本發(fā)明涉及一種重組病毒及其構建方法，特別涉及一種能夠表達ALV-J囊膜蛋白的ALV-A重組病毒，還涉及該重組病毒的構建方法。本發(fā)明屬于生物技術領域。

背景技術：

禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)能夠引起的禽的多種腫瘤性疾病。ALV分為A-J共10個亞群。目前，在我國流行的主要為A、B、J亞群，其中，ALV-J對我國養(yǎng)禽業(yè)的危害更為嚴重。因而，對于ALV-J致病機制等的研究尤為重要。反轉錄病毒感染宿主細胞需要病毒表面囊膜蛋白與其特定的細胞受體的相互作用。病毒囊膜蛋白的不同決定了病毒的宿主范圍。病毒受體介導病毒進入宿主細胞，是病毒感染過程的第一步。因而，禽白血病病毒受體的相關研究是解析禽白血病病毒感染機制的重要基礎，建立合理的檢測病毒進入的方法，對于研究反轉錄病毒與其受體的相互作用有很大幫助。

Ⅰ型Na+/H+交換蛋白(chNHE1)是ALV-J的受體(Ning,C.and B.Paul,Na+/H+exchanger type 1is a receptor for pathogenic subgroup J avian leukosis virus.Proceedings of the National Academy of Sciences,2006.103(14):p.5531-6.Dana,K.,et al.,Nonconserved tryptophan 38of the cell surface receptor for subgroup J avian leukosis virus discriminates sensitive from resistant avian species.Journal of Virology,2013.87(15):p.8399-8407.)。ALV-J的囊膜蛋白(envelop,env)通過與宿主細胞表面的受體chNHE1結合，引起跨膜區(qū)(TM)構象改變，介導病毒與細胞膜融合，從而使病毒核酸進入胞內(Barnard,R.J.O.,D.Elleder,.,and J.A.T.Young,Avian sarcoma and leukosis virus-receptor interactions:from classical genetics to novel insights into virus-cell membrane fusion.Virology,2006.344(1):p.25-29.)。受體介導病毒進入，對于病毒的感染有重要影響，因而對于受體與病毒相互作用的研究尤為重要。

作為逆轉錄病毒的一員，傳統(tǒng)的ALV-J病毒復制能力差，病毒滴度較低，其感染早期病毒載量低，不利于其實驗室研究。相對于ALV-J，ALV-A的病毒滴度相對較高，可彌補ALV-J病毒滴度不高的缺陷。ALV-A感染性克隆(pRAV-1)由本實驗室所構建，其轉染細胞后所拯救的病毒具有較高的復制能力，但只能用于ALV-A病毒的相關研究。為了解決傳統(tǒng)ALV-J株復制能力差，病毒滴度低等問題，本發(fā)明以本實驗室保存的ALV-A感染性克隆為骨架，將囊膜蛋白基因替換為ALV-J的囊膜蛋白基因，為了進一步提高病毒檢測敏感性，在其囊膜蛋白基因后引入海參熒光素酶(luciferase)報告基因，構建帶有l(wèi)uciferase報告基因的囊膜蛋白為ALV-J囊膜蛋白的重組ALV-A病毒。經(jīng)驗證，該重組病毒侵染宿主細胞后，能夠表達ALV-J的囊膜蛋白和luciferase報告基因，具有較高的敏感性和較強的復制能力，易于早期微量病毒檢測及定量，而且能夠利用ALV-J特異性受體chNHE1感染非允許細胞系。本發(fā)明所構建的重組病毒，與傳統(tǒng)的ALV-J株相比，具有復制能力強，病毒滴度高等優(yōu)點，有利于探討ALV-J致病機制等相關研究工作的開展，為病毒與其受體之間相互作用的研究以及抗ALV-J抗體檢測奠定了基礎。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一是提供一種能夠表達ALV-J囊膜蛋白的重組A亞群禽白血病病毒感染性克??；

