專利名稱：用于治療癌癥的msp36的慢病毒載體傳遞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過給予患者包含乳腺分泌蛋白(msp36)基因的慢病毒(lentiviral)載體，以治療癌癥或惡性腫瘤的組合物和方法，該給予方式使該基因在靶組織中表達(dá)而產(chǎn)生分泌的生物活性msp36蛋白。
背景技術(shù)：
在身體里正常細(xì)胞的分裂和遷移是被高度調(diào)節(jié)的。該調(diào)節(jié)系統(tǒng)稱為“細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定”，其利用若干機(jī)制以維持細(xì)胞的校驗(yàn)。調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)的主要機(jī)制包括通過可溶性介質(zhì)(例如生長(zhǎng)因子)的外部信號(hào)傳導(dǎo)、通過細(xì)胞接觸抑制的細(xì)胞生長(zhǎng)阻滯、通過特定的細(xì)胞表面受體-配體相互作用的細(xì)胞粘附和細(xì)胞分化。
Knudson首先論述癌癥的發(fā)展是一個(gè)多級(jí)過程[(1971)Proc.Nat.Acad.Sci.68，820-3]。正常細(xì)胞在其DNA內(nèi)累積遺傳突變，包括核苷酸的置換、缺失和重排。在關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因中某些這種突變的積累通常由于接觸抑制的喪失、細(xì)胞粘附的喪失、細(xì)胞分化的喪失和不能完成它們的預(yù)定功能，而經(jīng)常導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的喪失。此外，還可改變細(xì)胞存活和程序性死亡(凋亡)之間的平衡。由于這些遺傳突變，癌癥細(xì)胞喪失了維持細(xì)胞分裂在可控狀態(tài)下的調(diào)控元件，并且獲得超過組織和器官中正常細(xì)胞的增殖優(yōu)勢(shì)，以及作為轉(zhuǎn)移遷移到遠(yuǎn)處組織和器官的能力。
生長(zhǎng)因子和它們的特殊細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)結(jié)合蛋白形成了聯(lián)系外部環(huán)境和細(xì)胞的關(guān)鍵管道。生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白的實(shí)例包括表皮生長(zhǎng)因子(Taylor等(1970)Proc.Nat.Acad.Sci.67，164-71；Taylor等(1974)J.Biol.Chem.249，3198-203)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(Kanzake等(1990)Cell 61，1051-61；Dennis等(1989)J.Biol.Chem.264，7210-6)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(Zapf等(1975)Arch.Biochem.Biophys.168，638-45；Cohen andNissley(1976)Acta Endocrinol.83，243-58；Moses等(1976)Nature 263，137-40；Hintz and Liu(1977)J.Clin.Endocrinol.&Metab.45，988-95)，胰島素(Hoffinan等(1973)Exp.Cell Res.80，275-80)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(Huang等(1989)Proc.Nat.Acad.Sci.81，342-6)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(O’Connor-McCourt and Wakefield(1987)J.Biol.Chem.262，14090-9；Huang等(1988)J.Biol.Chem.263，1535-41；Kanzake等(1990)Cell 61，1051-61)。肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子家族包括酸性和堿性FGF、K-FGF、Int-2、FGF-5、KGF和FGF-7(Burgess and Maciag(1989)Ann.Rev.Biochem.58，575-606；Finch等(1989)Science 245，752-5；Gospodarowicz等(1986)Mol.Cell.Endocrinol.46，187-204)。這些生長(zhǎng)因子涉及生物過程例如生長(zhǎng)刺激、血管生成、創(chuàng)口愈合和組織再生(Burgess and Maciag；Gospodarowicz等；Kan等(1989)Proc.Nat.Acad.Sci.86，7432-6)。
Wu等(1991)J.Biol.Chem.266，16778-85，Lametsch等(2000)J.Biol.Chem.275，19469-74和Kurtz等(1997)Oncogene 14，2671-81分別從人表皮樣癌細(xì)胞、牛prepartum乳腺分泌物和小鼠SW13細(xì)胞中分離并鑒定了肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子的17KD結(jié)合蛋白。該蛋白與堿性或酸性FGF非共價(jià)結(jié)合，并且抑制了堿性FGF的功能(Wu，Lametsch和Kurtz)。
