞不表達(dá)這些金屬外肽酶)轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞的膜制品或可溶性重組人NEP或可溶性重組人DPP IV(二肽基氨基肽酶IV)(沒(méi)有N末端的胞漿和跨膜片段)的體外模型。
2-底物和抑制劑在體外，通過(guò)在體外測(cè)定下面的合成及天然底物的降解可以檢測(cè)出人細(xì)胞膜的膜氨基-和內(nèi)-外肽酶活性a/合成的特異的產(chǎn)熒光的或顯色的底物
-Mca-R-P-P-G-F-S-A-F-K(Dnp)-OH和/或Suc-A-A-F-Amc(NEP)(R&Dsystems and Bachem)-Ac-A-Amc或Ala-pNA(APN)(Bachem)b/生理底物-修飾的氚標(biāo)記的P物質(zhì)[(3，43H)Pro2-Sar9-Met(O2)11]-P物質(zhì)(DuPont-NEN)和天然的P物質(zhì)R-P-K-P-Q-Q-F-F-G-L-M(NEP-DPPIV-ACE)(Peninsula-Biovalley)；-天然的甲硫氨酸腦啡肽Y-G-G-F-M(NEP-APN)(Peninsula-Biovalley)在存在或不存在不同的可獲得的選擇性的合成肽酶抑制劑時(shí)，用細(xì)胞膜肽酶測(cè)定這些底物的水解可以檢測(cè)出肽檢測(cè)法的特異性-Thiorphan，Phosphoramidon(NEP)(Sigma and Roche)-Bestatin，Amastatin(APN)(Calbiochem)-DPPIV抑制劑(DPPIV)(Calbiochem)-Captopril(ACE)(Sigma)3-肽酶活性的測(cè)定根據(jù)對(duì)鼠Sialorphin的功能表征中所開發(fā)及建立出的方案測(cè)定外肽酶活性(Rougeot等，2003)。簡(jiǎn)單地，對(duì)于膜制品，將細(xì)胞在4℃下勻漿于10份體積(體積/重量)的50mM Tris/HCl(緩沖于pH7.1)中。在1000xg和5℃下進(jìn)行第一次離心5分鐘，以便去除細(xì)胞碎片和沉淀物中的細(xì)胞核。在100000xg和5℃下進(jìn)行第二次離心30分鐘，以便濃縮沉淀物中的膜級(jí)分，將其在冷Tris/HCl緩沖液中輕輕地洗滌三次，重懸于新鮮緩沖液內(nèi)，取樣并將其儲(chǔ)存于-80℃，直到被用作酶源。利用以牛血清白蛋白(BSA)作為標(biāo)準(zhǔn)物的Bio-RadDC蛋白檢測(cè)法進(jìn)行蛋白測(cè)定。
在存在或不存在特異性抑制劑時(shí)，通過(guò)監(jiān)測(cè)初始速度測(cè)定值條件下的代謝率測(cè)定出底物的水解。將抑制物加入到預(yù)孵育培養(yǎng)基中。標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)混合物包括終體積為200μL 50mM Tris-HCl(pH值6.5-7.2)內(nèi)的細(xì)胞膜。在預(yù)孵育10分鐘之后，加入底物，并在25℃的持續(xù)搖晃水箱中進(jìn)行消化20分鐘。通過(guò)冷卻到4℃并加入HCl(終濃度為0.3N)來(lái)終止反應(yīng)。然后離心反應(yīng)管(4700xg，4℃，15分鐘)，并測(cè)定出剩余的完整底物及其代謝物。
對(duì)于天然底物(P物質(zhì)和Met-腦啡肽)的應(yīng)用，根據(jù)它們的不同的疏水特征分離并定量出反應(yīng)產(chǎn)物-用C-18 Sep-Pak cartridges(Waters)分析放射性標(biāo)記的P物質(zhì)的水解。用H2O-0.1％TFA以及25％甲醇-0.1％TFA(每種4ml)洗脫分離出3H代謝物。用75-100％甲醇-0.1％TFA(4ml)洗脫出完整的氚標(biāo)記的底物。
-用RP-HPLC結(jié)合分光光度計(jì)分析Met-腦啡肽的水解(C-18LUNAcolumn，AIT)。用線性梯度為0.1％TFA的水溶液到0.1％TFA的100％乙腈溶液(1ml/min)洗脫30分鐘，可以分離出兩種Met-腦啡肽代謝物(YGG5.8±0.2；FM12.8±0.1分鐘滯留時(shí)間)和完整底物(YGGFM18.8±0.2分鐘)。通過(guò)監(jiān)測(cè)在264nm(L3000 Merck)處的柱流出物可以檢測(cè)它們的身份和相對(duì)數(shù)量(峰高)。
-也用放射免疫檢測(cè)法(RIA)定量處初始Met-腦啡肽底物的缺失。檢測(cè)使用抗Met-腦啡肽抗血清(Gros等，1978)和125I-Met-腦啡肽(80TBq/mmol，NEN)；它可檢測(cè)出微摩爾濃度的Tyr-Gly-Gly和Phe-Met代謝物終的納摩爾濃度的Met-腦啡肽。用液閃光譜法可以測(cè)定出每個(gè)級(jí)分的放射性強(qiáng)度。
