專利名稱：一種石斑魚虹彩病毒囊膜蛋白的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病毒囊膜蛋白的提取方法，具體地講涉及一種石斑魚虹彩病毒囊膜蛋白的提取方法。
背景技術(shù)：
病毒結(jié)構(gòu)蛋白是病毒形態(tài)發(fā)生所必需的蛋白質(zhì)，也是構(gòu)成具有侵染力的成熟病毒顆粒所必需的成分。在有囊膜病毒中，病毒的結(jié)構(gòu)蛋白主要有衣殼蛋白(capsid protein), 囊膜蛋白(envelope protein)以及基質(zhì)蛋白(matrix protein)。在這些蛋白中，囊膜蛋白由于位于病毒粒子的最外側(cè)，并且被認(rèn)為是病毒入侵吸附識(shí)別時(shí)的配體分子，因此受到廣泛的關(guān)注。囊膜是包被著病毒衣殼的一層膜，病毒囊膜的成分主要來(lái)自宿主細(xì)胞，由蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及多糖等組成。病毒完成裝配，從宿主細(xì)胞中釋放出來(lái)，細(xì)胞膜雙層磷脂中原有的細(xì)胞源性蛋白被病毒蛋白完全或部分取代，成為病毒的囊膜蛋白。囊膜在病毒感染、復(fù)制及致病過(guò)程中起重要作用。囊膜蛋白的主要功能有(1)是病毒的主要表面抗原，可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性的中和抗體。(2)具有凝集脊椎動(dòng)物紅血球細(xì)胞、細(xì)胞融合以及酶等活性。與靶細(xì)胞結(jié)合。對(duì)病毒囊膜蛋白的研究將有利于發(fā)現(xiàn)與闡明病毒感染、復(fù)制及裝配的機(jī)理，為研究病毒宿主相互作用機(jī)制和病毒防治提供依據(jù)。對(duì)于病毒囊膜蛋白的研究，病毒囊膜的分離純化是研究的基礎(chǔ)和起點(diǎn)。大多數(shù)囊膜蛋白是和膜及病毒衣殼整合在一起的，所以分離提純比較困難。用表面活性劑溶解囊膜是純化囊膜蛋白的常用策略，囊膜在表面活性劑的作用下可變成蛋白質(zhì)-脂肪-表面活性劑的復(fù)合物而被溶解。囊膜被溶解后，可以采用電泳技術(shù)分離純化囊膜蛋白進(jìn)而進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。表面活性劑是分離提純囊膜蛋白的關(guān)鍵性試劑，用合適的表面活性劑溶解囊膜是純化囊膜蛋白的第一步。表面活性劑可以分為幾大類，主要有(1)離子型表面活性劑，如十二烷基磺酸鈉(SDS)、脫氧膽酸鈉(DOC) ； (2)溫和非離子型表面活性劑，如曲拉通X-100 (Triton X-100)、乙基苯基聚乙二醇(NP-40); (3)溫和型兩性表面活性劑，如DDMAU、DDMAB。 在囊膜的提取中，表面活性劑的選擇很關(guān)鍵，臨界微團(tuán)濃度、親水-親脂物平衡值、電荷及紫外穿透性等是選擇表面活性劑的主要考慮因素。1% Triton-X 100是分離病毒囊膜比較常用的方法，常用于如牛流行熱病毒(bovine ephemeral fever virus, BEFV)和對(duì)蝦白斑綜合癥病毒(white spot syndrome virus, WSSV)等病毒的囊膜的分離。此外，痘苗病毒 (vaccinia virus, W)的囊膜用 1% NP-40 溶液(1% NP_40、50 mM Tris (pH 7.4)、150 mM NaCl和50 mM DTT)能得到了很好的分離。迄今為止，僅有少數(shù)的幾篇關(guān)于虹彩病毒囊膜蛋白的報(bào)道。而對(duì)于有囊膜虹彩病毒的囊膜提取方法，缺乏全面的比較和研究。本發(fā)明在比較了幾種不同的表面活性劑分離石斑魚虹彩病毒囊膜蛋白的效果后，建立了一種分離虹彩病毒囊膜蛋白的合適方法
發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺乏和不足之處，本發(fā)明提供一種虹彩病毒囊膜蛋白的提取方法。本發(fā)明通過(guò)以下方案實(shí)現(xiàn)
