用于檢測(cè)病毒性出血性敗血癥病毒的lamp引物組合物及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種用于檢測(cè)病毒性出血性敗血癥病毒的LAMP引物組合物及其應(yīng)用，該LAMP引物組合物由序列為SEQ?ID?No.1所示的正向內(nèi)引物FIP、序列為SEQ?ID?No.2所示的反向內(nèi)引物BIP、序列為SEQ?ID?No.3所示的正向外引物F3、序列為SEQ?ID?No.4所示的反向外引物B3組成。本發(fā)明的LAMP引物組合物用于快速檢測(cè)樣品中的病毒性出血性敗血癥病毒，對(duì)于病毒性出血性敗血癥病毒具有良好的特異性和靈敏度，所需檢測(cè)儀器簡(jiǎn)單，能夠快速、高效、準(zhǔn)確檢測(cè)病毒性出血性敗血癥病毒，適合口岸檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)和基層實(shí)驗(yàn)室推廣。
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于檢測(cè)病毒性出血性敗血癥病毒的LAMP引物組合物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及用于檢測(cè)病毒性出血性敗血癥病毒的LAMP引物組合物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]病毒性出血性敗血癥(Viral haemorrhagic septicaemia, VHS)是由彈狀病毒引起鮭、鱒、狗魚(yú)和大菱鲆等十多種魚(yú)類(lèi)的一種烈性傳染病，能夠?qū)е潞芨叩乃劳雎剩洳≡w為病毒性出血性敗血癥病毒(Viral haemorrhagic septicaemia virus,VHSV)。病毒性出血性敗血癥病毒(Viral haemorrhagic septicaemia virus, VHSV)屬?gòu)棤畈《究屏Ｍ鈴棤畈《緦?，是一種能夠感染鮭鱒魚(yú)類(lèi)的嚴(yán)重傳染病，致死率為90%~100%。本病最早發(fā)現(xiàn)于歐洲大陸及北美洲，最近幾年傳到了亞洲地區(qū)，并在我國(guó)局部地區(qū)流行。該病是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)必須申報(bào)的疫病，在我國(guó)進(jìn)境動(dòng)物傳染病二類(lèi)名錄中被列為必須申報(bào)的疫病。
[0003]本病主要流行于歐洲 及北美洲，近年來(lái)隨著水生動(dòng)物進(jìn)口貿(mào)易的增加，病毒性出血性敗血癥病毒已傳入我國(guó)并在一些地區(qū)流行，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)該病病原VHSV的檢測(cè)方法主要有病毒分離與培養(yǎng)方法、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法、間接熒光抗體試驗(yàn)方法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等，這些檢測(cè)方法雖已達(dá)到準(zhǔn)確的診斷，但是耗時(shí)長(zhǎng)、成本高、儀器設(shè)備要求高，檢測(cè)步驟復(fù)雜，不能滿足快速、準(zhǔn)確檢測(cè)該病毒的需求。因此，本發(fā)明嘗試探索更為快速、準(zhǔn)確、適合現(xiàn)場(chǎng)操作的檢測(cè)手段，便于對(duì)病毒性出血性敗血癥病毒疫情的監(jiān)控及預(yù)防。
[0004]逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Reversetranscription loop-mediatedisothermal amplification,RT-LAMP)是2000年報(bào)導(dǎo)的一種新穎核酸擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)的問(wèn)世解決了核酸診斷上出現(xiàn)的諸多難題，以其高效性、高特異性和反應(yīng)快速的特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于各種病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)以及環(huán)境中細(xì)菌等病原體的檢測(cè)研究。該技術(shù)在目的基因的高保守區(qū)域的6個(gè)特異性序列設(shè)計(jì)4條引物，運(yùn)用具有鏈置換活性的DNA聚合酶在60~65°C之間的恒溫條件下反應(yīng)幾十分鐘，就可以完成核酸的擴(kuò)增反應(yīng)。該方法具備便捷、靈敏、特異性高，不需要昂貴的儀器，在短時(shí)間內(nèi)便能完成檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，特別適用于中國(guó)進(jìn)出口岸進(jìn)行快速檢驗(yàn)檢疫，以便保護(hù)水生動(dòng)物貿(mào)易和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種用于快速、準(zhǔn)確檢測(cè)病毒性出血性敗血癥病毒(VHSV)的LAMP引物組合物。