對(duì)于合成底物的應(yīng)用，可以用多孔熒光分光光度計(jì)直接分析出現(xiàn)熒光信號(hào)(強(qiáng)度和偏振)的動(dòng)力學(xué)；信號(hào)的強(qiáng)度直接與反應(yīng)期間所形成的代謝物的量成比例。
實(shí)施例3人唾液純化和色譜法人唾液組分的提取及純化方案類似與為分子表征大鼠唾液中的Sialorphin所開發(fā)和建立的方案(Rougeot等，1994)，分析了提取物和色譜級(jí)分抑制含NEP的人細(xì)胞膜對(duì)生理底物P物質(zhì)的水解的能力。
提取并純化作為腦啡肽活性的強(qiáng)調(diào)節(jié)劑的人唾液組分。簡(jiǎn)單地，在4℃下凍融之后，根據(jù)下面的方案處理唾液樣品-甲醇-酸提取方案4℃下提取甲醇-酸中的的分子量組份；將1體積的唾液加入到4體積的含有0.1％四氟乙酸(TFA)溶液的甲醇中。第一步要實(shí)現(xiàn)去除高分子量的蛋白(包括降解酶)，所述蛋白分別在酸和甲醇介質(zhì)中被滅活和沉淀，并容許溶解小分子量的唾液成分(10≤Kda)。快速地渦旋甲醇混合物，并在12000g和4℃下離心15分鐘，經(jīng)在-110℃下凍干從上清液中去除甲醇。
-HPLC陽(yáng)離子交換色譜法(HPLC-EC)將甲醇提取的唾液溶解于溶劑A(即10mM醋酸銨，pH值為4.3)中，并將其注射到HEMA-IEC BIO-1000羧甲基柱(Alltech)中。根據(jù)它們的陽(yáng)離子特征，分別用兩步線性梯度10-500mM和500-900mM醋酸銨(pH值4.7)(流速為1ml/min)洗脫并分離出組分。收集2ml級(jí)分，并在凍干后測(cè)試其抑制人外肽酶活性(LNCaP)的能力。
如圖1所示，利用加入到代表性唾液樣品中的內(nèi)在標(biāo)準(zhǔn)物(氚標(biāo)記的肽3H-YQRFSR)評(píng)價(jià)提取和連續(xù)色譜的質(zhì)量和回收率；加入到對(duì)應(yīng)于2.5ml人體唾液所提取到的樣品中的標(biāo)記物的回收率是75-84％。對(duì)甲醇提取的唾液的HPLC陽(yáng)離子交換色譜法(圖2，對(duì)應(yīng)于7ml人體唾液的唾液提取物的代表性色譜)清楚地顯示出存在著兩種主要的分子唾液組分，其被洗脫于第一步的醋酸銨梯度值(10-500mM)，滯留時(shí)間分別為26-28分鐘和36-38分鐘，該組分抑制了90％的人膜結(jié)合肽酶對(duì)P物質(zhì)的內(nèi)切蛋白酶解(圖2中可見(jiàn)的兩個(gè)滯留時(shí)間為6和48分鐘的活性峰分別對(duì)應(yīng)于洗脫液和柱的總體積)。
-HPLC反相色譜法(RP-HPLC)。將先前HPLC-EC的活性級(jí)分溶解于溶劑A
中，并將其注射到Synergi Max-RP柱(Phenomenex)內(nèi)。用線性梯度1-99％溶劑B[乙腈-TFA的體積比為100-0.1]洗脫樣品組分。收集1ml級(jí)分，并在凍干后分析其抑制細(xì)胞表面的人外肽酶活性(LNCaP)的能力。內(nèi)標(biāo)記物的回收率為61％。RP-HPLC(圖3)對(duì)從先前HPLC-EC的13-14級(jí)分(滯留時(shí)間為26-28分鐘)中所分離到的活性分子形式的分離顯示出存在兩種主要的抑制人外肽酶活性的分子群，并且其被洗脫于乙腈梯度值內(nèi)，滯留時(shí)間分別為23-25和28-30分鐘。
將這些級(jí)分在經(jīng)線性梯度1-99％溶劑B[100％甲醇-0.1％TFA]洗脫的synergi Max-RP-HPLC柱中進(jìn)行進(jìn)一步的純化。在1分鐘的間隔內(nèi)，將柱洗脫液收集于microsorb管內(nèi)，并在凍干后測(cè)試這些級(jí)分的抑制抑制NEP的活性。如圖4所示，分離出了滯留時(shí)間分別為20-21以及29-30分鐘的兩種抑制人外肽酶對(duì)P物質(zhì)的內(nèi)切蛋白酶解的形式，并且確定了它們的氨基酸序列。
-Ciphergen蛋白芯片和氨基酸序列分析。利用Applied Biosystems肽測(cè)序儀(plate-forme d′Analyse et deMicros quen age des Prot ines，Institut Pasteur)，通過(guò)自動(dòng)化的Edman降解進(jìn)行N末端的序列分析。從最后的RP-HPLC中在滯留時(shí)間為10分鐘時(shí)所洗脫下的分子形式(級(jí)分20)對(duì)應(yīng)于690和769.5Da分子量，并且對(duì)應(yīng)于下面的5個(gè)氨基酸殘基的序列QRFSR。在26分鐘滯留時(shí)間所洗脫下的級(jí)分(級(jí)分28)分別對(duì)應(yīng)于兩種分子組分622-666Da和6495Da；對(duì)最高分子量的氨基酸的測(cè)定顯示它對(duì)應(yīng)于唾液的堿性富脯氨酸的多肽序列，是人的61個(gè)氨基酸序列的PRP-E(Isemura等，1982)。
