專利名稱：一種新的人基因編碼序列、其編碼的多肽及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種新的人基因核苷酸序列。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及人Myx的cDNA序列，該cDNA編碼的蛋白是Mad家族的成員。本發(fā)明還涉及由該核苷酸序列編碼的多肽，這些多核苷酸和多肽的應(yīng)用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生產(chǎn)方法。
Mad蛋白是一類含有堿性螺旋-環(huán)-螺旋亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)(bHLHZip，basic helix-loop-helix-leucin-zipper)的蛋白家族，能夠和另一類bHLHZip蛋白Max家族成員特異形成異源二聚體，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制物的作用，能在分化組織中調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)(EMBOJ 1995，14(22)5649-5659)。
Mad蛋白的發(fā)現(xiàn)和原癌基因myc的研究密不可分。myc基因是鳥類AMV病毒在細(xì)胞內(nèi)的同源序列，它最早在雞中被發(fā)現(xiàn)，以后又在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了其它形式的myc，組成了一個(gè)小的原癌基因家族。和Mad、Max蛋白一樣，Myc蛋白也含有bHLHZip結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)是許多轉(zhuǎn)錄因子的共同特征。HLH結(jié)構(gòu)和亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)是蛋白間相互作用的位點(diǎn)。Myc蛋白一般不會(huì)自身形成同源二聚體，而和Max蛋白形成異源二聚體，結(jié)合于DNA特意位點(diǎn)如轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子的Ebox基序上。myc基因?qū)儆凇凹纯淘缙诜磻?yīng)”(immediate early response”)基因，它們的表達(dá)可被促有絲分裂的刺激信號(hào)激活，且不依賴從頭開(kāi)始的蛋白質(zhì)合成，一般發(fā)生于靜止細(xì)胞轉(zhuǎn)向生長(zhǎng)狀態(tài)的早期，即G0向G1轉(zhuǎn)變時(shí)。它們的表達(dá)產(chǎn)物有利于S期的DNA合成，在細(xì)胞周期中表達(dá)水平保持不變。而當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入分化狀態(tài)，myc的表達(dá)即被迅速下調(diào)(Ann.Rev_Biochem.1992，61809-860)。
不同于Myc蛋白，Max蛋白存在于不增殖的G0細(xì)胞，并且在G0/G1轉(zhuǎn)換時(shí)它的豐度不變化。它的半衰期遠(yuǎn)大于Myc，是個(gè)非常穩(wěn)定的蛋白，它的含量也遠(yuǎn)高于Myc。Max不含有活化轉(zhuǎn)錄的活性位點(diǎn)，但Myc和Max形成異源二聚體后，可以提高和DNA結(jié)合的親合力，并提高活性區(qū)域的效率(Cell 1993，72211-222)。
Mad是又一類Max結(jié)合蛋白。迄今為止，有四個(gè)Mad家族成員被發(fā)現(xiàn)。1993年，美國(guó)的Ayer等以Max蛋白為探針篩選λgtll表達(dá)文庫(kù)，找到了人的Madl蛋白。Zervas等用相似的方法找到了另一個(gè)Mad蛋白-—人Mxil(Cell 1993，72211-222；223-232)。1995年Ayer同組人員Hurlin等用酵母雙雜交法在小鼠胚胎干細(xì)胞cDNA庫(kù)里找到了小鼠的Mad3和Mad4(EMBO J.1995，14(22)5649-5659)。1996年，Wang等人在挪威鼠中得到了Myx(U45986)，與Mad3有著極高的同源性，但未見(jiàn)文獻(xiàn)的進(jìn)一步報(bào)道。我們發(fā)現(xiàn)的人Myx蛋白和大鼠Mad3、挪威鼠Myx同源性較高，是Mad家族的又一新成員。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種新的多核苷酸，該多核苷酸編碼Mad家族的一個(gè)新成員。本發(fā)明的Mad家族成員被命名為人Myx。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種新的Mad家族成員，該蛋白被命名為人Myx蛋白。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)所述的新的人的Myx多肽的方法。
本發(fā)明還提供了這種人的Myx核酸序列和多肽的應(yīng)用。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種分離出的DNA分子，它包括編碼具有人Myx蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID No.3中從核苷酸11-631位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID No.3中從核苷酸11-631位的核苷酸雜交。較佳地，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID No.4所示的序列。更佳地，該序列具有SEQ ID No.3中從核苷酸11-631位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離的人Myx蛋白多肽，它包括具有SEQ ID No.4氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID No.4序列的多肽。