專利名稱：提取光合膜蛋白(光系統(tǒng)Ⅰ)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物分離工程與技術(shù)領(lǐng)域，具體是應(yīng)用超濾技術(shù)從類囊體中分離提取光合膜蛋白(光系統(tǒng)I)的方法，產(chǎn)品純度達84%以上。
背景技術(shù)：
光合膜蛋白(光系統(tǒng)I)是兩個具有光化學(xué)活性的生物復(fù)合體之一，主要參與光合作用中的電子轉(zhuǎn)移，從而實現(xiàn)光合作用將光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能。研究發(fā)現(xiàn)，光合膜蛋白(光系統(tǒng)I)的光電轉(zhuǎn)化效率高達95%，是人類研發(fā)新型生物太陽能電池的重要材料。然而基于光合蛋白復(fù)合體的新型光電器件距實際應(yīng)用還有很長的一段路要走。其中，如何大量制備高活性光合膜蛋白(光系統(tǒng)I)并長時間保持其穩(wěn)定性，對光系統(tǒng)I基光電器件的光電效率和壽命具有重要影響，是光系統(tǒng)I基太陽能電池開發(fā)的重要前提和保障。目前，從類囊體中分離光合膜蛋白(光系統(tǒng)I)的主要方法有蔗糖梯度離心法、層析法和等電聚焦法等。然而這些技術(shù)均存在一定的局限性，其中，蔗糖梯度離心法需要進行長時間的超速離心，容易引起蛋白質(zhì)的失活和變性；層析法和等電聚焦法，成本昂貴，且難于工業(yè)放大。膜分離法通常指利用天然或人工合成的薄膜，以外界能量或化學(xué)位差為推動力， 對雙組份或多組分的混合物進行分離、提純和富集的方法。膜分離技術(shù)是20世紀50年代發(fā)展起來的一項高效分離技術(shù)，與傳統(tǒng)的分離技術(shù)相比，具有分離效率高、能耗低、可連續(xù)操作、易于放大、無污染等優(yōu)點。超濾膜是指膜孔徑在I-IOOnm之間，具有不對稱結(jié)構(gòu)的復(fù)合膜。由于其孔徑尺寸與生物大分子的尺寸較為接近，故可用于生物大分子如蛋白質(zhì)等的分離與純化。超濾分離是分子級的，即可截留溶液中的大分子溶質(zhì)，同時使小分子溶質(zhì)透過；有時也可以通過調(diào)節(jié)溶液中微環(huán)境，使預(yù)分離的蛋白質(zhì)分子和膜表面帶有不同性質(zhì)的電荷，再通過蛋白質(zhì)分子之間、蛋白質(zhì)與膜表面之間的靜電作用，達到分離的目的。目前，在生物加工領(lǐng)域，超濾技術(shù)常用于蛋白質(zhì)的純化與濃縮，在工業(yè)上已有較多應(yīng)用，但由于自然體系中蛋白質(zhì)種類復(fù)雜， 且存在較多的同工酶，使用超濾法直接分離得到高純度的功能蛋白質(zhì)的實例極少，且這方面的研究仍處于實驗室規(guī)模。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種操作簡單，易于放大的光合膜蛋白(光系統(tǒng)I)超濾提取方法。本發(fā)明采取的技術(shù)路線是1.將含有葉綠素的藻類或高等植物葉子等，在IOO-SOOmM山梨醇Trich-HCl緩沖液(pH5-9)下勻漿；2.利用紗布對步驟1得到的勻漿液過濾，將濾液進行離心，離心條件為4°C，離心力大于1000g，離心時間大于10分鐘；
3.利用蒸餾水將步驟2得到的沉淀進行懸浮，并使葉綠素濃度在0. 2-1. Omg/mL ；4.向步驟3得到的葉綠素溶液中滴加表面活性劑，使表面活性劑濃度在0-5% (w/ ν)，將溶液在4°C下攪拌30分鐘以上，再離心，離心條件為4°C，離心力大于6000g，離心時間大于20分鐘；5.利用截留分子量為100-300kDa的超濾膜對步驟4得到的上清液進行超濾分離， 分離條件為表面活性劑濃度為0-5% (w/v)，溶液pH值6-10，離子強度0-1M。上述步驟均在4°C黑暗中進行。本發(fā)明直接應(yīng)用超濾分離技術(shù)從類囊體中提取獲得高純度的光合膜蛋白(光系統(tǒng)I)，由于超濾膜是指膜孔徑在Ι-lOOnm，具有不對稱結(jié)構(gòu)的復(fù)合膜。其孔徑尺寸與生物大分子的尺寸較為接近，故可用于生物大分子如蛋白質(zhì)等的分離與純化。本發(fā)明工藝僅涉及勻漿、增溶、離心和超濾四個簡單步驟，相對目前的實驗室提取工藝，具有操作簡單、分離濃縮同步進行、活性損失小、回收率高、能耗低、分離效率高、產(chǎn)品純度可調(diào)控、控制因素單一， 便于工業(yè)放大等特點。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例進一步描述本發(fā)明。實施例1，從菠菜中提取光合膜蛋白(光系統(tǒng)I)的方法，步驟取新鮮無斑的菠菜葉1kg，用蒸餾水洗凈，加入400mM山梨醇 +50mMTris-HCl (pH7. 