通過(guò)與大鼠唾液Sialorphin的類比，這些數(shù)據(jù)為人唾液Sialorphin樣肽的存在提供了直接證據(jù)，所述肽是五肽QRFSR，其在結(jié)構(gòu)與功能上都與大鼠的五肽QHNPR非常接近，并且被分泌到人唾液分泌物內(nèi)。它們支持了QRFSR是前體蛋白經(jīng)蛋白裂解加工處理后的成熟產(chǎn)物，加工的方式類似于SMR1和肽激素前體的成熟途徑。此外，至于QHNPR大鼠肽，所分泌的QRFSR肽似乎以不同的形式蓄積于人唾液分泌物內(nèi)，其中游離形式可能包括乙酸鹽形式，以及復(fù)合形式包括了與唾液PRP-E的高疏水性的相互作用。
實(shí)施例4QRFSR肽的合成和測(cè)試合成QRFSR肽，并在人LNCaP細(xì)胞膜靜態(tài)孵育物的試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，體外分析QRFSR抑制生理的NEP底物(P物質(zhì))的降解的能力。QRFSR肽抑制了人前列腺上皮細(xì)胞表面上所表達(dá)的NEP介導(dǎo)的對(duì)P物質(zhì)的細(xì)胞外的內(nèi)切蛋白酶解。QRFSR的有效濃度為1到25μM，半最大(IC50)濃度為11μM(圖5)。令人驚訝的是，在所觀察的鼠Sialorphin對(duì)人NEP活性的抑制作用不同的是，人QRFSR肽對(duì)鼠腎臟NEP活性的抑制作用比對(duì)人細(xì)胞表面NEP活性的抑制作用至少低10倍。衍生肽YQRFSR(被合成用于開發(fā)抗體和免疫檢測(cè)測(cè)定系統(tǒng)中的氚標(biāo)記的以及免疫原性的綴合物)明顯地表現(xiàn)出對(duì)人和鼠外-內(nèi)肽酶活性的相似的抑制作用(圖6和7)。
表天然的和衍生的人及鼠肽對(duì)人和鼠外內(nèi)肽酶活性的抑制能力

除了可能成熟于hPB基因產(chǎn)物的QRGPR肽(20-90μM)對(duì)LNCaP人細(xì)胞膜所誘導(dǎo)的P物質(zhì)內(nèi)切蛋白酶解沒(méi)有影響外，該結(jié)果使得本發(fā)明者推測(cè)天然NEP抑制物五肽中的三個(gè)中心氨基酸(常見(jiàn)的是Q-N末端和R-C末端)是它們與NEP外內(nèi)肽酶的功能性相互作用的親和力和/或特異性的決定性信號(hào)。此外，除了鼠和人NEP之間的強(qiáng)的初級(jí)氨基酸類似性(#85％)之外，本發(fā)明者觀察到了兩種天然抑制物五肽(分別是鼠QHNPR和人QRFSR)的功能性相互作用的相對(duì)特異性。所有的這些結(jié)果都為存在兩種外酶的二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)象特異性提供了證據(jù)，對(duì)Sialorphin或其衍生物與人NEP所形成的二元復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)的測(cè)定，容許進(jìn)一步了解這些天然抑制物的結(jié)合模式。
本發(fā)明者利用氚標(biāo)記的3H-YQRFSR肽在成熟雄鼠體內(nèi)建立了鼠Sialorphin的這種人類功能性肽模擬物的藥物動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)的參數(shù)(生物分布-生物利用度-清除率)，以及確定了它在體內(nèi)和體外的代謝機(jī)制和轉(zhuǎn)化(圖8)。RP-HPLC色譜特征發(fā)現(xiàn)-YQRFSR肽不受含NEP的人細(xì)胞膜的代謝，事實(shí)上，回收了93％完整肽，而沒(méi)有代謝膜時(shí)，回收了94％；-在相同的試驗(yàn)條件下，YQRFSR肽抑制了70％的這些人細(xì)胞膜對(duì)P物質(zhì)的內(nèi)切蛋白酶解。
因此，YQRFSR能用于研究BPLP成熟產(chǎn)物在急性疼痛(例如針刺疼痛試驗(yàn)和福爾馬林試驗(yàn))的鼠行為模型中的鎮(zhèn)痛活性，這些模型已經(jīng)被用于研究Sialorphin在體內(nèi)的功能特征(Rougeot等，2003)。