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種載體，它含有上述分離出的DNA。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種產(chǎn)生具有人Myx蛋白活性的多肽的方法，該方法包括(a)將編碼具有人Myx蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成人Myx蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID No.3中從核苷酸11-631位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成人Myx蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)人Myx蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有人Myx蛋白活性的多肽。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的多核苷酸全長(zhǎng)為737個(gè)核苷酸，其詳細(xì)序列見(jiàn)SEQID No.3，其中開(kāi)放讀框位于11-631位核苷酸。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”或“基本純的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來(lái)，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開(kāi)，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開(kāi)。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“人Myx蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有人Myx蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中11-631位核苷酸序列及其簡(jiǎn)并序列。該簡(jiǎn)并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的編碼框11-631位核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，所以與SEQ ID NO.3中11-631位核苷酸序列同源性低至約70％簡(jiǎn)并序列也能編碼出SEQ ID NO.4所述的序列。該術(shù)語(yǔ)還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳地在高度嚴(yán)緊條件下，與SEQ ID No.3中從核苷酸11-631位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語(yǔ)還包括與SEQ ID No.3中從核苷酸11-631位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
該術(shù)語(yǔ)還包括能編碼具有與人Myx相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(gè)核苷酸。
在本發(fā)明中，“基本純的”蛋白質(zhì)或多肽是指其至少占樣品總物質(zhì)的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或濕重計(jì))。純度可以用任何合適的方法進(jìn)行測(cè)量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測(cè)量多肽的純度?；炯兊亩嚯幕旧喜缓烊粻顟B(tài)下的伴隨其的組分。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“人Myx蛋白多肽”指具有人Myx蛋白活性的SEQ ID No.4序列的多肽。該術(shù)語(yǔ)還包括具有與人Myx蛋白相同功能的、SEQ ID No.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語(yǔ)還包括人Myx蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式還包括同源序列、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)謹(jǐn)度條件下能與人Myx DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人Myx多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含人Myx多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長(zhǎng)的多肽外，本發(fā)明還包括了人Myx多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人Myx多肽編碼序列的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供人Myx蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人Myx多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過(guò)各種技術(shù)得到，如通過(guò)輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過(guò)定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過(guò)將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
