專利名稱：：限制性表達慢病毒載體的制作方法
背景技術(shù)：
：本發(fā)明的權(quán)利要求得益于2001年10月2日提交的美國臨時申請60/326,593號，其全文已被納入本文作為參考。1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及改進型慢病毒載體及其在基因轉(zhuǎn)導和使轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)基因在靶細胞內(nèi)高水平表達中的應用，特別是慢病毒載體轉(zhuǎn)染的人造血干細胞來源(hHSC)的分化血細胞。2.關(guān)領(lǐng)域的說明通過人造血干細胞(hHSC)的轉(zhuǎn)導進行基因治療代表了一種非常有前景的治療多種遺傳性和獲得性淋巴造血系統(tǒng)疾病的方法。但是，利用現(xiàn)有的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)對經(jīng)長期再生的hHSC進行基因改造不可能獲得很高的效率以滿足治療的要求。例如，盡管莫洛尼鼠白血病病毒(MLV)來源的癌基因逆轉(zhuǎn)錄病毒載體因其能整合到靶細胞的染色體內(nèi)而被廣泛應用，但也無法用于轉(zhuǎn)染未經(jīng)增殖誘導因子處理的hHSC(Kohn等，1991；Mazurier等，1998)。實際上在MLV預整合復合物進行核轉(zhuǎn)移的時候需要有絲分裂時形成的核包膜破裂(Roe等，1993；Lewis和Emerman，1994)。不幸的是，不論是從骨髓、臍帶血(UCB)中采集的hHSC還是從外周血中動員的hHSC，在經(jīng)過持續(xù)的誘導刺激和增殖后大多數(shù)都失去了分裂或多潛能分化的能力(Bhatia等，1997；Dao等，1997；Dorrell等，2000)。但是最近的文獻說明利用特殊的刺激條件可以使一部分多潛能細胞以及能在非肥胖型糖尿病/重度聯(lián)合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠體內(nèi)長期植入的細胞維持生存、轉(zhuǎn)化甚至擴增能力(Dorrell等，2000；Dao等，1998；Piacibello等，1999；Ueda等，2000)。慢病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一個亞型，其整合復合前體的親核特性可以使其感染非分裂的細胞，該復合體使病毒通過核孔進入核內(nèi)。因此，人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)來源的慢病毒載體能夠在體內(nèi)和體外介導基因向非有絲分裂的細胞內(nèi)有效轉(zhuǎn)移、并在細胞內(nèi)整合和長期表達(Naldini等，1996a；Naldini等，1996b；Blomer等，1997)。特別是HIV來源的載體可以在缺乏細胞因子刺激的條件下高效地轉(zhuǎn)導人CD34+造血干細胞(Akkina等，1996；Sutton等，1998；Uchida等，1998；Miyoshi等，1999；Case等，1999)。這些細胞能在NOD/SCID小鼠體內(nèi)長期植入(Miyoshi等，1999)。這些初級受體來源的骨髓轉(zhuǎn)導細胞可以在次級小鼠體內(nèi)重建集落，說明慢病毒介導的基因轉(zhuǎn)導的靶細胞是非常原始的造血祖細胞，很有可能是真正的干細胞。由于目前的其他基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)都不具有這種能力，因此慢病毒載體為造血干細胞的研究以及通過hHSC的基因改造進行遺傳性和獲得性淋巴-造血系統(tǒng)疾病的基因治療提供了一個前所未有的基礎(chǔ)條件。但是很重要的一點是前幾代的慢病毒載體不能用于基因治療，因為這些基因無法滿足生物安全性的需要(Akkina等，1996；Sutton等，1998；Uchida等1998)，或者因為其所轉(zhuǎn)導的基因表達水平非常低(Miyoshi等，1999；Case等，1999；An等，2000)。因此需要改造慢病毒載體以使其能高效地轉(zhuǎn)導造血細胞，特別是造血祖細胞，并且能使轉(zhuǎn)導的轉(zhuǎn)基因高效表達。理想的干細胞基因治療方法應該能有效轉(zhuǎn)導HSCs，同時考慮到干細胞的可塑性，還應該使治療基因在特定的成熟血細胞系中限制性表達。第三代慢病毒載體是目前最理想的人靜止HSC基因轉(zhuǎn)導載體。而且，其自身滅活元件(SIN)提供了不受上游LTR干擾的組織特異性啟動子。發(fā)明概述本發(fā)明涉及改進型慢病毒載體的開發(fā)，該載體既滿足生物安全性的要求，又能在需要時被刺激誘導所轉(zhuǎn)導的基因以組織特異性或干細胞系特異的方式高效表達。另外，本發(fā)明還提供了一種通過轉(zhuǎn)錄活化或轉(zhuǎn)錄滅活控制基因在轉(zhuǎn)導細胞內(nèi)表達的方法，轉(zhuǎn)錄活化或轉(zhuǎn)錄滅活是通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子調(diào)節(jié)啟動子或增強子而實現(xiàn)的。本發(fā)明相應地描述了特別適于轉(zhuǎn)導人造血祖細胞及在特殊分化造血細胞系內(nèi)或在特異性轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控下進行基因表達的基因轉(zhuǎn)移載體。這些載體進一步促進了慢病毒載體在造血干細胞基因改造中的應用，特別適用于研究及治療目的。本發(fā)明所涉及的細胞類型包括未成熟的血細胞、成熟血細胞、嗜中性白細胞、單核細胞/巨噬細胞和粒細胞。但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員應該明白本發(fā)明不僅僅局限于造血細胞的轉(zhuǎn)導，也可以利用本發(fā)明的慢病毒載體轉(zhuǎn)導其他類型的細胞以使轉(zhuǎn)基因在該細胞內(nèi)特異性表達。其他類型的細胞包括終末分化細胞如神經(jīng)元、肺細胞、肌細胞、肝細胞、胰腺細胞、內(nèi)皮細胞、心肌細胞、皮膚細胞、骨髓基質(zhì)細胞以及眼細胞。另外，干細胞和前體細胞如胰腺導管細胞、神經(jīng)元前體細胞及中胚層干細胞也可以考慮。因此從整體意義上講，本發(fā)明涉及能轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導人造血祖細胞或干細胞(hHSC)并能使轉(zhuǎn)基因在這類細胞內(nèi)高效表達的改進型載體。另外，本發(fā)明還涉及這些轉(zhuǎn)基因的限制性表達，也就是說其表達是可調(diào)節(jié)的，可以在HSC特異性傳代細胞系內(nèi)表達或在轉(zhuǎn)錄激活物的刺激下表達。本發(fā)明的載體也可以是自身滅活的慢病毒載體，載體內(nèi)含有特定的自身滅活元件從而使這些載體在用于人體時是安全的。這些自身滅活元件或SIN元件包括對載體LTRs的改造以重建慢病毒基因組的復制子。在一個特別優(yōu)選的實施方式中，SIN元件包含了3’LTRU3區(qū)內(nèi)的核苷酸缺失。本發(fā)明的慢病毒載體首先提供了一種使轉(zhuǎn)基因在基因改造hHSCs的分化傳代細胞內(nèi)達到可控的、細胞特異的、高效表達的有效方法。人HSCs是難以被轉(zhuǎn)導的，因為在未被刺激的狀態(tài)下這些細胞對以前的載體系統(tǒng)介導的轉(zhuǎn)導是排斥的。本發(fā)明的慢病毒載體有能力轉(zhuǎn)染非分裂的細胞，因為這種載體的整合復合前體具有親核特性，能使其通過核孔進入核內(nèi)。而且本發(fā)明優(yōu)選的慢病毒載體即使在沒有細胞因子刺激的情況下也能在體內(nèi)和體外介導轉(zhuǎn)基因在非有絲分裂的細胞內(nèi)有效轉(zhuǎn)移、整合及適當?shù)鼗蜷L期地表達。被本發(fā)明的優(yōu)選慢病毒載體轉(zhuǎn)導的干細胞能在NOD/SCID小鼠體內(nèi)長期植入。然而，尤其值得注意的是本發(fā)明的優(yōu)選慢病毒載體具有較優(yōu)越的特點，即可以使轉(zhuǎn)基因在特異的人前體細胞或成熟的分化細胞內(nèi)受控制的、又是高效的表達，同時又符合人體生物安全性的要求。因此本發(fā)明的病毒載體一般是指重組載體，至少含有慢病毒的gag、pol和rev基因，或者病毒復制所需要的那些基因，利用病毒生產(chǎn)者細胞系這些基因可以使載體以合理的數(shù)量復制。為了滿足人體生物安全性的要求，本發(fā)明的優(yōu)選載體不含有慢病毒的任何其他活性基因，如vpr、vif、vpu、nej、tat。這些基因可以被去除，也可以被滅活。較好的是載體內(nèi)存在的活性慢病毒基因只有上述的gag、pol和rev。用于制備本發(fā)明慢病毒載體的慢病毒基因和骨架(即長末端重復序列或LTRs)的最佳組合為人免疫缺陷病毒(HIV)來源的、更好的是HIV-1來源的。因此，gag、pol和rev基因優(yōu)選HIV的基因，更好的是HIV-1的基因。但是，其他慢病毒的gag、pol和rev基因以及LTR區(qū)也可以用于本發(fā)明的某些特定目的，包括HIV-2、類人猿免疫缺陷病毒(SIV)、貓免疫缺陷病毒、牛免疫缺陷病毒、馬感染性貧血病毒、羊關(guān)節(jié)炎腦炎病毒等。這些構(gòu)建子在改造某些非人源的細胞時是有用的。但是，HIV來源的載體骨架(即HIVLTR和HIV的gag、pol和rev基因)在本發(fā)明的絕大多數(shù)情況下是優(yōu)選的，因為HIV來源的構(gòu)建子在轉(zhuǎn)導人造血祖細胞時最有效。本發(fā)明的病毒載體還包含一個表達盒，該表達盒含有一個位于啟動子控制之下的轉(zhuǎn)基因，啟動子活化后能促使轉(zhuǎn)基因在人細胞內(nèi)可測轉(zhuǎn)錄。在一個優(yōu)選實施方式中，啟動子活化后能促進轉(zhuǎn)基因在人源造血祖細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄。在一個更優(yōu)選的實施方式中，啟動子活化后能促進轉(zhuǎn)基因在特殊類型的細胞或前體細胞的子代細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明還有一個優(yōu)選實施方式，其中的啟動子通過轉(zhuǎn)錄控制因子或活化因子和抑制因子對其進行活化或抑制從而控制基因的轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明所用的啟動子優(yōu)選gp91-phox、gp47-phox、CD11b、EF1-α、PGK、β球蛋白啟動子、MHCII類啟動子、凝血因子IX啟動子、胰島素啟動子、PDX1啟動子、CD11、CD4啟動子和CD2的啟動子。其中g(shù)p91-phox的啟動子是最好的。該啟動子能控制基因在所需要的特定類型的細胞內(nèi)表達，其中主要是促進轉(zhuǎn)基因在單核細胞和粒細胞內(nèi)表達，同時其活性通過啟動子與活化因子特別是干擾素γ的相互作用而受到調(diào)節(jié)。但是，在任何情況下，本發(fā)明的啟動子都不限于上面所述的范圍，只要啟動子在前體細胞、造血細胞或其他細胞等靶細胞內(nèi)是有活性的，或者能控制轉(zhuǎn)錄活動，都包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。為了確定一個啟動子是否有用，將所選擇的啟動子在體外插入到構(gòu)建體中，然后導入選定的前體細胞內(nèi)，如果在一個可檢測的信噪比水平上啟動子能促進轉(zhuǎn)基因的表達，就說明該啟動子能用于本發(fā)明中。期望的信噪比約為10到200，較好的約為40到200，最好的約為150到200。一種檢測啟動子的方法是利用信號產(chǎn)生基因如綠色熒光蛋白基因(GFP)，下面有該方法的詳細描述。本發(fā)明還提供了一種增強轉(zhuǎn)導效率的方法，該方法是在載體內(nèi)插入一個中央多聚嘌呤簇(cPPT)。轉(zhuǎn)導效率可以達到20％、30％、40％、50％、60％、70％或高達80％。在一個優(yōu)選實施方式中，cPPT位于啟動子序列的下游。cPPT序列由序列號為SEQIDNO1的核苷酸序列舉例說明。本發(fā)明還有一個優(yōu)點就是包含獨特的多克隆位點。該位點是限制性內(nèi)切酶識別的位點，其序列與載體內(nèi)的其他序列不同。幾個這樣的位點一起構(gòu)成了獨特的多克隆位點。這些位點優(yōu)選位于cPPT和啟動子之間，或者位于cPPT的上游，盡管這些位點位于其他地方可能便于將多聚核苷酸插入載體或從載體中切除。例如，從這些多克隆位點上可以很容易地將外源片斷插入到載體序列中，從而易于實現(xiàn)本發(fā)明。上面所提到的啟動子還可以含有轉(zhuǎn)錄所需要的元件，并且作為轉(zhuǎn)錄盒的一部分。轉(zhuǎn)錄盒定義為含有一個或多個啟動子元件和增強子和/或位點控制區(qū)的序列，啟動子與增強子和/或位點控制區(qū)結(jié)合在一起，后者能保證轉(zhuǎn)基因的高效表達或組織特異的表達。一個或多個增強子可以位于載體的任何位置，他們調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因表達的活性最強。為了使轉(zhuǎn)基因在分化的靶細胞內(nèi)達到最高水平的表達，增強子還可以是分化靶細胞特異的增強子。細胞特異的增強子包括HS位點。HS位點是已知的β球蛋白、CD2和gp91的增強子，但是其他的HS或HS型的位點也可以被使用。例如成紅細胞的GATA-1增強子。人類基因組序列的應用大大促進了這類元件的鑒定，這些也可以作為本發(fā)明的一部分。一組特別優(yōu)選的增強子和絕緣體元件位于位點控制區(qū)(LCR)內(nèi)，被定義為DNA酶超敏位點。這些HS位點的增強子活性被認為具有染色質(zhì)區(qū)的解鏈活性，因此能促使轉(zhuǎn)錄因子接近染色質(zhì)，刺激增強子與啟動子結(jié)合因子之間的蛋白-蛋白相互作用，并且是定義結(jié)構(gòu)域之間的界限所需要的。順式存在于啟動子-基因盒上的HS位點提供了一種高水平的不依賴于整合位點的表達。這些元件可以單個也可以多個存在于轉(zhuǎn)基因序列的上游或下游。在本發(fā)明的一個最優(yōu)選實施方式中，HS位點臨近CPPT元件的上游和下游之間，并且整體位于啟動子的上游。因此這些HS位點可以被插入到上述的多個獨特的克隆位點上。所謂的臨近意味著在從參考元件即啟動子元件的邊界開始掃描載體序列時該元件即cPPT元件是所遇到的在功能的重要性上處于第一位的元件。在某些情況下，如啟動子在某些轉(zhuǎn)導的靶細胞內(nèi)的活性僅僅是溫和的，就需要利用一個轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)序列來促進轉(zhuǎn)基因的表達。一類轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)序列是位于表達盒內(nèi)的內(nèi)含子，它可以刺激基因的表達。但是，以這種方式存在的內(nèi)含子可能會將慢病毒RNA轉(zhuǎn)錄物置于正常的細胞剪接和處理過程中。因此在一個特殊的實施方式中，需要將含內(nèi)含子的轉(zhuǎn)基因置于與載體基因組轉(zhuǎn)錄物相反的位置上。一個較好的增強轉(zhuǎn)基因表達的方法是通過利用轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件，該調(diào)節(jié)元件不依賴剪接事件，如單純皰疹病毒的轉(zhuǎn)錄后處理元件、乙型肝炎病毒(HPRE)或土撥鼠肝炎病毒(WPRE)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件，WPRE的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件中含有一個額外的順式作用元件，這是HPRE所沒有的。調(diào)節(jié)元件位于載體內(nèi)，因此可以被包括在轉(zhuǎn)基因的RNA轉(zhuǎn)錄物之內(nèi)，但是卻在轉(zhuǎn)基因翻譯單位的終止密碼子之外?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)這樣的調(diào)節(jié)元件特別適合用在具有溫和啟動子的條件下，但是對于具有非常高效啟動子的情況可能是不合適的。我們特別希望將LTR區(qū)插入到本發(fā)明的慢病毒載體中，該LTR相對于野生型的LTR來說其啟動子活性弱化，因此這種構(gòu)建子具有自身滅活(SIN)的生物安全性特征。自身滅活載體是一種在轉(zhuǎn)導細胞內(nèi)全長載體RNA產(chǎn)物被大大簡化或剪切掉的載體。這個特點可以大大降低產(chǎn)生有復制能力的重組子(RCRs)的風險。而且還可以降低臨近載體整合位點的細胞編碼序列異常表達的危險。另外，SIN還可以減少LTR與控制基因表達的啟動子之間相互干擾的可能性。