本發(fā)明的目的之二是提供由上述感染性克隆所拯救得到的重組病毒。

為了達到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術手段：

本發(fā)明的一種能夠表達ALV-J囊膜蛋白的重組A亞群禽白血病病毒感染性克隆，其是以ALV-A感染性克隆為骨架，將其囊膜蛋白替換為ALV-J的囊膜蛋白，并在囊膜蛋白3’端攜帶luciferase報告基因的重組A亞群禽白血病病毒感染性克隆，其中所述的ALV-A感染性克隆的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的感染性克隆是通過以下方法構建得到的：

(1)將SEQ ID NO.2所示的ALV-A感染性克隆用KpnⅠ/StuⅠ進行雙酶切，膠回收大片段，作為載體骨架片段；

(2)以ALV-J毒株pHPRS103為模板，使用引物PF1/PR1進行PCR擴增，得到包含部分pol基因及整個env基因的片段，將該PCR產(chǎn)物通過ClonExpress^TM II One Step Cloning Kit同源重組于步驟(1)所得到的載體骨架之中，即構建得到表達ALV-J的囊膜蛋白的質粒命名為pALV-A(J)，其中，ALV-J毒株pHPRS103的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

PF1引物TGATAAGGTTATTTGGGTACCTTCTCGGAAAGT

PR1引物GCTGCCCACAGGCCTCTACAGCTGCTCCCTAATTC

(3)用EagⅠ和SalⅠ對pALV-A(J)質粒進行雙酶切，膠回收大片段；以ALV-A(J)質粒為模板，以PF2/PR2引物對擴增得到片段1；

PF2引物GCAGAATAGTATAAGCGGCCGCTACATGGGTGGTGGTA

PR2引物TTTTTGGCGTCTTCCATGGTGGTCGGCTGCAC

(4)以pGL3Luciferase報告質粒為模板，以PF3/PR3引物對擴增luciferase報告基因，并在其3’端引入SalⅠ酶切位點；

PF3引物ATGGAAGACGCCAAAAACATAAA

PR3引物CAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGCTTTACACGGCGATCTT

(5)將擴增得到luciferase報告基因片段與片段1通過重疊延伸PCR融合，與步驟(3)酶切后的大片段連接，得到攜帶luciferase報告基因的重組A亞群禽白血病病毒感染性克隆。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的一種能夠表達ALV-J囊膜蛋白的重組A亞群禽白血病病毒感染性克隆，命名為pALV-A(J)-luciferase，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

進一步的，本發(fā)明還提供了以上任一項所述的病毒感染性克隆在拯救表達ALV-J囊膜蛋白和luciferase的重組A亞群禽白血病病毒中的應用。

一種拯救表達ALV-J囊膜蛋白和luciferase的重組A亞群禽白血病病毒的方法，其包括以下步驟：將以上構建的病毒感染性克隆轉染于形成80％單層的DF-1細胞中，6h后棄掉上清，用無血清的DMEM清洗兩遍后，加入含10％胎牛血清的DMEM，置于37℃，5％CO₂條件下培養(yǎng)，轉染72h后，收獲細胞，即得。

在本發(fā)明所述的方法中，優(yōu)選的，還包括將收獲的細胞凍存至-80℃冰箱中，凍融兩次后在DF-1細胞上進行連續(xù)傳代，以獲得表達ALV-J囊膜蛋白和luciferase的重組A亞群禽白血病病毒的傳代毒。

更進一步的，本發(fā)明還提出了按照以上所述的制備得到的表達ALV-J囊膜蛋白和luciferase的重組A亞群禽白血病病毒。以及

所述的表達ALV-J囊膜蛋白和luciferase的重組A亞群禽白血病病毒在研究ALV-J致病機制以及檢測抗ALV-J抗體中的用途。

綜上，本發(fā)明以ALV-A感染性克隆為骨架，構建了囊膜蛋白替換為ALV-J的囊膜蛋白，并攜帶luciferase報告基因的重組病毒感染性克隆，并成功拯救出ALV-A(J)-luciferase重組病毒。經(jīng)驗證，該重組病毒具有較高的復制能力，病毒滴度達到10^5.21TCID50/ml，是ALV-J原型毒株HPRS103的125倍，且能夠與ALV-J特異性的細胞受體相互作用，由于攜帶有l(wèi)uciferase報告基因，病毒檢測比傳統(tǒng)ELISA方法更加簡便和敏感，易于定量。該重組病毒侵染表達chNHE1的293T細胞，最早在感染后8h即可檢測到病毒，具有較高的敏感性。