本發(fā)明還包括人Myx多肽編碼序列及其片段的反義序列。這種反義序列可用于抑制細(xì)胞內(nèi)人Myx的表達(dá)。
本發(fā)明還包括一種探針?lè)肿樱摲肿油ǔ＞哂腥薓yx多肽編碼序列的8-100個(gè)，較佳地15-50個(gè)連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測(cè)樣品中是否存在編碼人Myx的核酸分子。
本發(fā)明還包括檢測(cè)人Myx核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測(cè)探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對(duì)應(yīng)于人Myx多肽的編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長(zhǎng)度一般為15-50個(gè)核苷酸。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞、和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞等。
另一方面，本發(fā)明還包括對(duì)人Myx DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于人Myx基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人Myx基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制人Myx蛋白的分子，也包括那些并不影響人Myx蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的人Myx基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國(guó)專利No.4,946,778)或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來(lái)自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的人Myx基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)人Myx或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來(lái)免疫動(dòng)物來(lái)生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來(lái)制備(見(jiàn)Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerlmg等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人Myx功能的抗體以及不影響人Myx功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用人Myx基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過(guò)常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人Myx基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來(lái)免疫動(dòng)物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來(lái)免疫動(dòng)物而獲得。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，人Myx的cDNA核苷酸序列是如此獲得的，以人胚胎λgtllcDNA文庫(kù)(購(gòu)自Clontech公司)為模板，用一對(duì)寡核苷酸為引物——A5’-TGTCGCCGACATGGAACCCTTG-3’為正向引物，寡核苷酸B5’-TCCAACAGGTGACTCCGAGCAG-3’為反向引物，進(jìn)行PCR。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序后得到SEQ ID No.3的全長(zhǎng)cDNA序列。
Mad是一類Max結(jié)合蛋白，它們僅和Max結(jié)合形成異源二聚體。Mad蛋白與原癌基因myc具有相互拮抗作用，對(duì)腫瘤的研究有著極為重要的意義。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明范圍。
實(shí)施例1，人Myx的cDNA序列的克隆和測(cè)定1.引物擴(kuò)增以人胚胎入gtllcDNA文庫(kù)(購(gòu)自Clontech公司)為模板，用一對(duì)寡核苷酸為引物--A5’-TGTCGCCGACATGGAACCCTTG-3’(SEQ ID NO1)為正向引物，寡核苷酸B5’-TCCAACAGGTGACTCCGAGCAG-3’(SEQ ID NO2)為反向引物，進(jìn)行PCR。A/B的PCR條件為93℃4分鐘，隨之以93℃1分鐘、60℃1分鐘和72℃1分鐘進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5分鐘。電泳檢測(cè)得到約730bp的目的片段。
2.PCR產(chǎn)物的測(cè)序?qū)⑸鲜鯬CR擴(kuò)增產(chǎn)物A/B與pGEM-T載體(Promega)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM103，用QIAprep Plasmid試劑盒(QIAGEN)提取質(zhì)粒，用Sequi Therm EXCELTMDNA測(cè)序試劑盒(Epicentre Technologies)對(duì)抽提的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，最后用電腦軟件拼接順序，獲得全長(zhǎng)cDNA序列，共737bp，詳細(xì)序列見(jiàn)SEQ ID No.3，其中開(kāi)放讀框位于11-631位核苷酸。
