含有mhc i型啟動子的慢病毒載體的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于重組疫苗技術(shù)的領(lǐng)域并涉及慢病毒載體的改進，其可用作治療性和預 防性疫苗。包含MHC I型（MHCI)啟動子的載體提供了優(yōu)于其他載體的改進的特性。
[0002] 背景
[0003] 重組疫苗已隨重組DNA技術(shù)的進步而發(fā)展，允許修飾病毒基因組以產(chǎn)生修飾的病 毒。通過這種方式，已能夠?qū)⑦z傳序列引入非致病性病毒，從而其編碼待在感染后于靶細胞 內(nèi)表達的免疫原性蛋白質(zhì)，以在其宿主內(nèi)發(fā)展特定免疫應答。
[0004] 此類疫苗構(gòu)成了疫苗技術(shù)中的重大進步（Kutzler等，Nat Rev Genet，9 (10) :776-788, 2008)。具體而言，其具有優(yōu)于傳統(tǒng)疫苗的優(yōu)勢：避免活（減毒的） 病毒和消除與滅活疫苗制造相關(guān)聯(lián)的風險。
[0005] 采用經(jīng)修飾的逆轉(zhuǎn)錄病毒（逆轉(zhuǎn)錄病毒載體）的基因遞送在上世紀80年代早 期由Mann等描述（Cell，33 (1) : 153-9, 1983)。最常用的致瘤性逆轉(zhuǎn)錄病毒基于莫洛尼 (Moloney)鼠白血病病毒（MLV)。其基因組簡單，多聚蛋白質(zhì)Gag、Pol和Env從該基因組產(chǎn) 生并且需要以反式形式進行病毒復制（Breckpot等，2007, Gene Ther, 14(11) :847-62 ;He 等，2007，Expert Rev vaccines, 6(6) :913-24)。一般以順式需要的序列是長末端重復序列 (LTR)及其如下周邊序列：整合所需的反向重復序列（IR或att位點）、包裝序列Ψ、轉(zhuǎn)運 RNA結(jié)合位點（引物結(jié)合位點，PBS)，和涉及逆轉(zhuǎn)錄的一些其它序列（正鏈起始必需的LTR 內(nèi)的重復R以及多嘌呤序列（PPT))。為了生成復制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，通常使gag、pol 和env基因全部缺失，并且用表達盒替代。
[0006] 源自慢病毒基因組的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體（即慢病毒載體）已涌現(xiàn)為用于基因治療和 免疫治療目的的有希望的工具，因為它們顯示優(yōu)于其它病毒系統(tǒng)的若干優(yōu)勢。具體而言，慢 病毒載體本身無毒，并且不像其它逆轉(zhuǎn)錄病毒，慢病毒能夠轉(zhuǎn)導非分裂細胞，尤其是樹突細 胞（He等，2007, Expert Rev vaccines, 6 (6) :913-24)，這允許通過內(nèi)源性通路的抗原遞呈。
[0007] 慢病毒通過遺傳組成相似性、復制的分子機制和與其宿主的生物相互作用連接。 最為熟知的是其為長期亞臨床感染后潛伏起始并緩慢發(fā)展的慢病綜合征的病因；因此，其 被稱為"慢"病毒（Narayan等，1989, J Gen Virol，70(7) : 1617-39)。其基本構(gòu)成與所用逆 轉(zhuǎn)錄病毒相同但由于附屬基因（例如'^：?、叩1'、￥口11、116；^七31：和^￥)的存在而更為復雜， 所述附屬基因在慢病毒的體內(nèi)復制中起關(guān)鍵作用。
[0008] 慢病毒代表逆轉(zhuǎn)錄病毒科（Retroviridae)的一個慢病毒屬，其包括人免疫缺陷 病毒（HIV)、猿猴免疫缺陷病毒（SIV)、馬傳染性腦炎病毒（EIAV)、山羊關(guān)節(jié)炎腦炎病毒 (CAEV)、牛免疫缺陷病毒（BIV)和貓免疫缺陷病毒（FIV)。慢病毒可以無限地持續(xù)存在于其 宿主內(nèi)，并且在一生的感染期間以不同速度連續(xù)復制。病毒在其宿主內(nèi)的持續(xù)復制取決于 其避開宿主防御的能力。
