專利名稱：GFP－TNF－α融合蛋白原核表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建及產(chǎn)物和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種自動(dòng)發(fā)光蛋白基因表達(dá)載體的構(gòu)建極其表達(dá)產(chǎn)物和該表達(dá)產(chǎn)物在生物活性因子免疫性檢測(cè)，特別是在檢測(cè)腫瘤壞死因子(TNF)受體含量、分布，和檢測(cè)體液、細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α水平及可溶性TNF受體(sTNFR)含量中的應(yīng)用。
人體內(nèi)許多生物活性因子(包括部分外源性病原)都是通過(guò)與靶細(xì)胞受體結(jié)合，進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的，以調(diào)節(jié)機(jī)體的各種生理功能。因此，檢測(cè)這些因子與相應(yīng)受體的親和力，和這些受體在組織器官的分布，以及其在病理情況下的改變，對(duì)了解生理功能和病理變化機(jī)制都具有十分重要的意義。長(zhǎng)期以來(lái)，人們使用同位素標(biāo)記配體，來(lái)檢測(cè)受體的量，做配體與受體親和力檢測(cè)，一直沿用至今。盡管同位素法敏感，但同位素對(duì)喚境污染和對(duì)人體的損害，迫使人們尋找非同位素標(biāo)記物(如地高新，生物素等)取代，但多用于檢測(cè)可溶性因子，而對(duì)于配體一受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)，由于受定量較難等各種因素的限制，仍保留原檢測(cè)方法。
綠色熒光蛋白(GFP)源自海洋生物水母，能夠發(fā)射最大波長(zhǎng)為509nm，最大吸收波長(zhǎng)為395nm，并在475nm還有一個(gè)肩峰。GFP具有下列優(yōu)點(diǎn)分子量小，無(wú)細(xì)胞毒性，不干擾標(biāo)記蛋白的功能和定位，是目前唯一能在異源細(xì)胞內(nèi)表達(dá)并自發(fā)產(chǎn)生熒光的蛋白，無(wú)需輔助因子的參與，可進(jìn)行活體檢測(cè)。由于上述原因，GFP被認(rèn)為是一種理想的報(bào)道基因，是研究細(xì)胞基因表達(dá)和表達(dá)產(chǎn)物分布的最好工具。目前，含GFP真核表達(dá)載體已經(jīng)商品化。
腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是一個(gè)具有廣泛生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子，其參與免疫調(diào)節(jié)，炎癥反應(yīng)，抗腫瘤，組織修復(fù)等生理和病理過(guò)程。大量TNF-α的產(chǎn)生，可引起內(nèi)毒素樣休克，發(fā)熱，多器官功能衰竭等，慢性可引起惡液質(zhì)。TNF-α發(fā)揮其功能需要首先與TNF受體結(jié)合，在內(nèi)毒素性休克和一些炎癥疾病時(shí)，TNF-α及其可溶性受體明顯增高，并與某些疾病的預(yù)后有明顯關(guān)系。
本發(fā)明的目的是構(gòu)建綠色熒光蛋白(GFP)基因與人分泌型腫瘤壞死因子-α(TNF-α)基因融合體，使該融合體在大腸桿菌中表達(dá)的融合蛋白質(zhì)既有TNF-α的抗原，又能發(fā)射易于檢測(cè)的綠色熒光。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種利用本發(fā)明重組載體表達(dá)的既有TNF-α的抗原，又能發(fā)射易于檢測(cè)的綠色熒光的融合蛋白，替代同位素檢測(cè)法，檢測(cè)腫瘤壞死因子(TNF)受體含量、分布，和用于檢測(cè)體液、細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α水平及可溶性TNF受體(sTNFR)含量，使其具有特異性強(qiáng)，靈敏度高，重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)便快速，利于環(huán)保，有利人體健康，成本低，費(fèi)用少，有利于減輕患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)等特點(diǎn)。