由本發(fā)明構建的病毒感染性克隆拯救得到的pALV-A(J)-luciferase病毒，具有病毒滴度高，復制能力強，檢測敏感性高的優(yōu)點，能夠有效地檢測病毒早期感染過程，對于病毒與其受體的相關研究以及抗ALV-J抗體檢測有重要作用。

附圖說明

圖1為pALV-A(J)-luciferase重組病毒構建策略示意圖；

圖2為pALV-A(J)-luciferase質粒酶切鑒定；

1為EagⅠ單酶切的結果；2為SalⅠ單酶切的結果；3為EagⅠ/SalⅠ雙酶切的結果；

圖3為重組病毒的Western Blot驗證；

圖4為重組病毒活性鑒定(A)及其與ALV-J病毒滴度比較(B)；

圖5為重組病毒對ALV-J受體chNHE1的識別。

具體實施方式

下面結合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內。

本實施例所涉及的主要材料及其來源：

ALV-J毒株pHPRS103(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)及含有ALV-A毒株感染性克隆的載體pRAV-1(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)及pGL3Luciferase報告質粒為本實驗室保存；DF-1細胞及pCAGGS-chNHE1質粒由本實驗室保存；Polyjet轉染試劑購自SignaGen Laboratories公司；Luciferase Assay System購自Promega公司；ClonExpress^TM II One Step Cloning Kit購自Vazyme公司；PCR純化試劑盒，膠回收試劑盒購自AXYGEN；感受態(tài)DH5α細胞購自天根生化科技有限公司；質粒提取試劑盒購自QIAGEN；RT-PCR試劑盒及DNA Marker購自TaKaRa公司；蛋白Marker及Pierce IP裂解緩沖液均購自Thermo scientific公司；限制性內切酶及T4DNA連接酶購自NEB公司；ALV-J gp85單克隆抗體(MAb)4A3由本實驗室制備(Li,X.,et al.,Identification of a novel B-cell epitope specific for avian leukosis virus subgroup J gp85protein.Archives of Virology,2015.160(4):p.995-1004.)；山羊抗小鼠IRDye800CW紅外標記的IgG購自LI-COR Bioscience公司。

實施例1表達ALV-J囊膜蛋白和luciferase的重組ALV-A病毒感染性克隆ALV-A(J)-luciferase的構建

1、ALV-A(J)-luciferase重組質粒的構建:

將含有ALV-A毒株感染性克隆的pRAV-1載體(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)經(jīng)KpnⅠ/StuⅠ進行雙酶切，膠回收大小約為11 000bp的載體骨架片段。以pHPRS103(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)為模板，按表1中的引物PF1/PR1，PCR擴增大小約1 700bp的目的片段(包含部分pol基因及整個env基因片段)。將該PCR產(chǎn)物通過ClonExpress^TM II One Step Cloning Kit同源重組于載體骨架之中，構建得到表達ALV-J的囊膜蛋白的質粒命名為pALV-A(J)。隨后，用EagⅠ和SalⅠ對pALV-A(J)質粒進行雙酶切，膠回收大小約為11 000bp的條帶。以pALV-A(J)質粒為模板，以PF2/PR2引物對擴增EagⅠ位點至其下游約200bp的片段1；以pGL3Luciferase報告質粒為模板，以PF3/PR3引物對擴增luciferase報告基因，并在其3’端引入SalⅠ酶切位點。膠回收后通過重疊延伸PCR將片段1和luciferase報告基因融合成為能夠與載體骨架兩端重合的Luciferase片段。將Luciferase片段連接至骨架載體后得到攜帶luciferase報告基因表達ALV-J囊膜蛋白的重組ALV-A病毒的感染性克隆，重組病毒構建策略示意圖如圖1所示。

