專利名稱：一種利用原核表達(dá)系統(tǒng)高效制備蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用原核表達(dá)系統(tǒng)高效制備蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的方法，可應(yīng)用 于生物工程和生物技術(shù)研究等領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)研究是生命科學(xué)中重要組成部分，其中蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)可作為蛋白質(zhì) 定性甚至定量研究的重要的工具，可用于蛋白質(zhì)電泳，蛋白質(zhì)定量及蛋白免疫印記等實(shí) 驗(yàn)，目前，蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)來源較窄，眾多的蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)多是已知的天然蛋 白，分離純化復(fù)雜，分子量數(shù)值相差大，且由于天然蛋白質(zhì)修飾的復(fù)雜性，經(jīng)常出現(xiàn)不 同來源的同一蛋白電泳遷移率的差異，出現(xiàn)指示不明確的問題。同時(shí)這些標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋 白在western雜交中常常使用預(yù)染的方式，染料與蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)合牢固度以及結(jié) 合量的差異影響到電泳的遷移率及指示效果，同時(shí)價(jià)格昂貴。隨著蛋白質(zhì)異源重組表達(dá) 技術(shù)的成熟，為了使重組蛋白質(zhì)的純化更為便利，越來越多的重組表達(dá)蛋白末端攜帶有 利于親和純化的標(biāo)簽如his-teg等，這些蛋白的電泳檢測(cè)常常依賴于SDS-PAGE和western 雜交技術(shù)，在分析過程中使用的蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)往往存在上述諸多問題，同時(shí)蛋白分子 量標(biāo)準(zhǔn)不能在目標(biāo)蛋白檢測(cè)過程中同步被顯示，造成操作過程繁雜等實(shí)際問題，因此開 發(fā)與目標(biāo)蛋白同步顯示的蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)具有重要的價(jià)值。
本發(fā)明提供了高效生產(chǎn)攜帶特定標(biāo)簽蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)系列的技術(shù)，標(biāo)簽賦予 標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白易于檢測(cè)指示的特征。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用原核表達(dá)系 統(tǒng)高效制備蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的方法。
本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
一種利用原核表達(dá)系統(tǒng)制備蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的方法，包括以下步驟
(1)選擇常用低分子量標(biāo)準(zhǔn)為起始蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)A，中間蛋白分子量按 A+15，A+30, A+45, A+60, A+75,終點(diǎn)蛋白按A+105分子量標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定；
(2)選擇在大腸桿菌系統(tǒng)中無或少量稀有密碼子的基因序列為模板設(shè)計(jì)引物依 次獲取不同目的片段，通過Expasy tools在線軟件分析獲取截短基因的序列，目的序列與 pET28a載體連接后編碼區(qū)的分子量為(1)中所設(shè)定分子量，最適等電點(diǎn)在4_9之間；
(3)將目的片段按照一定的酶切位點(diǎn)分別插入表達(dá)載體pET^Sa，篩選的陽性克 隆分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21Star(DE3)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；
(4)將構(gòu)建好的分別表達(dá)多個(gè)分子量的工程菌分別進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)劑終濃度 的優(yōu)化；
(5)對(duì)不同蛋白進(jìn)行表達(dá)形式的鑒定；
(6)根據(jù)目標(biāo)蛋白的表達(dá)形式的不同分別用親和層析純化及包涵體純化等方法純化目的蛋白，即為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；
所述的利用原核表達(dá)系統(tǒng)制備蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的方法，步驟(1)設(shè)定的蛋白 質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)從起始蛋白按15或30千道爾頓梯度遞增，間隔均勻，其中低分子量間遞增 的梯度為15kD，高分子量間遞增的梯度為30kD。