本發(fā)明提供的用于腫瘤壞死因子及其受體檢測(cè)的發(fā)光蛋白基因表達(dá)重組載體，是在原核表達(dá)載體pRSET中插入含有綠色熒光蛋白(GFP)基因與人分泌型腫瘤壞死因子-α(TNF-α)基因融合體而構(gòu)建成的重組的pRSET-GFP-TNF表達(dá)質(zhì)粒。它的構(gòu)建方法是①用EcorR I和Hind III雙酶消化含GFP基因的質(zhì)粒(pS95A)，回收約700bpGFP cDNA片段；用與上述相同的雙酶消化原核表達(dá)載體pRSET，并將GFP cDNA片段插入該載體中，構(gòu)成pRSET-GFP重組體；②用BamH I和hind III雙酶消化含TNF基因的pBSK-17KDTNF質(zhì)粒，回收約近500bpTNF cDNA片段，插入用相同酶切的pRSET-GFP質(zhì)粒，構(gòu)建成pRSET-GFP-TNF重組體。該重組載體所含有的綠色熒光蛋白(GFP)基因與人分泌型腫瘤壞死因于-α(TNF-α)基因融合體含有如下堿基序列ATG AGC ACT GAA AGC ATG ATC CGG GAC GTG GAG CTG GCC GAG GAG GCGCTC CCC AAG AAG ACA GGG GGG CCC CAG GGC TCC AGG CGG TGC TTG TTC CTCAGC CTC TTC TCC TTC CTG ATC GTG GCA GGC GCC ACC ACG CTC TTC TGC CTGCTG CAC TTT GGA GTG ATC GGC CCC CAG AGG GAA GAG TTC CCC AGG GAC CTCTCT CTA ATC AGC CCT CTG GCC CAG GCA GTC AGA TCA TCT TCT CGA ACC CCGAGT GAC AAG CCT GTA GCC CAT GTT GTA GCA AAC CCT CAA GCT GAG GGG CAGCTC CAG TGG CTG AAC CGC CGG GCC AAT GCC CTC CTG GCC AAT GGC GTG GAGCTG AGA GAT AAC CAG CTG GTG GTG CCA TCA GAG GGC CTG TAC CTC ATC TACTCC CAG GTC CTC TTC AAG GGC CAA GGC TGC CCC TCC ACC CAT GTG CTC CTCACC CAC ACC ATC AGC CGC ATC GCC GTC TCC TAC CAG ACC AAG GTC AAC CTCCTC TCT GCC ATC AAG AGC CCC TGC CAG AGG GAG ACC CCA GAG GGG GCTGAG GCC AAG CCC TGG TAT GAG CCC ATC TAT CTG GGA GGG GTC TTC CAG CTGGAG AAG GGT GAC CGA CTC AGC GCT GAG ATC AAT CGG CCC GAC TAT CTC GACTTT GCC GAG TCT GGG CAG GTC TAC TTT GGG ATC ATT GCC CTG AGT AAA GGAGAA GAA CTT TTC ACT GGA GTT GTC CCA ATT CTT GTT GAA TTA GAT GGT GATGTT AAT GGG CAC AAA TTT TCT GTC AGT GGA GAG GGT GAA GGT GAT GCA ACATAC GGA AAA CTT ACC CTT AAA TTT ATT TGC ACT ACT GGA AAA CTA CCT GTTCCA TGG CCA ACA CTT GTC ACT ACT TTC ACT TAT GCT GTT CAA TGC TTT TCAAGA TAC CCA GAT CAT ATG AAA CAG CAT GAC TTT TTC AAG AGT GCC ATG CCCGAA GGT TAT GTA CAG GAA AAA ACT ATA TTT TTC AAA GAT GAC GGG AAC TACAAG ACA CGT GCT GAA GTC AAG TTT GAA GGT GAT ACC CTT GTT AAT AGA ATCGAG TTA AAA GGT ATT GAT TTT AAA GAA GAT GGA AAC ATT CTT GGA CAC AAATTG GAA TAC AAC TAT AAC TCA CAC AAT GTA TAC ATC ATG GCA GAC AAA CAAAAG AAT GGA ATC AAA GTT AAC TTC AAA ATT AGA CAC AAC ATT GAA GATGGA AGC GTT CAA CTA GCA GAC CAT TAT CAA CAA AAT ACT CCA ATT GGC GATGGC CCT GTC CTT TTA CCA GAC AAC CAT TAC CTG TCC ACA CAA TCT GCC CTTTCG AAA GAT CCC AAC GAA AAG AGA GAC CAC ATG GTC CTT CTT GAG TTT GTAACA GCT GCT GGG ATT ACA CAT GGC ATG GAT GAA CTA TAC AAA TAA本發(fā)明提供的用于腫瘤壞死因子及其受體免疫性檢測(cè)的發(fā)光蛋白，是由上述重組載體在大腸桿菌中表達(dá)的，具有發(fā)射可觀察的綠色熒光和腫瘤壞死因子抗原的GFP-TNF融合蛋白，該蛋白具有由前述的DNA序列所編碼的氨基酸序列。