本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種實(shí)現(xiàn)植物基因組外源基因定點(diǎn)整合的方法。

背景技術(shù)：

基因定點(diǎn)突變與定點(diǎn)置換技術(shù)也稱基因打靶技術(shù)，是在基因組的原位實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的定點(diǎn)突變、定點(diǎn)整合、基因置換及基因修復(fù)等.在應(yīng)用上，利用基因定點(diǎn)突變與定點(diǎn)置換技術(shù)培育植物新品種，可以避免現(xiàn)存轉(zhuǎn)基因技術(shù)中基因插入的隨機(jī)性導(dǎo)致的表達(dá)不確定性和對(duì)原基因組的損害。同時(shí)，在植物基因組原位進(jìn)行修復(fù)或改造可以避免現(xiàn)有的GMO(genetic modifiedorganism)可能存在的應(yīng)用風(fēng)險(xiǎn)，更容易為公眾所接受。在傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)中，外源基因(DNA片斷)進(jìn)入植物細(xì)胞后隨機(jī)整合到植物基因組中。由于插入位點(diǎn)具有隨機(jī)性，往往會(huì)產(chǎn)生許多不利結(jié)果，例如對(duì)植物內(nèi)源基因造成破壞，出現(xiàn)外源基因沉默等現(xiàn)象，導(dǎo)致大量轉(zhuǎn)化事件不能被應(yīng)用。因此，對(duì)植物基因組進(jìn)行定點(diǎn)整合外源片段一直是植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的重要目標(biāo)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是解決至少上述問題和/或缺陷，并提供至少后面將說明的優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種植物基因組外源序列定點(diǎn)整合的方法。

為此，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：

一種實(shí)現(xiàn)植物基因組外源基因定點(diǎn)整合的方法，包括如下步驟：

步驟一、構(gòu)建能夠在植株基因組的目的整合位點(diǎn)區(qū)域進(jìn)行基因組編輯的打靶載體，該打靶載體包括整合靶位點(diǎn)序列和Cas9核酸酶表達(dá)元件；整合位點(diǎn)區(qū)域即靶位點(diǎn)區(qū)域。

步驟二、構(gòu)建外源基因轉(zhuǎn)化載體，并將該外源基因轉(zhuǎn)化載體隨機(jī)整合到植株的基因組中，得到轉(zhuǎn)化有該外源基因的轉(zhuǎn)基因株系，其中，所述外源基因轉(zhuǎn)化載體包含整合位點(diǎn)序列和；和與所述目的整合位點(diǎn)兩翼相同的同源臂序列，且該同源臂序列位于所述整合位點(diǎn)序列和所述外源基因之間；

步驟三、將步驟一中構(gòu)建的所述打靶載體轉(zhuǎn)化導(dǎo)入步驟二中得到的轉(zhuǎn)基因株系內(nèi)，篩選得到只含有定點(diǎn)整合到所述目的整合位點(diǎn)區(qū)域的株系。

優(yōu)選的是，所述的實(shí)現(xiàn)植物基因組外源基因定點(diǎn)整合的方法中，步驟一和步驟二中的同源臂序列的長度為500～1000bp。

優(yōu)選的是，所述的實(shí)現(xiàn)植物基因組外源基因定點(diǎn)整合的方法中，步驟一中，所述打靶載體的篩選標(biāo)記基因?yàn)槌泵顾鼗颉?/p>

優(yōu)選的是，所述的實(shí)現(xiàn)植物基因組外源基因定點(diǎn)整合的方法中，步驟二中，所述外源基因轉(zhuǎn)化載體的篩選標(biāo)記基因?yàn)榭钩輨┗颉?/p>

優(yōu)選的是，所述的實(shí)現(xiàn)植物基因組外源基因定點(diǎn)整合的方法中，步驟三中，通過雜交進(jìn)行定點(diǎn)整合到所述目的整合位點(diǎn)區(qū)域的株系的篩選。

優(yōu)選的是，所述的實(shí)現(xiàn)植物基因組外源基因定點(diǎn)整合的方法中，所述植物基因組為水稻基因組。

本發(fā)明至少包括以下有益效果：

相比于傳統(tǒng)的直接利用打靶載體和供體片段共轉(zhuǎn)化進(jìn)行定點(diǎn)整合的方法，本發(fā)明首先通過將外源基因轉(zhuǎn)化載體將外源基因序列隨機(jī)整合到植物基因組上，再通過第二次轉(zhuǎn)化將打靶載體也導(dǎo)入含有外源基因轉(zhuǎn)化載體的植株內(nèi)，這樣打靶載體同時(shí)對(duì)整合位點(diǎn)序列和外源片段兩翼的靶位點(diǎn)序列進(jìn)行切割編輯，隨機(jī)整合位點(diǎn)為定點(diǎn)整合位點(diǎn)提供含有同源臂序列的外源基因的供體片段，然后利用植物本身的修復(fù)系統(tǒng)以及同源臂序列的存在，從而實(shí)現(xiàn)外源基因片段在目的整合位點(diǎn)的高效整合。并且，相比于兩種載體共轉(zhuǎn)化，本發(fā)明采用兩次轉(zhuǎn)化分別轉(zhuǎn)化兩個(gè)載體，因此，使得定點(diǎn)整合的成功率大大提高，實(shí)現(xiàn)了植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)上的重要突破。同時(shí)，本發(fā)明公開的實(shí)現(xiàn)植物基因組外源序列定點(diǎn)整合的方法，可以避免現(xiàn)存轉(zhuǎn)基因技術(shù)中基因插入的隨機(jī)性導(dǎo)致的表達(dá)不確定性和對(duì)原基因組的損害。