因此，它特別適于發(fā)現(xiàn)全能性的內(nèi)部啟動子。優(yōu)選的自身滅活特性是通過在載體DNA3’LTR的U3區(qū)刪除一段序列來實現(xiàn)的，載體DNA就是產(chǎn)生載體RNA的DNA序列。因此在反轉(zhuǎn)錄過程中，刪除轉(zhuǎn)移到前病毒DNA的5’LTR上。我們希望刪除足夠的U3序列以便最大限度地降低LTR的轉(zhuǎn)錄活性，從而大大降低在轉(zhuǎn)導細胞內(nèi)產(chǎn)生全長載體RNA的可能性。但是，我們通常期望保留LTR中參與病毒RNA多聚腺苷酸化的那些元件，這種功能不僅僅局限于U3、R和U5。因此就需要盡量從LTR上刪除具有轉(zhuǎn)錄活性的序列而保留參與多聚腺苷酸化的序列。對于HIV來源的慢病毒來說，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這種載體可以耐受U3區(qū)的大片段刪除，包括刪除LTR的TATA框，(即刪除-428到-18)，該刪除不會導致載體滴度的明顯下降。這些刪除使LTR區(qū)的轉(zhuǎn)錄活性基本被滅活，LTR的轉(zhuǎn)錄能力下降約90％或更多。在一個優(yōu)選實施方式中，LTR的轉(zhuǎn)錄能力下降約95％到99％。因此，LTR可以提供約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、到99％的轉(zhuǎn)錄滅活。本發(fā)明的慢病毒載體被認為可以根據(jù)需要用于轉(zhuǎn)移任何轉(zhuǎn)基因。在轉(zhuǎn)導造血祖細胞的例子中，一般選擇一個能在此類細胞中發(fā)揮所期望功能的基因，包括球蛋白基因、造血生長因子如紅細胞生成素(EPO)基因、白細胞介素(如白細胞介素-1(IL-1)，白細胞介素-2(IL-2)，白細胞介素-3(IL-3)，白細胞介素-6(IL-6)，白細胞介素-12(IL-12)等)以及集落刺激因子(如粒細胞集落刺激因子，粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子或干細胞集落刺激因子)、血小板特異的整合素αIIbβ、多藥物抗性基因、慢性肉芽腫患者所缺乏的gp91-phox或gp47基因、使細胞對病原體如人免疫缺陷病毒感染耐受的抗病毒基因、編碼血友病患者所缺乏的凝血因子VIII或IX的基因、參與T細胞介導的免疫反應的配基如T細胞抗原受體、B細胞抗原受體(免疫球蛋白)以及T細胞和B細胞抗原受體單獨或聯(lián)合與單鏈抗體如ScFv的結(jié)合物、腫瘤壞死因子(TNF)、IL-2、IL-12、γ干擾素、CTLA4、B7等、腫瘤細胞表達的基因如Melana、MAGE基因(如MAGE-1，MAGE-3)、P198、P1A、gp100等。在一個優(yōu)選實施方式中，用于治療的轉(zhuǎn)基因是gp91-phox(Dinauer等，1987)。在另一個優(yōu)選實施方式中，治療基因是gp91-phox基因連接上gp91-phox的啟動子，用于CGD。在一個最優(yōu)選的實施方式中，gp91-phox啟動子能使gp91-phox基因在單核細胞和粒細胞內(nèi)表達，并且還可以通過活化因子IFN-γ的作用調(diào)節(jié)gp91-phox的表達。在另一個優(yōu)選的實施方式中，載體內(nèi)含有轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件WPRE以促進gp91-phox基因的表達。在同一個優(yōu)選實施方式中，用于治療的轉(zhuǎn)基因是gp91-phox基因。本發(fā)明轉(zhuǎn)基因方法的主要用途在于將轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)移到造血細胞內(nèi)，其目的包括而不限于治療由于化療或免疫抑制治療以及感染如AIDS、遺傳性疾病、腫瘤等引起的骨髓抑制和嗜中性白細胞減少癥。造血細胞遺傳性疾病的例子有鐮刀型細胞貧血癥、地中海貧血(包括β地中海貧血)、血紅蛋白病、Glanzmann血小板無力癥、溶酶體病(包括Fabrydisease、葡萄糖腦苷脂酶缺乏癥、尼曼-皮克病、T細胞功能障礙免疫缺陷病)、重癥聯(lián)合免疫缺陷綜合征(SCID)、白細胞粘連缺乏癥(LAD)和由于分泌蛋白系統(tǒng)缺乏而導致的疾病，如凝血因子VIII和/或IX。在這種情況下，需要導入的基因包括括球蛋白基因(包括β球蛋白)、α-半乳糖苷酶A、葡萄糖腦苷脂酶、鞘磷脂磷酸二脂酶、細胞因子受體、CD18整合素的亞單位、造血生長因子如紅細胞生成素(EPO)、白細胞介素(特別是白細胞介素-1(IL-1)，白細胞介素-2(IL-2)，白細胞介素-3(IL-3)，白細胞介素-6(IL-6)，白細胞介素-12(IL-12)等)以及集落刺激因子(如粒細胞集落刺激因子，粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子或干細胞集落刺激因子)、血小板特異的整合素αIIbβ、多藥物抗性基因、gp91-phox或gp47-phox基因、使細胞對病原體如人免疫缺陷病毒感染耐受的抗病毒基因、編碼血友病患者所缺乏的凝血因子VIII或IX的基因、參與T細胞介導的免疫反應的配基如T細胞抗原受體、B細胞抗原受體(免疫球蛋白)以及T細胞和B細胞抗原受體單獨或聯(lián)合與單鏈抗體如ScFv的結(jié)合物、腫瘤壞死因子(TNF)、IL-2、IL-12、γ干擾素、CTLA4、B7等、腫瘤細胞表達的基因如Melana、MAGE基因(如MAGE-1，MAGE-3)、P198、P1A、gp100等。造血系統(tǒng)來源的腫瘤的例子包括髓樣細胞系、淋巴細胞系或紅細胞系以及其前體細胞來源的腫瘤。髓系白血病的例子包括而不限于急性早幼粒細胞性白細胞(APML)、急性骨髓性白血病(AML)和慢性骨髓性白血病(CML)?？捎帽景l(fā)明的慢病毒載體治療的淋巴系惡性腫瘤包括而不限于急性成淋巴細胞性白細胞(ALL)，其中包括B系的ALL和T系的ALL、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、幼淋巴細胞性白血病(PLL)、毛細胞白血病(BOL)和Waldenstrom巨球蛋白血癥?？捎帽景l(fā)明的慢病毒載體治療的其他形式的惡性淋巴瘤包括而不限于非何杰金氏淋巴瘤及其變異株、周圍T細胞淋巴瘤、成人T細胞性白血病/淋巴瘤(ATL)、皮膚T細胞淋巴瘤(CTCL)、大顆粒淋巴細胞白血病(LGF)和何杰金氏病。在其他實施方式中，本發(fā)明直接涉及用上述慢病毒載體轉(zhuǎn)導的宿主細胞。據(jù)信本發(fā)明的慢病毒載體可用于轉(zhuǎn)導多種細胞。這些細胞包括而不限于CD4+細胞、外周血淋巴細胞、外周血單核細胞、造血干細胞、胎兒的臍帶血細胞、成纖維細胞、腦細胞、肺細胞、肝細胞、肌細胞、胰腺細胞、內(nèi)皮細胞、心肌細胞、皮膚細胞、骨髓細胞以及眼細胞、胰腺導管細胞、神經(jīng)元前體細胞、中胚層干細胞等。轉(zhuǎn)導的細胞還可以是靈長類動物來源的、鼠源的或人源的，也可以是其他物種來源的。為了制備病毒顆粒，需要使用任何適于慢病毒gag和pol基因表達的細胞，或者經(jīng)基因改造后適于上述基因表達的任何細胞。例如可以使用病毒生產(chǎn)者細胞如293T細胞和HT1080細胞。當然，如上面所提到的，本發(fā)明的慢病毒載體特別適于轉(zhuǎn)導從骨髓、外周血或臍帶血中獲得的人定向造血干細胞或造血干細胞，以及轉(zhuǎn)導CD4+T細胞、外周血B或T細胞、外周血單核細胞、樹突狀細胞以及單核細胞。特別優(yōu)選的靶細胞是CD34+細胞，包括那些從外周血動員的CD34+細胞。在其他實施方式中，本發(fā)明直接涉及轉(zhuǎn)導人造血干細胞的方法，該方法包括使一群包括造血干細胞在內(nèi)的人源細胞與上述的慢病毒載體接觸，通過載體將基因?qū)肷鲜黾毎簝?nèi)的造血祖細胞內(nèi)。根據(jù)用途的不同干細胞可以在體內(nèi)轉(zhuǎn)導也可以在體外轉(zhuǎn)導。即使在人的基因治療中，如利用人干細胞進行的基因治療中，可以在體內(nèi)轉(zhuǎn)導干細胞，也可以在體外轉(zhuǎn)導然后將轉(zhuǎn)導的干細胞注入人體內(nèi)。本實施方式的另一方面是用本領(lǐng)域熟知的方法將人干細胞從人體內(nèi)，也就是患者體內(nèi)取出，再按照上述方法轉(zhuǎn)導。然后將轉(zhuǎn)導的干細胞回輸?shù)酵蝗梭w內(nèi)或其他患者體內(nèi)。如果是通過將載體直接注射到人體內(nèi)進行治療，則一般采用靜脈注射的方法注入載體。當細胞如CD34+細胞、樹突狀細胞、外周血細胞或腫瘤細胞在體外被轉(zhuǎn)導時，與細胞共孵育的載體顆粒量一般應在1到50感染復數(shù)(MOI)，相當于每105個細胞有1×105到5×105個病毒載體轉(zhuǎn)染單位。這其中當然包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45和50MOI的載體量。一般來說，載體的量用HeLa轉(zhuǎn)染單位(TU)表示。載體的其他注射途徑包括動脈內(nèi)注射(intrarterially)、通過內(nèi)窺鏡注射、病灶內(nèi)注射、經(jīng)皮注射、皮下注射、肌肉內(nèi)注射、膜內(nèi)注射、眼眶內(nèi)注射、真皮內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射、經(jīng)氣管注射、表皮下注射、通過中柱內(nèi)(intrastemal)注射、吸入或鼻內(nèi)噴霧、支氣管內(nèi)途徑等。在涉及用本發(fā)明的載體治療腫瘤/癌癥時，表達載體可以直接注射到腫瘤內(nèi)或腫瘤血管內(nèi)。體外進行基因治療的一個優(yōu)選實施例是患有慢性肉芽腫病的病人，其CD34+細胞可從骨髓或外周血中分離出來，回輸前在體外用表達gp91-phox基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)染，該基因在gp91-phox啟動子的控制之下。同樣的方法可用于治療地中海貧血的病人，如β地中海貧血，患者的細胞可用表達β球蛋白的慢病毒載體轉(zhuǎn)染，β球蛋白在β球蛋白啟動子或其他合適啟動子的控制之下。同樣，本發(fā)明的表達適當基因的慢病毒載體和啟動子結(jié)合可用于治療白細胞粘連缺乏癥(LAD)。對于患有重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)的病人來說，本發(fā)明也采用同樣的方法利用本發(fā)明的表達患者所缺乏基因的慢病毒載體，例如編碼白細胞介素受體普通γ鏈的連接上適當?shù)哪苁够蛟谔囟毎麅?nèi)表達并且是可控表達的啟動子的基因。對于HIV感染者的治療來說，本發(fā)明的發(fā)明者考慮采用細胞內(nèi)免疫的方法，其中，的細胞通過導入抗病毒的基因?qū)IV病毒耐受。在細胞內(nèi)免疫治療HIV的實施方式中，本發(fā)明的慢病毒載體的靶細胞包括造血祖細胞、外周血CD4+T細胞和單核細胞。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知道的，其他的病毒感染也可以用同樣的細胞內(nèi)免疫方法治療。對于腫瘤的免疫治療來說，可以用本發(fā)明的慢病毒載體基因改造腫瘤細胞或抗原提呈細胞如樹突狀細胞。某些基因可用于腫瘤的基因治療，這些基因包含在本發(fā)明的慢病毒載體內(nèi)，可以抑制和/或殺死腫瘤細胞、和/或阻止腫瘤細胞的增殖、和/或誘導腫瘤細胞的調(diào)亡，或者是一些基因如TNF。本文所描述的慢病毒載體也可通過直接注入血液或特定的器官用于體內(nèi)。例如在一個實施方式中，腦內(nèi)注射表達神經(jīng)膠質(zhì)細胞來源神經(jīng)生長因子(GDNF)的慢病毒載體可用于治療帕金森氏病。在另外一個實施例中，門脈內(nèi)注射表達凝血因子VIII的慢病毒載體用于矯正A型血友病是可行的。本發(fā)明還有一個實施例是通過靜脈或肌肉注射表達營養(yǎng)障礙基因的慢病毒載體用于治療杜興肌營養(yǎng)不良。還有一個優(yōu)選實施例是注射表達gp91-phox的慢病毒載體治療慢性肉芽腫病(CGD)。在一個優(yōu)選的實施方式中，表達受gp91-phox啟動子控制的gp91-phox基因的慢病毒載體被注射用于治療CGD。因此，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以多方面地使用本發(fā)明的慢病毒載體進行基因治療。從下面的詳細說明中可以很清楚地看到本發(fā)明的目的、特征和優(yōu)勢。但是應該明白的是這些詳細描述和特定實施例在說明本發(fā)明的優(yōu)選實施方式的同時，僅僅是通過說明的方式列舉的，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)這些詳細描述可以本著本發(fā)明的精神在本發(fā)明的范圍內(nèi)對本發(fā)明作出改變和修改。附圖的簡要描述下面的附圖構(gòu)成了本說明書的一部分，還用于進一步證明本發(fā)明的的某些方面。參考這些附圖中的一個或多個并結(jié)合本文特定實施方式的詳細描述可以更好地理解本發(fā)明。圖1A.含有g(shù)p91-phox啟動子的慢病毒載體。含gp91-phox啟動子(1540bp)(pHPP91-GFP)和WPRE序列(pWPP91-GFP)的慢病毒載體的示意圖。圖1B.gp91-phox啟動子的調(diào)節(jié)模型。轉(zhuǎn)錄阻抑蛋白CDP與轉(zhuǎn)錄激活物競爭結(jié)合4個元件。CDP的DNA結(jié)合活性在終末巨噬細胞發(fā)育的過程中是逐漸下調(diào)的，因此允許轉(zhuǎn)錄激活物與gp91-phox啟動子相互作用(LuoW，SkalnikDG.JBC，27118203，1996)。圖2A.干擾素γ可誘導的GFP基因在UCBCD34+細胞來源的單核細胞中的表達情況。GFP基因的表達受gp91-phox啟動子驅(qū)動，UCBCD34+細胞用pWPT-GFP和pWPP91-GFP慢病毒載體轉(zhuǎn)染(MOI10)。細胞在體外用GM-CSF(粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子)誘導3周分化成單核細胞(CD14+細胞)。分化的細胞用IFN-γ(1000U/ml)刺激6天，然后用連接PE單克隆抗體標記。PE陽性細胞群中GFP的表達情況通過FACS檢測。數(shù)字指的是每個象限中細胞的百分數(shù)。圖2B.干擾素γ可誘導的GFP基因在UCBCD34+細胞來源的粒細胞中的表達情況，GFP基因的表達受gp91-phox啟動子驅(qū)動，UCBCD34+細胞用pWPT-GFP和pWPP91-GFP慢病毒載體轉(zhuǎn)染(MOI10)。細胞在體外用G-CSF(粒細胞集落刺激因子)誘導3周分化成粒細胞(CD15+細胞)。分化的細胞用IFN-γ(1000U/ml)刺激6天，然后用連接PE單克隆抗體標記。PE陽性細胞群中GFP的表達情況通過FACS檢測。數(shù)字指的是每個象限中細胞的百分數(shù)。圖3A.將慢病毒載體轉(zhuǎn)導的UCBCD34+細胞植入NOD/SCID小鼠后小鼠骨髓內(nèi)GFP的表達情況。將未轉(zhuǎn)染的UCBCD34+細胞靜脈注射到經(jīng)亞致死劑量照射(375cGy)的NOD/SCID小鼠體內(nèi)(8-10周齡)。8周后從移植小鼠的股骨中分離骨髓細胞，然后用連接PerCP的抗人CD45抗體標記植入的細胞，人特異的細胞用連接PE的抗下列分子的抗體進行進一步的鑒別CD34(造血祖細胞)、CD19(B淋巴細胞)、CD33(嗜中性白細胞)、CD14(單核細胞)、CD15(粒細胞)、CD42b(巨核細胞)和血型糖蛋白A(成紅細胞)。GFP的表達情況用CD45+和PE陽性細胞來表示。數(shù)字指的是每個象限中細胞的百分數(shù)。圖3B.將慢病毒載體轉(zhuǎn)導的UCBCD34+細胞植入NOD/SCID小鼠后小鼠骨髓內(nèi)GFP的表達情況。將pHPT-GFP慢病毒載體(MOI10)轉(zhuǎn)染的UCBCD34+細胞靜脈注射到經(jīng)亞致死劑量照射(375cGy)的NOD/SCID小鼠體內(nèi)(8-10周齡)。8周后從移植小鼠的股骨中分離骨髓細胞，然后用連接PerCP的抗人CD45抗體標記植入的細胞，人特異的細胞用連接PE的抗下列分子的抗體進行進一步的鑒別CD34(造血祖細胞)、CD19(B淋巴細胞)、CD33(嗜中性白細胞)、CD14(單核細胞)、CD15(粒細胞)、CD42b(巨核細胞)和血型糖蛋白A(成紅細胞)。GFP的表達情況用CD45+和PE陽性細胞來表示。數(shù)字指的是每個象限中細胞的百分數(shù)。圖3C.將慢病毒載體轉(zhuǎn)導的UCBCD34+細胞植入NOD/SCID小鼠后小鼠骨髓內(nèi)GFP的表達情況。將pHPP91-GFP慢病毒載體(MOI10)的UCBCD34+細胞靜脈注射到經(jīng)亞致死劑量照射(375cGy)的NOD/SCID小鼠體內(nèi)(8-10周齡)。