一種可過(guò)量表達(dá)膜蛋白細(xì)菌及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種可過(guò)量表達(dá)膜蛋白細(xì)菌及其應(yīng)用，該菌株為埃希氏大腸桿菌，命名為Escherichia?coli1098-3，保藏號(hào)為CGMCC?No.8696，其16S?rRNA序列如SEQ?ID?NO：1所示。本發(fā)明對(duì)膜蛋白異常有極大耐受性，采用上述菌株，可過(guò)量表達(dá)膜蛋白，具有良好的應(yīng)用前景。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種可過(guò)量表達(dá)膜蛋白細(xì)菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物表面活性劑領(lǐng)域，特別涉及一種可過(guò)量表達(dá)膜蛋白細(xì)菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]本世紀(jì)60至70年代對(duì)大腸桿菌的研究使之成為自然界中最普遍為人們所認(rèn)識(shí)的生物體。大腸桿菌具有兩個(gè)顯著特征:操作簡(jiǎn)單和能在廉價(jià)的培養(yǎng)基中高密度培養(yǎng)，它的這些特征加上十多年外源基因表達(dá)的經(jīng)驗(yàn)使其在大多數(shù)科研應(yīng)用中成為高效表達(dá)異源蛋白最常用的原核表達(dá)系統(tǒng)。盡管大腸桿菌有眾多的優(yōu)點(diǎn)，但并非每一種基因都能在其中有效表達(dá)。
[0003]正常生理?xiàng)l件下膜蛋白的天然表達(dá)水平較低，對(duì)其異源大量表達(dá)成為功能和結(jié)構(gòu)研究的先決條件。結(jié)合膜蛋白純化和結(jié)晶的困難，膜蛋白的異源表達(dá)也因其疏水特性、細(xì)胞脫容量的有限性、對(duì)宿主細(xì)胞的毒性等問(wèn)題成為膜蛋白相關(guān)研究的瓶頸。尤其對(duì)于真核細(xì)胞膜蛋白的原核表達(dá)，宿主的不相容性往往會(huì)帶來(lái)更大的難題:截至2005年止，尚無(wú)一例以重組表達(dá)方式獲得結(jié)構(gòu)信息的膜蛋白的報(bào)道。而一個(gè)耐受膜蛋白的表達(dá)菌對(duì)于成功表達(dá)膜至關(guān)重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種可過(guò)量表達(dá)膜蛋白細(xì)菌，該菌株對(duì)膜蛋白異常有極大耐受性，采 用上述菌株，可過(guò)量表達(dá)膜蛋白，具有良好的應(yīng)用前景。
[0005]本發(fā)明的一種可過(guò)量表達(dá)膜蛋白細(xì)菌，該菌株為埃希氏大腸桿菌，命名為Escherichia colil098_3，保藏號(hào)為 CGMCC N0.8696，其 16S rRNA 序列如 SEQ ID NO:1 所示。于2014年I月26日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)。
[0006]本發(fā)明的一種可過(guò)量表達(dá)膜蛋白細(xì)菌的應(yīng)用，具體方法如下:利用超表達(dá)載體攜帶外源膜蛋白基因序列，通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化或熱激轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入菌株，菌株37°C培養(yǎng)OD6c?至
0.3-0.4，加IPTG至終濃度0.7mg/L，培養(yǎng)6_18h，收獲菌種。
[0007]所述電擊轉(zhuǎn)化的工藝條件為:0.2cm的電轉(zhuǎn)化池放入槽中，1_1.5kV，25uF，200歐；電擊后取出加入1ml SOB液體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)I小時(shí)；涂布于SD平板。