[0009] 重組整合型慢病毒載體的設(shè)計基于慢病毒的順式與反式作用序列的分離。非 分裂細胞中的有效轉(zhuǎn)導需要慢病毒基因組中存在兩種順式作用序列：中心多嘌呤序列 (cPPT)和中心終止序列（CTS)。這導致形成稱為中心DNA "瓣（flap) "的三鏈DNA結(jié) 構(gòu)，該結(jié)構(gòu)使基因進入非分裂細胞（包括樹突細胞（DC))核內(nèi)的效率最大化（Zennou等， 2000, Cell, 101 (2) 173-85 ;Arhel 等，2007, EMBO J，26 (12) : 3025-37)。
[0010] 樹突細胞對于抗原遞呈而言具有重要作用，因為其構(gòu)成了以遞呈抗原和起始免疫 應答為主要功能的抗原遞呈細胞（APC)的主要類型。
[0011] 為產(chǎn)生免疫應答，須由細胞將抗原蛋白加工成肽，所述肽通過主要組織相容性復 合物蛋白（MHC)在細胞表面顯示。循環(huán)的APC在引流淋巴結(jié)內(nèi)將肽-MHC復合物遞呈至T 細胞，其在此處與T細胞受體相互作用并聯(lián)合共刺激信號一起激活T細胞。
[0012] 多項研宄已顯示，使用慢病毒載體的接種導致DC進行抗原呈遞和抗原特異性細 胞毒性T淋巴細胞（CTL ;CD8+T細胞）的強激活。因此，在過去的10年中對慢病毒載體進 行了工程改造以用于基因轉(zhuǎn)移和免疫治療應用。
[0013] 已通過移除LTR U3序列，產(chǎn)生完全不含原先在LTR中存在的病毒啟動子和增強子 序列的"自動失活"載體，從而改善了慢病毒載體的安全性。
[0014] 可通過重組技術(shù)，在使用不同的DNA質(zhì)粒對HEK 293T人培養(yǎng)細胞瞬時轉(zhuǎn)染后生產(chǎn) 含有慢病毒載體的慢病毒顆粒，所述質(zhì)粒包括：
[0015] (i)包裝質(zhì)粒，其表達至少Gag、PolRev、Tat，并在一些情況下表達轉(zhuǎn)移構(gòu)建體的 包裝所必需的結(jié)構(gòu)和酶蛋白；
[0016] (ii)轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，其含有包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所必需的表達盒和HIV順式作用因子； 以及
[0017] (iii)編碼包膜的質(zhì)粒，在多數(shù)情況下是水泡性口炎病毒（VSV.G)的糖蛋白，該蛋 白允許形成能夠靶向多種細胞（尤其是主要組織相容性（MHC)抗原遞呈細胞（APC)，包括 DC)的混合顆粒（假型）。
[0018] 該方法能夠使轉(zhuǎn)染的細胞瞬時生產(chǎn)慢病毒顆粒載體。然而，還可通過將包裝基因、 原病毒編碼DNA和包膜基因穩(wěn)定插入細胞基因組，使得細胞持續(xù)地生產(chǎn)慢病毒顆粒載體。 這允許在不需要瞬時感染的條件下由細胞持續(xù)地生產(chǎn)慢病毒顆粒載體。當然，也可使用這 些方法的組合，其中將一些DNA/質(zhì)粒整合至細胞基因組而其他的通過瞬時轉(zhuǎn)染提供。
[0019] 非整合型慢病毒載體正被設(shè)計用于降低與插入誘變事件相聯(lián)系的潛在癌發(fā)生的 風險，特別用于疫苗接種目的：
[0020] 在基于直接注射抗原編碼整合型慢病毒載體的疫苗接種中，表達相關(guān)抗原的轉(zhuǎn)導 的細胞成為引發(fā)的免疫應答的靶標并在數(shù)天或數(shù)周內(nèi)從接種疫苗的生物體中清除。
[0021] 此外，自動失活的慢病毒載體中病毒啟動子和增強子序列的3' LTR的U3區(qū)域的 缺失限制了內(nèi)源性啟動子激活的可能性。該缺失直接體現(xiàn)了 1998-1999年進行的SCID-Xl 基因治療試驗所獲得的經(jīng)驗，該試驗使用基于莫羅尼病毒的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體針對患有罕 見類型的X連鎖（SCID-X1基因）嚴重免疫缺陷疾病的兒童進行（Cavazzana-Calvo等， 2000, Science.，288(5466) :669-72)。該試驗期間，莫羅尼來源的逆轉(zhuǎn)錄病毒在非常靠 近人LM02原癌基因處的整合導致9名兒童中的4名發(fā)展了白血?。℉acein-Bey-Abina 等，2008, J. Clin. Invest.，118(9) :3132-3142)。這表明，惡性腫瘤是病毒U3啟動子/增強 子接近LM02原癌基因的結(jié)果。