Lee(WO 02/34282)描述了基于TGF-β序列通過示差篩選含引物的人cDNA序列而分離的msp36。Lee顯示，與正常組織相比，msp36RNA和蛋白在乳腺癌和前列腺癌細(xì)胞株及患者腫瘤組織中被下調(diào)。在裸鼠中使用人腫瘤細(xì)胞的Matrigel移植試驗(yàn)中，msp36轉(zhuǎn)染或腺病毒感染進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的進(jìn)一步工作導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)遲緩、侵襲潛力降低、腫瘤細(xì)胞的基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)產(chǎn)生減少和腫瘤血管生成的抑制。Lee也證明了p21的誘導(dǎo)，該蛋白在引發(fā)細(xì)胞分化中扮演重要的角色(Liu等(2003)Drug Resist，Update 6，183-95)。這些實(shí)驗(yàn)顯示，msp36可調(diào)節(jié)乳腺腫瘤細(xì)胞的表型行為，將msp36植入msp36缺乏的腫瘤細(xì)胞顯示出它可用于治療人患者中的癌癥。
Lee所述的實(shí)驗(yàn)(WO 02/34282)利用DNA轉(zhuǎn)染或腺病毒感染以體外傳遞msp36到靶細(xì)胞，利用腺病毒感染體內(nèi)傳遞msp36到靶細(xì)胞。這兩種系統(tǒng)已用于傳遞各種基因以改善細(xì)胞中的基因缺陷。兩種系統(tǒng)也已用于修正動(dòng)物和人中的遺傳缺陷，其直接給予到患者中或通過體外處理細(xì)胞隨后將這些細(xì)胞重新引入動(dòng)物或患者中。然而，利用裸DNA或腺病毒作為傳遞載體表達(dá)的基因?qū)е孪率龅闹委熜缘鞍锥虝罕磉_(dá)。因此，通過裸DNA或腺病毒傳遞的msp36基因需要重復(fù)給予患者以進(jìn)行長(zhǎng)期治療。
至于其他蛋白質(zhì)，msp36蛋白的癌癥治療用途的一個(gè)問題是msp36濃度在腫瘤部位的波動(dòng)性。Msp36蛋白作為濃注(bolus)傳遞到腫瘤部位或通過靜脈注射而全身性傳遞，這導(dǎo)致形成蛋白濃度峰，緊接著通過清除和降解在腫瘤部位產(chǎn)生潛在的治療下濃度。例如，Intron-A(α-干擾素，Kenilworth，NJ)和Proleukin(白介素-2，Chiron，Emeryville，CA)分別具有約2小時(shí)和1.5小時(shí)的消除半壽期(參見各自產(chǎn)品的包裝說明書)。蛋白質(zhì)的聚乙二醇化經(jīng)常延長(zhǎng)了治療性蛋白的半壽期(Harris and Chess(2003)Nat.Rev.Drug Discov.2，214-21)，但患者仍然需要重復(fù)治療以提高蛋白質(zhì)濃度到治療水平。對(duì)于長(zhǎng)期的患者治療，需要重復(fù)給予msp36蛋白以抑制乳腺腫瘤的生長(zhǎng)。對(duì)于半壽期較短的治療性蛋白，例如白介素2和α-干擾素，患者的治療可頻繁至每天1-3次。確實(shí)需要的是在較長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)傳遞給患者改善腫瘤或惡性腫瘤必要的恒定治療劑量。
另一種傳遞治療水平的msp36的方法包括傳遞有效連接啟動(dòng)子的msp36基因到細(xì)胞中，msp36基因隨后在細(xì)胞中合成并分泌生物活性msp36蛋白。轉(zhuǎn)染裸DNA和脂質(zhì)體包被的DNA是兩種已確定的傳遞基因進(jìn)入細(xì)胞的非病毒方法。然而，這些方法導(dǎo)致治療性蛋白的短暫表達(dá)(Romano等(2000)Stem Cells 18，19-39)，不適于長(zhǎng)期傳遞最佳治療所需的恒定水平。非病毒傳遞系統(tǒng)的另一個(gè)缺陷是，因?yàn)榧?xì)胞防御系統(tǒng)的緣故，需要大量的裸DNA以達(dá)到治療效果(Crystal(1995)Nat.Med.1，15-7)。
Romano等和Mah等(2002)Clin.Pharmcokin.41，901-11描述了病毒基因傳遞系統(tǒng)。常用病毒系統(tǒng)包括腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)和逆轉(zhuǎn)錄病毒。這些系統(tǒng)已用于傳遞各種基因以改善細(xì)胞中的基因缺陷。它們也已用于修正動(dòng)物和人中的遺傳缺陷，其直接給予至患者中或體外處理細(xì)胞隨后將這些細(xì)胞重新引入動(dòng)物或患者中。然而，腺病毒和AAV載體不整合到宿主細(xì)胞中并且短暫地表達(dá)蛋白，對(duì)于長(zhǎng)期治療也需要反復(fù)給予患者。逆轉(zhuǎn)錄病毒序列整合到宿主細(xì)胞中，但經(jīng)常在幾周后由于它們的啟動(dòng)子區(qū)被宿主細(xì)胞甲基化而被滅活(Duch等(1994)J.Virol.68，5596-601；Chang and He(2001)Curr.Opin.Mol.Therap.3，468-75)。