表1.本實施例所用引物

2、ALV-A(J)-luciferase重組質粒的鑒定:

將構建得到的攜帶luciferase報告基因表達ALV-J囊膜蛋白的重組ALV-A病毒的感染性克隆經(jīng)SalⅠ單酶切，EagⅠ&SalⅠ雙酶切，進行重組質粒的鑒定。鑒定結果表明，用EagⅠ和SalⅠ分別單酶切后可獲得長度為13 211bp的片段，用EagⅠ和SalⅠ雙酶切后可獲得長度為11 334bp和1 877bp的兩條片段，大小正確，結果如圖2所示。酶切正確的質粒經(jīng)測序后，序列正確，表明重組質粒構建正確。將測序正確的質粒命名為pALV-A(J)-luciferase，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

實施例2表達ALV-J囊膜蛋白和luciferase的重組A亞群禽白血病病毒的拯救

1、方法

1.1重組病毒的拯救

將實施例1構建的病毒感染性克隆pALV-A(J)-luciferase進行純化，利用Polyjet轉染試劑按照使用手冊轉染于形成80％單層的DF-1細胞中，6h后棄掉上清，用無血清的DMEM清洗兩遍后，加入含10％胎牛血清的DMEM，置于37℃，5％CO₂條件下培養(yǎng)。轉染后72h，收取細胞，凍存至-80℃冰箱中，凍融兩次后在DF-1細胞上連續(xù)傳代。

1.2拯救病毒的western blot鑒定

取所拯救的傳代兩次的ALV-A(J)-luciferase病毒，進行SDS-PAGE電泳，轉印至硝酸纖維素膜，以5％脫脂乳封閉，以抗ALV-J的4A3MAb(1:200)為一抗，山羊抗小鼠IRDye800CW紅外標記的IgG為二抗，通過近紅外熒光掃描成像系統(tǒng)進行重組病毒的western blot。

1.3熒光素酶試驗檢測病毒感染能力

將拯救的ALV-A(J)-luciferase病毒接種于形成80％單層的DF-1細胞中，4h后棄掉上清，用無血清的DMEM清洗兩遍后，加入含10％胎牛血清的DMEM，然后在37℃，5％CO₂條件下繼續(xù)培養(yǎng)24h后，收集感染細胞，4 000r/min離心2min，棄上清。用50μL PBS懸浮細胞后，轉移至白色96孔檢測板的孔中，加入50μLLuciferase Assay反應液，混勻后室溫反應10min后，使用儀器檢測熒光強度。同時以DF-1空白細胞作為陰性對照。

1.4重組病毒TCID₅₀測定

將拯救的重組病毒按10^-1～10^-7進行10倍比稀釋，每個稀釋度做3次重復，分別接種于形成80％單層的DF-1細胞上，進行效價檢測。同時設未接毒對照孔。7d后，將細胞收至-80℃冰箱中，反復凍融兩次后，采用ELISA方法檢測ALV的p27蛋白，按Reed-Muech氏法計算TCID₅₀。同時，進行ALV-J株HPRS103TCID₅₀的檢測，以作對照。

1.5重組病毒對ALV-J受體chNHE1的識別

使用Polyjet試劑轉染ALV-J受體chNHE1真核表達質粒至形成80％密度的293T細胞中，轉染后24h進行ALV-A(J)-luciferase病毒感染，分別于感染后8h、16h和24h收取細胞，按照Luciferase Assay System的操作說明書檢測熒光強度，進行統(tǒng)計分析。同時設293T未轉染組接毒對照。