8周后從移植小鼠的股骨中分離骨髓細胞，然后用連接PerCP的抗人CD45抗體標記植入的細胞，人特異的細胞用連接PE的抗下列分子的抗體進行進一步的鑒別CD34(造血祖細胞)、CD19(B淋巴細胞)、CD33(嗜中性白細胞)、CD14(單核細胞)、CD15(粒細胞)、CD42b(巨核細胞)和血型糖蛋白A(成紅細胞)。GFP的表達情況用CD45+和PE陽性細胞來表示。數(shù)字指的是每個象限中細胞的百分數(shù)。圖3D.將慢病毒載體轉(zhuǎn)導的UCBCD34+細胞植入NOD/SCID小鼠后小鼠骨髓內(nèi)GFP的表達情況。將pWPT-GFP慢病毒載體(MOI10)的UCBCD34+細胞靜脈注射到經(jīng)亞致死劑量照射(375cGy)的NOD/SCID小鼠體內(nèi)(8-10周齡)。8周后從移植小鼠的股骨中分離骨髓細胞，然后用連接PerCP的抗人CD45抗體標記植入的細胞，人特異的細胞用連接PE的抗下列分子的抗體進行進一步的鑒別CD34(造血祖細胞)、CD19(B淋巴細胞)、CD33(嗜中性白細胞)、CD14(單核細胞)、CD15(粒細胞)、CD42b(巨核細胞)和血型糖蛋白A(成紅細胞)。GFP的表達情況用CD45+和PE陽性細胞來表示。數(shù)字指的是每個象限中細胞的百分數(shù)。圖3E.將慢病毒載體轉(zhuǎn)導的UCBCD34+細胞植入NOD/SCID小鼠后小鼠骨髓內(nèi)GFP的表達情況。將pWPP91-GFP慢病毒載體(MOI10)的UCBCD34+細胞靜脈注射到經(jīng)亞致死劑量照射(375cGy)的NOD/SCID小鼠體內(nèi)(8-10周齡)。8周后從移植小鼠的股骨中分離骨髓細胞，然后用連接PerCP的抗人CD45抗體標記植入的細胞，人特異的細胞用連接PE的抗下列分子的抗體進行進一步的鑒別CD34(造血祖細胞)、CD19(B淋巴細胞)、CD33(嗜中性白細胞)、CD14(單核細胞)、CD15(粒細胞)、CD42b(巨核細胞)和血型糖蛋白A(成紅細胞)。GFP的表達情況用CD45+和PE陽性細胞來表示。數(shù)字指的是每個象限中細胞的百分數(shù)。圖4.WPRE對gp91-phox啟動子控制的GFP基因在小鼠體內(nèi)髓樣細胞中表達的影響。數(shù)據(jù)來自圖3B、3C和3D；對照組細胞的背景熒光強度已經(jīng)減去。Neu代表嗜中性白細胞，Mo代表單核細胞，Gr代表粒細胞。圖5A、5B、5C和5D.攜帶受EF-1α啟動子控制的(5A、5B)或受gp91-phox髓樣細胞特異性啟動子控制的(5C、5D)GFP標記基因的慢病毒載體。載體5B和5D含有WPRE序列。圖6A、6B和6C.從pHPT-GFP開始構(gòu)建攜帶gp91-phox啟動子片斷(500bp)、多克隆位點(MCS)和gp91-phox特異性增強子插入片斷的慢病毒載體流程圖。第一步，通過PCR方法以1540bp的片段為模板(MCS-I序列包括在5’正向引物中)擴增出人gp91-phox啟動子的一個500bp的片段，插入到pHPT-GFP的XhoI-BamHI位點上，位于EF-1α短啟動子的位置上，得到一個中間載體pHP500-GFP。下一步，利用pHP500-GFP載體作為模板(MCS-II序列包括在5’正向引物中)擴增出一個含MCS-II、cPPT、MCS-I和gp91-phox500bp片段的PCR產(chǎn)物，將該產(chǎn)物插入到pHOX-GFP載體的ClaI-BamHI位點中得到載體pHPX-GFP(圖6B)。然后將gp91-phox特異的增強子插入到cPPT序列上游或下游的多克隆位點上得到載體pHPHS-GFP(圖6C)。最后，將WPRE序列插入到載體pHPHS-GFP中得到載體pWPHS-GFP。PCR擴增的HS元件在人基因組DNA序列中的位置(+1gp91-phox轉(zhuǎn)錄起始點)是HS-12(-11502，-13244)、HS-14(-13244，-14715)、HS-26(-25345，-26529)、HS-27(-26529，-27656)，HS-28(-27657，-28893)(圖6C)。所顯示的片段比計算出來的長度稍長，這是因為插入了幾個限制性酶切位點以便于克隆操作(HS-12和HS-14；gta恢復了pHPX-GFP上的5’SnaBI位點；HS-26、HS-27、HS-28SalI；gcgtcgac和XhoI；ctcgagcggc)。圖7.cPPT元件插入到慢病毒載體中。中央多聚嘌呤簇(cPPT)來自pRRLsinb.hPGK.EGFP載體(見Follenzi，A，Ailles，L.E.，Bakovic，S.，Geuna，M.，Naldini，L.(2000)GeneTransferbyLentiviralVecotrsisLimitedbyNuclearTranslocationandRescuedbyHIV-1polSequences.Nat.Genet.25217-22.)。將一個含有cPPT元件的NotI-EcoRV片段克隆到pHOX-GFP載體的NotI-ClaI位點上得到載體pHPT-GFP。NotI和ClaI位點都被連接片段所填充，因此NotI在pHPT-GFP中不再存在。ClaI位點得以恢復但成了dam甲基化的。因此，質(zhì)粒必須在dam(-)細菌中生長以便于利用此ClaI位點。實施方式的說明慢病毒載體為基因治療特別是人造血干細胞(hHSC)的轉(zhuǎn)導提供了一種強有力的工具，但是到目前為止，所構(gòu)建出的載體還不能滿足生物安全性的要求，并且其轉(zhuǎn)導的轉(zhuǎn)基因表達效率還不夠高。例如，含CMV啟動子的HIV來源的載體能使轉(zhuǎn)基因在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)高效表達(Naldini等，1996a；Naldini等，1996b；Blomer等，1997)，并且已經(jīng)初步證實這個基因轉(zhuǎn)移工具也能有效地轉(zhuǎn)導多潛能造血祖細胞，但在將治療基因?qū)氪蠖鄶?shù)淋巴-造血系統(tǒng)細胞時該載體基本是無用的，因為在這些靶細胞內(nèi)其轉(zhuǎn)錄活性被抑制的很低(Miyoshi等，1999；Case等，1999；An等，2000)?，F(xiàn)在的慢病毒載體大多將多個HIV的致病基因剔除了，從而消除了通過重組重新生成野生型病毒的能力(Zufferey等，1997；Dull等，1998)。自身滅活的設計剔除了HIV的轉(zhuǎn)錄元件從而使載體獲得了生物安全性(Zufferey等，1998)。但是這會降低轉(zhuǎn)基因的表達效率，較明顯的是通過降低多聚腺苷酸化的效率來實現(xiàn)(DeZazzo等，1991；Valsamakis等，1991；Brown等，1991；Cherrington和Ganem，1992；Valsa.Makis等，1992；Gilmartin等，1992)。本發(fā)明克服了本領(lǐng)域的這些缺點及其他缺陷，描述了構(gòu)建改進型HIV來源載體的方法，該載體具有良好的生物安全性和較高的基因表達效率。因此在實現(xiàn)本發(fā)明時，人源細胞可用HIV來源的慢病毒載體轉(zhuǎn)導，該載體含有抑制具有復制能力的重組子(RCR)形成的元件和誘導轉(zhuǎn)基因在造血祖細胞和體外分化的血細胞以及初級T細胞內(nèi)高水平表達的內(nèi)部啟動子元件。例如，本發(fā)明的載體可用于轉(zhuǎn)導人CD34+細胞以及其他人源的造血細胞。本文所描述的載體的啟動子元件包括gp91-phox啟動子、β-地中海貧血啟動子、gp47-phox和CD4啟動子、EF-1α啟動子或CD1b啟動子，但正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知道的，幾乎所有的啟動子元件都可以應用。Gp91-phox啟動子在某些特定類型的細胞如分化的粒細胞和單核細胞內(nèi)是活化的，可以啟動轉(zhuǎn)基因的表達。而且Gp91-phox啟動子可以通過與活化因子如IFN-γ的相互作用而被活化?？梢钥紤]通過分析注射這些載體的NOD/SCID小鼠體內(nèi)植入物和集落形成情況來確定這些啟動子在體內(nèi)的表達穩(wěn)定性。本發(fā)明的慢病毒載體中抑制RCR的元件是經(jīng)過自身滅活(SIN)設計的。這是通過刪除載體3’LTRU3的主要部分而實現(xiàn)的，這種刪除能使載體具有自身滅活(SIN)特性(Zufferey等，1998)。這種刪除也可以防止LTR和內(nèi)部啟動子元件之間互相干擾。但是，SIN會使轉(zhuǎn)基因的表達水平下降，特別是當啟動子的啟動能力不太強時，如PGK啟動子。本發(fā)明還描述了一種使不具有強啟動子的慢病毒載體內(nèi)的轉(zhuǎn)基因恢復表達水平的方法，該方法是將其他的調(diào)節(jié)元件如土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件(WPRE)或乙型肝炎病毒調(diào)節(jié)元件(HPRE)插入到缺失的3’LTR上游。WPRE的插入不會影響啟動子元件表達的特異性。載體中插入HS元件還有其他好處，比如將HS系列的增強子元件插入到pHPX-GFP中可以獲得高水平的基因表達，并且由于HS的沉默活性使雜基因的表達較少。見May等，(2000)″表達編碼人β球蛋白的慢病毒的β地中海貧血小鼠體內(nèi)治療性血紅蛋白的合成″(″Therapeutichaemaglobinsynthesisinbeta-thalassaemicmiceexpressinglentivirus-encodedhumanbeta-globin，)″Nature40682-86，本文已納入作為參考。May等人(2000)證實慢病毒載體內(nèi)位于β球蛋白啟動子上游的HS元件可以使β球蛋白cDNA高水平表達，并且其他基因的表達水平很低。在MLV來源的載體無效的情況下本發(fā)明的慢病毒載體可以有效地轉(zhuǎn)導幾種人血細胞，其中，包括CD34+細胞。而且，人CD34+細胞還被證實能以相對較低的MOI被有效轉(zhuǎn)染，盡管基因轉(zhuǎn)移的效率下降到約60％-70％。用10個MOI就可以達到預期的轉(zhuǎn)導效率，這一數(shù)值比以前文獻報道的都要低，以前大約需要60-300和1000-3000MOI(Miyoshi等，1999；Cas等，1999)。這部分是由于增大了載體與靶細胞之間接觸的可能性，因為本發(fā)明的方法是在一個較小的體積(200μl的體積內(nèi)105個細胞)內(nèi)使CD34+細胞與載體顆?；旌霞s6到24小時。因此，本發(fā)明提供了安全、高效并且能使轉(zhuǎn)基因在人造血祖細胞及其他各種血細胞中表達的HIV來源的載體，該載體還具有自身滅活特性。這些載體還提供了在分化細胞內(nèi)的細胞類型特異性表達及可控表達特性。因此這些載體可作為基因治療的工具治療遺傳性和獲得性淋巴造血系統(tǒng)疾病、腫瘤特別是造血系統(tǒng)的腫瘤，預防和治療HIV感染，以及通過慢病毒載體介導的人HSCs的基因改造來研究造血功能。1.慢病毒載體和基因治療慢病毒是復合型的逆轉(zhuǎn)錄病毒，除了含有一般逆轉(zhuǎn)錄病毒所具有的gag、pol和env基因外，還含有其他調(diào)節(jié)基因或結(jié)構(gòu)基因。這種高度的復雜性使病毒能在潛在感染期內(nèi)調(diào)整自己的生命周期。慢病毒的例子包括人免疫缺陷病毒HIV-1、HIV-2和類人猿免疫缺陷病毒SIV。通過將HIV的多個致病基因如env、vif、vpr、vpu和nef刪除構(gòu)建出了高生物安全性的慢病毒載體。慢病毒載體用于基因治療具有很大優(yōu)勢。載體可以穩(wěn)定地整合到靶細胞的基因組內(nèi)獲得長期表達。載體還不會轉(zhuǎn)移病毒的基因因而避免了轉(zhuǎn)導細胞被細胞毒T細胞破壞的問題。載體還具有相對較高的克隆形成能力，足以滿足臨床應用的需要。另外，慢病毒與其他逆轉(zhuǎn)錄病毒相比還能轉(zhuǎn)染非分裂的細胞，這點在進行組織如造血系統(tǒng)、腦、肝臟、肺和肌肉的基因治療時非常重要。例如，HIV-1來源的載體能在體內(nèi)和體外有效地將轉(zhuǎn)基因?qū)氩⒄系郊毎麅?nèi)并使其在細胞內(nèi)穩(wěn)定表達，這些細胞包括神經(jīng)元、肝細胞和單核細胞(Blomer等，1997；Kafri等，1997；Naldini等，1996；Naldini等，1998)。慢病毒基因組和前病毒DNA含有三個存在于逆轉(zhuǎn)錄病毒中的基因gag、pol和env，三者之間被兩個長末端重復序列(LTR)分開。gag基因編碼內(nèi)部結(jié)構(gòu)蛋白(基質(zhì)、殼體和核殼體)；pol基因編碼RNA指導的DNA聚合酶(反轉(zhuǎn)錄酶)、蛋白酶和整合酶；env基因編碼病毒包膜糖蛋白。5’和3’LTR負責啟動病毒RNA的轉(zhuǎn)錄和多聚腺苷酸化。LTR含有病毒復制所需要的所有其他順式作用元件。慢病毒還含有其他基因，包括vif、vpr、tat、rev、vpv、nef和vpx。5’LTR附近的序列是基因組(tRNA引物結(jié)合位點)反轉(zhuǎn)錄和病毒RNA有效包裝進入病毒顆粒(Psi位點)所必須的。如果包裝(或逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA包裝成有感染能力的病毒顆粒)所需要的序列被從基因組中刪除，則這種順式缺失就會阻止基因組RNA的包裝。但是，所產(chǎn)生的突變株依然能指導所有病毒蛋白的合成。慢病毒載體是本領(lǐng)域所熟知的，見Naldini等，(1996和1998)；Zufferey等，(1997)；Dull等，(1998)，Ramezani等，(2000)，本文都已納入作為參考。還可參見美國專利5,994,136；6,013,516；6,165,782；6,207,455；6,218,181；6,218,186；和6,277,633號，本文都已納入作為參考。一般來說，這些載體都是質(zhì)粒來源的或病毒來源的，都含有插入外源核酸、篩選及將核酸轉(zhuǎn)移到宿主細胞所需的序列。構(gòu)建病毒來源的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)包括兩部分第一部分是用于包裹結(jié)構(gòu)蛋白的包裝元件和產(chǎn)生有感染性的病毒所需要的酶，第二部分是載體本身的一些元件，也就是被轉(zhuǎn)移的基因序列。兩部分在設計時都采取了保證生物安全性的措施。第一代HIV來源的載體的包裝單位含有除包膜蛋白之外的所有HIV-1的蛋白質(zhì)(Naldini等，1998)。后來發(fā)現(xiàn)刪除另外四個負責毒性的病毒基因vpr、vif、vpu和nef也不會改變載體系統(tǒng)的效率(Zufferey等，1997)。后來還發(fā)現(xiàn)HIV的主要反式作用因子Tat對于產(chǎn)生具有全部功能的載體也是可有可無的(Dull等，1998)。因此，第三代HIV來源的慢病毒載體的包裝單位只含有野生型病毒的三個基因gag、pol和rev，這樣就消除了通過重組重新產(chǎn)生野生型病毒的可能性。這一系統(tǒng)還可以通過去除載體上的HIV轉(zhuǎn)錄單位加以改進(Zufferey等，1998)。實驗證明將產(chǎn)生載體RNA的DNA3’LTR的U3區(qū)刪除可以構(gòu)建出具有自身滅活(SIN)特性的載體。在反轉(zhuǎn)錄過程中這種刪除轉(zhuǎn)移到前病毒DNA的5’LTR上。只要刪除足夠的序列，包括去除TATA框，就可以消除LTR的轉(zhuǎn)錄活性，阻止轉(zhuǎn)導細胞內(nèi)產(chǎn)生全長的載體RNA。但這并不影響載體的滴度和在體外和體內(nèi)的特性。本發(fā)明還對現(xiàn)有的慢病毒載體進行了幾種改進，如上面所描述的及說明書的其他部分所描述的。將帶有外源基因的用于治療本發(fā)明所述的淋巴-造血系統(tǒng)疾病的慢病毒載體導入包裝細胞中就可以得到病毒生產(chǎn)者細胞，該細胞可以釋放出具有感染性的攜帶外源轉(zhuǎn)基因的病毒顆粒。env基因可以是任何病毒的，其中包括逆轉(zhuǎn)錄病毒。env優(yōu)選雙噬性的包膜蛋白，這樣就可以轉(zhuǎn)染人源細胞和其他物種的細胞。逆轉(zhuǎn)錄病毒來源的env基因包括而不限于下列病毒的Moloney鼠白細胞病毒(MoMuLV或MMLV)、Harvey鼠肉瘤病毒(HaMuSV或HSV)、鼠乳腺腫瘤病毒(MuMTV或MMTV)、長臂猿白血病病毒(GaLV或GALV)、人免疫缺陷病毒(HIV)和勞氏肉瘤病毒(RSV)。其他env基因如水泡性口炎病毒(VSV)蛋白G(VSVG)、肝炎病毒和流感病毒的env也可以使用。雖然VSVG蛋白是一種理想的env基因，因為VSVG使重組病毒具有很寬的宿主范圍，但是VSVG對宿主細胞有害。因此當使用VSVG時最好用可誘導的啟動子系統(tǒng)以便調(diào)節(jié)VSVG的表達，在不需VSVG表達時能使其對宿主的毒性降到最小。例如，Gossen和Bujard(1992)構(gòu)建的四環(huán)素調(diào)節(jié)的基因表達系統(tǒng)可用于提供VSVG的可誘導表達，當轉(zhuǎn)染細胞無四環(huán)素時VSVG的表達停止。