慢病毒載體具有某些超出其它基因傳遞系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)；它高效率地將外源基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，它可轉(zhuǎn)導(dǎo)不分裂的細(xì)胞，它可指導(dǎo)治療性蛋白的長(zhǎng)期表達(dá)，并且可在體內(nèi)或者體外有效地傳遞(Naldini(1998)Curr.Opin.Biotechnol.8，457-63)。
已開發(fā)了慢病毒載體并用于治療各種遺傳性疾病和獲得性疾病(Galimi and Verma(2001)Curr.Topics Micro.Immunol.261，245-54；Klimatcheva等(1999)Front.Biosci.4，D481-96)。慢病毒載體用于人類疾病治療的主要焦點(diǎn)是將基因轉(zhuǎn)入神經(jīng)元以治療CNS疾病(例如治療溶酶體存儲(chǔ)病、亨廷頓氏病及帕金森氏病)、將基因轉(zhuǎn)入造血祖細(xì)胞以治療淋巴-血液疾病(例如鐮狀紅細(xì)胞和β-地中海貧血以及血友病)，還用于HIV感染(Yee and Zaia(2001)Som.Cell Mol.Genet.26，159-74；Deglon and Aebischer(2001)Curr.Topics Micro.Immunol.261，191-210；Salmon and Trono，Curr.Topics Micro.Immunol.261，211-28；Amadoand Chen，Curr.Topics Micro.Immunol.261，229-44)。
有某些慢病毒載體在腫瘤學(xué)中潛在用途的報(bào)告。慢病毒載體已用于體外傳遞免疫原性蛋白到滅活的癌細(xì)胞中以生產(chǎn)抗癌疫苗(Nawrocki等(2001)Expert Opin.Biol.Ther.1，193-204；Koya等(2002)Leukemia 16，1645-54)、體外傳遞免疫調(diào)節(jié)蛋白到樹突細(xì)胞以刺激抗腫瘤反應(yīng)(Stripecke等(2003)Blood Cells Mol.Dis.31，28-37)、傳遞毒素例如白喉毒素(Yu等(2001)Cancer Gene Ther.8，628-35)、傳遞自殺基因例如HSV胸苷激酶(Kong等(2003)In Vivo 17，153-6；Del Palma等(2003)Nat.Med.9，789-95)或傳遞轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Dingli等(2003)GeneTher.102，489-96)，以嘗試直接殺死癌細(xì)胞。然而，沒有目標(biāo)為置換細(xì)胞外可溶蛋白調(diào)節(jié)物的慢病毒治療用途報(bào)道，該調(diào)節(jié)物通過細(xì)胞受體發(fā)揮減緩癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。
盡管在醫(yī)藥界中對(duì)癌癥治療的關(guān)注高度優(yōu)先，仍然需要新的治療方法以尋求這類疾病的進(jìn)展。大多數(shù)癌癥治療方法具有高毒性特性，患者不能耐受。靶向腫瘤位置而不全身給藥的新治療分子有希望提供改良的藥物功效而同時(shí)使副作用最小。
msp36顯示明顯希望用于治療乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌和其它可能的癌癥類型。和大多數(shù)治療一樣，劑量水平是該蛋白的最大功效的關(guān)鍵。理想狀態(tài)下，msp36蛋白質(zhì)在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)(即大于6個(gè)月)以恒定的劑量傳遞，這將是緩解乳腺、前列腺、卵巢和肺腫瘤或惡性腫瘤的最主要治療方法。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及在腫瘤或惡性腫瘤部位產(chǎn)生治療水平的msp36的方法。含msp36基因的慢病毒載體被傳遞到腫瘤位置或其附近，該msp36基因與在靶組織中有活性的啟動(dòng)子有效連接。慢病毒載體將有效連接至啟動(dòng)子的msp36基因傳遞入細(xì)胞，在那里msp36基因穩(wěn)定整合入細(xì)胞DNA。啟動(dòng)子指導(dǎo)生物活性msp36蛋白質(zhì)的合成，該蛋白從細(xì)胞中分泌。活性msp36增加了由腫瘤細(xì)胞或周圍基質(zhì)細(xì)胞合成的低到不可檢測(cè)的msp36水平，抑制腫瘤的細(xì)胞周期、遷移能力、MMP-9的合成，和/或阻止腫瘤位置的血管生成。
GenBank檢索號(hào)AF149412和M60047中描述了人msp36基因序列，AF271896中描述了牛msp36基因序列，AF065441中描述了小鼠序列。編碼蛋白的完整基因或cDNA或其片段可用于本發(fā)明，該蛋白能夠結(jié)合酸性或堿性FGF并抑制小鼠Matrigel腫瘤試驗(yàn)中的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、MMP-9合成或血管生成。
慢病毒載體中與msp36基因有效連接的啟動(dòng)子可以是組成型或誘導(dǎo)型，可以是組織特異性。已知許多組織特異性啟動(dòng)子。msp36的前導(dǎo)序列可以是同源或異源的。msp36基因可以是含有內(nèi)含子的全長(zhǎng)基因、cDNA、基因或cDNA的片段或其組合。慢病毒載體可來源于人、猿、貓、馬、?；蚋腥酒渌溉閯?dòng)物物種的慢病毒。慢病毒載體可包含其它治療性、自殺性或毒性基因，例如有效連接誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或穿過IRES(內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn))的HSV胸苷激酶(de Felipe(2002)Curr.Gene Ther.2，355-78)。此外，慢病毒藥物制劑可與其它治療性調(diào)節(jié)物一起傳遞，以治療癌癥或惡性腫瘤。