本發(fā)明提供的GFP-TNF-α融合蛋白，可用于①替代同位素，通過(guò)TNF-α與TNF受體結(jié)合試驗(yàn)，檢測(cè)TNF受體的含量；②檢測(cè)TNF受體在組織、細(xì)胞 的分布；③檢測(cè)體液、細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α水平；④檢測(cè)體液、細(xì)胞培養(yǎng)上清中可溶性TNF受體(sTNFR)的含量；其實(shí)用意義在于有利于對(duì)疾病的診斷和對(duì)病情的監(jiān)控。
本發(fā)明產(chǎn)物及方法的優(yōu)點(diǎn)在于因直接與配體融合表達(dá)，故其特異性強(qiáng)；因GFP可直接發(fā)光，不需再加任何輔助因子，所以操作簡(jiǎn)便，且靈敏度高，重復(fù)性好；由于其有效替代了傳統(tǒng)的同位素檢測(cè)法，故有利于環(huán)保，對(duì)人體無(wú)損害；由于采用大腸桿菌生產(chǎn)本發(fā)明融合蛋白，其生產(chǎn)成本低廉，可減輕患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。


圖1為GFP-TNF原核表達(dá)載體構(gòu)建流程圖；圖2為實(shí)施例2中GFP-TNF含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖3為實(shí)施例2中L929細(xì)胞TNF受體與GFP-TNF結(jié)合飽和曲線。
以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
實(shí)施例1本實(shí)施例用以說(shuō)明GFP-TNF-α重組體構(gòu)建過(guò)程和原核細(xì)胞表達(dá)；①用EcorR I和Hind III雙酶消化含GFP基因的質(zhì)粒(pS95A)，回收約700bpGFP cDNA片段；用與上述相同的雙酶消化原核表達(dá)載體pRSET，并將GFP cDNA片段插入該載體中，構(gòu)成pRSET-GFP重組體；②用BamH I和hind III雙酶消化含TNF基因的pBSK-17KDTNF質(zhì)粒，回收約近500bpTNF cDNA片段，插入用相同酶切的pRSET-GFP質(zhì)粒，構(gòu)建成pRSET-GFP-TNF重組體；③將pRSET-GFP-TNF重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL-12，在IPTG誘導(dǎo)下，讓大腸桿菌表達(dá)GFP-TNF融合蛋白，將菌體裂解離心，取上清過(guò)Ni-NTA層析柱，純化蛋白，用SDS-PAGE檢測(cè)蛋、白，在52KD處可見(jiàn)GFP-TNF融合蛋白。
④用TNF生物活性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)GFP-TNF有相近的胞毒活性，而且該胞毒作用可被抗TNF抗體特異性阻斷。將GFP-TNF與靶細(xì)胞孵育，熒光顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞表面有環(huán)狀綠色熒光，如加未標(biāo)記TNF，可競(jìng)爭(zhēng)性抑制熒光在細(xì)胞表面著色。
實(shí)施例2至5用以進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的具體應(yīng)用。
實(shí)施例2TNF-α與TNF受體結(jié)合試驗(yàn)一、原理GFP-TNF可與細(xì)胞表面TNF受體特異結(jié)合，在受體量一定的情況下，隨GFP-TNF含量的增加，與TNF受體結(jié)合量也增加。當(dāng)達(dá)到一定量時(shí)，受體配體結(jié)合可達(dá)飽和。測(cè)定飽和狀態(tài)下，一定量細(xì)胞產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線熒光測(cè)定結(jié)果，即可求得與TNF受體結(jié)合的GFP-TNF含量，即相當(dāng)于受體的含量。
二、操作步驟1.標(biāo)準(zhǔn)曲線制備GFP-TNF用量(3.92fmol/μl)0μl，0.1μl，0.5μl，1.0μl，5.0μl，10μl，50μl，100μl，用0.01M PBS調(diào)體積到1000μl，熒光測(cè)定。