根據(jù)得到的全長(zhǎng)cDNA序列推導(dǎo)出人Myx的氨基酸序列，共206個(gè)氨基酸殘基，其氨基酸序列詳見(jiàn)SEQ ID No.4。
實(shí)施例2，同源比較用本發(fā)明的人Myx的全長(zhǎng)cDNA序列及其編碼蛋白，在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫(kù)及Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR數(shù)據(jù)庫(kù)中，用BLAST程序進(jìn)行核酸和蛋白同源檢索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，它們與不同來(lái)源的Mad家族成員有著顯著的同源性。用PCGENE軟件分析發(fā)現(xiàn)人Myx蛋白與小鼠mad3(U32394)編碼的蛋白的同源性為82％，相似性為86.9％(見(jiàn)表1)；與挪威鼠myx(U45986)編碼的蛋白的同源性為79.6％，相似性為85.4％(見(jiàn)表2)，而且本發(fā)明的人Myx蛋白含有典型的bHLHZip結(jié)構(gòu)域(59RSVHNELEKRRRAQLKRCLERLKQQMPLGGDCARYTFLSLLRRARMHIQKLEDQEQRARQLKERLRSKQQSLQRQWMQL137，其中59RSVHNELEKRRR70為堿性區(qū)域，71AQLKRCLERLKQQM84為第一個(gè)螺旋，85LGGDC90為環(huán)，91ARYTTLSLLRRARMHIQK108為第二個(gè)螺旋，109LEDQEQRARQLKERLRSKQQSLQRQWMQL137為亮氨酸拉鏈)，因此可以推測(cè)它屬于Mad家族，具有Mad家族成員的一般功能。
Mad是又一類Max結(jié)合蛋白，它們不形成同源二聚體，僅和Max結(jié)合形成異源二聚體，與bHLHZip家族的其他成員則沒(méi)有相互作用(Cell 1993，72211-222)。Mad家族成員可在體外細(xì)胞分化時(shí)被誘導(dǎo)表達(dá)，例如在U937細(xì)胞分化時(shí)，Mad家族的mRNA表達(dá)上升，而c-myc的mRNA表達(dá)量下降(Oncogene 1994，91247-1252)。而Mad-Max復(fù)合物替代Myc-Max，可以抑制那些在細(xì)胞增殖和保持細(xì)胞未分化狀態(tài)起作用的Myc-Max目標(biāo)基因的表達(dá)(Genes Dey.1993，72110-2119)。Mad蛋白和Myc蛋白的相拮抗作用可以為Myc的精確調(diào)控提供一種新的手段。Mad蛋白的N端有另一個(gè)保守序列Sin3作用域(sm3-interacting domain，SID)。該區(qū)域可以和酵母轉(zhuǎn)變共抑制物Sin3的鼠同源物相互作用，提示Mad蛋白抑制轉(zhuǎn)錄的功能通過(guò)常規(guī)機(jī)制實(shí)現(xiàn)(EMBO J.1995，14(22)5646-5659)。本發(fā)明中SID區(qū)域?yàn)?IQVLLQAAEFLERREREA25。
在迄今為止發(fā)現(xiàn)的四個(gè)Mad家族成員中，人Madl和人Mxil(Cell 1993，72211-222；223-232)分別被定位與人染色體2p13和10q25，這兩個(gè)位點(diǎn)都和人類疾病緊密相關(guān)。2p13處經(jīng)常發(fā)生染色體移位、急性成淋巴細(xì)胞白血病、兒童慢性淋巴細(xì)胞白血病以及基底細(xì)胞乳頭瘤等腫瘤相關(guān)在成神經(jīng)膠質(zhì)瘤中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)10q24-10q26區(qū)段發(fā)生缺失，暗示該位置存在有抑癌基因(Oncogene 1994，9665-668)，在前列腺癌中已發(fā)現(xiàn)mxi基因的等位缺失和突變(Nature Genet.1995，9249-255)；而Mad3和Mad4在染色體上的定位結(jié)果顯示它們位于和許多不同腫瘤類型相關(guān)的候選區(qū)域(EMBO J.1995，14(22)5649-5659)。本發(fā)明的人Myx蛋白為進(jìn)一步研究Mad家族蛋白在腫瘤防治中的作用打下了基礎(chǔ)。
實(shí)施例3，人Myx在大腸桿菌中的表達(dá)在該實(shí)施例中，以實(shí)施例1中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物A/B為模板，將編碼人Myx的cDNA序列用對(duì)應(yīng)于該DNA序列的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物(SEQ ID No.5和6)進(jìn)行擴(kuò)增，獲得人Myx cDNA作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5’寡核苷酸引物序列為5’-TCAGGTCGACATGGAACCCTTGGCCAGCAAC-3’(SEQ ID No.5)，該引物含有SalI限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)之后是由起始密碼子開(kāi)始的人Myx編碼序列的21個(gè)核苷酸；3’端引物序列為5’-TrGGAAGCTTTCATAGCCAGGCGCCGCCG-3’(SEQ ID No.6)，該引物含有HindIII限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、翻譯終止子和人Myx的部分編碼序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于細(xì)菌表達(dá)載體pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、一個(gè)細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(ori)、一個(gè)IPTG-可調(diào)啟動(dòng)子/操縱子(P/O)、一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)、一個(gè)6-組氨酸標(biāo)記物(6-His)以及限制性內(nèi)切酶克隆位點(diǎn)。