實(shí)施例5在體外進(jìn)一步表征QRFSR肽通過(guò)在利用純化的可溶性人NEP和人DPPIV(沒(méi)有N末端的胞漿和跨膜片段)的體外酶檢測(cè)法中測(cè)定P物質(zhì)(SP)的內(nèi)切蛋白酶解，可以評(píng)價(jià)QRFSR肽的抑制特異性。利用選擇性的重組hNEP檢測(cè)法，建立了人QRFSR肽與hNEP的分子相互作用，這給肽抑制hNEP活性提供了直接證據(jù)，如圖9所示，QRFSR肽阻止了90％的NEP介導(dǎo)的SP的內(nèi)切蛋白酶解，它的抑制力確實(shí)是濃度依賴性的(r2＝0.99，n＝18)，范圍從5到50μM，半最大濃度是29±1μM。相反，25到50μM的QRFSR肽都不能阻止重組hDPPIV對(duì)SP的降解，說(shuō)明QRFSR肽在體外對(duì)分解代謝SP的細(xì)胞表面外酶的抑制力僅僅是因?yàn)樗鼈兣cNEP外肽酶的特異的相互作用。此外，從監(jiān)視SP的體外代謝的研究中，顯示出QRFSR肽和鼠QHNPR-Sialorphin一樣都不能完全地阻止脊髓的SP滅活外肽酶對(duì)內(nèi)源性SP的降解，因此在體內(nèi)不能完全阻止SP介導(dǎo)的傷害作用。
外肽酶(NEP和APN)在體內(nèi)以驚人的效率(在數(shù)秒鐘內(nèi))滅活腦啡肽。因?yàn)镹EP和APN在腦啡肽滅活中的互補(bǔ)作用，僅僅合成的NEPAPN合成抑制物可以在不同的疼痛模型中誘導(dǎo)出抗傷害應(yīng)答。
因此，在利用選擇性地表達(dá)人膜錨定的NEP或APN的重組HEK人類細(xì)胞的膜制品的酶檢測(cè)法中，評(píng)價(jià)了QRFSR肽的抑制特異性。在實(shí)驗(yàn)室中開發(fā)出了這些轉(zhuǎn)染的細(xì)胞模型。通過(guò)測(cè)定人工的特異性產(chǎn)熒光底物的降解可以在體外檢測(cè)出人細(xì)胞膜的膜氨基-和內(nèi)-外肽酶活性，所用的NEP底物是Mca-R-P-P-G-F-S-A-F-K-(Dnp)-OH(Mca-BK2)以及APN底物是Ala-pNA。利用選擇性的膜錨定hNEP檢測(cè)法，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)QRFSR肽對(duì)NEP對(duì)Mca-BK2的內(nèi)切蛋白酶解的抑制作用是濃度依賴性的(r2＝0.88，n＝29個(gè)測(cè)定點(diǎn))，以及有效劑量范圍是從5到50μM。利用選擇性的膜錨定的hAPN檢測(cè)法，本發(fā)明者已經(jīng)證實(shí)QRFSR肽抑制了hAPN對(duì)Ala-pNA的降解，有效劑量是10到90μM(r2＝0.93，n＝22個(gè)測(cè)定點(diǎn))(見(jiàn)圖10和11)。
表1QRFSR在體外和體內(nèi)對(duì)NEP和APN外酶活性的抑制作用(IC50)的總結(jié)。

這些結(jié)果說(shuō)明人QRFSR五肽在體外是一種NEP和APN外肽酶活性的有效的雙重抑制劑。此外，因?yàn)镹EP和APN在腦啡肽滅活中的互補(bǔ)作用，以及與表現(xiàn)出強(qiáng)的鎮(zhèn)痛活性的鼠Sialorphin的類似性，組合的生物學(xué)信息和所獲得的基因組信息使得本發(fā)明者推測(cè)QRFSR肽在體內(nèi)通過(guò)抑制滅活腦啡肽的NEP-APN外肽酶而實(shí)現(xiàn)了腦啡肽依賴性的抗傷害的機(jī)制。
實(shí)施例6QRFSR肽在體內(nèi)的功能表征盡管在大鼠和人NEP之間存在著強(qiáng)的初級(jí)氨基酸序列的同源性(≠85％)，本發(fā)明者在兩種抑制劑五肽(分別是大鼠QHNPR和人QRFSR)的抑制力上觀察到了相對(duì)的物種選擇性。所合成的氚標(biāo)記的衍生肽YQRFSR表現(xiàn)出了對(duì)人和大鼠外內(nèi)肽酶的相對(duì)相似的抑制效率(有效濃度范圍在5到50μM之間)。因此，在急性疼痛的行為鼠模型(即福爾馬林試驗(yàn))中研究了QRFSR衍生肽的抗傷害作用，該模型也被用于對(duì)鼠Sialorphin作用的體內(nèi)表征(Rougeot等，2003)。全身施用0.5和1mg/kg的YQRFSR肽抑制了早期(注射福爾馬林后的頭20分鐘)的舔爪(福爾馬林注射過(guò)的后爪)。例如，它明顯地減少了治療鼠在舔爪上所花費(fèi)的時(shí)間，從144±17s，n＝(載體)到97±14s，n＝8(0.5mg/kg)(p＝0.05)以及到84±13s，n＝8(1mg/kg)(p＝0.02，Dunnett t檢驗(yàn))。令人驚訝的是，與大鼠Sialorphin處理過(guò)的大鼠不同的是，YQRFSR處理過(guò)的大鼠在福爾馬林試驗(yàn)的后期(福爾馬林注射后40到60分鐘)在舔爪上所花費(fèi)的時(shí)間更少(載體處理過(guò)的大鼠63±13s對(duì)1mg/kg處理過(guò)的大鼠9±3s，p＝0.001)。在福爾馬林誘導(dǎo)的疼痛模型中，盡管在有效劑量上不如大鼠Sialorphin強(qiáng)(100-200μg/kg)，但是QRFSR衍生肽似乎有著與合成的混合NEP-APN抑制物RB101(2.5-5mg/kg，IV)同樣有效的疼痛抑制力(1mg/kg，IV)。
