用于檢測(cè)真鯛虹彩病毒的lamp引物組合物及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種用于檢測(cè)真鯛虹彩病毒的LAMP引物組合物及其應(yīng)用，該LAMP引物組合物由序列為SEQ?ID?No.1所示的正向內(nèi)引物FIP、序列為SEQ?ID?No.2所示的反向內(nèi)引物BIP、序列為SEQ?ID?No.3所示的正向外引物F3、序列為SEQ?ID?No.4所示的反向外引物B3組成。本發(fā)明的LAMP引物組合物用于快速檢測(cè)樣品中的真鯛虹彩病毒，對(duì)于真鯛虹彩病毒具有良好的特異性和靈敏度，所需檢測(cè)儀器簡(jiǎn)單，能夠快速、高效準(zhǔn)確的檢測(cè)真鯛虹彩病毒，適合口岸檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)和基層實(shí)驗(yàn)室推廣。
【專利說(shuō)明】用于檢測(cè)真鯛虹彩病毒的LAMP引物組合物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及用于檢測(cè)真鯛虹彩病毒的LAMP引物組合物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]我國(guó)是世界上最大的水產(chǎn)品生產(chǎn)和輸出國(guó)，目前，我國(guó)水產(chǎn)品總量已占全球漁業(yè)總產(chǎn)量的40%，連續(xù)15年居世界首位，養(yǎng)殖水產(chǎn)品產(chǎn)量占世界養(yǎng)殖總產(chǎn)量的70%。水產(chǎn)品在保障國(guó)家糧食安全、促進(jìn)農(nóng)民增收和農(nóng)村經(jīng)濟(jì)穩(wěn)步發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。我國(guó)水海產(chǎn)品出口面臨的壁壘主要為綠色壁壘，如日本的“肯定列表制度”、歐盟的《歐盟食品及飼料安全管理法規(guī)》及有關(guān)法令、美國(guó)的《最嚴(yán)謹(jǐn)?shù)乃a(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)范》(BAP)等，歐盟啟動(dòng)了對(duì)我國(guó)進(jìn)口人工養(yǎng)殖海產(chǎn)品的審查；韓國(guó)政府也禁止我國(guó)34家水產(chǎn)養(yǎng)殖企業(yè)向韓國(guó)出口魚(yú)類等水產(chǎn)品，嚴(yán)重制約了我國(guó)水產(chǎn)品的出口增長(zhǎng)。
[0003]真鯛虹彩病毒病(Redsea bream iridovirus disease, RSIVD)是在養(yǎng)殖的海水魚(yú)中經(jīng)常發(fā)生并且危害較大的病毒病。該病是由真鯛虹彩病毒((Red sea breamiridovirus, RSIV)引起,該病首次報(bào)導(dǎo)是在1990年,在日本四國(guó)的真鯛養(yǎng)殖場(chǎng),養(yǎng)殖的真鯛大量死亡。自1991年，該病就在日本西南部的18個(gè)區(qū)流行并造成20多種養(yǎng)殖的海水魚(yú)群嚴(yán)重?fù)p失。受感染的包括鱸形目、鰈形目和飩形目的魚(yú)，引起養(yǎng)殖魚(yú)群主要是真鯛魚(yú)苗的大批死亡，不過(guò)也有關(guān)于商品規(guī)格的魚(yú)死亡的報(bào)導(dǎo)。此后該病就在各種海水養(yǎng)殖魚(yú)類中流行并造成很大的損失。1998年該病在韓國(guó)流行，引起60%的鯛魚(yú)和鱸魚(yú)死亡。現(xiàn)在RSIVD已經(jīng)傳到臺(tái)灣，據(jù)報(bào)道該病使養(yǎng)殖的石斑魚(yú)損失很大。我們?cè)?jīng)從自臺(tái)灣和泰國(guó)進(jìn)口過(guò)來(lái)的鱸魚(yú)中檢出過(guò)RSIV，由于該病毒造成的危害極大，OIE將其列為重要傳染病。
[0004]目前，國(guó)內(nèi)外針對(duì)病原RSIV的檢測(cè)方法已進(jìn)行了相關(guān)研究，但是很多方法耗時(shí)長(zhǎng)、成本高。因此，需要建立一種針對(duì)RSIV的快速、有效、準(zhǔn)確且適合野外現(xiàn)場(chǎng)操作的方法，以達(dá)到及早發(fā)現(xiàn)該病并進(jìn)行隔離或撲殺，達(dá)到抑制疫病大規(guī)模暴發(fā)流行的目的。
[0005]環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Reversetranscription loop-mediated isothermalamplification, LAMP)是2000年報(bào)導(dǎo)的一種新穎核酸擴(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)的問(wèn)世解決了核酸診斷上出現(xiàn)的諸多難題，以其高效性、高特異性和反應(yīng)快速的特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于各種病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)以及環(huán)境中細(xì)菌等病原體的檢測(cè)研究，取得了可喜的成就。