[0008]所述熱激轉(zhuǎn)化的工藝條件為:100L感受態(tài)細(xì)胞置于冰上，將細(xì)胞均勻懸浮；加入IOL連接好的質(zhì)粒，DNA濃度為10pg/L，混勻；冰上放置30分鐘；42°C水浴熱激55秒；冰上放置10分鐘；加100L LB培養(yǎng)液，370C 250轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)30分鐘；與此同時(shí)將LB平板置于37°C，放置片刻后加入4uL IPTG和40uL X-Gal均涂布于平板表面放置使之吸附滲透；將細(xì)菌涂布在含抗生素瓊脂平板上，平皿在37°C下正向放置I小時(shí)，待接種的液體吸收進(jìn)瓊脂后，將平皿倒置，培養(yǎng)過(guò)夜。
[0009]本發(fā)明描述一種從油污污染土壤中分離得到的細(xì)菌，膜厚度大，可耐受較大機(jī)械壓力，同時(shí)也能夠耐受膜蛋白毒性，可以對(duì)膜蛋白外源表達(dá)有較好耐性。根據(jù)BLAST聚類(lèi)分析及形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果(見(jiàn)圖1)，將該菌株定命名為Escherichia colil098_3。該菌經(jīng)檢測(cè)可顯著降低表面張力，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)發(fā)現(xiàn)菌株是前所未見(jiàn)或未有應(yīng)用的。
[0010]本發(fā)明提供的菌株Escherichia colil098_3的特征如下:
[0011]本發(fā)明該菌菌落圓形，凸起，表面光滑濕潤(rùn)，邊緣整齊，不透明；呼吸類(lèi)型為好氧呼吸，在有氧條件下生長(zhǎng)良好，革蘭氏染色呈陽(yáng)性，形態(tài)觀察菌體桿狀。測(cè)定菌株的16S rRNA部分序列，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析。
_2] 有益.效果
[0013]本發(fā)明對(duì)膜蛋白異常有極大耐受性，采用上述菌株，可過(guò)量表達(dá)膜蛋白，具有良好的應(yīng)用前景。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1為本發(fā)明菌株16S rRNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)；
[0015]圖2左圖為普通菌種過(guò)量表達(dá)膜蛋白細(xì)胞結(jié)構(gòu)，右圖為本發(fā)明菌株過(guò)量表達(dá)膜蛋白細(xì)胞結(jié)構(gòu)。
【具體實(shí)施方式】
[0016]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
[0017]實(shí)施例1
[0018]菌種來(lái)源:本菌種來(lái)源于油污污染土壤，具體分離方法如下:
[0019](I)富集:取油污地土壤Ig于富集培養(yǎng)基(牛肉膏0.5g、蛋白胨lg、氯化鈉
0.5g, ρΗ7.0~7.6)中，于28°C、120轉(zhuǎn)/min恒溫培養(yǎng)48h。再取其培養(yǎng)液2mL轉(zhuǎn)入另一富集培養(yǎng)基中，28°C，120轉(zhuǎn)/min進(jìn)一步富集培養(yǎng)48h。
[0020](2)初篩:取終富集液100 μ L油平板培養(yǎng)基(原油5g、氯化銨6g、硫酸鎂0.2g、氯化鈣0.0Olg磷酸二氫鉀4.lg、磷酸氫二鈉14g、EDTA0.0Olg、瓊脂20g、酵母粉0.5g、H201000ml、pH7.4)，初步篩選出透明圈較大的單菌落。
[0021](3)復(fù)篩:將初篩得到的菌種分別點(diǎn)接于磷酸消解蛋白培養(yǎng)基平板和羽毛粉平板培養(yǎng)基平板，于37°C下恒溫振蕩培養(yǎng)48h，培養(yǎng)液離心得上清測(cè)表面張力大小,最后獲得菌株1098-3，表面張力為34.3mN/m。
[0022]菌種鑒定:
[0023](I)菌落形態(tài)觀察:在LB平板上對(duì)菌株進(jìn)行劃線分離，24h后觀察單菌落形態(tài)并對(duì)細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色，觀察細(xì)胞形態(tài)。