2.細(xì)胞TNF受體含量測(cè)定取1×106細(xì)胞，加入以下5個(gè)濃度的GFP-TNF作飽和分析，非特異結(jié)合組同時(shí)加入300倍TNF標(biāo)準(zhǔn)品。各樣品作復(fù)孔。在37℃搖床培養(yǎng)2h后，放4℃，10min終止反應(yīng)，收集細(xì)胞，離心去上清，并用PBS洗細(xì)胞一次，以去除游離的GFP-TNF。加1mlPBS混懸細(xì)胞，用熒光分光光度計(jì)，在波長(zhǎng)480nm/509nm測(cè)定吸光度。特異結(jié)合等于總結(jié)合減去非特異結(jié)合。
三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1.標(biāo)準(zhǔn)曲線GFP-TNF用量(3.92fmol/μl)0μl，0.1μl，0.5μl，1.0μl，5.0μl，10μl，50μl，100μl測(cè)定結(jié)果(OD)0.02，0.18，0.43，1.5，6.4，8.5，58，116回歸方程Y＝-0.32061461+1.162034315X，r＝0.999618(見(jiàn)圖2)2.飽和曲線以細(xì)胞與GFP-TNF結(jié)合量(fmol/1×106細(xì)胞)為Y軸，不同濃度GFP-TNF為X軸(fmol)作圖(見(jiàn)圖3)。
X(fmol)3.92，19.6，39.2，78.4，196測(cè)定結(jié)果(OD)0.01，0.02，0.17，0.25，0.27Y(fmol/1×106細(xì)胞)1.011，1.148，1.654，1.925，1.991由圖3可見(jiàn)，最后兩個(gè)點(diǎn)之間雖然GFP-TNF含量增加1.5倍，但其OD值不變，提示配體與受體結(jié)合已達(dá)飽和狀態(tài)。
3.單點(diǎn)分析受體分子數(shù)當(dāng)受體基本達(dá)到飽和狀態(tài)時(shí)，由標(biāo)準(zhǔn)曲線得知，此時(shí)GFP-TNF用量為78.4fmol。
受體總數(shù)(RT)＝1.925fmol/1×106細(xì)胞＝1158受體分子數(shù)/細(xì)胞實(shí)施例3原位TNF受體檢測(cè)一、原理一定量GFP-TNF融合蛋白與組織切片孵育，其可與細(xì)胞表面TNF受體特異結(jié)合。由于GFP可發(fā)出綠色熒光，在熒光顯微鏡下可檢測(cè)細(xì)胞熒光著色。由此可觀察TNF受體存在于何種組織或細(xì)胞，并在不同情況下進(jìn)行定性比較。
二、操作步驟切片或細(xì)胞涂片加20ul(78.4fmol)的GFP-TNF，陰性對(duì)照組同時(shí)加入100倍的TNF標(biāo)準(zhǔn)品，于37℃反應(yīng)1h。用PBS沖洗熒光顯微鏡觀察結(jié)果。
三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果Raji細(xì)胞陰性對(duì)照組無(wú)熒光蛋白結(jié)合，而實(shí)驗(yàn)組可見(jiàn)細(xì)胞表面呈環(huán)狀熒光發(fā)光，用100倍TNF標(biāo)準(zhǔn)品，可完全阻斷GFP-TNF與細(xì)胞表面受體的結(jié)合。
實(shí)施例4體液或細(xì)胞培養(yǎng)上清TNF-α水平檢測(cè)一、原理
GFP-TNF(標(biāo)記物)和標(biāo)準(zhǔn)品(非標(biāo)記TNF)或被測(cè)物對(duì)有限量的抗TNF抗體發(fā)生可逆性地特異性競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)，最終形成的熒光復(fù)合物含量與樣品中TNF含量呈負(fù)相關(guān)。
二、操作步驟1.抗體稀釋曲線的制作用1％BSA-0.01MPBS，倍比稀釋抗TNF單抗，取其效價(jià)為1∶50-1∶3200，調(diào)體積為100ul，再加100ul1％BSA-0.01MPBS，及GFP-TNF蛋白5ul*(熒光測(cè)定結(jié)果為6.4)震蕩混勻，37℃反應(yīng)2h。加入6％PEG-抗(抗鼠1g抗體)100ul。37℃反應(yīng)2h。2500rpm，15min，4℃離心。分離游離與結(jié)合的GFP-TNF，用熒光分光光度計(jì)測(cè)定總的熒光數(shù)值(T)及各管特異結(jié)合值(B)。橫坐標(biāo)為抗體稀釋度，縱坐標(biāo)為B/T，繪制抗體稀釋曲線，選用結(jié)合率(B/T)為30-50％時(shí)的抗體稀釋度為TNF抗原含量測(cè)定的最適抗體濃度，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品測(cè)定。