用SalI和HindIII消化pQE-9載體及插入片段，隨后將插入片段連接到pQE-9載體并保持開(kāi)放讀框在細(xì)菌RBS起始。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化購(gòu)自Qiagen，商品名為M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷貝的質(zhì)粒pREP4，其表達(dá)lacI阻遏物并攜帶卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，抽提質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證人Myx的cDNA片段已正確插入了載體。
在補(bǔ)加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子克隆。過(guò)夜(O/N)培養(yǎng)物以1∶100-1∶250的稀釋率稀釋，然后接種到大體積培養(yǎng)基中，培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)至600光密度(OD600)為0.4-0.6時(shí)，加入IPTG(“異丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至終濃度為1mM。通過(guò)使lac1阻遏物失活，IPTG誘導(dǎo)啟動(dòng)P/O導(dǎo)致基因表達(dá)水平提高。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞3-4小時(shí)，隨后離心(6000×g，20分鐘)。超聲裂解包涵體，收集細(xì)胞并將細(xì)胞沉淀溶于6M的鹽酸胍中。澄清后，通過(guò)在能使含6-His標(biāo)記物蛋白緊密結(jié)合的條件下，用鎳-螯合柱層析從溶液中純化溶解的人Myx。用6M鹽酸胍(PH5.0)從柱中洗脫人Myx?？捎脦追N方法從鹽酸胍中變性沉淀蛋白?；蛘?，使用透析步驟除去鹽酸胍，或者從鎳-螯合柱中分離出的純化蛋白。純化后的蛋白質(zhì)被結(jié)合到第二個(gè)柱中，該柱中具有遞減的線性鹽酸胍梯度。在結(jié)合到該柱時(shí)蛋白質(zhì)變性，隨后用鹽酸胍(PH5.0)洗脫。最后，將可溶的蛋白質(zhì)用PBS進(jìn)行透析，然后將蛋白質(zhì)保存在終濃度為10％(w/v)甘油的貯存液中。
用12％的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，鑒定表達(dá)蛋白的分子量大小為約24KDa。
此外，用常規(guī)方法對(duì)達(dá)蛋白的N端和C端各10個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的氨基酸進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID No.4的序列一致。
實(shí)施例4，人Myx在真核細(xì)胞(CHO細(xì)胞株)中的表達(dá)在該實(shí)施例中，以實(shí)施例1中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物A/B為模板，將編碼人Myx的cDNA序列用對(duì)應(yīng)于該DNA序列的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物(SEQ IDNo.7和8)進(jìn)行擴(kuò)增，獲得人Myx cDNA作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5’寡核苷酸引物序列為5’-TCAGAAGCTTATGGAACCCTTGGCCAGCAAC-3’(SEQ ID No.7)該引物含有HindIII限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)之后是由起始密碼子開(kāi)始的人Myx編碼序列的21個(gè)核苷酸；3’端引物序列為5’-TrGGGAATTCTCATAGCCAGGCGCCGCCG-3’(SEQ ID No.8)
該引物含有EcoRI限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、一個(gè)翻譯終止子和人Myx的部分編碼序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于CHO細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3上的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生索抗性(Ampr和Neor)、一個(gè)噬菌體復(fù)制起點(diǎn)(fl ori)、一個(gè)病毒復(fù)制起點(diǎn)(SV40ori)、一個(gè)T7啟動(dòng)子、一個(gè)病毒啟動(dòng)子(P-CMV)、一個(gè)Sp6啟動(dòng)子、一個(gè)SV40啟動(dòng)子、一個(gè)SV40加尾信號(hào)和相應(yīng)的polyA順序、一個(gè)BGH加尾信號(hào)和相應(yīng)的polyA順序。