8)緩沖溶液200mL，用組織搗碎機搗碎，勻漿，勻漿液用4層紗布過濾，濾液在4°C離心15min(離心力1400g)，取沉淀。用蒸餾水將沉淀懸浮，使葉綠素濃度至0. 8mg/mL,向溶液中滴加非離子型表面活性劑Triton X-100，至Triton X_100終濃度為 0.2% (w/v)，在4°C下攪拌30min，離心(4°C，6000g，20min)，取上清液(1.8L)，利用截留分子量為300kDa的平板式超濾膜(聚醚砜材質(zhì)，0. 09m2)進行分離，分離條件=TritonX-IOO濃度為0.2% (w/v)，溶液pH值8.0，NaCl濃度300mM，截留液即為光合膜蛋白(光系統(tǒng)I)溶液，純度為83%。實施例2，從鈍頂螺旋藻中提取光合膜蛋白(光系統(tǒng)I)的方法，步驟取基因改造的鈍頂螺旋藻^g，用蒸餾水洗凈，加入200mM山梨醇 +50mMTris-HCl (pH7. 0)緩沖溶液500mL，用組織搗碎機搗碎，勻漿，勻漿液用4層紗布過濾， 濾液在4°C離心15分鐘(離心力2500g)，取沉淀。用蒸餾水將沉淀懸浮，使葉綠素濃度至 0. 6mg/mL，向溶液中滴加非離子型表面活性劑Triton X-100，至Triton X_100終濃度為 0.3% (w/v)，在4°C下攪拌30min，離心(4°C，6000g，20min)，取上清液(3. 5L)，利用截留分子量為IOOkDa的平板式超濾膜(聚醚砜材質(zhì)，0. 09m2)進行分離，分離條件TritonX-100濃度為0.3% (w/v)，溶液pH值7.0，NaCl濃度200mM，截留液即為光合膜蛋白(光系統(tǒng)I)溶液，純度為86%。實施例3，從菠菜中提取光合膜蛋白(光系統(tǒng)I)的方法，步驟取新鮮無斑的菠菜葉1. 5kg,用蒸餾水洗凈，加入400mM山梨醇 +50mMTris-HCl (pH7. 8)緩沖溶液300mL，用組織搗碎機搗碎，勻漿，勻漿液用6層紗布過濾，濾液在4°C離心10min(離心力4000g)，取沉淀。用蒸餾水將沉淀懸浮，使葉綠素濃度至0. 8mg/mL,向溶液中滴加非離子型表面活性劑Triton X-100，至Triton X_100終濃度為0.2% (w/v)，在4°C下攪拌30min，離心(4°C，8000g，15min)，取上清液(2. 5L)，利用截留分子量為300kDa的平板式超濾膜(聚醚砜材質(zhì)，0. 09m2)進行分離，分離條件=TritonX-IOO濃度為0.2% (w/v)，溶液pH值7.8，妝(1濃度3001111，截留液即為光合膜蛋白(光系統(tǒng)I)溶液，純度為84. 1%。
權(quán)利要求
1.一種提取光合膜蛋白(光系統(tǒng)I)的方法，是以截留分子量為100-300kDa的超濾膜超濾處理光系統(tǒng)I的粗酶液，最終獲得高純度的光合膜蛋白(光系統(tǒng)I)；所述光系統(tǒng)I的粗酶液是將類囊體膜增溶、離心后得到的上清液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取光合膜蛋白(光系統(tǒng)I)的方法，其特征在于所述用截留分子量為100-300kDa的超濾膜處理時，表面活性劑濃度為0_5% (w/v)，溶液pH值6_10， 離子強度0-1M。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的提取光合膜蛋白(光系統(tǒng)I)的方法，其特征在于所述表面活性劑為離子型表面活性劑、非離子型表面活性劑或兩親性肽分子表面活性劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的提取光合膜蛋白(光系統(tǒng)I)的方法，其特征在于 所述用截留分子量為100-300kDa的超濾膜的組件形式為中空纖維素膜、平板膜或卷式膜。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種提取光合膜蛋白(光系統(tǒng)I)的方法，屬于生物分離工程技術(shù)領(lǐng)域，主要是應(yīng)用超濾分離技術(shù)，經(jīng)過破碎、離心、增溶和超濾四個簡單步驟，即可從葉綠體中提取高純度的光合膜蛋白(光系統(tǒng)I)，在提取過程中，未使用層析及蔗糖梯度離心技術(shù)，大幅度縮短了提取周期，實現(xiàn)了光合膜蛋白(光系統(tǒng)I)的快速大規(guī)模制備。
文檔編號C07K1/34GK102344484SQ201010240728
公開日2012年2月8日 申請日期2010年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月27日
發(fā)明者劉建國, 呂建仁, 崔占峰, 張曙光 申請人:中國石油大學(xué)(華東)