一種石斑魚虹彩病毒囊膜蛋白的提取方法，其特征在于包括以下步驟①石斑魚胚胎細(xì)胞接種石斑魚虹彩病毒，待細(xì)胞出現(xiàn)完全病變效應(yīng)時(shí)，收集病毒懸液；②收集的病毒懸液凍融2-3次，去除細(xì)胞碎片，取上清液進(jìn)行超速離心，收集病毒粒子，用蔗糖密度梯度離心得到純化的病毒粒子；③將純化的病毒粒子用0. 1% SDS室溫處理30分鐘。 步驟②所述超速離心為^OOOrpm離心90分鐘。步驟②凍融是指將病毒懸液放入低溫冰箱或液氮中凍存后取出室溫溶解。步驟①是將接種病毒的石斑魚胚胎細(xì)胞經(jīng)過(guò)磷酸緩沖鹽溶液漂洗后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0. 25%的胰蛋白酶消化1-2分鐘，加入新配置的PH 7. 4 7. 6的含8-10%胎牛血清的 MEM培養(yǎng)液，2548°C進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增；待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)接種0.01-0. 1 MOI的病毒，于 25-28 °C培養(yǎng)3-4天后，收集病毒懸液。步驟②去除細(xì)胞碎片的方法為12，OOOg離心30分鐘，取出上清液，其沉淀用磷酸緩沖鹽溶液重懸并反復(fù)凍融3次后再超聲波破碎，4，OOOg離心20分鐘。步驟②所述蔗糖密度梯度離心為將病毒懸浮液加于30%-60%蔗糖密度梯度上， 150, 000 g 4°C離心1小時(shí)，收集密度梯度40%-50%之間的條帶，溶于TN buffer中；100, 000 g 4°C離心1小時(shí)得到純化的病毒粒子。步驟①收集的病毒懸液于-20 -80°C凍存保存。步驟②收集的病毒粒子用磷酸緩沖鹽溶液重懸溶解后再進(jìn)行蔗糖密度梯度離心。TN buffer 為 50 mM Tris /HCl 與 150 mM NaCl 的混合物，其 pH 為 7. 5。本發(fā)明的優(yōu)選方案是用蔗糖密度梯度離心純化病毒粒子，0. 1% SDS處理病毒，分離病毒囊膜蛋白；包括以下步驟
1、病毒接種敏感細(xì)胞石斑魚胚胎細(xì)胞，待細(xì)胞出現(xiàn)完全病變效應(yīng)(cytopathic effect, CPE)時(shí)，收集病毒懸液，_80°C凍存。2、收集的病毒懸液反復(fù)凍融3次，以完全釋放病毒，離心去除細(xì)胞碎片，上清液進(jìn)行超速離心，28000rpm離心90分鐘，收集病毒粒子，沉淀的病毒粒子用磷酸緩沖鹽溶液重懸溶解，150，OOOg蔗糖密度梯度離心90分鐘得到純化的病毒粒子。3、用三種不同的表面活性劑Triton X_100、NP_40和SDS分離病毒囊膜，用抗病毒的主要衣殼蛋白和囊膜蛋白VP16的抗體Western blot檢測(cè)病毒囊膜蛋白分離的效果，同時(shí)電鏡觀察處理后的囊膜去除情況。4、根據(jù)上述步驟確定的病毒囊膜蛋白分離的方法，即0. 1% SDS處理病毒粒子，用已知的病毒囊膜蛋白VP88和VP90及衣殼蛋白VP38的抗體flfestern blot驗(yàn)證方法的可靠性。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益之處在于
(1)本發(fā)明提供的石斑魚虹彩病毒囊膜蛋白的提取方法能完全溶解病毒囊膜而不影響病毒衣殼的完整性。因此，本方法也適用于其他有囊膜虹彩病毒囊膜蛋白的分離。(2)囊膜蛋白的研究是近幾年病毒結(jié)構(gòu)蛋白研究的一個(gè)熱點(diǎn)。本發(fā)明主要針對(duì)病毒囊膜蛋白，能促進(jìn)病毒囊膜蛋白質(zhì)組學(xué)的研究進(jìn)展，有助于進(jìn)一步研究病毒囊膜蛋白在病毒感染宿主過(guò)程中的功能，在分子與細(xì)胞水平上了解病毒與宿主的相互作用機(jī)制，為防治虹彩病毒病害和病毒疫苗的研制提供有力的科學(xué)依據(jù)與應(yīng)用基礎(chǔ)。