因此，tet/VP16反式作用因子存在于第一個載體中，而另一個載體上的tet操縱區(qū)控制克隆到啟動子下游的VSVG編碼序列。含有病毒env核酸序列的載體在發(fā)揮功能時與調(diào)節(jié)序列如啟動子或增強子有關(guān)。調(diào)節(jié)序列可以是任何真核啟動子或增強子，包括EF1α、PKG、Moloney鼠白血病病毒啟動子-增強子元件、人巨細胞病毒增強子、牛痘病毒P7.5啟動子等(見下面表1和表2中所列的)。在某些情況下，如Moloney鼠白血病病毒啟動子-增強子元件，啟動子-增強子元件位于LTR序列內(nèi)或臨近LTR元件。較好的調(diào)節(jié)序列是那些構(gòu)建載體所用的慢病毒本身所不具有的。例如，如果載體用SIV構(gòu)建，則SIVLTR中的SIV調(diào)節(jié)元件應該被非SIV來源的調(diào)節(jié)元件所替代。我們還可以通過將特定類型細胞受體的抗體或特定配基連接到病毒的包膜蛋白上從而使重組病毒具有靶向性。將感興趣的序列(包括調(diào)節(jié)區(qū))連同編碼特定靶細胞受體配基的其他基因插入到病毒載體中，載體就具有了靶向特異性。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以通過插入一個糖脂或糖蛋白而使其具有靶向特異性。靶向性通常是通過利用對逆轉(zhuǎn)錄病毒載體有靶向性的抗體的抗原結(jié)合區(qū)或重組型抗體型分子如單鏈抗體來實現(xiàn)的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員不需過多的實驗就應該知道或很容易地確定如何利用特殊的方法來使逆轉(zhuǎn)錄病毒載體具有靶向性。異源核酸序列或外源核酸序列如編碼治療遺傳性或獲得性造血系統(tǒng)疾病的基因所具有的多聚核苷酸序列可與調(diào)節(jié)核酸序列連接。異源序列優(yōu)選連接到啟動子上，構(gòu)成嵌合基因。標記基因用于分析載體是否存在，以及觀察載體是否感染和整合。標記基因的存在確保了只有那些表達轉(zhuǎn)基因的宿主細胞才能被選擇出來并生長增殖。典型的標記基因編碼對抗生素或其他毒性物質(zhì)如組氨醇、嘌呤霉素、潮霉素、新霉素、氨甲蝶呤抗性的蛋白質(zhì)以及編碼細胞表面標記物。本發(fā)明的重組病毒能將核酸序列轉(zhuǎn)移到哺乳動物細胞內(nèi)。術(shù)語″核酸序列″是指本文所詳細描述的任何核酸分子，尤其是指DNA。核酸分子可以是各種來源的，包括DNA、cDNA、合成的DNA、RNA或上述物質(zhì)的組合。這種核酸序列也包括基因組DNA，其中可以包含天然的內(nèi)含子，也可以不包含。而且，這種基因組DNA可以帶有啟動子區(qū)、多聚腺苷酸區(qū)或其他相關(guān)序列。基因組DNA可以通過本領(lǐng)域所熟知的方法從適當?shù)募毎麅?nèi)提取和純化。另外也可以從細胞中分離信使RNA(mRNA)，通過反轉(zhuǎn)錄或其他方法制備cDNA。載體可以通過轉(zhuǎn)染或感染的方式進入包裝細胞株。包裝細胞產(chǎn)生含有載體基因組的病毒顆粒。轉(zhuǎn)染或感染的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。將包裝載體和轉(zhuǎn)移載體共轉(zhuǎn)染到包裝細胞后，重組病毒從培養(yǎng)液中恢復出現(xiàn)，其滴度可以本領(lǐng)域技術(shù)人員所使用的標準方法確定。因此，包裝載體一般和顯性選擇標記物如新霉素、DHFR、谷氨酰胺合成酶一起通過鈣-磷酸鹽沉淀、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染或電穿孔導入人源細胞系內(nèi)，隨后用適當?shù)乃幬锖Y選，分離出陽性克隆。選擇標記基因一般與載體的包裝基因相連。已知有些穩(wěn)定的細胞系適宜作為具有包裝功能的包裝細胞，如美國專利5,686,279號和Ory等人(1996)的文獻所描述的包裝細胞。轉(zhuǎn)染有慢病毒載體的包裝細胞就稱為病毒生產(chǎn)者細胞。因此所謂的病毒生產(chǎn)者細胞就是能產(chǎn)生或釋放包裝的具有感染性病毒顆粒的細胞或細胞系，該病毒顆粒中含有治療轉(zhuǎn)基因。這些細胞還可以是貼壁依賴性的，就是說這些細胞在黏附到一種表面如玻璃或塑料表面上時可以生長、存活或維持其功能。病毒生產(chǎn)者細胞也可以是惡性轉(zhuǎn)化細胞。可以作為慢病毒載體包裝細胞的貼壁依賴性細胞系有HeLa細胞或293細胞和PERC.6細胞，載體在這些包裝細胞內(nèi)具有復制能力。在某些應用方面，特別是當病毒用于基因治療時，優(yōu)選復制能力缺陷的載體以避免病毒在治療的患者體內(nèi)無節(jié)制地增殖。在某些例子中，可以選擇經(jīng)改造的哺乳動物細胞系，細胞系的改造是通過修飾病毒生產(chǎn)者細胞的基因組以使其具有病毒的基本功能，或者是與輔助病毒共轉(zhuǎn)染病毒生產(chǎn)者細胞，使其表達某些蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)能彌補因從病毒基因組刪除序列而缺失的功能。例如，對于HIV-1來源的載體來說，可用如Corbeau等人(1996)描述的HIV-1包裝細胞系PSI422。同樣，如果所產(chǎn)生的病毒載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒，則可用Ory等人(1996)所描述的人源293來源的逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細胞293GPG，該細胞能產(chǎn)生高滴度的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。如果載體系統(tǒng)很小，則可以通過改造病毒生產(chǎn)者細胞(或者通過改造病毒的基因組，或者通過使用輔助病毒或粘粒)以彌補親本病毒的功能，使其能在病毒生產(chǎn)者細胞內(nèi)復制并包裝成病毒顆粒。Naldini等人(1996)已經(jīng)用慢病毒轉(zhuǎn)移載體感染體外貼壁生長的人源細胞，并且通過直接將載體注射到成年大鼠腦內(nèi)來轉(zhuǎn)導神經(jīng)元。載體能有效地將標記基因轉(zhuǎn)移到神經(jīng)元中，并且能長期表達而不會造成明顯的病理損傷。單劑量的載體注射后10個月檢測動物發(fā)現(xiàn)基因表達的平均水平無明顯下降，也沒有跡象表明出現(xiàn)了病理損傷或免疫反應(Blomer等，1997)。2.SIN設計SIN的設計提高了慢病毒載體的生物安全性。HIVLTR主要是由U3序列組成的，該序列含有增強子和啟動子元件，二者能調(diào)節(jié)HIV基因在感染細胞內(nèi)的基礎(chǔ)表達和誘導表達，并且受細胞活化的影響。這些啟動子元件中的幾個是病毒復制所必須的。某些增強子元件在各種病毒分離株中是高度保守的，已被證明是病毒產(chǎn)生致病性的關(guān)鍵因素。增強子元件可以影響病毒在不同靶細胞內(nèi)的復制速度(Marthas等，1993)。由于病毒的轉(zhuǎn)錄起始于5’LTRU3區(qū)的3’末端，這些序列不包含在病毒mRNA之內(nèi)，因此3’LTR來源的拷貝作為產(chǎn)生整合的前病毒兩個LTR的模板。如果逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中的U3區(qū)的3’拷貝發(fā)生改變，則載體RNA還可以從病毒生產(chǎn)者細胞的無活性的5’LTR產(chǎn)生，但是在靶細胞內(nèi)不能再產(chǎn)生。用這種載體轉(zhuǎn)導結(jié)果就會使子代病毒的兩個LTR都失去活性。因此，逆轉(zhuǎn)錄病毒是自身滅活的(SIN)，這些病毒被稱為SIN轉(zhuǎn)移載體。有關(guān)SIN設計的進一步細節(jié)見Zufferey等，1998和美國專利5,994,136號的描述，本文已納入作為參考。但是正如其中所描述的，3’LTR刪除的范圍也有限制。首先，U3區(qū)的5’末端還有另外一項基本功能，就是該末端是整合所必須的(末端的二核苷酸+att序列)。因此，末端的二核苷酸和att序列是U3序列5’端能刪除的邊界。另外，某些松弛區(qū)也會影響R區(qū)中下游多聚腺苷酸化位點的活性。過多地從3’LTR刪除U3序列會降低載體轉(zhuǎn)錄物的多聚腺苷酸化水平，進而對載體在病毒生產(chǎn)者細胞中的滴度和基因在靶細胞中的表達造成負面影響。但是另外一個方面，有限的刪除不會取消LTR在轉(zhuǎn)導細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄活性。本文所描述的慢病毒載體可以是將3’LTRU3區(qū)的-418到-18位核苷酸刪除的。這樣大范圍的刪除甚至可以到TATA框，因此LTR在轉(zhuǎn)導細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄活性被完全滅活。但這些載體在病毒生產(chǎn)者細胞內(nèi)的滴度及轉(zhuǎn)基因在靶細胞內(nèi)的表達并不受影響。這一設計大大提高了載體的生物安全性。象這種大范圍刪除U區(qū)的SIN型載體無法以鼠白血病病毒(MLV)或脾壞死病毒(SNV)來源的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體為基礎(chǔ)構(gòu)建而其轉(zhuǎn)導效率不降低。去除-418到-18位的核苷酸序列可以使LTR的轉(zhuǎn)錄活性消失，從而使載體在轉(zhuǎn)導細胞內(nèi)無法生成全長的載體RNA。但是HIV來源的慢病毒載體無論在體內(nèi)還是體外都無法通過SIN設計來使其活性降低。3.轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件(PRE)在某些實施方式中需要增強轉(zhuǎn)基因的表達，特別是本發(fā)明的那些具有溫和啟動子的慢病毒載體。一種類型的PRE是位于表達盒內(nèi)的內(nèi)含子，該內(nèi)含子能刺激基因的表達。但是在慢病毒的生命周期循環(huán)中內(nèi)含子會被剪切掉。因此，如果用內(nèi)含子作為PRE，就需要將其置于載體基因組轉(zhuǎn)錄物方向相反的位置上。不依賴剪接事件的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件其優(yōu)點在于在病毒的生命循環(huán)周期中不會被刪除。這種調(diào)節(jié)元件的例子包括單純皰疹病毒的轉(zhuǎn)錄后處理元件、乙型肝炎病毒的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件(HPRE)和土撥鼠肝炎病毒的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件(WPRE)。其中WPRE是最好的，因為它含有HPER所不具有的順式作用元件(Donello等，1998)。這個調(diào)節(jié)元件位于載體內(nèi)因此可以被包含在轉(zhuǎn)基因的RNA轉(zhuǎn)錄物之內(nèi)，但是位于轉(zhuǎn)基因翻譯單位的終止密碼子之外。如本發(fā)明和Zufferey等人(1999)所證明的，WPRE是在使用慢病毒載體時刺激和增強轉(zhuǎn)基因表達的有效工具。3.WPRE的特征見美國專利6,136,597號的描述，本文已納入作為參考。如該專利文獻所描述，WPRE是一種RNA輸出元件，可以有效介導RNA從核到胞漿的轉(zhuǎn)運。它可以通過插入一個順式作用核酸序列來增強轉(zhuǎn)基因的表達，因此該元件和轉(zhuǎn)基因位于同一個轉(zhuǎn)錄物之內(nèi)。實驗表明順式存在的WPRE能將轉(zhuǎn)基因的表達增強7到10倍。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)移序列是以cDNA的形式而不是以含內(nèi)含子的完全基因的形式轉(zhuǎn)移出來，其剪接一般是在形成逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的事件中完成的。內(nèi)含子介導初級轉(zhuǎn)錄物與剪接復合物的相互作用。由于剪接復合物對RNA的處理促進了RNA向胞漿的轉(zhuǎn)運，并且剪接結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)通常是結(jié)合在一起的，因此cDNA的表達效率常常不高。而載體中包含WPRE就可以增強轉(zhuǎn)基因的表達。4.啟動子和增強子″啟動子″是一種調(diào)控序列，該序列控制轉(zhuǎn)錄的起始和速度。它可以含有遺傳元件，調(diào)節(jié)蛋白和分子在此結(jié)合，如RNA多聚酶，從而啟動核酸序列的特異性轉(zhuǎn)錄。術(shù)語″位于操縱下的″、″連接于調(diào)控下的″、″控制下的″以及″轉(zhuǎn)錄控制下的″是指啟動子與核酸序列具有正確的功能定位和/或正確的方向以便控制該序列的轉(zhuǎn)錄起始和/或表達。啟動子一般含有一個能定位RNA合成起始位點的序列。其中最熟悉的是TATA框，但是某些啟動子沒有TATA框，如哺乳動物末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶基因的啟動子和SV40晚期基因的啟動子，重疊于起始位點上的不連續(xù)元件可以幫助其定位轉(zhuǎn)錄起始點。另外，啟動子元件還能調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起始的頻率。一般來說，啟動子位于起始位點上游30-110bp區(qū)域內(nèi)，雖然也有許多啟動子含有位于起始位點下游的功能元件。為了使一個編碼序列置于啟動子控制之下，需要將轉(zhuǎn)錄閱讀框架轉(zhuǎn)錄起始位點的5’端置于該啟動子的下游，即3’端?！迳嫌巍鍐幼幽艽碳NA的轉(zhuǎn)錄、促進編碼RNA的表達。各啟動子元件之間的距離通常是很靈活的，這樣各元件相對移動時啟動子的功能也不會發(fā)生改變。比如tk啟動子的各元件之間距離達到50bp時其活性才開始下降。不同的啟動子作用方式不同，各元件之間可以協(xié)同活化轉(zhuǎn)錄，也可以各自獨立活化轉(zhuǎn)錄。啟動子可以和增強子連接，也可以不連接，增強子是指調(diào)節(jié)核酸序列轉(zhuǎn)錄活化的順式調(diào)節(jié)序列。啟動子可以是與核酸序列有關(guān)的天然序列，例如可以通過分離編碼片段和/或外顯子上游的5’非編碼序列獲得。這種啟動子被稱為″內(nèi)源性″的啟動子。同樣，增強子也可以是與核酸序列有關(guān)的天然序列，位于該序列的下游或上游。另外，將編碼核酸片段置于重組的或異源的啟動子控制之下也有某些優(yōu)勢，重組的或異源的啟動子是指在自然環(huán)境中該啟動子不會與核酸片段相關(guān)。重組的或異源的增強子也是指在自然環(huán)境中該啟動子不會與核酸片段相關(guān)的增強子。這種啟動子或增強子包括其他基因的啟動子或增強子、從其他任何病毒、原核細胞或真核細胞分離的啟動子或增強子和非″天然的″的啟動子或增強子，即含有能改變表達的不同轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)和/或突變體的不同元件。例如，重組DNA載體中最常用的啟動子包括β-內(nèi)酰胺酶(青霉素酶)、乳糖和色氨酸(trp)的啟動子系統(tǒng)。除了通過合成構(gòu)建啟動子和增強子核酸序列外，還可以利用本文所描述的組合物通過重組克隆技術(shù)和/或核酸擴增技術(shù)構(gòu)建啟動子和增強子序列，包括PCRTM(見美國專利4,683,202和5,928,906號，本文都已納入作為參考)。另外，那些調(diào)控基因在線粒體、葉綠體等無核細胞器內(nèi)轉(zhuǎn)錄和/或表達的序列也可用于本發(fā)明中。含有啟動子、增強子以及其他位點或轉(zhuǎn)錄控制/調(diào)節(jié)元件的控制序列也被稱為″轉(zhuǎn)錄盒″。利用天然的啟動子和/或增強子有效控制DNA片段在細胞器、細胞、組織、器官或有機體內(nèi)表達是非常重要的。分子生物學領(lǐng)域的技術(shù)人員一般都知道如何結(jié)合使用啟動子、增強子和某種類型的細胞來進行蛋白的表達(見Sambrook等，1989，本文已納入作為參考)。所用的啟動子可以是組成的、組織特異的、可誘導的、和/或在適當?shù)臈l件下能使導入的DNA片段高水平表達的，比如適于基因治療的，或者適于某些用途如大規(guī)模制備重組蛋白和/或肽的。啟動子可以是異源的，也可以是內(nèi)源性的。利用T3、T7或SP6胞漿表達系統(tǒng)是另外一種可能的實施方式。真核細胞支持某些細菌啟動子控制的胞漿轉(zhuǎn)錄，只要提供合適的細菌多聚酶，該啟動子可以作為轉(zhuǎn)導復合物的一部分，也可以作為附加的基因表達載體。