該技術(shù)在目的基因的高保守區(qū)域的6個(gè)特異性序列設(shè)計(jì)4條引物，運(yùn)用具有鏈置換活性的DNA聚合酶在60~65°C之間的恒溫條件下反應(yīng)幾十分鐘，就可以完成核酸的擴(kuò)增反應(yīng)。該方法以其便捷、靈敏、特異性高，不需要昂貴的儀器，可在短時(shí)間內(nèi)便能完成檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，特別適用于中國(guó)進(jìn)出口岸進(jìn)行快速檢驗(yàn)檢疫，以便保護(hù)水生動(dòng)物貿(mào)易和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種用于快速、準(zhǔn)確檢測(cè)真鯛虹彩病毒(RSIV)的LAMP引物組合物。[0007]本發(fā)明的另一目的在于該LAMP引物組合物在檢測(cè)真鯛虹彩病毒中的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的目的可通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn):
[0009]一種用于檢測(cè)真鯛虹彩病毒的LAMP引物組合物，該引物組合物由序列為SEQ IDN0.1所示的正向內(nèi)引物FIP、序列為SEQ ID N0.2所示的反向內(nèi)引物BIP、序列為SEQ IDN0.3所示的正向外引物F3、序列為SEQ ID N0.4所示的反向外引物B3組成。
[0010]本發(fā)明還提供上述LAMP引物組合物在檢測(cè)真鯛虹彩病毒中的應(yīng)用，包括以下步驟:
[0011](I)提取樣品中的DNA ；
[0012](2)以步驟⑴中提取的DNA為模板，進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)；
[0013](3)對(duì)步驟(2)得到的LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。
[0014]在上述步驟⑵中，LAMP擴(kuò)增反應(yīng)條件為:60-65 °C下反應(yīng)30_90分鐘，停止反應(yīng)；最為優(yōu)選的反應(yīng)條件為:62°C下反應(yīng)60分鐘,停止反應(yīng)。
[0015]在上述步驟(3)中LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物可以采用如下方法判定樣品中是否含有真鯛虹彩病毒:①擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下觀察，如果在遠(yuǎn)離點(diǎn)樣孔出現(xiàn)梯狀條帶，則證明所檢測(cè)的病毒為真鯛虹彩病毒，樣品中含有該病毒擴(kuò)增產(chǎn)物中加入雙鏈DNA(dsDNA)染料PicoGreen顯色劑后觀察熒光顏色變化，如果反應(yīng)后的反應(yīng)液顯示綠色熒光，則證明所檢測(cè)的病毒為真鯛虹彩病毒，樣品中含有該病毒；③從LAMP擴(kuò)增反應(yīng)開(kāi)始時(shí)刻即通過(guò)Loopamp 濁度儀檢測(cè)反應(yīng)液，至擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束，觀察LAMP濁度儀檢測(cè)圖，如果濁度逐漸增加，模塊的顏色由綠色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色，則證明所檢測(cè)的病毒為真鯛虹彩病毒，樣品中含有該病毒。
[0016]相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明的LAMP引物組合物，可以快速檢測(cè)樣品中的真鯛虹彩病毒(RSIV)，該LAMP引物組合物只對(duì)RSIV進(jìn)行特異性的擴(kuò)增，與其他病毒并無(wú)交叉反應(yīng)，對(duì)RSIV的特異性和靈敏度較常規(guī)PCR方法高。利用本發(fā)明的LAMP引物組合物檢測(cè)RSIV，檢測(cè)時(shí)間短，對(duì)RSIV的特異性和靈敏度高，所需檢測(cè)儀器簡(jiǎn)單，能夠快速、高效準(zhǔn)確的檢測(cè)真鯛虹彩病毒，適合口岸檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)和基層實(shí)驗(yàn)室推廣。本發(fā)明的方法，為水生動(dòng)物進(jìn)出境檢疫、疫病監(jiān)測(cè)和流行學(xué)調(diào)查研究提供了一種特異、敏感、有效的新型快速檢測(cè)技術(shù)，為保證進(jìn)出境水生動(dòng)物國(guó)門安全提供了堅(jiān)實(shí)有力的技術(shù)保障。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1為利用本發(fā)明LAMP組合物在不同溫度下進(jìn)行的LAMP擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中泳道M為DL2000Marker，泳道1_6依次為反應(yīng)溫度60°C、61°C、62°C、63°C、64°C和65°C時(shí)的LAMP擴(kuò)增結(jié)果。
[0018]圖2為利用本發(fā)明LAMP引物組合物在不同反應(yīng)時(shí)間下進(jìn)行的LAMP擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中泳道M為DL2000Marker，泳道1_5依次分別為恒溫反應(yīng)30min、45min、60min、75min 和 90min 時(shí)的 LAMP 擴(kuò)增結(jié)果。