1.6重組病毒在檢測抗ALV-J中和抗體中的應用

利用pALV-A(J)-luciferase重組病毒的感染可以通過直接檢測luciferase熒光強度來定量的優(yōu)勢，本發(fā)明應用拯救的pALV-A(J)-luciferase重組病毒進行中和抗體檢測試驗。使用了臨床采集血清92份、動物實驗的ALV-J血清58份和SPF雞陰性血清15份以及抗ALV-A，ALV-B，REV和MDV血清各3份。所有的血清在使用pALV-A(J)-luciferase重組病毒檢測中和抗體的同時，也使用HPRS-103來進行傳統(tǒng)病毒微量中和試驗作為對照。具體操作步驟參考(Fadly,A.M.Leukosis and sarcoma.In:A laboratory manual for the isolation and identification of avian pathogens,3rd ed.S.B.Hitchner,C.H.Domermuth,H.G.Purchase,andJ.E.Williams,eds.American Associationo f AvianP athologists,K ennettS quare,Pa.pp.54-58.1989.)進行。在luciferase重組病毒試驗中，熒光檢測值低于1000(表明病毒陰性)即可判定血清中ALV-J中和抗體為陽性。傳統(tǒng)病毒微量中和試驗中，禽白血病病毒群特異性抗原ELISA檢測陰性即可判定血清中ALV-J中和抗體為陽性。

2.結果

2.1重組病毒的拯救與鑒定

將拯救的pALV-A(J)-luciferase重組病毒處理后，進行SDS-PAGE凝膠電泳及western Blot。所用的一抗為本實驗室所制備的特異性針對ALV-J的單克隆抗體4A3。重組病毒的Western Blot結果如圖3所示，結果證明，所拯救的pALV-A(J)-luciferase重組病毒能很好的表達ALV-J囊膜蛋白。

2.2重組病毒滴度測定

用所獲取的pALV-A(J)-luciferase病毒感染易感細胞DF-1，24h后檢測熒光強度。重組病毒活性鑒定(A)及其與ALV-J病毒滴度比較(B)如圖4所示，結果發(fā)現(xiàn)，感染組熒光強度約為空白細胞的1000倍，表明所拯救的重組病毒具有高效的感染能力。將病毒進行10倍比稀釋后，感染DF-1細胞。7天后收毒，用ELISA方法檢測ALV。按Reed-Muech氏法計算結果表明，所拯救的重組病毒滴度為10^5.21TCID₅₀/mL。同時測得ALV-J HPRS103毒株的TCID₅₀為10^3.11TCID50/ml。

2.3重組病毒對ALV-J受體chNHE1的識別

為了驗證所拯救的pALV-A(J)-luciferase重組病毒具有正常ALV-J病毒結合病毒受體的能力，利用拯救的pALV-A(J)-luciferase重組病毒感染表達chNHE1的293T細胞。分別于接毒后8h、16h和24h收獲細胞，檢測熒光強度。重組病毒對ALV-J受體chNHE1的識別結果如圖5所示。結果發(fā)現(xiàn)，轉染chNHE1受體組接毒后的熒光強度是未轉染組的3-10倍。證明所拯救的pALV-A(J)-luciferase重組病毒能夠有效侵染表達chNHE1的293T細胞。

2.4pALV-A(J)-luciferase重組病毒在檢測抗ALV-J中和抗體中的應用

pALV-A(J)-luciferase重組病毒和傳統(tǒng)病毒微量中和試驗檢測ALV-A、ALV-B、REV和MDV血清以及15份SPF雞血清均為陰性，特異性好。對92份臨床血清檢測結果表明，pALV-A(J)-luciferase重組病毒組中和抗體陽性28份，傳統(tǒng)病毒微量中和試驗組陽性為24份。對58份ALV-J感染動物實驗血清檢測結果表明，pALV-A(J)-luciferase重組病毒組中和抗體陽性28份，傳統(tǒng)病毒微量中和試驗組陽性為26份。兩種方法的符合率為96％(見表2)。臨床血清和動物實驗血清檢測結果表明，利用pALV-A(J)-luciferase重組病毒進行的中和試驗方法敏感性高于傳統(tǒng)方法。

表2pALV-A(J)-luciferase重組病毒和傳統(tǒng)病毒微量中和試驗檢測結果