[0006]本發(fā)明的另一目的在于該LAMP引物組合物在檢測(cè)病毒性出血性敗血癥病毒中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明的目的可通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn):[0008]一種用于檢測(cè)病毒性出血性敗血癥病毒的LAMP引物組合物，該引物組合物由序列為SEQ ID N0.1所示的正向內(nèi)引物FIP、序列為SEQ ID N0.2所示的反向內(nèi)引物BIP、序列為SEQ ID N0.3所示的正向外引物F3、序列為SEQ ID N0.4所示的反向外引物B3組成。
[0009]本發(fā)明還提供上述LAMP引物組合物在檢測(cè)病毒性出血性敗血癥病毒中的應(yīng)用，包括以下步驟:
[0010](I)提取樣品中的RNA ；
[0011](2)以步驟⑴中提取的RNA為模板，進(jìn)行RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)；
[0012](3)對(duì)步驟(3)得到的RT-LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。
[0013]在上述步驟⑵中，RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)條件為:60_65°C下反應(yīng)30_90分鐘，停止反應(yīng)；最為優(yōu)選的反應(yīng)條件為:62°C下反應(yīng)60分鐘，停止反應(yīng)。
[0014]在上述步驟(3)中RT-LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物可以采用如下方法判定樣品中是否含有病毒性出血性敗血癥病毒:①擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下觀察，如果在遠(yuǎn)離點(diǎn)樣孔出現(xiàn)梯狀條帶，則證明所檢測(cè)的病毒為病毒性出血性敗血癥病毒，樣品中含有該病毒擴(kuò)增產(chǎn)物中加入雙鏈DNA(dsDNA)染料PicoGreen顯色劑后觀察熒光顏色變化，如果反應(yīng)后的反應(yīng)液顯示綠色熒光，則證明所檢測(cè)的病毒為病毒性出血性敗血癥病毒，樣品中含有該病毒?’③從RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)開(kāi)始時(shí)刻即通過(guò)Loopamp濁度儀檢測(cè)反應(yīng)液，至擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束，觀察LAMP濁度儀檢測(cè)圖，如果濁度逐漸增加，模塊的顏色由綠色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色，則證明所檢測(cè)的病毒為病毒性出血性敗血癥病毒，樣品中含有該病毒。
[0015]相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明的LAMP引物組合物，可以快速檢測(cè)樣品中的病毒性出血性敗血癥病毒(VHSV)，該LAMP引物組合物只對(duì)VHSV進(jìn)行特異性的擴(kuò)增，與其他病毒并無(wú)交叉反應(yīng)，對(duì)VHSV的特異性和靈敏度較常規(guī)PCR方法高。利用本發(fā)明的LAMP引物組合物檢測(cè)VHSV，檢測(cè)時(shí)間短，對(duì)VHSV的特異性和靈敏度高，所需檢測(cè)儀器簡(jiǎn)單，能夠快速、高效、準(zhǔn)確檢測(cè)病毒性出血性敗血癥病毒，適合口岸檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)和基層實(shí)驗(yàn)室推廣。本發(fā)明的方法，為我國(guó)魚(yú)類(lèi)能夠順利出口歐盟、美國(guó)等國(guó)家及地區(qū)奠定基礎(chǔ)，也為及時(shí)發(fā)現(xiàn)魚(yú)病疫情隱患，提高疫情預(yù)警和防控能力提供理論依據(jù)。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1為利用本發(fā)明LAMP組合物在不同溫度下進(jìn)行的RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果的瓊脂糖電泳圖，其中泳道M為DL2000Marker，泳道1_6依次為反應(yīng)溫度60°C、61°C、62°C、63°C、64°C和65°C時(shí)的LAMP擴(kuò)增結(jié)果。
[0017]圖2為利用本發(fā)明LAMP引物組合物在不同反應(yīng)時(shí)間下進(jìn)行的RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果的瓊脂糖電泳圖，其中泳道M為DL2000Marker，泳道1_5依次分別為恒溫反應(yīng)30min、45min、60min、75min 和 90min 時(shí)的 LAMP 擴(kuò)增結(jié)果。