[0022] 增強子是順式作用序列，其可相隔一定距離作為轉(zhuǎn)錄激活因子起作用。其已被廣 泛用于病毒來源的載體，因為其似乎就在多種細胞類型（特別是DC)中獲得轉(zhuǎn)基因強表達 而言最為有效（Chinnasamy，Chinnasamy 等，2000，Hum Gene Ther 11(13) :1901-9 ;Rouas 等，2008, Cancer Gene Ther 9 (9) :715-24 ;Kimura等，2007, Mol Ther 15 (7) :1390-9 ;Gruh 等，2008, J Gene Med 10 (I) 21-32)。然而，考慮到插入誘變的安全問題，應將這類轉(zhuǎn)錄增強 子序列從慢病毒載體構(gòu)建體中刪除以破壞增強子鄰近效應所產(chǎn)生的插入誘變風險。迄今為 止，該增強子鄰近效應是最常見的插入突變機制并且是基因轉(zhuǎn)移后人或動物腫瘤發(fā)生事件 的病例中描述的唯一效應。
[0023] 因此，需要研發(fā)不包括病毒增強子的逆轉(zhuǎn)錄病毒，特別是慢病毒載體，其允許轉(zhuǎn)基 因編碼的免疫原性肽足量表達，如果可能，表達量與使用CMV啟動子時觀察到的相當。
[0024] 一項最近的研宄報道了使用主要組織相容性復合物II型基因 （MHC II型） (Kimura 等，2007, MolTher 15(7):1390-9)和 dectin-2 基因 （Lopes 等，2008, J Virol 82(1):86-95)來源的DC特異性啟動子代替病毒啟動子。Lopes等使用的dectin-2基因啟 動子包含推定的增強子和腺病毒保守序列（腺病毒啟動子中的反向末端重復）（Bonkabara 等，2001，J. Immunology, 167:6893-6900)。Kimura等使用的MHC II型基因啟動子不含任何 已知增強子。
[0025] 然而，在沒有增強子的情況下，發(fā)現(xiàn)MHC II型啟動子無法在DC中提供足夠的轉(zhuǎn)基 因表達。具體而言，與使用CMV啟動子/增強子所觀察到的免疫應答相反，包含MHC II型 啟動子的慢病毒載體未能在免疫活性C57BL/6小鼠中引起免疫反應。雖然在小鼠中注射后 觀察到了整合和持續(xù)的轉(zhuǎn)基因表達，但通過MHC II型啟動子轉(zhuǎn)錄的慢病毒載體無法刺激抗 原特異性⑶8+細胞毒性T淋巴細胞應答，甚至在疫苗接種加強后也是如此。這些研宄的作 者因此總結(jié)，MHC II型啟動子的采用僅對于基因替代治療中需要持續(xù)表達的應用是有興趣 的，但在免疫治療中并非如此。
[0026] 因此，對于針對抗原誘導免疫應答，MHC II型啟動子不是適當?shù)穆《据d體啟動 子。此外，dectin-2啟動子具有樹突細胞特異性，其無法消除整合至其他非表達細胞類型 中的載體。而且，dectin-2啟動子似乎含有增強子。因此，由于安全原因，dectin-2啟動子 不是良好的慢病毒載體啟動子。
[0027] 優(yōu)選地，在免疫治療中，慢病毒載體提供了有效的轉(zhuǎn)基因表達，其引發(fā)所需的特異 性免疫應答。這需要APC(如樹突細胞）中的表達處于高水平。
[0028] 還優(yōu)選通過免疫應答除去慢病毒載體所轉(zhuǎn)導的細胞以提供更高水平的安全性。 即，針對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生的免疫應答可在宿主中引發(fā)足以除去慢病毒載體轉(zhuǎn)導細胞的免疫應 答。轉(zhuǎn)導細胞的除去消除了宿主中慢病毒載體的持續(xù)性，以及該載體可能的次級效應。為 除去轉(zhuǎn)導細胞，非樹突細胞中的表達需要具有允許通過免疫應答來消除的水平。
[0029] 同時，啟動子應通過原初和記憶T細胞的激活中涉及的關(guān)鍵細胞（即樹突細胞） 使免疫刺激最大化并應使導致惡性腫瘤的干細胞中的插入誘變和基因毒性的風險最小化。 因此，啟動子應在樹突和其他細胞中具有足夠高的活性，但不含增強子。基于這些標準，由 于強增強子的存在，病毒啟動子（如CMV啟動子）不是理想的。這些標準總結(jié)如下