表1列出的是本發(fā)明可使用的能調(diào)節(jié)RNA表達的元件/啟動子的例子，這些例子是非限定性的。表2列出的是可誘導元件的例子，可誘導元件是能被特異的刺激活化的核酸序列，這些例子也是非限定性的。組織特異性啟動子或元件及其活性特征的鑒定是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。這種序列包括而不限于在下列基因中人LIMK2基因(Nomoto等，1999)、生長抑素受體2基因(Kraus等，1998)、鼠附睪視黃酸結(jié)合基因(Lareyre等，1999)、人CD4(Zhao-Emonet等，1998)、鼠α2(XI)膠原(Tsumaki等，1998)、D1A多巴胺受體基因(Lee等，1997)、胰島素樣生長因子II(Wu等，1997)以及人血小板內(nèi)皮細胞黏附分子-1(Almendro等，1996)。最初本發(fā)明的慢病毒載體用于將治療基因轉(zhuǎn)化細胞時是將基因置于規(guī)則的真核細胞啟動子之下。盡管優(yōu)選gp91-phox啟動子，但上面表1和表2中所描述的啟動子和調(diào)節(jié)信號元件也可以使用。另外，任何啟動子/增強子的組合(如真核啟動子數(shù)據(jù)庫EPDB中的每一個)都可用于驅(qū)動編碼治療轉(zhuǎn)基因的結(jié)構(gòu)基因的表達，該治療基因位于本發(fā)明的慢病毒載體內(nèi)。腫瘤基因治療所用的組織特異性啟動子或腫瘤的靶標可與本發(fā)明的慢病毒載體一起用于腫瘤的治療，特別是造血系統(tǒng)腫瘤的治療。啟動子和增強子元件可以通過與適當?shù)霓D(zhuǎn)錄激活物或轉(zhuǎn)錄抑制因子相互作用被活化或抑制，如圖1B所描述的gp91-phox啟動子和Luo和Skalnik(1996)J.Biol.Chem.27118203-201，以及Luo和Skalnik(1996)J.Biol.Chem.27123445-23451所描述的那些元件，本文已納入作為參考。對于gp91-phox啟動子來說，干擾素-γ對表達盒轉(zhuǎn)錄和表達的調(diào)控可以作為說明本發(fā)明中啟動子或增強子元件與調(diào)控因子如何相互作用的例子。增強子最初是被看作位于同一DNA分子遠處位置上的能增強啟動子轉(zhuǎn)錄活性的元件。它的這種能在很遠的位置發(fā)揮作用的能力在以前的原核細胞轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的經(jīng)典研究中是沒有先例的。后來的研究表明具有增強子活性的DNA區(qū)結(jié)構(gòu)類似于啟動子。也就是說它們也是由許多單個的元件構(gòu)成的，每個元件結(jié)合一個或多個轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白。比如圖1B所顯示的gp91-phox啟動子的調(diào)節(jié)模式。本發(fā)明中比較典型的增強子是DNA酶超敏元件，其同源類似物見文獻LienLL，LeeY，OrkinSH，(1997)″通過酵母人工染色體轉(zhuǎn)導胚胎干細胞研究髓樣細胞表達的人gp91-phox的調(diào)節(jié)抑制多變的細胞表達模式需要遠端順式作用元件的完全互補″(″Regulationofthemyeloid-cell-expressedhumangp91-phoxgeneasstudiedbytransferofyeastartificialchromosomeclonesintoembryonicstemcellssuppressionofavariegatedcellularpatternofexpressionrequiresafullcomplementofdistantciselements，)″MolCellBiol.17(4)2279-90。其全部內(nèi)容已清楚地納入本文中作為參考。在這些增強子元件的影響下，基因表達可能增強(由于HS的增強子活性)而且穩(wěn)定(由于HS的沉默活性)。gp91-phox啟動子HS元件的模擬物在其他的啟動子-增強子系統(tǒng)中是有活性的。例如文獻MayC，RiveliaS，CallegariJ，HellerG，GaenslerKM，LuzzattoL，SadelainM，(2000)″表達慢病毒編碼的人β球蛋白的β地中海貧血小鼠體內(nèi)治療性血紅蛋白的合成″(Therapeutichaemoglobinsynthesisinbeta-thalassaemicmiceexpressinglentivirus-encodedhumanbeta-globin.)Nature406(6791)82-6，本文已納入作為參考，其中類似的β球蛋白HS元件位于慢病毒內(nèi)控制β球蛋白cDNA表達的β球蛋白啟動子的上游。啟動子和增強子都具有在細胞內(nèi)活化轉(zhuǎn)錄的基本功能。他們通常重疊并相鄰，常常具有同樣的結(jié)構(gòu)模式?？傊@些都說明增強子和啟動子是同源的，結(jié)合到這些序列上的轉(zhuǎn)錄活化蛋白以基本相同的方式與細胞的轉(zhuǎn)錄復合物相互作用。二者之間的基本區(qū)別是其調(diào)控模式。增強子作為整體來講必須位于遠端刺激轉(zhuǎn)錄，這和啟動子區(qū)及其組成元件是不同的。另外，啟動子必須含有一個或多個在特定位點并在特定方向上直接啟動RNA合成的元件，而增強子不具備這些特征。除了操作距離的區(qū)別之外，增強子和啟動子是非常相似的。因此，控制轉(zhuǎn)錄和表達的調(diào)控序列可以含有各種排列組合的元件，以便控制其調(diào)控的方式和力度。一個被證明有用的信號是多聚腺苷酸信號(hGH、BGH、SV40)。內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(IRES)序列的使用使信使RNA具有了多基因性或多順反子化。IRES元件繞過了5’甲基化帽子依賴翻譯的核糖體掃描模式，可以在內(nèi)部位點開始翻譯(Pelletier和Sonenberg，1988)。細小核糖核酸病毒家族兩個成員(脊髓灰質(zhì)炎病毒和腦心肌炎病毒)(Pelletier和Sonenberg，1988)和一個哺乳動物信使RNA(Macejak和Sarnow，1991)的IRES元件已被報道。IRES可與異源開放閱讀框架連接。多個開放閱讀框架可以一起轉(zhuǎn)錄，但每個都由一個IRES分開，形成多順反子信使RNA。由于有IRES元件，每個開放閱讀框架都和核糖體結(jié)合而翻譯。多個基因可以由一個啟動子/增強子驅(qū)動轉(zhuǎn)錄出一條信使RNA而得以有效表達。在任何情況下都應該明白啟動子是DNA元件，只有當其位于基因的上游時才能導致該基因的表達。用本發(fā)明的慢病毒載體轉(zhuǎn)移的大多數(shù)轉(zhuǎn)基因都位于啟動子元件的下游才能發(fā)揮功能。一個特異的起始信號也是編碼序列有效翻譯所需要的。這些信號包括ATG起始密碼子或其臨近的序列。外源的翻譯控制信號包括ATG起始密碼子也需要提供。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應該能夠很容易地確定這一點并提供必須的信號。大家都知道，起始密碼子必須位于目的編碼序列的開放閱讀框架內(nèi)才能確保整個編碼序列的完整翻譯。外源翻譯控制信號和起始密碼子可以是天然的，也可以是合成的。表達的效率會因包含適當?shù)霓D(zhuǎn)錄增強子元件而得到提高。5.表中序列的簡要描述SEQIDNO1代表的是HIV中央多聚嘌呤簇元件的核苷酸序列，如文獻Follenzi，A，Ailles，L.E.，Bakovic，S.，Geuna，M.，Naldini，L.(2000)″慢病毒載體介導的基因轉(zhuǎn)移被核轉(zhuǎn)位所限制而被HIV-1pol序列所恢復″，(″GeneTransferbyLentiviralVecotrsisLimitedbyNuclearTranslocationandRescuedbyHIV-1polSequences，)″Nat.Genet.25217-22所報道的，該序列來自HIV。SEQIDNO2-6代表的是含DNA酶超敏位點的核苷酸序列，這些序列在本發(fā)明的某些實施方式中用作增強子。見下述文獻的報道LienLL，LeeY，和OrkinSH，″通過酵母人工染色體轉(zhuǎn)導胚胎干細胞研究髓樣細胞表達的人gp91-phox的調(diào)節(jié)抑制多變的細胞表達模式需要遠端順式作用元件的完全互補″(″Regulationofthemyeloid-cell-expressedhumangp91-phoxgeneasstudiedbytransferofyeastartificialchromosomeclonesintoembryonicstemcellssuppressionofavariegatedcellularpatternofexpressionrequiresafullcomplementofdistantciselements，)″Mol.Cell.Biol.17(4)2279-90(1997)。SEQIDNOS7-16代表的是用于制備SEQIDNO2-6的HS元件的PCR引物序列。PCR引物序列和HS元件的序列是基于人類基因組工程所報道的人基因組序列(編號NT011844；http∥www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/human/)。PCR擴增的HS元件(+1gp91-phox轉(zhuǎn)錄起始點)在人基因組DNA序列中的位置為HS-12(-11503，-13244)，HS-14(-13244，-14715)，HS-26(-25345，-26529)，HS-27(-26529，-27656)，HS-28(-27657，-28893)。所顯示的片段比計算出來的長度稍長，這是因為在末端插入了幾個限制性酶切位點以便于克隆操作(HS-12和HS-14；gta恢復了pHPX-GFP上的5’SnaBI位點；HS-26、HS-27、HS-28SalI；gcgtcgac和XhoI；ctcgagcggc)。本發(fā)明特定實施方式中所涉及的其他序列包括那些編碼gp91-phox及其同源物的序列，其中包括Genbank檢索號為NM000397的編碼gp91-phox的核苷酸序列(Dinauer，等，1987)，SEQIDNO18和SEQIDNO19多肽序列。特定實施方式中涉及的序列還有Genbank檢索號為M66390的核苷酸序列所編碼的gp91-phox啟動子，編號為SEQIDNO17，以及Genbank檢索號為M82856的核苷酸序列所編碼的CD11b啟動子，編號為SEQIDNO20。6.核酸本發(fā)明的一個實施方式涉及轉(zhuǎn)移編碼治療基因的核酸，特別是用于治療造血系統(tǒng)和淋巴造血系統(tǒng)疾病，如上述遺傳性和獲得性疾病的基因。在一個實施方式中，核酸編碼全長的基因、基本為全長的基因或與這種基因功能相當?shù)幕?。因此，在本發(fā)明的某些實施方式中，造血系統(tǒng)和淋巴造血系統(tǒng)疾病的治療包括向造血系統(tǒng)來源的細胞內(nèi)轉(zhuǎn)導含有治療性核酸表達構(gòu)建體的慢病毒載體。還涉及向造血細胞內(nèi)轉(zhuǎn)導該構(gòu)建體并使其表達編碼治療性多肽的核酸，從而恢復細胞的正常表型。核酸可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的任何技術(shù)制備。合成的核酸，特別是合成的寡核苷酸的非限定性的例子包括通過磷酸三酯、亞磷酸或phosphoramidite化學技術(shù)以及EP266,032描述的固相合成技術(shù)經(jīng)體外合成而制備的核酸，本文已納入作為參考?；蛘咄ㄟ^如Froehler等(1986)和美國專利5,705,629號所描述的脫氧核苷H磷酸中間體合成的核酸，本文都已納入作為參考。通過酶催化反應制備核酸的非限定性例子包括通過酶擴增反應如PCR(見美國專利4,683,202號和4,682,195號，本文已納入作為參考)，或者如美國專利5,645,897號所描述的寡核苷酸的合成，本文已納入作為參考。通過生物方法制備核酸的非限定性的例子包括在活細胞內(nèi)制備的重組核酸(如Sambrook等，1989，本文已納入作為參考)。核酸可以用聚丙稀酰胺凝膠電泳、氯化銫密度梯度離心或本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的其他任何技術(shù)純化(如Sambrook等1989，本文已納入作為參考)。術(shù)語″核酸″一般是指至少一個分子，一條DNA、RNA鏈或其衍生物或模仿物，其中至少含有一個堿基，如DNA中天然的嘌呤或嘧啶堿基(腺嘌呤A、鳥嘌呤G、胸腺嘧啶T和胞嘧啶C)、RNA中嘌呤或嘧啶堿基(A、G、鳥嘧啶U和C)。術(shù)語″核酸″包含″寡核苷酸″和″多聚核苷酸″。術(shù)語″寡核苷酸″是指長度約為3到100堿基之間的至少一個分子。術(shù)語″多聚核苷酸″是指長度約大于100個堿基的至少一個分子。這些定義一般指至少一個單鏈分子，但在某些特定實施方式中，還可以至少包含另外一條鏈，該鏈至少與其他一條單鏈部分、基本或完全互補。因此，一個核酸可以至少含有一條或多條雙鏈分子，或者至少含有一個三鏈分子，三鏈分子中含有一條或多條互補鏈或含有與特定序列互補的一條鏈。在某些實施方式中，″基因″是指可以轉(zhuǎn)錄的核酸。本文所用″基因片段″是指基因的核酸片段。在某些情況下，基因包含位于轉(zhuǎn)錄物中的調(diào)節(jié)序列、信使RNA產(chǎn)物或組合物。在某些特定實施方式中，基因含有編碼蛋白、多肽或肽的轉(zhuǎn)錄序列。在另外一些特殊情況下，基因含有核酸、和/或含有編碼多肽或肽的序列，這些序列在造血系統(tǒng)和淋巴造血系統(tǒng)疾病中是缺失的或突變的。與本文所描述的術(shù)語相一致的是，″分離基因″可以含有可轉(zhuǎn)錄的從其他序列如其他的天然基因、調(diào)節(jié)序列、多肽或肽編碼序列等分離出來的核酸序列、調(diào)節(jié)序列、編碼序列等。因此，簡單地說，術(shù)語″基因″就是指含有能被轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列及其互補序列的核酸。在某些特定情況下，能被轉(zhuǎn)錄的核酸至少含有一個功能蛋白、多肽和/或肽編碼單位。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，功能術(shù)語″基因″包括基因組序列、RNA或cDNA序列，或者一些小的人工合成核酸片段，包括基因非轉(zhuǎn)錄部分的核酸片段，其中包括而不限于基因的非轉(zhuǎn)錄啟動子或增強子區(qū)。小的人工合成基因核酸片段通過核酸操作技術(shù)可以表達或者適于表達蛋白質(zhì)、多肽、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、肽、融合蛋白、突變體等。因此，″截短的基因″是指一些臨近核苷酸殘基缺失的核酸序列?？梢愿鶕?jù)特定的核酸序列來設計各種長度的核酸片段。通過給序列賦值，如第一個殘基為1，第二個殘基為2等，就可以確定所有核酸片段殘基的位置n→n+y其中n為從1開始到序列最后一個殘基數(shù)字的整數(shù)，y為核酸片段的長度減1，n+y不會超過序列的最后一個數(shù)字。因此，對于一個10-mer的核酸片段來說，其相應的堿基為1到10、2到11、3到12...等等，依此類推。對于一個15-mer的核酸片段來說，其相應的堿基為1到15、2到16、3到17...等等，依此類推。對于一個20-mer的核酸片段來說，其相應的堿基為1到20、2到21、3到22...等等，依此類推。本發(fā)明的核酸，不論其長度如何，都可以和其他的核酸序列連接，其中包括而不限于啟動子、增強子、多聚腺苷酸信號、限制性內(nèi)切酶酶切位點、多克隆位點、編碼片段等，從而形成一個或多個核酸構(gòu)建體。各種核酸構(gòu)建體之間的長度差別很大。因此幾乎所有長度的核酸片段都可以使用，但是總長度最好不要太大以便于基因操作或在合適的重組核酸載體內(nèi)使用。術(shù)語″載體″是指攜帶核酸分子的載體，核酸序列可以插入其中以便于導入細胞內(nèi)并被復制。如上面及本說明書其他部分所描述的，本發(fā)明的載體是慢病毒來源的。由本發(fā)明載體所攜帶的核酸分子編碼治療性基因，可用于基因治療。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以通過標準的重組技術(shù)(見Maniatis等，1988和Ausubel等，1994，本文都已納入作為參考)構(gòu)建這樣的載體。術(shù)語″表達載體″是指任何類型的、含有能編碼可翻譯RNA的核酸的基因構(gòu)建體。在某些情況下，RNA分子進而被翻譯成蛋白質(zhì)、多肽或肽。在另外一些情況下，這些序列不翻譯，例如只生成反義分子或核酶。表達載體可以含有各種″調(diào)控序列″，調(diào)控序列是與編碼序列相連的、基因在特定宿主細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯所必須的核酸序列。除了控制轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)控序列以外，載體和表達載體還可以包含具有其他功能的核酸序列，描述如下A.多克隆位點本發(fā)明的載體可以含有多克隆位點(MCS)，多克隆位點是指含有多個限制性酶切位點的核酸區(qū)，通過標準重組技術(shù)在每個位點都可以消化載體(見Carbonelli等，1999，Levenson等，1998，和Cocea，1997，本文已納入作為參考)?！逑拗菩詢?nèi)切酶消化″是指只在核酸分子的特定位置上用酶催化裂解核酸分子。這些限制性內(nèi)切酶大多是商品化的。其應用是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。常常用限制性內(nèi)切酶在MCS上切開以線性化或片段化載體，從而使外源片段連接到載體上。″連接″是指在兩個核酸片段之間形成磷酸二酯鍵的過程，兩個片段可以彼此臨近，也可以不臨近。與限制性內(nèi)切酶和連接反應相關(guān)的技術(shù)是重組