用HindIII和EcoRI消化pcDNA3載體及插入片段，隨后將插入片段連接到pcDNA3載體。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，在補(bǔ)加Amp(100μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的克隆。抽提質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證人Myx的cDNA片段已正確插入了載體。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞是采用脂轉(zhuǎn)染法，用Lipofectin(GiBco Life)進(jìn)行的。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，經(jīng)2-3周的持續(xù)G418加壓篩選，收集細(xì)胞及細(xì)胞上清測(cè)定表達(dá)蛋白酶活力。去G418，連續(xù)傳代培養(yǎng)；對(duì)混合克隆細(xì)胞極限稀釋，選擇具有較高蛋白活性的細(xì)胞亞克隆。按常規(guī)方法大量培養(yǎng)上述陽(yáng)性亞克隆。48小時(shí)后，開(kāi)始收集細(xì)胞及上清，用超聲裂解方法破碎細(xì)胞。以含0.05％Triton的50mMTris·HCl(PH7.6)溶液為平衡液及洗脫液，用經(jīng)預(yù)平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mMTris·HCl(PH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTris·HCl(PH8.0)溶液為洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(PH7.4)為透析液對(duì)表達(dá)蛋白溶液進(jìn)行透析。最后凍干保存。
用12％的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，鑒定表達(dá)蛋白的分子量大小約為24KDa。
此外，用常規(guī)方法對(duì)達(dá)蛋白的N端和℃端各10個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的氨基酸進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)與SEQIDNo.4的序列一致。
實(shí)施例5，制備抗體將實(shí)施例3和4中獲得的重組蛋白用來(lái)免疫動(dòng)物以產(chǎn)生抗體，具體方法如下。重組分子用層析法進(jìn)行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進(jìn)行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過(guò)的蛋白，對(duì)小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原，對(duì)小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進(jìn)行腹膜內(nèi)注射以加強(qiáng)免疫。每隔14天進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，至少進(jìn)行三次?？寡宓奶禺惙磻?yīng)活性用它在體外沉淀人Myx基因翻譯產(chǎn)物的能力來(lái)評(píng)估。SEQ ID No.1～No.8的說(shuō)明SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.1TGTCGCCGAC ATGGAACCCT TG 22SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO2TCCAACAGGT GACTCCGAGC AG 22SEQ ID No.3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度737bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子型cDNA(xi)序列描述SEQ ID No.31 TGTCGCCGAC ATGGAACCCT TGGCCAGCAA CATCCAGGTC CTGCTGCAGG CGGCCGAGTT61 CCTGGAGCGC CGTGAGAGAG AGGCCGAGCA TGGTTATGCG TCCCTGTGCC CGCATCGCAG121 TCCAGGCCCC ATCCACAGGA GGAAGAAGCG ACCCCCCCAG GCTCCTGGCG CGCAGGACAG181 CGGGCGGTCA GTGCACAATG AACTGGAGAA GCGCAGGAGG GCCCAGTTGA AGCGGTGCCT241 GGAGCGGCTG AAGCAGCAGA TGCCCCTGGG CGGCGACTGT GCCCGGTACA CCACGCTGAG301 CCTGCTGCGC CGTGCCAGGA TGCACATCCA GAAGCTGGAG GATCAGGAGC AGCGGGCCCG361 ACAGCTCAAG GAGAGGCTGC GCAGCAAGCA GCAGAGCCTG CAGCGGCAGT GGATGCAGCT421 CCGGGGGCTG GCAGGAGCGG CCGAGCGGGA GCGGCTGCGG GCGGACAGTC TGAACTCCTC481 AGGCCTCTCC TCTGAGCGCT CAGACTCAGA CCAAGAGGAG CTGGAGGTGG ATGTGGAGAG541 CCTGGTTTTT GGGGGTGAAG CCGAGCTGCT GCGGGGCTTC GTCGCCGGCC AGGAGCACAG601 CTACTCGCAC GGCGGCGGCG CCTGGCTATG ATGTTCCTCA CCCAGGGGCG GCCTCTGCCC661 TCTACTCGTG CCAGGCCCAC TTGCCAAGGC AGGAGCCCTC CCCAAGCCTT CAGGGCTGCT721 