這些數(shù)據(jù)(如圖12、13和14所示)清楚地說(shuō)明YQRFSR肽抑制了急性和長(zhǎng)期化學(xué)刺激所誘導(dǎo)的傷害作用。
它的鎮(zhèn)痛能力與3mg/kg劑量嗎啡幾乎一樣有效。
此外，在存在阿片受體拮抗劑thenalaxone時(shí)，可以完全逆轉(zhuǎn)QRFSR衍生肽在化學(xué)激發(fā)的疼痛行為中所誘導(dǎo)的鎮(zhèn)痛作用，這與其鎮(zhèn)痛作用涉及到內(nèi)源性阿片能途徑是相一致的。
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180 185 190Ile Ser Ser Asn Pro Arg Ser Ile Tyr195 200<210>3<211>5<212>PRT<213>Homo sapiens<400>3Gln Arg Phe Ser Arg1 5<210>4<211>6<212>PRT<213>Homo sapiens<400>4Tyr Gln Arg Phe Ser Arg1 5<210>5<211>6<212>PRT<213>Homo sapiens<400>5Cys Gln Arg Phe Ser Arg1 權(quán)利要求
1.一種肽，其是堿性富脯氨酸淚液蛋白(BPLP)的成熟產(chǎn)物或所述成熟產(chǎn)物的肽衍生物，其中所述肽或肽衍生物表現(xiàn)出對(duì)金屬外肽酶的調(diào)控性能、特別是抑制性能。
2.權(quán)利要求1的肽，其中所述金屬外肽酶是NEP或APN。
3.權(quán)利要求1的肽或肽衍生物，其中所述肽或肽衍生物包括序列X1-X2-Arg-Phe-Ser-Arg，其中—X1代表H原子或Tyr氨基酸或Cys氨基酸；—當(dāng)X1是氫原子時(shí)，X2代表Gln或Glp；或者當(dāng)X1是Tyr時(shí)，X2代表Gln，其中所述序列X1-X2-Arg-Phe-Ser-Arg是所述肽的C末端部分。
4.權(quán)利要求1的肽，其由序列X1-X2-Arg-Phe-Ser-Arg組成。
5.權(quán)利要求3的肽，其中所述肽包括序列QRFSR、YQRFSR、或CQRFSR。
6.權(quán)利要求5的肽，其由序列QRFSR組成。
7.權(quán)利要求5的肽，其由序列YQRFSR組成。
8.權(quán)利要求5的肽，其由序列CQRFSR組成。
9.編碼權(quán)利要求1到8中任一項(xiàng)的肽的核酸。
10.用于克隆和/或表達(dá)的載體，所述載體包括權(quán)利要求9的核酸。
11.包括權(quán)利要求9的核酸或權(quán)利要求10的載體的宿主細(xì)胞。
12.特異性識(shí)別權(quán)利要求1到8中任一項(xiàng)的肽的抗體。
13.特異性識(shí)別BPLP蛋白的抗體。
14.一種藥物組合物，其包括權(quán)利要求1到8中任一項(xiàng)的肽或其衍生物或模擬物，以及藥用可接受的載體。
15.一種藥物組合物，其包括權(quán)利要求1到8中任一項(xiàng)的肽或其衍生物或模擬物的聚合物，以及藥用可接受的載體。
16.一種藥物組合物，其包括權(quán)利要求9的核酸或表達(dá)所述核酸的載體。
17.一種藥物組合物，其包括編碼BPLP蛋白的核酸或表達(dá)所述核酸的載體。
18.一種藥物組合物，其包括權(quán)利要求12或13的抗體。
19.一種藥物組合物，其包括BPLP蛋白以及藥用可接受的載體。
20.權(quán)利要求14到17和19中任一項(xiàng)的藥物組合物，其包括與BPLP肽協(xié)同作用的第二種藥劑。
21.權(quán)利要求1到8中任一項(xiàng)的肽或其衍生物或模擬物在制備用于預(yù)防或治療疾病的藥物中的用途，其中在所述疾病中需要調(diào)控膜金屬肽酶的活性。
22.權(quán)利要求21的用途，其中金屬肽酶是膜鋅金屬肽酶。
23.權(quán)利要求22的用途，其中金屬肽酶是NEP或APN。
24.權(quán)利要求1到8中任一項(xiàng)的肽或其衍生物或模擬物在制備用于預(yù)防或治療疼痛的藥物中的用途。
25.權(quán)利要求24的用途，其中所述疼痛是慢性疼痛、急性疼痛、內(nèi)臟炎性疼痛或神經(jīng)性疼痛。