圖1不同表面活性劑處理后Wfestern blot檢測(cè)VP16及用三種已知病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗體Western blot驗(yàn)證新建立的方法的可靠性，其中V指純化的病毒粒子，S、P分別指處理后的病毒離心分離上清和沉淀。圖2病毒用不同表面活性劑處理后的電鏡觀察，箭頭指示的是病毒的衣殼，箭箭頭指示的是病毒的囊膜。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述。、材料
實(shí)驗(yàn)所用病毒為石斑魚虹彩病毒(SGIV，A3/12/98 PPD)。選用細(xì)胞系為石斑魚胚胎細(xì)胞系，細(xì)胞在含8-10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。、方法
2. 1細(xì)胞培養(yǎng)與病毒擴(kuò)增
取長(zhǎng)滿單層的石斑魚胚胎細(xì)胞，去除原有培養(yǎng)液，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline, PBS)漂洗一遍后加入0. 25%的胰蛋白酶消化1_2分鐘，加入新配置的含 8-10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液(pH 7.4),吹勻后分至3個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶中于進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)接種0.01 MOI (multiplicity of infection，感染復(fù)數(shù))的石斑魚彩虹病毒，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，擴(kuò)增病毒。連續(xù)培養(yǎng)3-4天后，細(xì)胞病變完全，收集病毒懸液，_80°C凍存?zhèn)溆谩?. 2病毒純化
病毒懸液凍融2-3次后分裝入50毫升的離心管中，12，OOOg離心30分鐘，取出上清記為SNl，沉淀用磷酸緩沖鹽溶液重懸并反復(fù)凍融3次后再超聲波破碎，4，OOOg離心20分鐘， 取上清記為SN2，將Sm與SN2混合4°C保存過(guò)夜；28，OOOrpm離心90分鐘以沉淀病毒，2 毫升TN buffer (50 mM Tris /HC1，150 mM NaCl, pH 7. 5)重懸沉淀；將病毒懸浮液加于 30%-60%蔗糖密度梯度上，150，000 g 4°C離心1小時(shí)，收集密度梯度40%_50%之間的條帶， 溶于TN buffer中；100，000 g 4°C離心1小時(shí)洗糖；收集病毒沉淀，用適量TN buffer溶解，-80°C保存?zhèn)溆谩?. 3三種不同的表面活性劑Triton X-100、NP-40和SDS分離病毒囊膜
在囊膜的提取中，表面活性劑的選擇很關(guān)鍵，本發(fā)明比較了三種不同的表明活性劑分離病毒囊膜的效果，分離后的上清和沉淀SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)膜進(jìn)行Western blot檢測(cè)。所用一抗分別是抗病毒MCP和VP16蛋白的抗體。MCP是虹彩病毒的主要衣殼蛋白，是病毒衣殼的標(biāo)志；病毒編碼蛋白VP16是一個(gè)囊膜蛋白。Triton X-100提取囊膜蛋白根據(jù)Walker方法并略作修改。純化的病毒用1% Triton X-100在不同的NaCl濃度(0M, 0. 1M, 0. 5M和1M)下室溫處理30分鐘，20，000 g 4°C離心30分鐘，吸取上清，沉淀再用TN Buffer洗滌一次，分離后的上清和沉淀SDS-PAGE 分離后轉(zhuǎn)膜Astern blot檢測(cè)。NP-40提取囊膜蛋白參考Ojeda等建立的方法。純化的病毒粒子用50mM Tris (pH 7. 4)、1%NP-40、150 mM NaCl 和不同濃度的二硫蘇糖醇(DL-Dithiothreitol, DTT) (ImM, 5mM, IOmM和50mM) 37°C處理60分鐘，離心后吸取上清，沉淀TN Buffer洗滌一次，分離后的上清和沉淀SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)膜Wfestern blot檢測(cè)。純化的病毒粒子用溶于TN Buffer的不同濃度的SDS (0. 01%, 0. 1%和1. 0%)室溫處理30分鐘，離心后吸取上清，沉淀TN Buffer洗滌一次，分離后的上清和沉淀SDS-PAGE 分離后轉(zhuǎn)膜Astern blot檢測(cè)。2.4不同的表面活性劑處理后的電鏡觀察