[0024](2)菌體形態(tài)觀 察:將菌株制片，進(jìn)行革蘭式染色后，用帶拍攝裝置的光學(xué)顯微鏡觀察菌體的形狀、大小、及其特殊構(gòu)造，并拍攝菌體染色照片。
[0025](3)分子鑒定
[0026]①菌株DNA的提取方法[0027]A、取Iml細(xì)菌過(guò)夜培養(yǎng)液移至1.5mL的Eppendorf管中，5000rpm離心10分鐘,去
上清液；
[0028]B、立即加入600 μ L預(yù)熱的提取緩沖液，混勻后，65°C溫浴Ih ；
[0029]C、冰浴冷卻(5分鐘)，加入600 μ L酚/氯仿(1:1)溶液，顛倒混勻后，靜置lOmin，然后 12000rpm 離心 6min ；
[0030]D、上清轉(zhuǎn)移至另一個(gè)Eppendorf管中，加入等體積氯仿,靜置5min, 12000rpm離心5min ;E、取上清液，加入等體積異丙醇，沉淀DNA ；
[0031]F、用玻棒撈出DNA沉淀，70%乙醇漂洗后，吸干，溶解于500yLTE或重蒸水中，-20°C保存。如DNA沉淀無(wú)法撈出，可5000rpm離心，使DNA沉淀；
[0032]②16S rRNA的基因擴(kuò)增
[0033]A、PCR反應(yīng)引物為通用引物:
[0034]BSF8 (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和 BSRl541(AAGGAGGTGATCCAGCCGCA)
[0035]B、在冰上建立PCR反應(yīng)體系:
【權(quán)利要求】
1.一種可過(guò)量表達(dá)膜蛋白細(xì)菌，其特征在于:該菌株為埃希氏大腸桿菌，命名為Escherichia colil098_3，保藏號(hào)為 CGMCC N0.8696，其 16S rRNA 序列如 SEQ ID NO:1 所示。
2.一種如權(quán)利要求1所述的可過(guò)量表達(dá)膜蛋白細(xì)菌的應(yīng)用，其特征在于:具體方法如下:利用超表達(dá)載體攜帶外源膜蛋白基因序列，通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化或熱激轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入菌株，菌株37°C培養(yǎng)OD6tltl至0.3-0.4，加IPTG至終濃度0.7mg/L,培養(yǎng)6_18h，收獲菌種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種可過(guò)量表達(dá)膜蛋白細(xì)菌的應(yīng)用，其特征在于:所述電擊轉(zhuǎn)化的工藝條件為:0.2cm的電轉(zhuǎn)化池放入槽中，1-1.5kV，25uF，200歐；電擊后取出加入Iml SOB液體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)I小時(shí)；涂布于SD平板。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種可過(guò)量表達(dá)膜蛋白細(xì)菌的應(yīng)用，其特征在于:所述熱激轉(zhuǎn)化的工藝條件為:100L感受態(tài)細(xì)胞置于冰上，將細(xì)胞均勻懸浮；加入IOL連接好的質(zhì)粒，DNA濃度為10pg/L，混勻；冰上放置30分鐘；42°C水浴熱激55秒；冰上放置10分鐘；加100LLB培養(yǎng)液，370C 250轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)30分鐘；與此同時(shí)將LB平板置于37°C，放置片刻后加入4uL IPTG和40uL X-Gal均涂布于平板表面放置使之吸附滲透；將細(xì)菌涂布在含抗生素瓊脂平板上，平皿在37°C下正向放置 I小時(shí)，待接種的液體吸收進(jìn)瓊脂后，將平皿倒置，培養(yǎng)過(guò)夜。
【文檔編號(hào)】C12N1/21GK103992979SQ201410145843
【公開(kāi)日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2014年4月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月11日
【發(fā)明者】張中鴿, 曹張軍 申請(qǐng)人:東華大學(xué), 張中鴿