專利名稱：一種wssv囊膜蛋白原核表達(dá)包涵體的變復(fù)性方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物學(xué)領(lǐng)域白斑綜合癥病毒(White spot syndrome virus, WSSV)蛋白體外原核表達(dá)實踐中的一種技術(shù)革新，具體涉及一種WSSV囊膜蛋白原核表達(dá)包涵體的變復(fù)性方法，其能有效提升包涵體的復(fù)性效率達(dá)95%以上并獲得可溶性蛋白。
背景技術(shù)：
白斑綜合癥病毒已在全球范圍內(nèi)成為蝦類中最普遍的、分布最廣、最致命的病毒。但目前然沒有可用來控制該病毒發(fā)生和傳播的辦法。給世界對蝦養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的損失。因此，弄清其致病機理，成為有效防治的基礎(chǔ)。目前，研究結(jié)果一致認(rèn)為，囊膜蛋白在對蝦白斑綜合癥病毒與宿主的相互作用中扮演著重要的角色。但其致病機理尚不明了，因此，WSSV囊膜蛋白也成為國內(nèi)外科技工作者的研究熱點。大多數(shù)研究工作的前提均是通過構(gòu)建WSSV囊膜蛋白的體外重組原核表達(dá)體系獲取可溶性的體外表達(dá)蛋白。然而，在進行WSSV囊膜蛋白的體外重組原核表達(dá)時經(jīng)常獲得的表達(dá)產(chǎn)物為不溶的、無活性的固體顆粒，即包涵體。若想獲得可溶性蛋白，通常的做法是對包涵體進行變復(fù)性。包涵體的復(fù)性是一個復(fù)雜的過程，復(fù)性成功與否很大程度上和蛋白本身的性質(zhì)有關(guān)。有些蛋白在寬松的條件下復(fù)性效率可以達(dá)到95%以上，而有一些蛋白至今還沒有發(fā)現(xiàn)對其進行復(fù)性的有效方法，一般來說，蛋白質(zhì)的復(fù)性效率在20%左右。目前已知的很多包涵體變復(fù)性方法應(yīng)用于WSSV囊膜蛋白原核表達(dá)的包涵體變復(fù)性時均存在各方面的缺點，例如復(fù)性效率低或無法獲得可溶性蛋白等等。因此一種有效的WSSV蛋白原核表達(dá)包涵體的變復(fù)性方法是進行大規(guī)模WSSV囊膜蛋白體外原核表達(dá)研究所迫切需要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種WSSV囊膜蛋白原核表達(dá)包涵體的變復(fù)性方法。該方法能使WSSV蛋白原核表達(dá)形成的包涵體的復(fù)性效率達(dá)到95%以上，最終獲得可溶性蛋白。本發(fā)明的基本原理是(1)在包涵體中加入變復(fù)性添加劑并劇烈攪動，使沉淀緩慢溶解；(2)低溫離心丟棄剩余的沉淀；(3)通過透析法逐漸降低外透液濃度來控制變性劑去除速度，最終通過濃縮得到可溶性的蛋白。本發(fā)明所述WSSV囊膜蛋白原核表達(dá)包涵體的變復(fù)性方法包括變復(fù)性添加劑劑量、沉淀溶解、緩沖液劑量、透析復(fù)性的過程。作為處理對象的WSSV囊膜蛋白原核表達(dá)包涵體在此前通過超聲破碎細(xì)胞、低溫離心獲得。本發(fā)明所述WSSV囊膜蛋白原核表達(dá)包涵體的變復(fù)性方法，具體的步驟如下I)向WSSV囊膜蛋白原核表達(dá)包涵體中加入含8M尿素的IOmM Tris-HCl, pH8. 0，劇烈攪動，25°C下用磁力攪拌器不斷攪拌3-4小時，使沉淀緩慢溶解；2) 4°C, 12000rpm 離心 12min,棄沉淀；3)在所得上清液中加入pH8. O的磷酸鹽緩沖液，以pH8. O的磷酸鹽緩沖液透析20-22小時，然后用PEG-20000濃縮得可溶性蛋白。