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員所熟知的。B.剪接位點大多數(shù)可翻譯的真核RNA分子都要經(jīng)過剪接過程以去除初級轉(zhuǎn)錄物中的內(nèi)含子。含有真核基因組序列的載體需要供體和/或受體的剪接位點以確保轉(zhuǎn)錄物被正確加工從而翻譯出蛋白質(zhì)(見Chandler等，1997，本文已納入作為參考)。C.終止信號本發(fā)明的載體或構(gòu)建體一般至少含有一個終止信號?！褰K止信號″或″終止子″是由能終止RNA聚合酶合成RNA轉(zhuǎn)錄物的DNA序列組成的。因此，在某些實施方式中，終止信號可以終止RNA轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生。終止子是在體內(nèi)達到理想的信使RNA水平所必須的。在真核系統(tǒng)中，終止子區(qū)還可以含有特異的DNA序列，該序列可以使新的轉(zhuǎn)錄物通過位點特異的裂解暴露出多聚腺苷酸位點。這一序列發(fā)出信號使特異性內(nèi)源多聚酶將一段約200個腺苷酸殘基的序列(多聚A)加到轉(zhuǎn)錄物的3’末端。具有這種多聚A尾巴的RNA分子更加穩(wěn)定，并且翻譯的效率更高。因此，在涉及真核基因的其他實施方式中，優(yōu)選能促進信使RNA多聚腺苷酸化的終止信號。終止子和/或多聚腺苷酸位點元件可以增加信使RNA的水平，并且可以降低核糖體越過表達盒進入其他序列的可能性?？捎糜诒景l(fā)明的終止子包括本說明書中所描述的以及本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的任何已知的終止子，包括而不限于基因的終止序列，如牛生長激素終止子，或病毒的終止序列如SV40終止子。在某些實施方式中，終止信號缺少可轉(zhuǎn)錄或可翻譯的序列，例如由于序列截短。D.多聚腺苷酸信號在真核基因的表達中，一般都包括一個多聚腺苷酸信號以使轉(zhuǎn)錄物正確腺苷酸化。多聚腺苷酸信號的性質(zhì)被認為不是成功實現(xiàn)本發(fā)明的關(guān)鍵，任何序列的腺苷酸信號都可以使用。例如SV40的多聚腺苷酸信號和牛生長激素的多聚腺苷酸信號，只要該信號便于并且適于用在各種靶細胞中。多聚腺苷酸尾巴可以增加轉(zhuǎn)錄物的穩(wěn)定性，并能促進轉(zhuǎn)錄物向胞漿轉(zhuǎn)運。E.復制起點為了使本發(fā)明的載體在宿主細胞內(nèi)增殖，載體需要有一個或多個復制起始位點(常被稱作″ori″)，它是一個特異的核酸序列，復制在此起始。另外，如果宿主細胞是酵母，可以用自主復制序列(ARS)。F.可篩選和可掃描標記物在本發(fā)明的某些實施方式中，轉(zhuǎn)導本發(fā)明慢病毒載體的細胞需要在體外被鑒定，或者需要觀察轉(zhuǎn)導的細胞是否出現(xiàn)可鑒別的變化以確定細胞是否含有表達載體。一般來說，篩選標記物是指能使細胞被篩選的標記物。陽性篩選標記物是指當標記物存在時細胞被篩選出來，陰性篩選標記物是指當標記物存在時細胞不被篩選出來。陽性篩選標記物的例子有藥物抗性標記物。一般來說，使用藥物篩選標記物的目的在于轉(zhuǎn)化子的克隆和鑒定，例如，對新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、零霉素、組胺醇耐受的基因可以作為篩選標記。除了提供表型篩選以區(qū)別轉(zhuǎn)化子的標記物之外，其他類型的標記物還有可掃描的標記物如GFP，其篩選基礎(chǔ)在于比色分析。另外，可掃描的酶標記物如單純皰疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)也可以使用。本領(lǐng)域的技術(shù)人員還應該知道如何使用FACS分析免疫標記物。用什么樣的標記物并不重要，只要該標記物能和編碼基因產(chǎn)物的核酸同時表達。其他可篩選和可掃描標記物的例子都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。7.宿主細胞本文所用的術(shù)語″細胞″、″細胞系″和″細胞培養(yǎng)物″可以混用。這些術(shù)語都包含其子代細胞，即任何的或所有的子代細胞?？梢岳斫獾氖遣⒎撬械淖哟毎际且粯拥模@是因為會發(fā)生定向的或偶然的突變。在表達異源核酸序列時，″宿主細胞″是指原核細胞或真核細胞，或者任何可轉(zhuǎn)導的有機體，載體能在其中復制并且本發(fā)明載體所編碼的異源核酸能在其中表達。宿主細胞能作為并且已經(jīng)作為載體的受體。宿主細胞能被″轉(zhuǎn)染″或″轉(zhuǎn)化″是指外源核酸能被轉(zhuǎn)染或?qū)胨拗骷毎?。轉(zhuǎn)化的細胞包括初級轉(zhuǎn)化細胞及其子代細胞。本文所用的術(shù)語″基因工程的″和″重組的″細胞或宿主細胞一般是指外源核酸序列如本發(fā)明的攜帶治療基因的慢病毒載體能被導入其中的細胞。因此，重組細胞與天然的細胞是有區(qū)別的，后者不含有被導入的重組核酸。在某些實施方式中，RNA或蛋白序列可以與其他RNA或蛋白序列在同一個宿主細胞內(nèi)表達。共表達可以通過兩個或多個不同的重組載體共轉(zhuǎn)染宿主細胞來實現(xiàn)。另外，一個重組載體也可以構(gòu)建成含有編碼多個不同RNA的載體，這些RNA都可以在轉(zhuǎn)染有這種載體的宿主細胞內(nèi)表達。宿主細胞可以是原核細胞，也可以是真核細胞，這要根據(jù)是希望復制載體還是希望載體編碼的核酸序列被部分或全部表達而定。許多細胞系和細胞培養(yǎng)物都可以作為宿主細胞，還可以從美國典型培養(yǎng)物收集中心(ATCC)得到，該機構(gòu)是負責儲存活的培養(yǎng)物和基因材料的組織(www.atcc.org)。本發(fā)明所涉及的宿主細胞的例子包括而不限于病毒包裝細胞、病毒生產(chǎn)者細胞、293細胞、人造血祖細胞、人造血干細胞、CD34+細胞、CD4+細胞等。A.組織和細胞組織可以含有宿主細胞或能被轉(zhuǎn)化的或與核酸轉(zhuǎn)移組合物和/附加試劑接觸的細胞。組織可以是有機體的一部分或是從有機體中分離出來的。在某些實施方式中，組織及其組成細胞包括但不限于血(如造血細胞(如人造血祖細胞、人造血干細胞、CD34+細胞、CD4+細胞)、淋巴細胞以及其他血細胞)、骨髓、腦、干細胞、血管、肝臟、肺臟、骨、乳腺、軟骨、宮頸、結(jié)腸、角膜、胚胎、子宮內(nèi)膜、內(nèi)皮細胞、上皮細胞、食管、筋膜、成纖維細胞、濾泡、神經(jīng)節(jié)細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、杯狀細胞、腎、淋巴結(jié)、肌肉、神經(jīng)元、卵巢、胰腺、外周血、前列腺、皮膚、小腸、脾、胃、睪丸。B.有機體在某些實施方式中，宿主細胞或組織至少包含在一種有機體中。在某些實施方式中，有機體可以是人、靈長類動物或鼠。在另外一些實施方式中，有機體可以是任何真核的甚至是原核的(如真細菌，一種太古生物)生物，這些都是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員很容易理解的(例如參見網(wǎng)頁http∥phylogeny.arizona.edu/tree/phylogeny.html)。C.可注射組合物和藥用制劑為了利用本發(fā)明的慢病毒載體組合物進行基因治療，一般將需要的細胞與含有治療基因的慢病毒載體混合。細胞還可以包含在有機體如需要基因治療的人體內(nèi)。注射的途徑有多種，根據(jù)注射的部位及疾病的性質(zhì)而定，包括靜脈注射、動脈注射、真皮內(nèi)注射、皮內(nèi)注射、肌肉注射、鼻內(nèi)注射、皮下注射、經(jīng)皮注射、氣管內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射、瘤內(nèi)注射、灌注以及灌洗。有時也可以將細胞從有機體中分離出來，在體外用慢病毒轉(zhuǎn)染后再移植到有機體內(nèi)。本發(fā)明的慢病毒載體可以用注射器或任何用于注射液體的方法注射，只要表達載體能通過用于注射的針頭孔徑。最近出現(xiàn)了一種新型的無針注射系統(tǒng)(美國專利5,846,233)，該系統(tǒng)含有一個能儲存液體的玻璃腔的噴嘴和一個用于將液體從噴嘴噴到注射部位的動力裝置。注射器系統(tǒng)也可以是用于基因治療的將多種劑量的液體精確注射到任何深度的裝置(美國專利5,846,225號)。用于制備核酸溶液的自由堿或藥用鹽可以用水適量混合表面活性劑如羥丙纖維素配制。分散溶液也可以用甘油、液體聚乙烯甘油及其混合物或油配制。在普通的儲藏和使用條件下，這些含有保存液的制劑會防止微生物的生長。適于注射的藥用制劑包括無菌水溶液或分散液，以及可以在使用時制備成無菌水溶液或分散液的無菌粉末(見美國專利5,466,468號，本文特地將其納入作為參考)。但是不管在什么情況下，制劑都必須是無菌的，并且還要有一定的流動性以便于注射。制劑在制造和儲存條件下必須是穩(wěn)定的，并且在儲存時不能出現(xiàn)微生物如細菌和真菌的污染。載體可以是含有水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇以及液體聚乙烯甘油等)、上述物質(zhì)的適宜混合物、和/或植物油的溶劑或分散介質(zhì)。適當?shù)牧鲃有钥梢酝ㄟ^使用包被如卵磷脂、通過在分散液中保持所需要的顆粒直徑以及通過使用表面活性劑來維持。防止微生物污染可以通過加入各種抗細菌和抗真菌藥物來達到，如對羥苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在許多情況下，優(yōu)選等滲的試劑如糖或氯化鈉。要延長注射組合物的吸收時間可以通過在組合物中加入延遲吸收的試劑如單硬脂酸鋁和凝膠來實現(xiàn)。對于經(jīng)胃腸道外途徑注射的水溶液來說，如果需要溶液應該是適于緩沖的，液體稀釋時應首先用足量的鹽或葡萄糖將其調(diào)整為等滲。這種水溶液特別適于靜脈注射、動脈注射、肌肉注射、皮下注射、瘤內(nèi)注射以及腹膜內(nèi)注射。因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本說明書可以很容易地知道哪些是可用的無菌注射溶劑。例如，一個劑量的藥物可用1ml等滲的氯化鈉溶液溶解，然后或者加到1000ml皮下灌注液中，或者直接注射到適當部位，(見《Remington制藥學》(Remington’sPharmaceuticalSciences)，第15版，1035-1038頁和1570-1580頁)。根據(jù)病人的不同狀況也可以改變注射的劑量。在任何情況下都要根據(jù)病人的實際狀況來確定注射的劑量。而且，用于人體注射的制劑必須符合FDA生物標準所要求的無菌、無熱源、一般安全性及純度的標準。無菌注射液可以通過將需要量的溶于適當溶劑中的活性化合物與上述各種所需的其他組分混合，經(jīng)過濾除菌后制備。一般來說分散液是通過將各種無菌的活性組分摻入到含堿性分散介質(zhì)和上述其他各種組分的無菌載體中而制備的。如果用無菌粉末制備無菌注射液，優(yōu)選的制備方法是將真空干燥或冷凍干燥的活性組分粉末與上述無菌過濾液中的所需組分混合。本文所涉及的組合物還可以制備成中性溶液或鹽溶液。藥用鹽，包括加酸的鹽，一般是用無機酸如鹽酸或硫酸、有機酸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等配制。與游離羰基形成的鹽也可以來自無機堿如鈉、鉀、銨、鈣、氫氧化鐵，也可以來自有機堿如異丙胺、三甲胺、組氨酸、普魯卡因等。一旦成為制劑，溶液就以與劑型相適的方式來注射，所用的劑量是治療有效量的。制劑可以很容易地以各種劑型如注射液、藥物釋放膠囊等給藥。本文所用的術(shù)語″載體″包括任何的及所有的溶劑、分散介質(zhì)、載體、包被物稀釋液、抗細菌及抗真菌試劑、等滲液、吸收延遲液、緩沖液、載體溶液、懸液、膠體等。這些介質(zhì)和試劑如何用于藥用活性物質(zhì)是本領(lǐng)域所熟知的。除了與活性組分不相容的常規(guī)介質(zhì)或試劑以外，上述物質(zhì)都可用于治療組合物中。其他的活性組分也可以添加到組合物中。術(shù)語″藥用的″是指那些注射到人體內(nèi)后不會產(chǎn)生變態(tài)反應或其他毒副作用的分子實體或組合物。含有蛋白活性組分的水溶性組合物的制備是本領(lǐng)域所熟知的。這種組合物一般都制備成注射液或注射懸液，也可以制備成適于制成液體或懸液的固體。術(shù)語″接觸″或″暴露于″用于細胞時是指將治療性慢病毒載體導入靶細胞。對于分散的、固體的、能接觸到的腫瘤來說，基因治療特別適于采取瘤內(nèi)注射或腫瘤血管內(nèi)注射的方式。也可以考慮局部、區(qū)域或全身給藥。對于＞4cm的腫瘤，注射量約為4-10ml(優(yōu)選10ml)，對于＜4cm的腫瘤，注射量約為1-3ml(優(yōu)選3ml)。多點注射時單個劑量一般約為0.1-0.5ml。病毒顆粒最好通過多點注射到腫瘤內(nèi)來導入，注射點之間相隔約1cm。某些疾病入造血系統(tǒng)腫瘤優(yōu)選全身給藥。如果需要時也可以連續(xù)給藥。優(yōu)選通過注射器或?qū)Ч芙o藥。連續(xù)注射可以持續(xù)一段時間，如從初次注射開始持續(xù)約1-2小時、約2-6小時、約6-12小時、約12-24小時、約1-2天、約1-2周或更長。一般來說，通過持續(xù)灌注給予治療組合物的量與單次或多次注射所給予的量相等，在灌注期內(nèi)可以適當調(diào)整劑量。治療方案可以是各種各樣的，這要根據(jù)疾病的類型、發(fā)病組織的部位以及病人的健康狀況及年齡等因素而定。臨床醫(yī)生可以根據(jù)自己對本發(fā)明慢病毒載體治療制劑效率和毒性(如果有)的了解作出決定。治療時有各種″單位劑量″。一個單位劑量定義為一個含本發(fā)明慢病毒載體的預定量的治療組合物。給藥劑量及給藥途徑和劑型都是臨床醫(yī)生所熟悉的。一個單位劑量并不一定通過一次注射來完成，可以在一定期間內(nèi)連續(xù)給予。本發(fā)明的單位劑量為了方便以轉(zhuǎn)導單位(T.U.)表示，通過測定細胞系如HeLa或293細胞內(nèi)病毒的滴度來確定。單位劑量為103，104，105，106，107，108，109，1010，1011，1012，1013T.U.或更高。8.實施例下面的實施例用于說明本發(fā)明的優(yōu)選實施方式。本領(lǐng)域的技術(shù)人員優(yōu)先選用實施例中所描述的技術(shù)，這些技術(shù)是發(fā)明者所發(fā)現(xiàn)的，很適于實現(xiàn)本發(fā)明，因此可以作為實現(xiàn)本發(fā)明的優(yōu)選實施模式。但是，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本說明書的精神，可以對本文所描述的特殊實施方式作出改變，在不背離本發(fā)明的精神及范圍的情況下同樣也能得到一樣或相似的結(jié)果。A.實施例1-3所用的材料和方法1.載體的制備具有水泡性口炎病毒(VSV)G包膜蛋白假模型的HIV來源載體的制備是通過與三個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293上皮細胞而獲得的，見Naldini等，1996a的描述。HIV來源的包裝構(gòu)建體是pCMvΔR8.91，該載體編碼HIV-1的Gag和Pol前體和調(diào)節(jié)蛋白Tat及Rev(Zufferey等，1997)。VSVG是pMD.G.表達的。HIV載體質(zhì)粒起源于pHR’，是將其骨架經(jīng)改造而成的(Naldini等，1996a)。自身滅活載體來自上述的SIN-18載體，該載體的3’LTR的U3區(qū)從-418到-18缺失，去除了所有的轉(zhuǎn)錄活性序列(Zufferey等，1998)。簡言之，pHR’SIN的構(gòu)建過程如下將一個含多聚嘌呤簇序列的KpnI-XbaI片段和3’LTR從pHR’上切下，然后克隆到pUC-18的相應位點中。