病毒的表面活性劑處理見(jiàn)上。處理后的沉淀用適量的TN Buffer充分重懸后采用懸滴法制片。即取少量相應(yīng)懸液，直接滴在有Parafilm膜的網(wǎng)上，懸液在網(wǎng)上呈半球形。30分鐘后，用一片干凈濾紙從網(wǎng)邊吸去液體。稍干后用1%磷鎢酸(PTA)染色45秒，用濾紙吸去染液后電鏡觀察。2. 5三種已知病毒結(jié)構(gòu)蛋白Wfestern blot驗(yàn)證建立的方法的可靠性
病毒編碼蛋白VP88和VP90是囊膜蛋白，VP38是衣殼蛋白。0. 1% SDS分離病毒囊膜后，分離的上清和沉淀SDS-PAGE跑膠后轉(zhuǎn)膜Western blot檢測(cè)驗(yàn)證方法的可靠性。、結(jié)果
3.1三種不同的表面活性劑處理后的Wfestern blot檢測(cè)結(jié)果本研究利用病毒的主要衣殼蛋白抗體和囊膜蛋白抗體，Western blot比較了三種不同的表面活性劑Triton X-100、NP-40和SDS分離病毒囊膜蛋白的效果。結(jié)果表明，1% Triton X-100結(jié)合不同濃度的NaCl均只能部分分離囊膜蛋白VP16，多數(shù)仍在沉淀中(圖lb)； 1%ΝΡ-40處理隨著DTT濃度的升高，主要衣殼蛋白也被溶解到上清中(圖Ic)；而不同濃度的SDS均能溶解病毒囊膜蛋白VP16，0. 1% SDS已能完全溶解病毒囊膜而不破壞衣殼的完整性，達(dá)到分離病毒囊膜的效果，因此可能是一種比較合適的分離石斑魚虹彩病毒囊膜蛋白的方法(圖la)。3. 2不同的表面活性劑處理后的電鏡觀察結(jié)果
電鏡在確定病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)等方面具有其它方法不可代替的作用。我們對(duì)三種去垢劑處理后的病毒形態(tài)和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了電鏡觀察。結(jié)果顯示蔗糖密度梯度純化的病毒粒子結(jié)構(gòu)完整，可以觀察到明顯的病毒囊膜，形態(tài)為標(biāo)準(zhǔn)的六邊形(圖2)。1% Triton X-100和1% NP-40處理病毒囊膜不完全，在處理后的病毒粒子中仍可以觀察到殘留的病毒囊膜(圖2)。 0.1% SDS處理后的病毒粒子衣殼結(jié)構(gòu)完整，而且觀察不到囊膜(圖2)。電鏡觀察結(jié)果說(shuō)明 0. 1% SDS室溫處理30分鐘能溶解病毒囊膜而不破壞衣殼的完整性，與上述Wfestern blot 檢測(cè)的結(jié)果一致。3.3三種已知病毒結(jié)構(gòu)蛋白Wfestern blot結(jié)果
為了進(jìn)一步驗(yàn)證0. 1% SDS分離SGIV囊膜蛋白的可靠性，我們用3個(gè)病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗體(VP88、VP90和VP38)Western blot檢測(cè)0. 1% SDS分離病毒囊膜后各蛋白的分布。與之前的研究報(bào)道一致，囊膜蛋白VP88和VP90全部在上清中，而衣殼蛋白VP38與MCP —樣，全部分布在沉淀(圖Id)。
由以上結(jié)果可知0. 1%的SDS能完全溶解病毒囊膜而不影響病毒衣殼的完整性， 因此能分離出SGIV囊膜蛋白，為防治虹彩病毒病害和病毒疫苗的研制提供有力的科學(xué)依據(jù)與應(yīng)用基礎(chǔ)。
權(quán)利要求
1.一種石斑魚虹彩病毒囊膜蛋白的提取方法，其特征在于包括以下步驟①石斑魚胚胎細(xì)胞接種石斑魚虹彩病毒，待細(xì)胞出現(xiàn)完全病變效應(yīng)時(shí)，收集病毒懸液；②收集的病毒懸液凍融2-3次，去除細(xì)胞碎片，取上清液進(jìn)行超速離心，收集病毒粒子，用蔗糖密度梯度離心得到純化的病毒粒子；③將純化的病毒粒子用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0. 1% SDS室溫處理30分鐘。