用慢病毒載體傳遞的msp36基因治療含低或不可測(cè)msp36水平的乳腺癌腫瘤將導(dǎo)致msp36蛋白的長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)。由慢病毒載體指導(dǎo)的外源msp36的表達(dá)在乳腺癌小鼠模型中抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲潛力和腫瘤血管生成。
我們描述了通過傳遞包含msp36基因的慢病毒載體來治療患者中乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌和肺癌的方法，該基因在腫瘤部位表達(dá)局部治療水平的msp36蛋白。本發(fā)明方法涉及利用直接注射將慢病毒載體給予到腫瘤位置或其附近。包含msp36基因的慢病毒載體可與其它癌癥治療聯(lián)合傳遞，例如手術(shù)干預(yù)、放射療法、激素療法、免疫療法、化學(xué)療法或冷凍療法。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及通過給予帶有與啟動(dòng)子有效連接的msp36基因的慢病毒載體，在腫瘤位置傳遞有效治療量的msp36，來治療患者中的癌癥或惡性腫瘤的方法。這種癌癥或惡性腫瘤包括乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌和任何其它癌癥，其中相對(duì)于正常非癌變組織msp36水平降低或不存在。
本文所用的“基因”指哺乳動(dòng)物msp36，優(yōu)選人msp36、編碼全部或部分msp36的基因、cDNA、DNA、核酸、寡核苷酸、多核苷酸或其片段或部分。該基因可包含內(nèi)含子。msp36基因包含普通人群中所述的天然多態(tài)性，其改變核苷酸順序并可改變氨基酸序列。作為非限制性實(shí)例，片段或部分包括至少70-100個(gè)或更多核苷酸的核酸片段?；蚩赏ㄟ^化學(xué)或重組方法制備。
本文所用的“變體”指msp36基因，其具有不改變翻譯氨基酸序列的保守核苷酸改變，或者具有導(dǎo)致msp36基因產(chǎn)生的翻譯氨基酸序列改變一個(gè)或多個(gè)氨基酸的非保守核苷酸改變。術(shù)語“變體”包括氨基酸的缺失、插入或二者。術(shù)語“變體”也包括插入或除去參與或指導(dǎo)糖基化或其它翻譯后修飾的氨基酸殘基，并且可包括msp36多肽的N-端前導(dǎo)序列或其它氨基酸的存在。Msp36的變體也可包括融合蛋白，例如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)。
本文所用的“生物活性”msp36多肽指顯示類似于(但不必相同)msp36多肽活性的多肽。生物活性msp36多肽抑制癌細(xì)胞的細(xì)胞周期、抑制體外實(shí)驗(yàn)中的癌細(xì)胞遷移(Albini(1998)Pathol.Oncol.Res.4，230-41)、降低癌細(xì)胞或周圍基質(zhì)組織中MMP-9的生成、加強(qiáng)凋亡、降低腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)速度、降低腫瘤細(xì)胞侵襲潛力或體內(nèi)抑制癌細(xì)胞誘導(dǎo)的血管生成。劑量依賴性可不與msp36多肽一致。該多肽可在各種細(xì)胞中制備，包括真核和原核細(xì)胞，包括細(xì)菌、昆蟲和哺乳動(dòng)物(例如小鼠、大鼠和人)細(xì)胞。
本文所用的“慢病毒載體”包括基于HIV-1或HIV-2的載體，或基于猿、貓、馬或牛免疫缺陷病毒的載體，或基于可感染其它哺乳動(dòng)物物種的慢病毒的載體。載體通常為復(fù)制缺陷性。
本文所用的“藥物組合物”包含含有msp36基因的慢病毒載體，以及一種或多種藥物可接受載體、稀釋劑或賦形劑，可包含其它活性成份。藥物組合物的制劑可以是水性或非水性的等滲無菌溶液或混懸液。
包含msp36基因的慢病毒載體可通過各種方式給藥，包括注射或局部應(yīng)用。慢病毒載體可通過腫瘤內(nèi)、血管內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)或吸入給藥傳遞到患者中的位置。
本文所用的患者指已被醫(yī)師診斷為患有癌癥或惡性腫瘤的人。癌癥可起源或位于各種組織或器官，包括但不限于乳腺、前列腺、卵巢和肺。該患者可患有早期癌癥或晚期癌癥。其它癌癥治療可在用含msp36基因的慢病毒藥物制劑治療之前、同時(shí)或之后應(yīng)用。
Wu等(1991)J.Biol.Chem.266，16778-85中已作為HBp17描述了人msp36，Lametsch等(2000)J.Biol.Chem.275，19469-74和Kurtz等(1997)Oncogene 14，2671-81中已分別作為FGF-BP描述了牛和鼠msp36。HBp17被描述為肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子家族的成員。msp36基因的DNA序列顯示大約17KD的多肽；SDS-PAGE上的遷移顯示大小約為36KD。表觀大小的差異可能是由于粘附在多肽上的糖。