對于冷凍保藏的包涵體，在采用本發(fā)明方法前要進行預(yù)處理，即用IOmM TriS-HCl(pH8. O)溶液重懸超聲離心得到的沉淀(沉淀即為超聲破碎細(xì)胞、低溫離心獲得的包涵體)，12000rpm,離心 IOmin,棄上清。預(yù)處理中，重懸液的用量優(yōu)選20_30ml。步驟I)中變復(fù)性劑量優(yōu)選8ml含8M尿素的IOmM Tris-HCl。步驟3)中緩沖液的劑量優(yōu)選15-20ml pH8. O的磷酸鹽緩沖液(PBS) (PBS可使尿素的濃度降低以利于復(fù)性)以PH8. O的PBS緩沖液透析20-22小時(期間換6_8次透析液)，然后用PEG-20000濃縮到約1ml。取30 μ I樣品加入7. 5 μ I的5 X LSB上樣緩沖液，100 V沸水處理5-lOmin，12000rpm離心IOmin后取5 μ I上清上樣，SDS-PAGE檢測復(fù)性情況。
本發(fā)明的有益效果是通過WSSV蛋白原核表達(dá)包涵體的變復(fù)性方法革新，對各研究所或?qū)嶒炇疫M行WSSV蛋白原核表達(dá)時產(chǎn)生的包涵體進行變復(fù)性從而獲得可溶性的體外表達(dá)蛋白具有指導(dǎo)作用。


圖I. SDS-PAGE分析VP32蛋白包涵體變復(fù)性(泳道1，2 VP32 ;泳道M :Marker)。
具體實施例方式實施例一本發(fā)明實施例一提供一種WSSV囊膜蛋白VP32原核表達(dá)形成的包涵體的變復(fù)性方法，下面進行詳細(xì)說明VP466基因原核表達(dá)蛋白的包涵體的獲得屬于現(xiàn)有技術(shù)，可通過基因合成方法合成VP466基因，經(jīng)過酶切、酶切產(chǎn)物的亞克隆、轉(zhuǎn)化、單克隆測序驗證、轉(zhuǎn)化、小量表達(dá)、大量表達(dá)、表達(dá)產(chǎn)物純化獲得包涵體。本實施例中提供一個包涵體制備過程，但不是對本發(fā)明的限制。 VP32蛋白的原核表達(dá)過程1.VP32基因序列(AY897235. I)采用基因合成的方法(由上海生工生物公司合成)，直接進行PGEX-4T-1質(zhì)粒(上海吳江近岸蛋白質(zhì)科技有限公司)轉(zhuǎn)化(N端帶GST標(biāo)簽)。2.酶切在滅菌的Eppendorf管中，準(zhǔn)備雙酶切反應(yīng)體系。1)￥ 32基因酶切反應(yīng)體系(4(^1，371，311)
權(quán)利要求
1.一種WSSV囊膜蛋白原核表達(dá)包涵體的變復(fù)性方法，其特征是包括以下步驟 1)向WSSV囊膜蛋白原核表達(dá)包涵體中加入8M尿素的10mM Tris-HCl，pH8. 0，劇烈攪動，25°C下用磁力攪拌器不斷攪拌3-4小時，使沉淀緩慢溶解； 2)4°C, 12000 rpm 離心 12 min,棄沉淀； 3)在所得上清液中加入pH8.O的磷酸鹽緩沖液，以pH8. O的磷酸鹽緩沖液透析20-22小時，然后用PEG-20000濃縮得可溶性蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種WSSV囊膜蛋白原核表達(dá)包涵體的變復(fù)性方法，其特征是透析期間換6-8次透析液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種WSSV囊膜蛋白原核表達(dá)包涵體的變復(fù)性方法。其內(nèi)容包括1)向WSSV囊膜蛋白原核表達(dá)包涵體中加入8M尿素的10mMTris-HCl，pH8.0，劇烈攪動，25℃下用磁力攪拌器不斷攪拌3-4小時，使沉淀緩慢溶解；2)4℃，12000rpm離心12min，棄沉淀；3)在所得上清液中加入pH8.0的磷酸鹽緩沖液，以pH8.0的磷酸鹽緩沖液透析20-22小時，然后用PEG-20000濃縮得可溶性蛋白。利用本發(fā)明，WSSV囊膜蛋白原核表達(dá)包涵體的復(fù)性效率均達(dá)到了95%以上，獲得了可溶性蛋白。
文檔編號C07K1/14GK102924580SQ20121046842
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月19日
發(fā)明者李鵬, 嚴(yán)潔, 馬曉燕, 周開亞 申請人:南京師范大學(xué)