2.標(biāo)準(zhǔn)曲線制備及樣品測(cè)定TNF標(biāo)準(zhǔn)品(曲線范圍0.050～320ng/ml)及樣品每管100ul，做雙管，GFP-TNF5ul，及100ul一抗(按已選好的稀釋度)，其它程序同上。每批樣品測(cè)定均做標(biāo)準(zhǔn)曲線，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中TNF含量。
實(shí)施例5體液或細(xì)胞培養(yǎng)上清可溶性TNF受體(sTNFR)檢測(cè)一、原理GFP-TNF可與sTNFR特異結(jié)合，足量的GFP-TNF存在時(shí)，測(cè)定不同含量的TNFR標(biāo)準(zhǔn)品的熒光值，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，由待測(cè)樣品的熒光值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線便可得知其sTNFR的含量。
二、操作步驟sTNFR標(biāo)準(zhǔn)品(0.02-102.4ng/ml)和樣品，每管100ul，做雙管，GFP-TNF50ul，37℃反應(yīng)2h。再加入6％PEG8000，離心分離，測(cè)沉淀部分的熒光值。每批樣品測(cè)定均做標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定值由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中sTNFR的含量。
權(quán)利要求
1.在原核表達(dá)載體pRSET中插入含有綠色熒光蛋白(GFP)基因與人分泌型腫瘤壞死因子-α(TNF-α)基因構(gòu)建成的重組的pRSET-GFP-TNF表達(dá)質(zhì)粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組載體，其特征在于它的構(gòu)建方法是①用EcorR I和Hind III雙酶消化含GFP基因的質(zhì)粒(pS95A)，回收約700bpGFP cDNA片段；用與上述相同的雙酶消化原核表達(dá)載體pRSET，并將GFP cDNA片段插入該載體中，構(gòu)成pRSET-GFP重組體；②用BamH I和hind III雙酶消化含TNF基因的pBSK-17KDTNF質(zhì)粒，回收約近500bpTNF cDNA片段，插入用相同酶切的pRSET-GFP質(zhì)粒，構(gòu)建成pRSET-GFP-TNF重組體；
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組基因表達(dá)載體，其特征在于其所含有的綠色熒光蛋白(GFP)基因與人分泌型腫瘤壞死因子-α(TNF-α)基因融合體具有如下堿基序列ATG AGC ACT GAA AGC ATG ATC CGG GAC GTG GAG CTG GCC GAG GAG GCGCTC CCC AAG AAG ACA GGG GGG CCC CAG GGC TCC AGG CGG TGC TTG TTC CTCAGC CTC TTC TCC TTC CTG ATC GTG GCA GGC GCC ACC ACG CTC TTC TGC CTGCTG CAC TTT GGA GTG ATC GGC CCC CAG AGG GAA GAG TTC CCC AGG GAC CTCTCT CTA ATC AGC CCT CTG GCC CAG GCA GTC AGA TCA TCT TCT CGA ACC CCGAGT GAC AAG CCT GTA GCC CAT GTT GTA GCA AAC CCT CAA GCT GAG GGG CAGCTC CAG TGG CTG AAC CGC CGG GCC AAT GCC CTC CTG GCC AAT GGC GTG GAGCTG AGA GAT AAC CAG CTG GTG GTG CCA TCA GAG GGC CTG TAC CTC ATC TACTCC CAG GTC CTC TTC AAG GGC CAA GGC TGC CCC TCC ACC CAT GTG CTC CTCACC CAC ACC ATC AGC CGC ATC GCC GTC TCC TAC CAG ACC AAG GTC AAC CTCCTC TCT GCC ATG AAG AGC CCC TGC CAG AGG GAG ACC CCA GAG GGG GCTGAG GCC AAG CCC TGG TAT GAG CCC ATC TAT CTG GGA GGG GTC TTC CAG CTGGAG AAG GGT GAC CGA CTC AGC GCT GAG ATC AAT CGG CCC GAC TAT CTC GACTTT GCC GAG TCT GGG CAG GTC TAC TTT GGG ATC ATT GCC CTG AGT AAA GGAGAA GAA CTT TTC