[0018]圖3為利用本發(fā)明LAMP引物組合物進(jìn)行的RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果的檢測(cè)結(jié)果，其中圖3A是通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳判讀的結(jié)果:在電泳圖中泳道M為DL2000Marker，泳道I和2分別為VHSV樣品和陰性對(duì)照；圖3B是通過(guò)檢測(cè)濁度變化判讀的結(jié)果:從RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)開(kāi)始時(shí)刻即通過(guò)Loopamp濁度儀檢測(cè)反應(yīng)液，至擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束，圖3B中橫坐標(biāo)I和2分別為VHSV樣品和陰性對(duì)照。
[0019]圖4為利用 本發(fā)明LAMP引物組合物檢測(cè)VHSV的特異性分析的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中泳道M為DL2000Marker,泳道1-5依次分別為VHSV、IHNV、SVCV、IPNV和ISA的RT-LAMP的擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道6為陰性對(duì)照。
[0020]圖5為利用本發(fā)明LAMP引物組合物檢測(cè)VHSV的靈敏度分析的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中泳道M為DL2000Marker，泳道1_7依次分別為反應(yīng)體系中VHSV RNA含量10ng、lng、0.lng、0.01ng、lpg、0.lpg、0.01pg 時(shí)的擴(kuò)增產(chǎn)物。
【具體實(shí)施方式】
[0021 ] 下述非限制性實(shí)施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。下述實(shí)施例中，如無(wú)特殊說(shuō)明，所使用的實(shí)驗(yàn)方法均為常規(guī)方法，所用試劑等均可從化學(xué)試劑公司購(gòu)買(mǎi)。
[0022]實(shí)施例1本發(fā)明LAMP弓丨物組合物的設(shè)計(jì)和合成
[0023]根據(jù)Genbank VHSV基因組中N基因的核苷酸序列(Genbank No:AB672617.1)，使用 Primer Explore V3 和 Primer Premier5.0 軟件針對(duì)其中的 6 個(gè)區(qū)域(3，端的 F3c、F2c、Flc以及5’端的B1、B2、B3)設(shè)計(jì)LAMP引物，對(duì)不同引物組進(jìn)行LAMP擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)和檢測(cè)分析，最終篩選出擴(kuò)增速率高、特異性好的一組LAMP引物，分別為正向內(nèi)引物FIP、反向內(nèi)引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3，其序列如表1。引物由大連寶生物工程有限公司合成。
[0024]表1.VHSV RT-LAMP 檢測(cè)引物組
[0025]
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測(cè)病毒性出血性敗血癥病毒的LAMP引物組合物，其特征在于，該LAMP弓丨物組合物由序列為SEQ ID N0.1所示的正向內(nèi)引物FIP、序列為SEQ ID N0.2所示的反向內(nèi)引物BIP、序列為SEQ ID N0.3所示的正向外引物F3、序列為SEQ ID N0.4所示的反向外引物B3組成。
2.權(quán)利要求1所述的LAMP引物組合物在檢測(cè)病毒性出血性敗血癥病毒中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，包括以下步驟: (1)提取樣品中的RNA； (2)以步驟(1)中提取的RNA為模板，進(jìn)行RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)； (3)對(duì)步驟(2)得到的RT-LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，在步驟(2)中RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)條件為:60-65 °C下反應(yīng)30-90分鐘，停止反應(yīng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)條件為:62°C下反應(yīng)60分鐘，停止反應(yīng)。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103952499SQ201410214689
【公開(kāi)日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2014年5月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月20日
【發(fā)明者】吳斌, 肇慧君, 胡強(qiáng), 王剛 申請(qǐng)人:吳斌, 肇慧君, 胡強(qiáng), 王剛