Lee(WO 02/34282)描述了利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生重組msp36，以及體外用裸DNA和腺病毒載體傳遞msp36基因到腫瘤細(xì)胞。Lee鑒定了體外msp36對(duì)乳腺癌細(xì)胞的作用，并且顯示出細(xì)胞周期時(shí)間、細(xì)胞遷移和MMP-9分泌的抑制。Lee也顯示了當(dāng)這些細(xì)胞被包裹在Matrigel基質(zhì)中并植入裸小鼠中時(shí)體內(nèi)對(duì)血管生成的抑制。
可獲得用于本發(fā)明方法的編碼所需msp36的遺傳材料。GenBank檢索號(hào)AF149412和M60047中描述了人msp36基因的基因序列，AF271896中描述了牛msp36基因序列，AF065441中描述了小鼠序列。
用于本發(fā)明方法的充分開發(fā)的系統(tǒng)利用基于HIV-1的慢病毒載體。該系統(tǒng)歸納于Ailles和Naldini(2002)Curr.Topics Micro.Immunol.261，31-52中。已對(duì)慢病毒載體進(jìn)行了廣泛地修改以增加其應(yīng)用于人類時(shí)的安全性。在轉(zhuǎn)移載體中僅僅保留了大約10％的原始病毒序列。產(chǎn)生慢病毒載體所需的包裝細(xì)胞用多至4個(gè)單獨(dú)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，以使重組降到最低。在大多數(shù)慢病毒載體結(jié)構(gòu)中，治療基因序列與CMV啟動(dòng)子有效連接。
包含msp36基因的慢病毒載體可配制在藥物可接受載體、稀釋劑或稀釋劑中，可包含其它的活性成分。藥物組合物的制劑可為水性或非水性的等滲無菌溶液或混懸液。優(yōu)選配方是磷酸緩沖鹽水(PBS)。PBS中可存在其它載體，例如乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、組氨酸、甘氨酸、明膠、膠原、聚乙烯吡咯烷酮。載體列表不是窮盡性的。藥物制劑可儲(chǔ)存在4℃、-20℃或-80℃，并且在給予患者前恢復(fù)到室溫，或由粉末或無水制劑重新配制。
慢病毒載體藥物制劑可利用注射器注射到組織部位中。注射部位可為腫瘤內(nèi)、血管內(nèi)、皮下、肌內(nèi)或腹膜內(nèi)。藥物制劑可局部應(yīng)用于手術(shù)部位，例如在切除原發(fā)性腫瘤后。此外，制劑可被霧化以吸入給藥。
治療劑量指含msp36基因的慢病毒載體的量，其改善、減小或消除癌癥或惡性腫瘤。含msp36基因的慢病毒載體的量根據(jù)給藥途徑、所應(yīng)用的組織、患者的狀態(tài)(包括年齡、體重、性別和癌癥或惡性腫瘤的嚴(yán)重程度)而變化，所有這些都由醫(yī)生或從業(yè)者決定?？赏ㄟ^利用細(xì)胞培養(yǎng)物和動(dòng)物模型的標(biāo)準(zhǔn)方法來確定治療效果和毒性，從而決定治療劑量和毒性劑量的范圍。慢病毒載體劑量的測(cè)量可通過在培養(yǎng)物中感染細(xì)胞和有限稀釋來進(jìn)行，或基于ELISA法測(cè)定p24衣殼蛋白(Perkin-Elmer，Boston，MA)。優(yōu)選劑量是具有高療效指數(shù)和低毒性指數(shù)的劑量。通過轉(zhuǎn)導(dǎo)單位(TU)測(cè)定的治療患者癌癥的慢病毒載體范圍為105至1010TU/劑。
可與其它癌癥治療一起在藥物制劑中傳遞慢病毒載體。例如，拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑(例如喜樹堿)、微管蛋白結(jié)合劑(例如紫杉醇)、烷化劑(例如苯丁酸氮芥)、抗代謝物(例如L-天冬酰胺酶)或免疫抑制劑(例如地塞米松)制劑可與慢病毒載體制劑混合或重新配制，并且注射或局部應(yīng)用于患者。
以下非限制性實(shí)施例描述了本發(fā)明治療乳腺癌的實(shí)踐。然而，本發(fā)明不限于乳腺癌，并且可用于任何腫瘤組織中msp36水平降低或無法檢測(cè)的癌癥。
實(shí)施例1.含msp36基因的慢病毒載體的構(gòu)建和其在轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中能指導(dǎo)生物活性msp36合成的證明人msp36基因可利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)從乳腺cDNA庫(kù)分離(Marathon-Ready cDNA，BD Biosciences(Clontech)，Palo Alto，CA)。按照廠商說明書，兩種引物(例如正向引物5′-actggatccgtgtgctcagaacaag-3′和反向引物5′-tgacatctcttaaaggaacccgttctc-3′)可在Perkin-Elmer 480型熱循環(huán)儀(shelton，CT)中以37℃退火、72℃延長(zhǎng)和94℃變性的條件使用。所得PCR產(chǎn)物克隆入pBluescript II(Stratagene，La Jolla，CA)。
Zufferey等(1998)J.Virol.72，9873-80、Yam等(2002)Mol.Ther.5，479-84和Logan等(2002)Curr.Opin.Bioteclmol.13，429-36中描述了慢病毒載體，而且可通過商業(yè)化途徑獲得，例如ViraPowerTM慢病毒表達(dá)系統(tǒng)(Invitrogen)和LentiPakTM(Genetix Pharmaceuticals，Cambridge，MA)。這些載體具有方便的限制性酶切位點(diǎn)以插入cDNA，并包含CMV啟動(dòng)子。人msp36基因與其同源信號(hào)序列和poly(A)位點(diǎn)一起被引入。