26.權(quán)利要求1到8中任一項(xiàng)的肽或其衍生物或模擬物在制備用于預(yù)防或治療水-礦物質(zhì)失衡的藥物中的用途。
27.權(quán)利要求26的用途，其中所述藥物用于預(yù)防或治療水-礦物質(zhì)失衡所引起的骨、牙、腎臟、甲狀旁腺、胰腺、腸、胃粘膜、前列腺、和唾液腺疾病。
28.權(quán)利要求27的用途，其中所述疾病選自甲狀旁腺亢進(jìn)癥或減低癥、骨質(zhì)疏松癥、胰腺炎、頜下腺結(jié)石、腎結(jié)石和骨營(yíng)養(yǎng)不良。
29.權(quán)利要求1到8中任一項(xiàng)的肽或其衍生物或模擬物用于預(yù)防或治療人際關(guān)系及行為障礙性疾病的用途。
30.權(quán)利要求29的用途，其中所述疾病選自回避障礙、感知減退障礙、孤獨(dú)癥、兒童多動(dòng)癥、Hospitalism、人際關(guān)系功能障礙以及與外界的關(guān)系障礙、精神分裂樣人格障礙、精神分裂癥、對(duì)環(huán)境的興趣降低、與性相關(guān)的社交活動(dòng)障礙、和性行為障礙。
31.權(quán)利要求29的用途，其中所述疾病是抑郁疾病。
32.權(quán)利要求21的用途，其中所述藥物用于預(yù)防或治療炎性關(guān)節(jié)炎。
33.權(quán)利要求21的用途，其中所述肽或其衍生物或模擬物具有利鈉劑的作用。
34.權(quán)利要求21的用途，其中所述肽具有利尿劑的作用。
35.權(quán)利要求21的用途，其中所述藥物用于預(yù)防或治療動(dòng)脈粥樣硬化。
36.權(quán)利要求21的用途，其中所述藥物用于預(yù)防或治療腫瘤。
37.權(quán)利要求21的用途，其中所述藥物用于預(yù)防或治療炎性腸病。
38.權(quán)利要求21的用途，其中所述藥物用于治療感染。
39.權(quán)利要求21的用途，其中所述藥物用于控制免疫炎癥應(yīng)答。
40.權(quán)利要求21的用途，其中所述藥物用于治療神經(jīng)退行性疾病。
41.權(quán)利要求40的用途，其中所述藥物用于治療與淀粉樣變相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病。
42.權(quán)利要求9的核酸在制備用于預(yù)防或治療如在權(quán)利要求21到41中任一項(xiàng)所定義的疾病的藥物中的用途。
43.權(quán)利要求12的抗體在制備用于預(yù)防或治療如在權(quán)利要求21到41中任一項(xiàng)所定義的疾病的藥物中的用途。
44.BPLP蛋白在制備用于預(yù)防或治療如在權(quán)利要求21到41中任一項(xiàng)所定義的疾病的藥物中的用途。
45.編碼BPLP蛋白的核酸在制備用于預(yù)防或治療如在權(quán)利要求21到41中任一項(xiàng)所定義的疾病的藥物中的用途。
46.權(quán)利要求13的針對(duì)BPLP蛋白的抗體在制備用于預(yù)防或治療如在權(quán)利要求21到41中任一項(xiàng)所定義的疾病的藥物中的用途。
47.一種體外預(yù)測(cè)、診斷或確定病變的演變的方法，所述病變涉及BPLP或其任何成熟產(chǎn)物的產(chǎn)生的改變，所述方法包括檢測(cè)或定量測(cè)試對(duì)象的生物學(xué)樣品中的BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物，并將BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物的產(chǎn)生與對(duì)照對(duì)象的生物學(xué)樣品中的相同物質(zhì)的產(chǎn)生進(jìn)行比較。
48.權(quán)利要求47的方法，其中通過(guò)將生物學(xué)樣品與在權(quán)利要求12或13中所定義的抗體接觸來(lái)檢測(cè)BPLP或其任何成熟產(chǎn)物的產(chǎn)生。
49.一種體外預(yù)測(cè)或診斷病變的方法，所述病變涉及BPLP或其任何成熟產(chǎn)物的產(chǎn)生的改變，所述方法包括檢測(cè)測(cè)試對(duì)象的生物學(xué)樣品中的BPLP基因或其轉(zhuǎn)錄物的數(shù)量和/或質(zhì)量上的異常。