所述的利用原核表達(dá)系統(tǒng)制備蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的方法，步驟( 通過分別設(shè) 計(jì)引物并PCR擴(kuò)增的方法得到目的基因片段；同時(shí)利用載體的ATG，最終表達(dá)的蛋白N 端帶有his標(biāo)簽。
所述的原核表達(dá)系統(tǒng)制備蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的方法，步驟C3)還包括將步驟(2) 獲取的不同的目的基因按照一定的酶切位點(diǎn)插入表達(dá)載體pET48a+后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌 BL21 (DE3)-star,得到一系列表達(dá)蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的工程菌。
所述的原核表達(dá)系統(tǒng)制備蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的方法，步驟(4)還包括將所述 的一系列表達(dá)蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的工程菌分別接種于含50μ g/ml卡納霉素的LB液體 培養(yǎng)基中，220rpm/min，37°C培養(yǎng)過夜，次日按1 50比例擴(kuò)大培養(yǎng)勸后加入異丙 基-3"0-半乳糖苷到終濃度為1.011111101九，分別于誘導(dǎo)池，5h，7h，9h及Ilh后取同體 積樣、12000rmp/min，離心4min，沉淀菌體；用1*SDS_PAGE上樣緩沖液重懸，沸水煮 5-10min離心取上清于SDS-PAGE分析，確定最優(yōu)誘導(dǎo)時(shí)間。
所述的原核表達(dá)系統(tǒng)制備蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的方法，步驟(4)還包括將的一系 列表達(dá)蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的工程菌分別接種于含50 μ g/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中 220rpm/min, 37°C培養(yǎng)過夜，次日按1 50比例擴(kuò)大培養(yǎng)勸后加入異丙基-β-D-半 乳糖苷到終濃度分別為0.2，0.5，0.8，l.lmmol/L,同時(shí)于誘導(dǎo)證后取同體積樣、 12000rmp/min,離心4min，沉淀菌體；用1*SDS_PAGE上樣緩沖液重懸，沸水煮 5-10min離心取上清于SDS-PAGE分析，確定最適誘導(dǎo)劑終濃度。
所述的原核表達(dá)系統(tǒng)制備蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的方法，步驟( 將所述的最優(yōu)誘 導(dǎo)時(shí)間及最適誘導(dǎo)劑終濃度，應(yīng)用于工程菌的最優(yōu)誘導(dǎo)，收集菌體沉淀用磷酸緩沖液和TritonX-IOO重懸，冰浴，超聲破菌lOmin，高速冷凍離心并分別收集上清和沉淀，小 量進(jìn)行SDS-PAGE分析，鑒定蛋白的表達(dá)形式。
所述的原核表達(dá)系統(tǒng)制備蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的方法，步驟(6)將所述得到的鑒 定為可溶形式的蛋白上清結(jié)合鎳柱，先用PBS洗滌雜蛋白，再用濃度為含150mmOl/L咪 唑的PBS洗脫并收集目的蛋白；鑒定為包涵體形式的蛋白其沉淀先用NaCl溶液洗滌兩 次，接著用磷酸緩沖液PBS和1 % TritonX-IOO重懸超聲破菌2min，再用包涵體洗滌液洗 滌兩次，然后用包涵體洗滌液超聲破菌2min，最后用包涵體洗滌液洗滌三次，得到目的 蛋白，即為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)。
所述的原核表達(dá)系統(tǒng)制備蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的方法，利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的 重組蛋白標(biāo)簽包括His-teg、GST teg、MBP teg、Strep tag以及金黃色葡萄球菌蛋白A的抗體結(jié)合區(qū)，對(duì)應(yīng)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)可與帶同種標(biāo)簽的待檢測(cè)蛋白同時(shí)在檢測(cè)過 程顯示，即可指示待檢測(cè)蛋白的分子量及含量。
本發(fā)明選取了于大腸桿菌系統(tǒng)中無或少量稀有密碼子的基因序列為模板設(shè)計(jì)引 物獲取目的片段與pET-28a(+)片段連接轉(zhuǎn)入大腸桿菌系統(tǒng)，表達(dá)過程中克服了因稀有密 碼子多從而造成表達(dá)中斷或表達(dá)量少的缺點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的快速而高效的表達(dá)，同時(shí)表達(dá)中利用載體的ATG，使每個(gè)蛋白的N端都帶有6*his，研制出了即可指示 蛋白聚丙烯酰胺電泳，標(biāo)示目的蛋白分子量，又可指示其他同標(biāo)簽蛋白的蛋白質(zhì)分子量 標(biāo)準(zhǔn)，為蛋白質(zhì)研究提供了一個(gè)重要試劑。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明利用原核表達(dá)系統(tǒng)生長繁殖快，操作簡單，價(jià)格低 廉、外源基因表達(dá)產(chǎn)物的水平高及融合表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)，人為設(shè)定常用蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)， 利用原核表達(dá)系統(tǒng)高效制備間隔均勻、有特殊標(biāo)簽的蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，形成的標(biāo)準(zhǔn)分 子量蛋白具有便于檢測(cè)指示的顯著特征。