CGGAGTCACC TGTTGGASEQ ID No.4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度206個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子型多肽(xi)序列描述SEQ ID No.41 Met Glu Pro Leu Ala Ser Asn Ile Gln Val Leu Leu Gln Ala Ala16 Glu Phe Leu Glu Arg Arg Glu Arg Glu Ala Glu His Gly Tyr Ala31 Ser Leu Cys Pro His Arg Ser Pro Gly Pro Ile His Arg Arg Lys46 Lys Arg Pro Pro Gln Ala Pro Gly Ala Gln Asp Ser Gly Arg Ser61 Val His Asn Glu Leu Glu Lys Arg Arg Arg Ala Gln Leu Lys Arg76 Cys Leu Glu Arg Leu Lys Gln Gln Met Pro Leu Gly Gly Asp Cys91 Ala Arg Tyr Thr Thr Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Arg Met His106 Ile Gln Lys Leu Glu Asp Gln Glu Gln Arg Ala Arg Gln Leu Lys121 Glu Arg Leu Arg Ser Lys Gln Gln Ser Leu Gln Arg Gln Trp Met136 Gln Leu Arg Gly Leu Ala Gly Ala Ala Glu Arg Glu Arg Leu Arg151 Ala Asp Ser Leu Asn Ser Ser Gly Leu Ser Ser Glu Arg Ser Asp166 Ser Asp Gln Glu Glu Leu Glu Val Asp Val Glu Ser Leu Val Phe181 Gly Gly Glu Ala Glu Leu Leu Arg Gly Phe Val Ala Gly Gln Glu196 His Ser Tyr Ser His Gly Gly Gly Ala Trp LeuSEQ ID NO.5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度31堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.5TCAGGTCGAC ATGGAACCCT TGGCCAGCAAC 31SEQ ID NO.6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.6TTGGAAGCTT TCATAGCCAG GCGCCGCCG 29SEQ ID NO.7的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度31堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.7TCAGAAGCTT ATGGAACCCT TGGCCAGCAAC 31SEQ ID NO.8的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.8TTGGGAATTC TCATAGCCAG GCGCCGCCG29表I人Myx蛋白與小鼠Mad3蛋白的同源比較進(jìn)行同源比較的兩個(gè)序列是hMyx-人Myx蛋白殘基總數(shù)206msMad3-小鼠Mad3蛋白殘基總數(shù)205比較真值表結(jié)構(gòu)-遺傳真值表開(kāi)放間隔罰分10單位間隔罰分10表示一致殘基的符號(hào)為“|”表示相似殘基的符號(hào)為“.”被認(rèn)為是相似的氨基酸為A，S，T；D，E；N，Q；R，K；I，L，M，VF，Y，WhMyx - MEPLASNIQVLLQAAEFLERREREAEHGYASLCPHRSPGPIHRRKKRPPQ -50|||.||||||||||||||||||||||||||||||| ||| . ||.| | |msMad3 - MEPVASNIQVLLQAAEFLERREREAEHGYASLCPHHSPGTVCRRRKPPLQ -50hMyx - APGAQDSGRSVHNELEKRRRAQLKRCLERLKQQMPLGGDCARYTTLSLLR -100|||| ||||||||||||||||||||||| |.|||||| ||.|||||||||msMad3 - APGALNSGRSVHNELEKRRRAQLKRCLEQLRQQMPLGVDCTRYTTLSLLR -100hMyx - RARMHIQKLEDQEQRARQLKERLRSKQQSLQRQWMQLRGLAGAAERERLR -150||.||||||.||| || |||.||||||||| | || || || ||||||msMad3 - -ARVHIQKLEEQEQQARRLKEKLRSKQQSLQQQLEQLQGLPGARERERLR -149hMyx - ADSLNSSGLSSERSDSDQEELEVDVESLVFGGEAELLRGFVAGQEHSYSH -200|||| ||||||||||||||.|||||| |||| |.||| | || ||||||msMad3 - ADSLDSSGLSSERSDSDQEDLEVDVENLVFGTETELLQSFSAGREHSYSH -199hMyx - GGGAWL -206|||msMad3 - STCAWL -205同源性168(82％)相似性10(4.9％)插入人Myx蛋白的間隔數(shù)0插入小鼠Mad3蛋白的間隔數(shù)1表II人Myx蛋白與挪威鼠Myx蛋白的同源比較進(jìn)行同源比較的兩個(gè)序列是hMyx-人Myx蛋白殘基總數(shù)206.NrMyx-挪威鼠Myx蛋白殘基總數(shù)206比較真值表結(jié)構(gòu)-遺傳真值表開(kāi)放間隔罰分10單位間隔罰分10表示一致殘基的符號(hào)為“|”表示相似殘基的符號(hào)為“.”