2.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于步驟②所述超速離心為^OOOrpm離心 90分鐘。
3.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于步驟②凍融是指將病毒懸液放入低溫冰箱或液氮中凍存后室溫溶解。
4.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于步驟①是將接種病毒的石斑魚胚胎細(xì)胞經(jīng)過(guò)磷酸緩沖鹽溶液漂洗后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0. 25%的胰蛋白酶消化1-2分鐘，加入新配置的 pH 7. 4 7. 6的含8-10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液，25_28°C進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增；待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)接種0. 01-0. 1 MOI的病毒，于25-28°C培養(yǎng)3_4天后，收集病毒懸液。
5.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于步驟②去除細(xì)胞碎片的方法為12，OOOg 離心30分鐘，取出上清液，其沉淀用磷酸緩沖鹽溶液重懸并反復(fù)凍融3次后再超聲波破碎， 4，OOOg離心20分鐘。
6.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于步驟②所述蔗糖密度梯度離心為將病毒懸浮液加于30%-60%蔗糖密度梯度上，150，000 g 4°C離心1小時(shí)，收集密度梯度40%_50% 之間的條帶，溶于TN buffer中；100，000 g 4°C離心1小時(shí)得到純化的病毒粒子。
7.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于步驟①收集的病毒懸液于-20 -80°C 凍存保存。
8.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于步驟②收集的病毒粒子用磷酸緩沖鹽溶液重懸溶解后再進(jìn)行蔗糖密度梯度離心。
9.如權(quán)利要求6所述的提取方法，其特征在于所述TNbuffer為50 mM Tris /HCl與 150 mM NaCl的混合物，其pH為7. 5。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種石斑魚虹彩病毒囊膜蛋白的提取方法，是通過(guò)蔗糖密度梯度離心純化病毒粒子，0.1%SDS處理純化病毒，分離病毒囊膜蛋白。本發(fā)明主要針對(duì)病毒囊膜蛋白，能促進(jìn)病毒囊膜蛋白質(zhì)組學(xué)的研究進(jìn)展，有助于進(jìn)一步研究石斑魚虹彩病毒囊膜蛋白在病毒感染宿主過(guò)程中的功能，在分子與細(xì)胞水平上了解病毒與宿主的相互作用機(jī)制，為防治虹彩病毒病害和病毒疫苗的研制提供有力的科學(xué)依據(jù)與應(yīng)用基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12R1/93GK102242173SQ20111011042
公開(kāi)日2011年11月16日 申請(qǐng)日期2011年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月29日
發(fā)明者公杰, 歐陽(yáng)征亮, 秦啟偉, 黃友華, 黃曉紅 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所