再將獲得的質(zhì)粒用EcoRV完全酶切，用PvuII部分酶切，然后自身連接起來。得到一個U3區(qū)缺失400個核苷酸的質(zhì)粒。將一個XhoI連接物插入到缺損質(zhì)粒的EcoRI位點，并將XhoI-XbaI片段插入到經(jīng)相應酶消化的質(zhì)粒pHR’CMVlacZ中。其他所有的SIN-18質(zhì)粒是通過用報告基因(編碼熒光素酶、GFP和Neo)替代lacZ而獲得的。本發(fā)明所用的pHR’載體與原來最初所報告的不同(Naldini等，1996)，本發(fā)明的載體是通過XhoI-KpnI酶切從多聚嘌呤簇上游的Nef編碼區(qū)刪除一個11bp的片段和從3’LTR下游的人源序列中刪除一個1456bp的片段。這個人源序列在HXB2前病毒基因組的原始克隆中還存在。這兩個刪除不會影響病毒在分裂的293T細胞中的滴度和基因的表達。EF1α片段的插入是通過將一個含有EF1-GFP序列的ClaI-BamHI盒插入到pHR’-W-SIN的ClaI-BamHI位點而實現(xiàn)的，得到的載體為pHR-EF1-GFP-W-SIN。這個載體衍生物具有幾個不同的功能特點，其不同在于EF-1α-短啟動子、3’LTR的loxP位點以及cPPT。3’LTR的loxP位點在轉(zhuǎn)導細胞內(nèi)是復制到5’LTR上的，并且如果存在附加的Cre重組酶，整合的前病毒將被去除。但是，loxP位點和Cre介導的刪除并不是gp91-phox啟動子發(fā)揮活性所必須的，并且也不是載體用于造血干細胞臨床治療所需要的。存在于pHR-EF1-GFP-(+/-)W-SIN中的EF-1α和存在于pHPT-GFP及pWPT-GFP中的EF-1α短啟動子之間的區(qū)別就在于短的版本不含內(nèi)含子，這使載體更小。圖5A到5D中的示意圖描述的是質(zhì)粒構(gòu)建體pHPT-GFP，pWPT-GFP，pHPP91-GFP和pWPP91-GFP。用磷酸鈣沉淀法將質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染293T細胞后，收獲上清，蔗糖密度梯度離心濃縮病毒顆粒，然后重懸到無血清的CellgroSCGM培養(yǎng)基(Cellgenix，德國)中，用0.45μm的SpinX濾膜過濾。病毒原種保存于-70℃，如上面所描述的(Zufferey等，1997)通過轉(zhuǎn)導HeLa細胞并用流式細胞儀測定GFP的表達來確定病毒的滴度。滴度在每毫升5×107到108HeLa轉(zhuǎn)導單位(TU)之間。2.CD34+細胞的純化和轉(zhuǎn)導按照研究指導手冊收集臍帶血(CB)樣品，純化CD34+細胞(見Arrighi等，1999)。簡要步驟如下用Ficoll-Paque(Pharmacia，Uppsala，瑞典)密度梯度離心獲得的CB單個核細胞置于冰上與抗CD34M450Dynabeads(Dynal，挪威)按照廠商提供的說明書共孵育。經(jīng)幾次洗滌洗去未結(jié)合的細胞后，通過與試劑盒內(nèi)的″Detach-a-bead″在37℃孵育15分鐘從磁珠上分離CD34+細胞。立即洗滌細胞并用流式細胞儀分析。純化的細胞中CD34+細胞占89±7.0％。將105細胞接種到含100μlCellgroSCGM培養(yǎng)基的96孔板中用于轉(zhuǎn)導，培養(yǎng)基中加入了抗生素(GibcoBRL，LifeTechnologiesLTD，Paisley，Scotland，U.K.)、10-4M二硫蘇糖醇(FlukaBiochemika，Buchs，瑞士)和TPO(10ng/ml)、SCF(50ng/ml)、Flt3L(50ng/ml)。孵育過夜后，每孔中加入106(一般來說)或105-5×105(用于劑量-效應分析)HeLa轉(zhuǎn)導單位(TU)的載體，將液體體積用含TPO的CellgroSCGM培養(yǎng)基調(diào)整到200μl。24小時后，洗滌細胞并用添加抗生素、10-4M二硫蘇糖醇和TPO(10ng/ml)、SCF(50ng/ml)、Flt3L(50ng/ml)的CellgroSCGM培養(yǎng)基稀釋到400μl，繼續(xù)培養(yǎng)3天。細胞直接用于分析GFP和CD34的表達，或用3種生長因子繼續(xù)培養(yǎng)。3.細胞因子所有細胞因子都是人源重組的，得自Peprotech(英國，倫敦)。4.抗體和免疫反應試劑所有抗體都來自BectonDickinsonPharmingen(USA)。抗-CD34mIgG包被的M450Dynabeads來自DynalA/S(奧斯陸，挪威)。5.體外分化和IFN-γ刺激體外分化是用GM-CSF和SCF刺激向單核細胞分化，以及用G-CSF或G-CSF刺激三周和SCF刺激向粒細胞分化。分化的細胞用IFN-γ(1000U/ml)刺激6天，用PE連接的單克隆抗體標記，然后用FACS分析PE陽性細胞群中的GFP表達情況。數(shù)字表示的是每個象限中的細胞百分數(shù)。6.流式細胞術(shù)細胞按Arrighi等描述的方法稍加改動在FACScalibur(Becton-Dickinson)上分析。FL-1用于分析GFP，F(xiàn)L-2用于分析PE標記的單克隆抗體，F(xiàn)L-3用于分析PercP標記的單克隆抗體。細胞在分析前用0.5％的多聚甲醛固定。數(shù)據(jù)用Scripps研究所(LaJolla，CA)的J.Trotter編寫的WINMDI軟件和CellQuest軟件(Becton-Dickinson)分析。B.實施例1-4實施例1用含gp91-phox啟動子控制下的表達盒的HIV來源的慢病毒載體轉(zhuǎn)染人造血祖細胞可以在單核細胞及粒細胞內(nèi)獲得基因的限制性表達pWPP91-GFP(含WPRE)和pHPP91-GFP(不含WPRE)慢病毒載體是通過用pWPT-GFP和pHPT-GFP慢病毒載體上巨噬細胞NADPH氧化酶啟動子(1)的gp91-phox亞單位的1540bp片段替換EF-1α而構(gòu)建的。pWPT-GFP和pHPT-GFP都是SIN(自身滅活)慢病毒載體，含有中央多聚嘌呤簇(cPPT)以增強靶細胞的轉(zhuǎn)導效率(圖1和圖5)。重組慢病毒載體用上述標準方法制備并濃縮100倍，用于造血干祖細胞(HSCs)CD34+細胞的轉(zhuǎn)導。見SalmonP，KindlerV，DucreyO，ChapuisB，ZublerRH，TronoD.，″用改進型慢病毒載體轉(zhuǎn)導人造血祖細胞和分化血細胞后基因在細胞內(nèi)的高水平表達″(″High-leveltransgeneexpressioninhumanhematopoieticprogenitorsanddifferentiatedbloodlineagesaftertransductionwithimprovedlentiviralvectors，″)Blood96(10)3392-8(2000)，本文已納入作為參考。利用慢病毒載體可以使UCBHSC達到很高的轉(zhuǎn)導百分率，例如可以達到80％，該載體的EF1-α-GFP表達盒下游插入一個中央多聚嘌呤簇。轉(zhuǎn)化的HSCs經(jīng)體外分化(細胞因子混合物刺激)或體內(nèi)分化(移植到NOD/SCID小鼠體內(nèi))后還能保持較高的GFP陽性率。用攜帶gp91-phox-GFP表達盒的慢病毒載體轉(zhuǎn)導HSCs，然后經(jīng)體外分化(細胞因子混合物刺激)或體內(nèi)分化(移植到經(jīng)亞致死劑量射線照射的NOD/SCID小鼠體內(nèi))后，能表達GFP的細胞只限于成熟的單核細胞和粒細胞。成熟嗜中性白細胞內(nèi)gp91啟動子控制的GFP表達可以通過插入WPRE而增強，并且其特異性不會下降。由慢病毒載體轉(zhuǎn)導到HP/SCs內(nèi)的gp91-phox啟動子，不論是否含有WPRE，在成熟的嗜中性白細胞內(nèi)都對IFN-γ的刺激產(chǎn)生生理性反應(圖2)。實施例2HS增強子元件產(chǎn)生高效穩(wěn)定的表達對于各種淋巴造血系統(tǒng)疾病的基因治療來說，一個重要的問題是如何使治療基因在相應的分化細胞內(nèi)達到高水平的表達。為了達到高效穩(wěn)定的表達水平，可以在位于慢病毒載體4個DNA酶超敏位點(HS)內(nèi)的gp91-phox基因上游30kb處插入gp91特異的增強子。首先，為了縮短病毒基因組，用一個與gp91啟動子功能相當?shù)?.5kb片段替代gp91啟動子(Skalnik等，1991)，得到pHP500-GFP載體(圖6A)。為了便于克隆，引入一個獨特的多克隆位點以便于在兩個cPPT位點上都能插入增強子(插入增強子后其中央位置和功能依然保持)，得到載體pHPX-GFP(圖6B)。覆蓋4個HS位點的片段是以基因組DNA為模板通過PCR方法制備的。PCR引物序列是基于人類基因組工程所報道的人基因組序列(編號NT011844；http∥www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/human/)。見SEQIDNOS2-16。gp91-phoxHS位點的位置參考了文獻，見LienLL，LeeY，和OrkinSH(1997)。擴增出特異性位點兩側(cè)約1-1.5kb的片段，然后克隆到慢病毒載體中得到最終的pHPHS-GFP。見SEQIDNOS2-16。含有WPRE序列的載體也構(gòu)建出來(pWPHS-GFP，圖6C)。包含HS元件的載體一旦轉(zhuǎn)染到HSCs并經(jīng)分化后，轉(zhuǎn)基因就會高水平和/或穩(wěn)定地表達。實施例3慢性肉芽腫性疾病的治療進展慢性肉芽腫性疾病(CGD)的發(fā)生與gp91-phox基因的缺失高度相關(guān)，該基因編碼NADPH的一個亞單位(Dinauer等，1987)。與X染色體連鎖的gp91-phox基因在約60％的CGD患者中出現(xiàn)缺損。其綜述資料見MalechHL，″慢性肉芽腫性疾病的基因治療進展″(″Progressingenetherapyforchronicgranulomatousdisease)，Infect.Dis.179(Suppl.2)S318-25，1999。一種治療該疾病的方法是轉(zhuǎn)導適當?shù)募毎员阒辽賹p91-phox的一個功能拷貝導入病人體內(nèi)。如上面所討論的，這種治療方法包括將細胞從患者體內(nèi)分離出來，經(jīng)體外轉(zhuǎn)導后再移植回患者體內(nèi)。從CGD病人體內(nèi)分離出CD34細胞，用本發(fā)明的慢病毒載體轉(zhuǎn)導，該載體攜帶gp91-phox基因的一個功能拷貝，如含SEQIDNO18所示核酸序列的gp91-phox基因，或者任何編碼具有SEQIDNO19所示氨基酸序列的多肽的核酸序列。通過載體內(nèi)gp91-phox啟動子的控制，gp91-phox多肽可適當表達。如上所述，加上WPRE元件和HS增強子可使基因的表達效率提高。將細胞移植到檢測系統(tǒng)內(nèi)，如SCID-NOD小鼠或相應的患者體內(nèi)?？梢酝ㄟ^將轉(zhuǎn)導細胞移植到適當?shù)幕蚯贸∈篌w內(nèi)進一步評價這種治療方法的效果。實施例4白血病粘連缺乏病(LAD)的治療方法一種治療該疾病的方法是轉(zhuǎn)導適當?shù)募毎员阒辽賹⑺铇訂魏思毎准毎纤氐囊粋€功能拷貝導入病人體內(nèi)。如上面所討論的，這種治療方法包括將細胞從患者體內(nèi)分離出來，經(jīng)體外轉(zhuǎn)導后再移植回患者體內(nèi)。從LAD病人體內(nèi)分離出CD34細胞，用本發(fā)明的慢病毒載體轉(zhuǎn)導，該載體攜帶整合素基因的一個功能拷貝。通過載體內(nèi)CD11b啟動子的控制，整合素多肽可適當表達。CD11b啟動子可以選自SEQIDNO20所示的多聚核苷酸序列編碼的啟動子。見Hickstein等，1992。如上所述，加上WPRE元件和HS增強子可使基因的表達效率提高。根據(jù)本說明書的精神，本說明書和權(quán)利要求書所描述的所有組合物和/或方法不需要特別的實驗就可以制備和實現(xiàn)。雖然本發(fā)明的組合物和方法是以優(yōu)選實施方式來描述的，但是只要不超越本發(fā)明的概念、精神和范圍，本領(lǐng)域的技術(shù)人員很容易對本發(fā)明的組合物和/或方法作出修改，例如在步驟上，以及步驟的順序上作出調(diào)整。特別需要指出的是，只要能達到同樣的或相似的效果，本文所描述的試劑都可以用化學及生理相關(guān)的試劑來代替。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應該很清楚所有這些代替或修改都應該在本發(fā)明權(quán)利要求所定義的本發(fā)明的精神、范圍和概念之內(nèi)。參考文獻下面的參考文獻對本說明書作了一定程度的補充和細節(jié)說明，特地將其納入作為參考。U.S.PatentNo.4,682,195U.S.PatentNo.4,683,202U.S.PatentNo.5,466,468U.S.PatentNo.5,645,897U.S.PatentNo.5,686,279U.S.PatentNo.5,705,629U.S.PatentNo.5,846,225U.S.PatentNo.5,846,233U.S.PatentNo.5,925,565U.S.PatentNo.5,928,906U.S.PatentNo.5,935.819U.S.PatentNo.5,994,136U.S.PatentNo.6,013,516U.S.PatentNo.6,136,597U.S.PatentNo.6,165,782U.S.PatentNo.6,207,455U.S.PatentNo.6,218,181U.S.PatentNo.6,218,186EP266,032Akkina，Walton，Chen，Li，Planelles，Chen，″High-efficiencygenetransferintoCD34+cellswithahumanimmunodeficiencyvirustype1-basedretroyiralvectorpseudotypedwithvesicularstomatitisvirusenvelopeglycoproteinG″，J.Virol.，702581-2585，1996。Almendro等，″Cloningofthehumanplateletendothelialcelladhesionmolecule-1promoteranditstissue-specificexpression.Structuralandfunctionalcharacterization，″J.Immunol.，157(12)5411-5421，1996。An，Wersto，Agricola，Metzger，Lu，Amado，Chen，Donahue，″MarkingandgeneexpressionbyalentivirusvectorintransplantedhumanandnonhumanprimateCD34(+)cells，″J.Virol.，741286-1295，2000。Angel，Bauman，Stein，Dellus，Rahmsdorf和Herrlich，″12-0-tetradecanoyl-phorbol-13-acetateInductionoftheHumanCollagenaseGeneisMediatedbyanInducibleEnhancerElementLocatedinthe5′FlankingRegion，″Mol.Cell.Biol.，72256，1987a。Angel，Imagawa，Chiu，Stein，Imbra，Rahmsdorf，Jonat，Herrlich和Karin，″PhorbolEster-InducibleGenesContainaCommoncisElementRecognizedbyaTPA-ModulatedTrahs-actingFactor，″Cell，49729，1987b。Arrighi，Hauser，Chapuis，Zubler，Kindler，″Long-termcultureofhumanCD34(+)progenitorswithFLT3-Ligand，thrombopoietin，andstemcellfactorinducesextensiveamplificationofaCD34(-)CD14(-)andCD34(-)CD14(+)dendriticcellprecursor，″Blood，932244-2252，1999。Atchison和Perry，″TandemKappaImmunoglobulinPromotersareEquallyActiveinthePresenceoftheKappaEnhancerImplicationsforModelofEnhancerFunction，″Cell，46253，1986。Atchison和Perry，″TheRoleoftheKappaEnhanceranditsBindingFactorNF-kappaBintheDevelopmentalRegulationofKappaGeneTranscription，″Cell，48121，1987。Banerji等，″ExpressionofaBeta-GlobinGeneisEnhancedbyRemoteSV40DNASequences，″Cell，27299，1981。