被認(rèn)為是相似的氨基酸為A，S，T；D，E；N，Q；R，K；I，L，M，V；F，Y，WhMyx - MEPLASNIQVLLQAAEFLERREREAEHGYASLCPHRSPGPIHRRKKRPPQ -50|||.||||||||||||||||||||||||||||||| ||| . ||.| | |NrMyx - MEPVASNIQYLLQAAEFLERREREAEHGYASLCPHHSPGTVCRRRKAPLQ -50hMyx - APGAQDSGRSVHNELEKRRRAQLKRCLERLKQQMPLGGDCARYTTLSLLR -100|||| ||| |||||||||||||||||| |.|||||| | .|||||||||NrMyx - APGALNSGRHVHNELEKRRRAQLKRCLEQLRQQMPLGVDHTRYTTLSLLR -100hMyx - RARMHIQKLEDQEQRARQLKERLRSKQQSLQRQWMQLRGLAGAAERERLR -150|||||||||.||| | |||.|||.||||| | || || | ||.|||NrMyx - GARMHIQKLEEQEQQAQRLKEKLRSRQQSLQQQLEQLQGLLGVRERDRLR -150hMyx - ADSLNSSGLSSERSDSDQEELEVDVESLVFGGEAELLRGFVAGQEHSYSH -200|||| |||||||| |||||.||||||||||| |.||| | |||||||||NrMyx - ADSLDSSGLSSERFDSDQEDLEVDVESLVFGTETELLQSFSAGQEHSYSH 200hMyx - GGGAWL -206|.||NrMyx - STGTWL -206同源性164(79.6％)相似性12(5.8％)插入人Myx蛋白的間隔數(shù)0插入挪威鼠Myx蛋白的間隔數(shù)0
權(quán)利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有人Myx蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID No.3中從核苷酸11-631位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID No.3中從核苷酸11-631位的核苷酸雜交。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID No.4所示的序列。
3.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，該序列具有SEQ ID No.3中從核苷酸11-631位的核苷酸序列。
4.一種分離的人Myx蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID No.4氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如權(quán)利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID No.4序列的多肽。
6.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA。
7.一種用權(quán)利要求6所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
8.一種產(chǎn)生具有人Myx蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，該方法包括(a)將編碼具有人Myx蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成人Myx蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID No.3中從核苷酸11-631位的核苷酸序列有至少70％的同源性(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成人Myx蛋白的重組細(xì)胞(c)在適合表達(dá)人Myx蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有人Myx蛋白活性的多肽。
9.一種能與權(quán)利要求4所述的人Myx蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的探針?lè)肿?，其特征在于是指能與人Myx基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合與其它非相關(guān)抗原分子的抗體。
11一種探針?lè)肿?，其特征在于，它具有人Myx多肽編碼序列中8-100個(gè)連續(xù)核苷酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的探針?lè)肿?，其特征在于，它具有人Myx多肽編碼序列中15～50個(gè)連續(xù)的核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的人基因核苷酸序列——人Myx的cDNA序列。該cDNA編碼的蛋白是Mad家族的成員,它與SEQ ID No.3中從核苷酸11—631位的核苷酸序列有至少70%的同源性。所述序列蓖麻—具有SEQ ID No.4所示的序列的多肽。此外,還提出了生產(chǎn)具有人Myx蛋白活性的多肽的方法。本發(fā)明為進(jìn)一步研究Mad家族蛋白在腫瘤治療中的作用打下了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12P21/02GK1248626SQ99113968
公開(kāi)日2000年3月29日 申請(qǐng)日期1999年8月9日 優(yōu)先權(quán)日1999年8月9日
發(fā)明者余龍, 傅強(qiáng), 趙勇, 張宏來(lái), 趙壽元 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)