ACT GGA GTT GTC CCA ATT CTT GTT GAA TTA GAT GGT GATGTT AAT GGG CAC AAA TTT TCT GTC AGT GGA GAG GGT GAA GGT GAT GCA ACATAC GGA AAA CTT ACC CTT AAA TTT ATT TGC ACT ACT GGA AAA CTA CCT GTTCCA TGG CCA ACA CTT GTC ACT ACT TTC ACT TAT GCT GTT CAA TGC TTT TCAAGA TAC CCA GAT CAT ATG AAA CAG CAT GAC TTT TTC AAG AGT GCC ATG CCCGAA GGT TAT GTA CAG GAA AAA ACT ATA TTT TTC AAA GAT GAC GGG AAC TACAAG ACA CGT GCT GAA GTC AAG TTT GAA GGT GAT ACC CTT GTT AAT AGA ATCGAG TTA AAA GGT ATT GAT TTT AAA GAA GAT GGA AAC ATT CTT GGA CAC AAATTG GAA TAC AAC TAT AAC TCA CAC AAT GTA TAC ATC ATG GCA GAC AAA CAAAAG AAT GGA ATC AAA GTT AAC TTC AAA ATT AGA CAC AAC ATT GAA GATGGA AGC GTT CAA CTA GCA GAC CAT TAT CAA CAA AAT ACT CCA ATT GGC GATGGC CCT GTC CTT TTA CCA GAC AAC CAT TAC CTG TCC ACA CAA TCT GCC CTTTCG AAA GAT CCC AAC GAA AAG AGA GAC CAC ATG GTC CTT CTT GAG TTT GTAACA GCT GCT GGG ATT ACA CAT GGC ATG GAT GAA CTA TAC AAA TAA
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組載體在大腸桿菌中表達(dá)的具有發(fā)射可觀察的綠色熒光和腫瘤壞死因子生物活性的GFP-TNF融合蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組載體在大腸桿菌中表達(dá)的具有發(fā)射可觀察的綠色熒光和腫瘤壞死因子生物活性的GFP-TNF融合蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的融合蛋白，其特征在于它具有權(quán)利要求3所述的DNA序列所編碼的氨基酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的融合蛋白，其特征在于它具有權(quán)利要求3所述的DNA序列所編碼的氨基酸序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求4至7中任一項(xiàng)所述的融合蛋白，其特征在于它在腫瘤壞死因子(TNF)及其受體的免疫性檢測(cè)中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求4至7中任一項(xiàng)所述的融合蛋白，其特征在于它在檢測(cè)腫瘤壞死因子(TNF)的含量、體液及細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α水平或可溶性TNF受體(sTNFR)含量，或在檢測(cè)TNF受體在組織、細(xì)胞分布中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了在原核表達(dá)載體pRSET中插入含有綠色熒光蛋白(GFP)基因與人分泌型腫瘤壞死因子－α(TNF－α)基因融合體而構(gòu)建成的重組的pRSET－GFP－TNF表達(dá)質(zhì)粒,其在大腸桿菌中表達(dá)的融合蛋白質(zhì)既有TNF－α的抗原,又能發(fā)射易于檢測(cè)的綠色熒光,可用于替代同位素法檢測(cè)腫瘤壞死因子(TNF)及其受體,具有特異性強(qiáng),靈敏度高,重復(fù)性好,操作簡(jiǎn)便快速、成本低,利于環(huán)保和人體健康等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/70GK1272549SQ99116458
公開(kāi)日2000年11月8日 申請(qǐng)日期1999年5月4日 優(yōu)先權(quán)日1999年5月4日
發(fā)明者李卓婭, 石文芳, 孫義敏, 龔非力, 姜曉丹 申請(qǐng)人:同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)