通過磷酸鈣沉淀，共轉(zhuǎn)染載體質(zhì)粒構(gòu)建物和2個(gè)核心包裝質(zhì)粒和VSV-G包膜質(zhì)粒。將20ug(450ul)的質(zhì)?；旌衔锛尤牒?×106293細(xì)胞(CRL-1573，ATCC，Manassas，VA)的100mm平板中，該細(xì)胞在Iscove改良Dulbecco培養(yǎng)基(JRH，Biosciences，Lenexa，KS)和10％FBS中培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染16小時(shí)后加入新鮮培養(yǎng)基，在新鮮培養(yǎng)基加入24小時(shí)后收獲條件培養(yǎng)基。通過低速離心澄清培養(yǎng)基，通過0.2um醋酸纖維素薄膜過濾器過濾，儲(chǔ)藏在-80℃。通過使用293細(xì)胞有限稀釋物的定量PCR，測(cè)定病毒制劑的滴度(以轉(zhuǎn)導(dǎo)單位為單位，TU)，并且利用p24衣殼蛋白ELISA試驗(yàn)(Perkin-Elmer)測(cè)量總的病毒顆粒。
將慢病毒載體制品(107TU/ml)加入以2×105個(gè)細(xì)胞接種的HeLa細(xì)胞中。在48小時(shí)收獲培養(yǎng)基，通過ELISA定量msp36蛋白的量。
實(shí)施例2.msp36比活的測(cè)定按實(shí)施例1所示，轉(zhuǎn)染5個(gè)293細(xì)胞的100mm平板。在轉(zhuǎn)染24和48小時(shí)后收獲條件培養(yǎng)基，按實(shí)施例1中所述的方法收集和處理。鑒定該培養(yǎng)基的p24衣殼蛋白和TU。將條件培養(yǎng)基加入HeLa細(xì)胞，如實(shí)施例1所述在24和48小時(shí)后從這些培養(yǎng)物收獲含msp36的條件培養(yǎng)基。
利用旋轉(zhuǎn)柱將培養(yǎng)基濃縮到約10ug/mL的msp36蛋白。通過ELISA定量msp36的產(chǎn)生，并且檢測(cè)1ug/mL蛋白誘導(dǎo)MCF7乳腺癌細(xì)胞中p21表達(dá)的能力。在24和72小時(shí)時(shí)收集細(xì)胞，通過蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)p21。慢病毒指導(dǎo)的msp36誘導(dǎo)P21的水平可與在大腸桿菌中產(chǎn)生的重組msp36相比。
實(shí)施例3.體外乳腺癌細(xì)胞中的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率在1-5的MOI下用包含msp36基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)染3種乳腺癌細(xì)胞系(MDAMB435、MCF7和T47D)。48小時(shí)后收獲一半的細(xì)胞，通過使用慢病毒載體特異性引物的定量PCR測(cè)定被轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞百分率。同樣在48小時(shí)采集另一半的細(xì)胞，用于p21誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)。收集培養(yǎng)基并通過ELISA定量msp36蛋白的產(chǎn)生。
實(shí)施例4.將基因傳遞產(chǎn)生的msp36水平與對(duì)靶乳腺癌細(xì)胞系的有效性關(guān)聯(lián)，終點(diǎn)為a)細(xì)胞周期的抑制；b)細(xì)胞遷移的抑制；和c)MMP-9分泌的抑制。
軟瓊脂糖上的無貼壁依賴性生長(zhǎng)。與未處理的對(duì)照細(xì)胞相比，實(shí)施例3的msp36轉(zhuǎn)導(dǎo)的MDAMB435和T47D乳腺癌細(xì)胞在2.5個(gè)星期時(shí)在軟瓊脂糖中顯示出無貼壁依賴性生長(zhǎng)的抑制(Alley andLieber(1984)Br.J.Cancer 49，225-33)。
細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查。與非轉(zhuǎn)導(dǎo)或模擬轉(zhuǎn)導(dǎo)的對(duì)照細(xì)胞群相比，msp36轉(zhuǎn)導(dǎo)的MDAMB435和T47D乳腺癌細(xì)胞顯示出形態(tài)學(xué)改變?？赏ㄟ^ELISA測(cè)定轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的msp36產(chǎn)生。此外，這些細(xì)胞表達(dá)p21，如蛋白質(zhì)印跡的測(cè)定。
使用跨孔遷移試驗(yàn)測(cè)定的侵襲潛力降低?？衫?4孔BiocoatTMMatrigelTM侵襲室(Becton Dickinson)，用包被Matrigel的8um聚碳酸酯過濾器測(cè)定細(xì)胞侵襲潛力。將來自實(shí)施例3的105個(gè)msp36轉(zhuǎn)導(dǎo)的MDAMB435細(xì)胞在上室中平板培養(yǎng)48小時(shí)。下室含有DMEM+10％FBS，或含有無FBS的DMEM作為對(duì)照。在培育后，細(xì)胞用3％戊二醛固定，用Giemsa染色。通過擦拭除去濾器上表面的細(xì)胞，計(jì)數(shù)遷移到下室的細(xì)胞數(shù)。