50.一種體外篩選化合物的結(jié)合NEP上的結(jié)合BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物的結(jié)合位點(diǎn)的能力的方法，其包括以下步驟a)在存在BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物、或存在任一保留了BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物的結(jié)合特異性或生理學(xué)活性的肽的情況下，將候選化合物與表達(dá)NEP的細(xì)胞一起孵育；b)確定候選化合物與BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物或保留了BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物的結(jié)合特異性或生理學(xué)活性的肽競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合NEP的能力。
51.權(quán)利要求50的方法，其包括以下步驟a)制備含有NEP上的結(jié)合BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物的結(jié)合位點(diǎn)的細(xì)胞培養(yǎng)物或器官標(biāo)本或組織樣品；b)加入待測(cè)試的候選化合物，以測(cè)試其與半飽和濃度的標(biāo)記的BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物或保留了BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物的結(jié)合特異性或生理學(xué)活性的肽的競(jìng)爭(zhēng)性；c)在存在候選化合物的情況下，并在能發(fā)生特異性結(jié)合的條件下，將步驟a)的細(xì)胞培養(yǎng)物、器官標(biāo)本或組織樣品孵育一段足以發(fā)生特異性結(jié)合的時(shí)間；d)定量在存在不同濃度的候選化合物的情況下與細(xì)胞培養(yǎng)物、器官標(biāo)本或組織樣品特異性結(jié)合的標(biāo)記。
52.一種用于確定與NEP上的結(jié)合BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物的結(jié)合位點(diǎn)特異性結(jié)合的化合物的親和力的方法，其包括以下步驟a)制備含有NEP上的結(jié)合BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物的結(jié)合位點(diǎn)的細(xì)胞培養(yǎng)物或器官標(biāo)本或組織樣品；b)加入先前已經(jīng)標(biāo)記了放射性或非放射性標(biāo)記的候選化合物；c)在存在標(biāo)記的候選化合物的情況下，并在能發(fā)生特異性結(jié)合的條件下，孵育步驟a)的細(xì)胞培養(yǎng)物、器官標(biāo)本或組織樣品一段足以發(fā)生特異性結(jié)合的時(shí)間；和d)定量在存在不同濃度的候選化合物情況下與細(xì)胞培養(yǎng)物、器官標(biāo)本或組織樣品特異性結(jié)合的標(biāo)記。
53.一種在體外篩選化合物的作為BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物對(duì)NEP活性的激動(dòng)劑或拮抗劑的能力的方法，所述方法包括步驟a)在存在(i)BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物、或任一保留了BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物的結(jié)合特異性或生理學(xué)活性的肽和(ii)NEP底物的情況下，將候選化合物與表達(dá)NEP的細(xì)胞進(jìn)行孵育；b)確定NEP對(duì)NEP底物的內(nèi)切蛋白酶解作用，其中如果存在候選化合物時(shí)的內(nèi)切蛋白酶解與不存在候選化合物時(shí)的內(nèi)切蛋白酶解相比是增加的，說(shuō)明所述化合物具有拮抗劑活性；而如果存在候選化合物時(shí)的內(nèi)切蛋白酶解與不存在候選化合物時(shí)的內(nèi)切蛋白酶解相比是減少的，說(shuō)明所述化合物具有激動(dòng)劑活性。