Banerji，Olson和Schaffner，″Alymphocyte-specificcellularenhancerislocateddownstreamofthejoiningregioninimmunoglobulinheavy-chaingenes，″Cell，35729，1983。Berkhout，Silverman和Jeang，″TatTrans-activatestheHumanImmunodeficiencyVirusThroughaNascentRNATarget，″Cell，59273，1989。Bhatia，Bonnet，Kapp，Wang，Murdoch，Dick，″Quantitativeanalysisrevealsexpansionofhumanhematopoieticrepopulatingcellsaftershort-termexvivoculture，″J.Exp.Med.，186619-624，1997。Blanar，Baldwin，F(xiàn)lavell和Sharp，″Agamma-interferon-inducedfactorthatbindstheinterferonresponsesequenceoftheMHCclassIgene，H-2κB，″EMBOJ.，81139，1989。Blomer，Naldini，Kafri，Trono，Verma，Gage，″Highlyefficientandsustainedgenetransferinadultneuronswithalentivirusvector，″Virol.，716641-6649，1997。Bodine和Ley，″Anenhancerelementlies3′tothehumanagammaglobingene，″EMBOJ.，62997，1987。Boshart，Weber，Jahn，Dorsch-Hasler，F(xiàn)leckenstein和Schaffner，″Averystronge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tt1020ttttgtagagtcggggtctccctatgttgcccaggctggagtgcagtggtgtgatcctag1080ctcactgcagcctggacctcgggctcaagaaattctcacacctcagcctgtccagtagca1140ggggctacaggcgcgcaccaccatcccagctaattaaaaatatttttttgtagagacagg1200gtctctctatgttgcccaggctggtttcaaactcccaggctcaagcaatcctcctgcctt1260gcctcccaaatgacatcggattacaggcgtgagccactgagcctggcccgtattaatgtt1320tagaacacgaattccaggaggcaggctaagtctattcagcttgttcatatgcttgggcca1380acccaagaaacaagtgggtgacaaatggcaccttttggatagtggtattgactttgaaag1440tttgggtcaggagctggggaggaagggtgggcaggctgtgggcagtcctgggcggaagac1500caggcagggctatgtgctcactgagcctccgccctcttcctttgaatctctgatagactt1560ctgcctcctacttctccttttctgcccttctttgctttggtggcttccttgtggttcctc1620agtggtgcctgcaaccctggttcactcttccaggttctggctccttccagccatggctct1680cagagtccttctgttaacaggtgcatgggggtggggtgggggactctgggtggggaggag1740ggtaacttttgggtctgtcataaatagagggccc177權(quán)利要求1.一種重組慢病毒載體，所述載體包含(a)慢病毒的gag、pol和rev基因；(b)含有轉(zhuǎn)基因的表達盒，該轉(zhuǎn)基因位于啟動子的控制之下，啟動子能促使轉(zhuǎn)基因在人細胞內(nèi)可測轉(zhuǎn)錄；以及(c)位于表達盒上游的中央多聚嘌呤簇(cPPT)。2.如權(quán)利要求1所述的載體，其中，cPPT包含SEQIDNO1所示的核苷酸序列。3.如權(quán)利要求1所述的載體，其中，所述載體能轉(zhuǎn)導約20％到約80％的細胞。4.如權(quán)利要求1所述的載體，其中，所述載體能轉(zhuǎn)導約40％到約80％的細胞。5.如權(quán)利要求1所述的載體，其中，所述載體能轉(zhuǎn)導約60％到約80％的細胞。6.如權(quán)利要求1所述的載體，所述載體還包含位于cPPT附近的多個獨特的克隆位點。7.如權(quán)利要求2所述的載體，其中，所述多個獨特的克隆位點位于cPPT上游。8.如權(quán)利要求2所述的載體，其中，所述多個獨特的克隆位點位于cPPT下游。9.如權(quán)利要求2所述的載體，其中，所述多個獨特的克隆位點位于cPPT上游和下游。10.如權(quán)利要求2所述的載體，其中，gag、pol和rev基因是HIV的gag、pol和rev基因。11.如權(quán)利要求10所述的載體，其中，gag、pol和rev基因是HIV-1的gag、pol和rev基因。12.如權(quán)利要求1所述的載體，該載體還被定義為自身滅活載體(SIN)。13.如權(quán)利要求1所述的載體，其中，LTR區(qū)是通過3’LTRU3區(qū)的刪除而被修飾成幾乎無轉(zhuǎn)錄活性的。14.如權(quán)利要求13所述的載體，其中，刪除的是相對于U3-R區(qū)邊界的-418到-18位的核苷酸。15.如權(quán)利要求1所述的載體，該載體還被定義為不能通過重組重建野生型慢病毒的載體。16.如權(quán)利要求15所述的載體，其中，所述載體不表達gag、pol和rev之外的慢病毒的功能基因。17.如權(quán)利要求1所述的載體，其中，所述啟動子是gp91-phox啟動子、gp47-phox啟動子、CD11b啟動子、EF1-α啟動子、PGK啟動子、β球蛋白啟動子、MHCII類啟動子、凝血因子IX啟動子、胰島素啟動子、PDX1啟動子、CD4啟動子和CD2的啟動子。18.如權(quán)利要求17所述的啟動子，其中，所述啟動子是gp91-phox啟動子。19.如權(quán)利要求17所述的啟動子，其中，所述啟動子是gp47-phox啟動子。20.如權(quán)利要求17所述的啟動子，其中，所述啟動子是CD11b啟動子。21.如權(quán)利要求17所述的啟動子，其中，所述啟動子是EF1-α啟動子。22.如權(quán)利要求17所述的載體，該載體還包含至少一個增強子序列。23.如權(quán)利要求22所述的載體，其中，至少一個增強子序列選自SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4、SEQIDNO5、SEQIDNO6和SEQIDNO7所示的序列。24.如權(quán)利要求22所述的載體，其中，至少一個增強子序列位于cPPT附近。25.如權(quán)利要求19.5所述的載體，其中，至少一個增強子序列位于cPPT上游。26.如權(quán)利要求24所述的載體，其中，至少一個增強子序列位于cPPT下游。27.如權(quán)利要求24所述的載體，其中，增強子序列位于cPPT上游和下游。28.如權(quán)利要求27所述的載體，其中，所述增強子序列選自SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4、SEQIDNO5、SEQIDNO6和SEQIDNO7所示的序列。29.如權(quán)利要求1所述的載體，其中，所述啟動子能促使轉(zhuǎn)基因以約10-約200的信-噪比為表達。30.如權(quán)利要求29所述的載體，其中，所述啟動子能促使轉(zhuǎn)基因以約40-約200的信-噪比為表達。31.如權(quán)利要求30所述的載體，其中，所述啟動子能促使轉(zhuǎn)基因以約150-約200的信-噪比為表達。32.如權(quán)利要求1所述的載體，其中，所述啟動子能使轉(zhuǎn)基因在轉(zhuǎn)錄激活物的刺激下表達。33.如權(quán)利要求32所述的載體，其中，所述轉(zhuǎn)錄激活物是IFN-γ。34.如權(quán)利要求32所述的載體，其中，所述啟動子能促使轉(zhuǎn)基因在特定類型的細胞內(nèi)表達。35.如權(quán)利要求1所述的載體，其中，所述啟動子能促使轉(zhuǎn)基因在特定類型的細胞內(nèi)表達。36.如權(quán)利要求35所述的載體，其中，所述特定細胞類型選自成熟血細胞、嗜中性白細胞、單核細胞、粒細胞、神經(jīng)元、肺細胞、肌細胞、肝細胞、胰腺細胞、內(nèi)皮細胞、心肌細胞、皮膚細胞、骨髓基質(zhì)細胞和眼細胞。37.如權(quán)利要求35所述的載體，其中，所述細胞類型是成熟血細胞。38.如權(quán)利要求35所述的載體，其中，所述細胞類型是嗜中性白細胞。39.如權(quán)利要求35所述的載體，其中，所述細胞類型是單核細胞或粒細胞。40.如權(quán)利要求35所述的載體，其中，所述細胞類型是神經(jīng)元。41.如權(quán)利要求1所述的載體，其中，所述轉(zhuǎn)基因是gp91-phox、gp47-phox、紅細胞生成素、白細胞介素、集落刺激因子、整合素αIIbβ、多藥物抗性基因、抗病毒基因、編碼凝血因子VIII的基因、編碼凝血因子IX的基因、T細胞抗原受體、B細胞抗原受體、單鏈抗體(ScFv)、TNF、γ干擾素、CTLA4、B7、Melana、MAGE、標記基因、熒光素酶或GFP。42.如權(quán)利要求41所述的載體，其中，所述轉(zhuǎn)基因是gp91-phox。43.如權(quán)利要求41所述的載體，其中，所述轉(zhuǎn)基因是gp47-phox。44.如權(quán)利要求41所述的載體，其中，所述轉(zhuǎn)基因是編碼標記基因的基因。45.如權(quán)利要求41所述的載體，其中，所述轉(zhuǎn)基因是編碼GFP的基因。46.如權(quán)利要求1所述的載體，該載體還包含促進所述轉(zhuǎn)基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)序列。47.如權(quán)利要求46所述的載體，其中，所述轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)序列是位于表達盒內(nèi)的內(nèi)含子。48.如權(quán)利要求47所述的載體，其中，所述內(nèi)含子位于與載體基因組轉(zhuǎn)錄物相反的方向上。49.如權(quán)利要求46所述的載體，其中，所述轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)序列是轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件。50.如權(quán)利要求49所述的載體，其中，所述轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)序列是土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件(WPRE)。51.如權(quán)利要求50所述的載體，其中，所述轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)序列是乙型肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件(HPRE)。52.一種被權(quán)利要求1所述的載體轉(zhuǎn)導的宿主細胞。53.如權(quán)利要求52所述的轉(zhuǎn)導的宿主細胞，其中，所述細胞是病毒生產(chǎn)者細胞。54.如權(quán)利要求53所述的轉(zhuǎn)導的宿主細胞，其中，所述生產(chǎn)者細胞是293T細胞。55.如權(quán)利要求54所述的宿主細胞，其中，所述細胞是人造血祖細胞。56.如權(quán)利要求55所述的轉(zhuǎn)導的宿主細胞，其中，所述人造血祖細胞是CD34+細胞。57.一種自身滅活的重組慢病毒載體，所述載體包含(a)慢病毒的gag、pol和rev基因；(b)含有轉(zhuǎn)基因的表達盒，該轉(zhuǎn)基因位于啟動子的控制之下，啟動子與轉(zhuǎn)錄激活物相互作用時能促使轉(zhuǎn)基因在人細胞內(nèi)可測轉(zhuǎn)錄；(c)位于表達盒上游的中央多聚嘌呤簇(cPPT)；以及(d)能促進轉(zhuǎn)基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件。58.一種自身滅活的重組慢病毒載體，所述載體包含(a)慢病毒的gag、pol和rev基因；(b)含有轉(zhuǎn)基因的表達盒，該轉(zhuǎn)基因位于啟動子的控制之下，啟動子能促使轉(zhuǎn)基因在特定類型的人細胞內(nèi)可測轉(zhuǎn)錄；(c)位于表達盒上游的中央多聚嘌呤簇(cPPT)；以及(d)能促進轉(zhuǎn)基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件。59.一種自身滅活的重組慢病毒載體，所述載體包含(a)慢病毒的gag、pol和rev基因；(b)含有轉(zhuǎn)基因的表達盒，該轉(zhuǎn)基因位于啟動子的控制之下，其中，(i)所述啟動子能促使轉(zhuǎn)基因在特定類型的人細胞內(nèi)可測轉(zhuǎn)錄，以及(ii)所述啟動子與轉(zhuǎn)錄激活物相互作用時能促使轉(zhuǎn)基因在特定類型的人細胞內(nèi)可測轉(zhuǎn)錄；(c)位于表達盒上游的中央多聚嘌呤簇(cPPT)；以及(d)能促進轉(zhuǎn)基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件。60.一種自身滅活的重組慢病毒載體，所述載體包含(a)慢病毒的gag、pol和rev基因；(b)含有轉(zhuǎn)基因的表達盒，該轉(zhuǎn)基因位于啟動子的控制之下，其中(i)啟動子能促使轉(zhuǎn)基因在特定類型的人細胞內(nèi)可測轉(zhuǎn)錄，以及(ii)啟動子與轉(zhuǎn)錄激活物相互作用時能促使轉(zhuǎn)基因在特定類型的人細胞內(nèi)可測轉(zhuǎn)錄；(c)位于表達盒上游的中央多聚嘌呤簇(cPPT)；(d)能促進轉(zhuǎn)基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件；以及(e)至少一個增強子元件。61.一種轉(zhuǎn)導人造血干細胞的方法，其特征在于，所述方法包括使一群含造血干細胞的人細胞與權(quán)利要求1所述的載體接觸，條件是用所述載體能有效轉(zhuǎn)導所述細胞群中的造血祖細胞。62.如權(quán)利要求61所述的方法，其中，所述人造血干細胞群包含CD34+細胞。63.如權(quán)利要求61所述的方法，其中，所述細胞群經(jīng)處理后能刺激細胞的增殖，但不會明顯丟失干細胞的多潛能性。64.如權(quán)利要求61所述的方法，其中，所述干細胞在體內(nèi)轉(zhuǎn)導。65.如權(quán)利要求61所述的方法，其中，所述干細胞在體外轉(zhuǎn)導。66.如權(quán)利要求65所述的方法，其中，所述轉(zhuǎn)導的干細胞被輸注到人類受試者。67.一種在限定類型的細胞內(nèi)表達轉(zhuǎn)基因的方法，其特征在于，所述方法包括按照權(quán)利要求61所述的方法轉(zhuǎn)導人細胞并使所需的細胞類型成熟。68.如權(quán)利要求67所述的方法，所述方法還包括使啟動子與轉(zhuǎn)錄激活物相互作用以刺激轉(zhuǎn)基因表達的步驟。全文摘要本發(fā)明涉及使轉(zhuǎn)基因在人源造血祖細胞以及其他所有血細胞衍生物內(nèi)安全、高效而且強勁表達以便于進行人體基因治療的HIV來源的慢病毒載體。該慢病毒載體含有能使轉(zhuǎn)基因在特定細胞或組織內(nèi)特異性表達的啟動子。而且啟動子受活化因子、增強子或抑制因子的調(diào)控。這些載體具有自身滅活特性因而具有很高的生物安全性。本發(fā)明對其他的啟動子也作了描述。載體還可以含有附加的轉(zhuǎn)錄增強元件如土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件，但其特異性和控制啟動子的能力并沒有下降。這些載體可作為基因治療的工具用于治療遺傳性和獲得性淋巴造血系統(tǒng)疾病、腫瘤特別是造血系統(tǒng)的腫瘤，以及用于通過慢病毒載體介導的人HSCs的基因改造來研究造血功能。文檔編號A61K48/00GK1606456SQ02824127公開日2005年4月13日申請日期2002年9月30日優(yōu)先權(quán)日2001年10月2日發(fā)明者D·特羅諾,M·維茲那羅維茨申請人:克雷頓研究院