[0019]圖3為利用本發(fā)明LAMP引物組合物進(jìn)行的LAMP擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果的檢測(cè)結(jié)果，其中圖3A是通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳判讀的結(jié)果:在電泳圖中泳道M為DL2000Marker，泳道I和2分別為RSIV樣品和陰性對(duì)照；圖3B是通過(guò)檢測(cè)濁度變化判讀的結(jié)果:從LAMP擴(kuò)增反應(yīng)開(kāi)始時(shí)刻即通過(guò)Loopamp濁度儀檢測(cè)反應(yīng)液，至擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束，圖3B中橫坐標(biāo)I和2分別為RSIV樣品和陰性對(duì)照。
[0020]圖4為利用本發(fā)明LAMP引物組合物檢測(cè)RSIV的特異性分析的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中泳道M為DL2000Marker，泳道1-5依次分別為RSIV、IHNV,SVCV, IPNV和ISA的LAMP的擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道6為陰性對(duì)照。
[0021]圖5為利用本發(fā)明LAMP引物組合物檢測(cè)RSIV的靈敏度分析的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中泳道M為DL2000Marker，泳道1-7依次分別為反應(yīng)體系中RSIV DNA含量10ng、lng、
0.lng、0.01ng、lpg、0.lpg、0.01pg 時(shí)的擴(kuò)增產(chǎn)物。
【具體實(shí)施方式】
[0022]下述非限制性實(shí)施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。下述實(shí)施例中，如無(wú)特殊說(shuō)明，所使用的實(shí)驗(yàn)方法均為常規(guī)方法，所用試劑等均可從化學(xué)試劑公司購(gòu)買。
[0023]實(shí)施例1本發(fā)明 LAMP弓丨物組合物的設(shè)計(jì)和合成
[0024]根據(jù)Genbank RSIV基因組中糖蛋白基因(Genbank NO:AB007366.1)的核苷酸序列，使用Primer Explore V3和Primer Premier5.0軟件針對(duì)其中的6個(gè)區(qū)域(3，端的F3c、F2c、Flc以及5’端的B1、B2、B3)設(shè)計(jì)LAMP引物，對(duì)不同引物組進(jìn)行LAMP擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)和檢測(cè)分析，最終篩選出擴(kuò)增速率高、特異性好的一組LAMP引物，分別為正向內(nèi)引物FIP、反向內(nèi)引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3，其序列如表1。引物由大連寶生物工程有限公司合成。
[0025]表1.RSIV LAMP檢測(cè)弓丨物組
[0026]
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測(cè)真鯛虹彩病毒的LAMP引物組合物，其特征在于，該LAMP引物組合物由序列為SEQ ID N0.1所示的正向內(nèi)引物FIP、序列為SEQ ID N0.2所示的反向內(nèi)引物BIP、序列為SEQ ID N0.3所示的正向外引物F3、序列為SEQ ID N0.4所示的反向外引物B3組成。
2.權(quán)利要求1所述的LAMP引物組合物在檢測(cè)真鯛虹彩病毒中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，包括以下步驟: (1)提取樣品中的DNA； (2)以步驟⑴中提取的DNA為模板，進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)； (3)對(duì)步驟(2)得到的LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，在步驟(2)中LAMP擴(kuò)增反應(yīng)條件為:60-65 °C下反應(yīng)30-90分鐘，停止反應(yīng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述LAMP擴(kuò)增反應(yīng)條件為:62°C下反應(yīng)60分鐘,停止反應(yīng)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/70GK103966364SQ201410214697
【公開(kāi)日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2014年5月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月20日
【發(fā)明者】吳斌, 肇慧君, 李葉, 劉釗 申請(qǐng)人:吳斌, 肇慧君, 李葉, 劉釗