本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)、目標(biāo)和特征將部分通過下面的說明體現(xiàn)，部分還將通過對(duì)本發(fā)明的研究和實(shí)踐而為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解。

附圖說明

圖1為本發(fā)明所述的外源基因轉(zhuǎn)化載體的部分序列連接示意圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文字能夠據(jù)以實(shí)施。

應(yīng)當(dāng)理解，本文所使用的諸如“具有”、“包含”以及“包括”術(shù)語并不配出一個(gè)或多個(gè)其它元件或其組合的存在或添加。

如圖1所示，本發(fā)明提供一種實(shí)現(xiàn)植物基因組外源基因定點(diǎn)整合的方法，包括如下步驟：

步驟一、構(gòu)建能夠在植株基因組的目的整合位點(diǎn)區(qū)域進(jìn)行基因組編輯的打靶載體，該打靶載體包括整合靶位點(diǎn)序列和Cas9核酸酶表達(dá)元件；

步驟二、構(gòu)建外源基因轉(zhuǎn)化載體，并將該外源基因轉(zhuǎn)化載體隨機(jī)整合到植株的基因組中，得到轉(zhuǎn)化有該外源基因的轉(zhuǎn)基因株系，其中，所述外源基因轉(zhuǎn)化載體包含整合位點(diǎn)序列和；和與所述目的整合位點(diǎn)兩翼相同的同源臂序列，且該同源臂序列位于所述整合位點(diǎn)序列和所述外源基因之間；

步驟三、將步驟一中構(gòu)建的所述打靶載體轉(zhuǎn)化導(dǎo)入步驟二中得到的轉(zhuǎn)基因株系內(nèi)，篩選得到只含有定點(diǎn)整合到所述目的整合位點(diǎn)區(qū)域的株系。

在本發(fā)明的其中一個(gè)實(shí)施例中，作為優(yōu)選，步驟一和步驟二中的同源臂序列的長度為500～1000bp。

在上述方案中，步驟一中，所述打靶載體的篩選標(biāo)記基因?yàn)槌泵顾鼗颉?/p>

在上述方案中，步驟二中，所述外源基因轉(zhuǎn)化載體的篩選標(biāo)記基因?yàn)榭钩輨┗颉?/p>

在上述方案中，作為優(yōu)選，步驟三中，通過雜交進(jìn)行定點(diǎn)整合到所述目的整合位點(diǎn)區(qū)域的株系的篩選。

在上述方案中，所述植物基因組為水稻基因組。

在本發(fā)明的其中一個(gè)實(shí)施例中，實(shí)現(xiàn)植物基因組外源序列定點(diǎn)整合的方法包括：

步驟1，在目的整合外源基因片段的區(qū)域，選擇合適的靶位點(diǎn)，構(gòu)建打靶載體并驗(yàn)證打靶載體可在該位點(diǎn)進(jìn)行高效地基因組編輯。

步驟2，構(gòu)建外源基因轉(zhuǎn)化載體(抗性篩選標(biāo)記基因可為抗除草劑基因)，將外源基因序列通過常規(guī)轉(zhuǎn)基因方法隨機(jī)整合到植物的染色體上。其中，外源基因轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建要求該外源基因序列兩翼增加了與整合位點(diǎn)兩翼相同的同源臂序列，長度一般要求在500-1000bp，并在同源臂兩端添加靶位點(diǎn)序列(如圖1)；

步驟3，將步驟2中得到的陽性轉(zhuǎn)基因株系作為受體進(jìn)行第二次轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化載體為整合位點(diǎn)(靶位點(diǎn))對(duì)應(yīng)的打靶載體(抗性篩選標(biāo)記基因?yàn)槌泵顾鼗?，打靶載體轉(zhuǎn)化后，會(huì)同時(shí)對(duì)整合位點(diǎn)和外源片段兩翼的靶位點(diǎn)進(jìn)行切割編輯，隨機(jī)整合位點(diǎn)為定點(diǎn)整合位點(diǎn)提供含有同源臂序列的外源基因供體片段，利用植物本身的修復(fù)系統(tǒng)以及同源臂序列的存在，從而實(shí)現(xiàn)外源基因片段在靶位點(diǎn)的定點(diǎn)整合，可通過后續(xù)的雜交實(shí)現(xiàn)隨機(jī)整合和定點(diǎn)整合的分離，得到只含有定點(diǎn)整合的植株。

這里說明的模塊數(shù)量和處理規(guī)模是用來簡化本發(fā)明的說明的。對(duì)本發(fā)明的植物基因組外源序列定點(diǎn)整合方法的應(yīng)用、修改和變化對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的。

盡管本發(fā)明的實(shí)施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實(shí)施方式中所列運(yùn)用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對(duì)于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地實(shí)現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細(xì)節(jié)和這里示出與描述的圖例。