MMP-9產(chǎn)生的減少。msp36轉(zhuǎn)導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞和非轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞在1ug/mL msp36-條件培養(yǎng)基的存在下檢測(cè)。MMP-9的產(chǎn)生通過信號(hào)識(shí)別蛋白體的受體檢測(cè)(Yamagata等(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.151，158-62)。
實(shí)施例5.通過治療預(yù)先接種了人乳腺癌細(xì)胞的裸小鼠以改善腫瘤生長(zhǎng)和血管生成，確定基因傳遞系統(tǒng)所傳遞的msp36的功效，并比較傳遞msp36基因與傳遞msp36蛋白儲(chǔ)藏的功效。
檢測(cè)4個(gè)裸小鼠群，每群5只裸小鼠1)未治療對(duì)照；2)用msp36載體治療；3)用msp36蛋白治療；4)對(duì)照載體。將3×106個(gè)MDAMB435腫瘤細(xì)胞注射到每只裸小鼠的兩個(gè)乳房脂肪墊中。在注射腫瘤7-10天后，用注射器將3種濃度(在實(shí)施例3中確定)之一的含msp36基因的慢病毒載體注射到一組小鼠的每個(gè)腫瘤部位。作為陽性對(duì)照，將msp36蛋白注射到單獨(dú)一組動(dòng)物的腫瘤部位中。作為陰性對(duì)照，將鹽水注射至第3組小鼠的腫瘤部位，第4組小鼠注射不含msp36基因的慢病毒載體。每2天進(jìn)行測(cè)徑器測(cè)量，以檢測(cè)發(fā)育中腫瘤的大小。當(dāng)腫瘤大小在任何方向達(dá)到20mm時(shí)(大約5-7周)，處死小鼠并且通過肉眼目測(cè)、組織病理學(xué)和免疫組化檢測(cè)原發(fā)性腫瘤、引流淋巴結(jié)和肺。RT-PCR和PCR測(cè)定msp36蛋白表達(dá)的存在、msp36RNA轉(zhuǎn)錄物的存在和msp36-LV DNA的存在。制備另外的組織切片以通過免疫組化測(cè)定CD31，一種與新血管形成相關(guān)的蛋白標(biāo)記。
本文引用的全部文獻(xiàn)通過引用整體結(jié)合到本文中。
顯而易見的是，可對(duì)上文所述的本發(fā)明進(jìn)行各種修改而不偏離本發(fā)明的范圍和精神。
權(quán)利要求
1.一種表達(dá)多肽的方法，所述方法包括將DNA構(gòu)建物穩(wěn)定引入靶哺乳動(dòng)物細(xì)胞，所述DNA構(gòu)建物包含編碼msp36多肽或其功能變體的核苷酸序列，其中所述DNA構(gòu)建物包含在慢病毒基因傳遞載體中。
2.權(quán)利要求1的方法，其中通過將所述慢病毒基因傳遞載體注射到包含所述靶哺乳動(dòng)物細(xì)胞的靶組織或器官中，體內(nèi)將所述DNA構(gòu)建物引入所述靶哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。
3.權(quán)利要求1的方法，其中通過所述慢病毒基因傳遞載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)將所述DNA構(gòu)建物體外引入所述靶哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。
4.權(quán)利要求1、2或3的方法，其中所述靶哺乳動(dòng)物細(xì)胞是哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞。
5.權(quán)利要求1、2或3的方法，其中所述靶哺乳動(dòng)物細(xì)胞是前列腺上皮細(xì)胞。
6.權(quán)利要求1、2或3的方法，其中所述靶哺乳動(dòng)物細(xì)胞是卵巢上皮細(xì)胞。
7.權(quán)利要求1、2或3的方法，其中所述靶哺乳動(dòng)物細(xì)胞是肺上皮細(xì)胞。
8.權(quán)利要求1、2或3的方法，其中所述DNA構(gòu)建物進(jìn)一步包含與編碼msp36多肽或其功能變體的所述核苷酸序列有效連接的啟動(dòng)子，并且體內(nèi)或體外在所述靶哺乳動(dòng)物細(xì)胞中是有效的。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述啟動(dòng)子是乳腺特異性啟動(dòng)子。
10.權(quán)利要求8的方法，其中所述啟動(dòng)子是前列腺特異性啟動(dòng)子。
11.權(quán)利要求8的方法，其中所述啟動(dòng)子是卵巢腺特異性啟動(dòng)子。
12.權(quán)利要求8的方法，其中所述啟動(dòng)子是肺特異性啟動(dòng)子。
13.權(quán)利要求8的方法，其中所述啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子。
14.權(quán)利要求8的方法，其中所述啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
15.權(quán)利要求8的方法，其中所述DNA構(gòu)建物進(jìn)一步包含自殺基因。
16.一種抑制哺乳動(dòng)物中腫瘤生長(zhǎng)的方法，其中所述腫瘤在病原學(xué)上與msp36基因或多肽缺陷相關(guān)，所述方法包括直接給予含有所述腫瘤的靶組織或器官中的細(xì)胞慢病毒載體，所述慢病毒載體包含與啟動(dòng)子有效連接的編碼msp36多肽的核酸序列，其中所述核酸序列的表達(dá)導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)。