圖1是目的基因PCR擴(kuò)增圖2是重組質(zhì)粒雙酶切圖3目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)圖4是目的蛋白純化后檢測(cè)his標(biāo)簽圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明，所述實(shí)驗(yàn)例旨在以舉 例方式具體闡明本發(fā)明。標(biāo)簽的選擇、模板基因，試劑，溫度，和其他變量的值及載體 和宿主的選擇只是舉例說明本發(fā)明的應(yīng)用，而不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制，以下說明不用于 限制本發(fā)明的范圍。
1分子量標(biāo)準(zhǔn)的選定
根據(jù)應(yīng)用廣泛性的原則，選擇15kD為起始蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，中斷蛋白依次 為30kD，45kD, 60kD, 75kD, 90kD,及終點(diǎn)蛋白120kD，低分子量間遞增的梯度為 15kD,高分子量間遞增的梯度為30kD。
2引物的設(shè)計(jì)
根據(jù)大麥CesA全長基因和大腸桿菌IacZ和DNAligase基因序列為模板，應(yīng)用軟 件primer 5設(shè)計(jì)引物，且在上下游引物的5 ‘端引入酶切位點(diǎn)，確保最后總編碼序列的表 達(dá)產(chǎn)物是以上設(shè)計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)分子量
權(quán)利要求
1.一種利用原核表達(dá)系統(tǒng)制備蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的方法，其特征在于包括以下步驟(1)選擇常用低分子量標(biāo)準(zhǔn)為起始蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)A，中間蛋白分子量按A+15， A+30，A+45, A+60, A+75,終點(diǎn)蛋白按A+105分子量標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定；(2)選擇稀有密碼子含量低或者無稀有密碼子的基因序列為模板，通過Expasytools 軟件分析截短基因編碼蛋白質(zhì)的序列特征，并設(shè)計(jì)引物依次獲取不同的目的片段，使目 的序列與pET28a載體連接后編碼區(qū)的分子量為(1)中所設(shè)定分子量，最適等電點(diǎn)在4-9 之間；(3)將目的片段按照一定的酶切位點(diǎn)分別插入表達(dá)載體pET28a，篩選的陽性克隆分 別轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21—Star(DE3)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；(4)將構(gòu)建好的分別表達(dá)多個(gè)分子量的工程菌分別進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)劑終濃度的優(yōu) 化，并對(duì)不同蛋白進(jìn)行表達(dá)形式的鑒定；(5)根據(jù)目標(biāo)蛋白的表達(dá)形式的不同分別用親和層析純化及包涵體純化等方法純化目 的蛋白，即為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用原核表達(dá)系統(tǒng)制備蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的方法，其特征在 于，步驟(1)設(shè)定的蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)從起始蛋白按15或30千道爾頓梯度遞增，間隔均 勻，其中低分子量間遞增的梯度為5-15kD，高分子量間遞增的梯度為30kD。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用原核表達(dá)系統(tǒng)制備蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的方法，其特征在 于，步驟(2)通過分別設(shè)計(jì)引物并PCR擴(kuò)增的方法得到目的基因片段；同時(shí)利用載體的 ATG,最終表達(dá)的蛋白N端帶有his標(biāo)簽。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的原核表達(dá)系統(tǒng)制備蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的方法，其特征在 于，步驟(3)還包括將步驟(2)獲取的不同的目的基因按照一定的酶切位點(diǎn)插入表達(dá)載體 pET-28a(+)后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)-star，得到一系列表達(dá)蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的工 程菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的原核表達(dá)系統(tǒng)制備蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的方法，其特征在于， 步驟(4)還包括將所述的一系列表達(dá)蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的工程菌分別接種于含50ug/ml卡 納霉素的LB液體培養(yǎng)基中，220rpm/min，37°C培養(yǎng)過夜，次日按1 50比例擴(kuò)大培養(yǎng) 3h后加入異丙基-0"0-半乳糖苷到終濃度為1.011111101/1^，分別于誘導(dǎo)3h，5h，7h，9h及 Ilh后取同體積樣、12000rmp/min，離心4min，沉淀菌體；用1*SDS_PAGE上樣緩沖液 重懸，沸水煮5-lOmin離心取上清于SDS-PAGE分析，確定最優(yōu)誘導(dǎo)時(shí)間。