54.權(quán)利要求53的方法，用于篩選作為BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物的激動(dòng)劑的化合物，其包括以下步驟a)制備含有NEP上的結(jié)合BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物的結(jié)合位點(diǎn)的細(xì)胞培養(yǎng)物或器官標(biāo)本或組織樣品；b)在存在i)候選化合物、ii)半飽和濃度的BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物或任一保留了BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物的結(jié)合特異性或生理學(xué)活性的肽、和iii)NEP底物時(shí)，孵育步驟a)的細(xì)胞培養(yǎng)物、器官標(biāo)本和組織樣品，所述細(xì)胞培養(yǎng)物、器官標(biāo)本和組織樣品的濃度使得可對(duì)NEP酶活性進(jìn)行檢測(cè)，孵育的時(shí)間為足以在初始速度條件下發(fā)生NEP底物的內(nèi)切蛋白酶解的時(shí)間；c)通過(guò)分別測(cè)定在存在或不存在候選化合物以及在存在或不存在BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物或保留了BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物的結(jié)合特異性或生理學(xué)活性的肽時(shí)的NEP底物內(nèi)切蛋白酶解的水平而定量步驟a)的生物學(xué)材料中所存在的NEP活性。
55.權(quán)利要求53的方法，用于篩選作為BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物的拮抗劑的化合物，其包括以下步驟a)制備含有NEP上的結(jié)合BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物的結(jié)合位點(diǎn)的細(xì)胞培養(yǎng)物或器官標(biāo)本或組織樣品；b)在存在次最大濃度的BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物或任一保留了BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物的結(jié)合特異性或生理學(xué)活性的肽、NEP底物和候選化合物的條件下，孵育步驟a)的細(xì)胞培養(yǎng)物、器官標(biāo)本和組織樣品，所述細(xì)胞培養(yǎng)物、器官標(biāo)本和組織樣品的濃度使得可在初始速度條件下對(duì)NEP酶活性進(jìn)行檢測(cè)，孵育的時(shí)間為足以在初始速度條件下發(fā)生NEP底物的內(nèi)切蛋白酶解的時(shí)間；c)通過(guò)分別測(cè)定在存在或不存在候選化合物以及在存在或不存在BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物或保留了BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物的結(jié)合特異性或生理學(xué)活性的肽時(shí)的NEP底物內(nèi)切蛋白酶解的水平而定量步驟a)的生物學(xué)材料中所存在的NEP活性。
56.一種分子復(fù)合物，其包括-金屬外肽酶受體、特別是NEP受體或APN受體的BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物的結(jié)合位點(diǎn)；-BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物。
57.調(diào)控內(nèi)源性BPLP蛋白或其成熟產(chǎn)物與膜金屬外肽酶之間的相互作用的制劑在制備用于預(yù)防或治療其中需要調(diào)控所述膜金屬肽酶的活性的疾病的治療性組合物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種肽，所述肽是堿性富脯氨酸淚液蛋白(BPLP)的成熟產(chǎn)物或所述成熟產(chǎn)物的肽衍生物或模擬物，其中所述肽或其肽衍生物或模擬物表現(xiàn)出對(duì)金屬外肽酶(特別是NEP和/或APN)的抑制性能。本發(fā)明也涉及編碼所述肽的多核苷酸以及涉及針對(duì)所述肽的抗體。此外，本發(fā)明涉及人BPLP蛋白及其所衍生的抑制肽、編碼人BPLP蛋白或其所衍生的肽的多核苷酸以及針對(duì)BPLP蛋白或其所衍生的肽的抗體的診斷性及治療性的用途。
文檔編號(hào)C07K14/435GK1953988SQ200580015689
公開日2007年4月25日 申請(qǐng)日期2005年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月19日
發(fā)明者卡特琳·魯若, 讓-弗朗索瓦·休奧米, 馬里-諾埃勒·尤恩格霍爾, 安妮·維內(nèi)爾, 埃弗利娜·杜富爾 申請(qǐng)人:巴斯德研究院