17.權(quán)利要求16的方法，其中通過將所述載體注射在所述腫瘤部位或其附近來給予所述靶組織或器官所述載體。
18.權(quán)利要求16的方法，其中所述腫瘤生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)是增強(qiáng)腫瘤的凋亡。
19.權(quán)利要求16的方法，其中所述腫瘤生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)是降低腫瘤細(xì)胞的MMP9合成和/或分泌。
20.權(quán)利要求16的方法，其中所述腫瘤生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)是在所述腫瘤部位或其附近減少血管生成。
21.權(quán)利要求16的方法，其中所述腫瘤生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)是降低腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)速度。
22.權(quán)利要求16的方法，其中所述腫瘤生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)是降低腫瘤細(xì)胞侵襲潛力。
23.權(quán)利要求16的方法，所述方法進(jìn)一步包括選自手術(shù)介入、放射治療、激素治療、免疫療法、化學(xué)療法或冷凍療法的其它治療。
24.一種具有穩(wěn)定整合的慢病毒DNA構(gòu)建物的靶哺乳動(dòng)物細(xì)胞，所述DNA構(gòu)建物包含編碼msp36多肽或其功能變體的核苷酸序列，所述核酸序列與在所述靶哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有活性的啟動(dòng)子有效連接。
25.權(quán)利要求24的轉(zhuǎn)化靶哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所述啟動(dòng)子是乳腺特異性的。
26.權(quán)利要求24的轉(zhuǎn)化靶哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所述啟動(dòng)子是前列腺特異性的。
27.權(quán)利要求24的轉(zhuǎn)化靶哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所述啟動(dòng)子是卵巢特異性的。
28.權(quán)利要求24的轉(zhuǎn)化靶哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所述啟動(dòng)子是肺特異性的。
29.權(quán)利要求24的轉(zhuǎn)化靶哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所述啟動(dòng)子為組成型。
30.權(quán)利要求24的轉(zhuǎn)化靶哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所述啟動(dòng)子為誘導(dǎo)型。
31.權(quán)利要求24的轉(zhuǎn)化靶哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所述細(xì)胞來自小鼠。
32.權(quán)利要求24的轉(zhuǎn)化靶哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所述細(xì)胞來自大鼠。
33.權(quán)利要求24的轉(zhuǎn)化靶哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所述細(xì)胞來自人。
34.一種上皮細(xì)胞，所述上皮細(xì)胞表達(dá)通過慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)引入其中的正常msp36基因。
35.一種用于體內(nèi)或體外治療靶細(xì)胞中msp36基因缺陷的重組慢病毒載體，所述載體包含與啟動(dòng)子有效連接的正常msp36基因，所述啟動(dòng)子在所述靶細(xì)胞中有效。
36.權(quán)利要求35的重組載體，所述載體具有復(fù)制缺陷。
37.權(quán)利要求35的重組載體，其中所述靶細(xì)胞是乳房上皮細(xì)胞。
38.權(quán)利要求35的重組載體，其中所述靶細(xì)胞是前列腺上皮細(xì)胞。
39.權(quán)利要求35的重組載體，其中所述靶細(xì)胞是卵巢上皮細(xì)胞。
40.權(quán)利要求35的重組載體，其中所述靶細(xì)胞是肺上皮細(xì)胞。
41.一種藥物組合物，所述組合物包含權(quán)利要求35的載體和藥物可接受載體。
全文摘要
慢病毒載體有利地用于傳遞表達(dá)的MSP36基因，用于治療癌癥。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1921892SQ200480037000
公開日2007年2月28日 申請(qǐng)日期2004年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月17日
發(fā)明者P·托曼 申請(qǐng)人:艾克蒂斯生物公司