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的原核表達(dá)系統(tǒng)制備蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的方法，其特征在于， 步驟⑷還包括將的一系列表達(dá)蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的工程菌分別接種于含50ug/ml卡那霉 素的LB液體培養(yǎng)基中220rpm/min，37°C培養(yǎng)過夜，次日按1 50比例擴(kuò)大培養(yǎng)3h后加 入異丙基-β-D-半乳糖苷到終濃度分別為0.2，0.5，0.8，l.lmmol/L,同時(shí)于誘導(dǎo)5h后 取同體積樣、12000rmp/min，離心4min，沉淀菌體；用1*SDS_PAGE上樣緩沖液重懸， 沸水煮5-lOmin離心取上清于SDS-PAGE分析，確定最適誘導(dǎo)劑終濃度。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的原核表達(dá)系統(tǒng)制備蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的方法，其特征在 于，步驟(5)將所述的最優(yōu)誘導(dǎo)時(shí)間及最適誘導(dǎo)劑終濃度，應(yīng)用于工程菌的最優(yōu)誘導(dǎo)， 收集菌體沉淀用磷酸緩沖液和TritonX-IOO重懸，冰浴，超聲破菌lOmin，高速冷凍離心并分別收集上清和沉淀，小量進(jìn)行SDS-PAGE分析，鑒定蛋白的表達(dá)形式。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的原核表達(dá)系統(tǒng)制備蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的方法，其特征在于， 步驟(6)將所述得到的鑒定為可溶形式的蛋白上清結(jié)合鈷柱Talon resin，先用PBS洗滌雜 蛋白，再用含150mmOl/L咪唑的PBS洗脫并收集目的蛋白；鑒定為包涵體形式的蛋白其 沉淀先用NaCl溶液洗滌兩次，接著用磷酸緩沖液PBS和1 % TritonX-IOO重懸超聲破菌 2min,再用包涵體洗滌液洗滌兩次，然后用包涵體洗滌液超聲破菌2min，最后用包涵體 洗滌液洗滌三次，得到目的蛋白，即為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的原核表達(dá)系統(tǒng)制備蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的方法，其特征在于， 原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組蛋白標(biāo)簽包括His-tag、GST tag、MBP tag、Strep tag以及金黃 色葡萄球菌蛋白A的抗體結(jié)合區(qū)，對(duì)應(yīng)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)可與帶同種標(biāo)簽的待檢 測(cè)蛋白同時(shí)在western雜交檢測(cè)過程顯示，既可指示待檢測(cè)蛋白的分子量及含量，同時(shí)也 可以檢測(cè)雜交程序是否正確。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用原核表達(dá)系統(tǒng)高效制備蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的方法，包括以下步驟(1)選擇常用低分子量標(biāo)準(zhǔn)為起始蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)A；(2)選擇稀有密碼子含量低或者無稀有密碼子的基因序列為模板，并設(shè)計(jì)引物依次獲取不同的目的片段，使目的序列與pET28a載體連接后編碼區(qū)的分子量為(1)中所設(shè)定分子量，最適等電點(diǎn)在4-9之間；(3)將目的片段按照一定的酶切位點(diǎn)分別插入表達(dá)載體pET28a-(+)，篩選的陽性克隆分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21_star(DE3)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；(4)對(duì)不同蛋白進(jìn)行表達(dá)形式的鑒定；(5)分別用親和層析純化及包涵體純化等方法純化目的蛋白，即為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)。
文檔編號(hào)C12P21/02GK102021195SQ20101051735
公開日2011年4月20日 申請(qǐng)日期2010年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月25日
發(fā)明者李新宇, 李玉紅, 陳鵬 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)