專利名稱：一種鼠源il-27重組蛋白真核表達(dá)載體及構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
IL-27 (Interleukin-27)，是近些年發(fā)現(xiàn)的新的白細(xì)胞介素，該細(xì)胞因子在免疫系統(tǒng)中對(duì)于炎癥及腫瘤有廣泛而重要的作用。IL-27重組蛋白在此領(lǐng)域的研究中具有重要意義。然而由于IL-27由EBI3和p28亞基共同組成一個(gè)異源二聚體，使得該蛋白的表達(dá)載體構(gòu)建相對(duì)困難。

發(fā)明內(nèi)容
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本發(fā)明的目的是解決IL-27重組蛋白的表達(dá)載體構(gòu)建問(wèn)題，提供一種高效表達(dá)IL-27的真核表達(dá)載體，以及方法簡(jiǎn)單、操作方便的構(gòu)建方法。本發(fā)明首先提供了一種鼠源IL-27重組蛋白真核表達(dá)載體pSZ12，以及用于構(gòu)建該載體的相關(guān)引物引物PRM-149如序列表SEQ ID No. 1，PRM_150如序列表SEQ ID No. 2，PRM-151 如序列表 SEQ ID No. 3，PRM-152 如序列表 SEQ ID No. 4。本發(fā)明的關(guān)鍵片段pSZ12-insert，如序列表SEQ ID No. 7所示，其對(duì)應(yīng)的氨基酸序列為E!BI3 (metl-pro228) - (GGGS) 4-p28 (phe29-ser234) -6 XHis-stop condon.本發(fā)明同時(shí)提供了 EBI3和p28的連接鏈(GGGS)4的編碼DNA序列，如序列表SEQIDNo. 9 所示。本發(fā)明將pcDNA3. 1+作為基礎(chǔ)載體實(shí)現(xiàn)了高效的蛋白表達(dá)效率。本發(fā)明所述鼠源IL-27重組蛋白真核表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括下列步驟第I、設(shè)計(jì)引物引物PRM-149如序列表SEQ ID No. I所示，包含了 KpnI酶切位點(diǎn)和EBI3的5’端編碼序列的一部分；弓丨物PMR-150如序列表SEQID No. 2所示，包含了(GGGS)4鏈編碼序列、EBI3的3’端編碼序列的一部分和P28的5’端編碼序列的一部分；弓丨物PMR-151如序列表SEQID No. 3所示，包含了 p28的5’端編碼序列的一部分；引物PMR-152如序列表SEQ ID No. 4所示，包含了 p28的3’端編碼序列的一部分、6X組氨酸編碼序列，終止密碼子以及XhoI酶切位點(diǎn)；第2、擴(kuò)增關(guān)鍵片段pSZ12_insert首先提取IFN- Y +CpG刺激的小鼠樹突狀細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)成cDNA，以此為模板，以引物PRM-149和PRM-150擴(kuò)增出片段pSZ12-L，如序列表SEQ ID No. 5所示，以弓丨物PRM-151和PRM-152擴(kuò)增出片段pSZ12_R，如序列表SEQ ID No. 6所示；然后以純化后的pSZ12-L和pSZ12-R為模板，以PRM-149和PRM-152為引物做S0EPCR，擴(kuò)增出關(guān)鍵片段pSZ12-insert，如序列表SEQ ID No. 7所示(附圖I)；
第3、將pSZ12-insert和pcDNA3. 1+載體用KpnI+XhoI雙酶切并純化后用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，涂布氨芐抗性LB培養(yǎng)基平板；第4、鑒定質(zhì)粒pSZ12，如序列表SEQ ID No. 8所示；挑取單克隆，氨芐抗性液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)并提質(zhì)粒。酶切鑒定(附圖2)，并測(cè)序鑒定，與預(yù)期設(shè)計(jì)完全一致。 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果本發(fā)明中的關(guān)鍵片段pSZ12-inSert可克隆至其他載體上，以方便不同情況下的IL-27重組蛋白的表達(dá)應(yīng)用。本發(fā)明提供了自主設(shè)計(jì)的(GGGS)4連接兩個(gè)亞基，可以保證兩個(gè)亞基的同時(shí)表達(dá)并形成類似內(nèi)源性蛋白的結(jié)構(gòu)。 本發(fā)明中pcDNA3. 1+所包含的neo抗性基因序列可以方便構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系。neo抗性基因序列使成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞具有對(duì)一定濃度G418的抗性，利用這一特點(diǎn)可以通過(guò)向培養(yǎng)基中加入適當(dāng)濃度的G418來(lái)篩選出成功轉(zhuǎn)染該表達(dá)載體的細(xì)胞并進(jìn)行培養(yǎng)，從而構(gòu)建出穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系。本發(fā)明中所包含的6X組氨酸編碼序列可以方便IL-27重組蛋白的純化?，F(xiàn)在市場(chǎng)上已經(jīng)有成熟的篩選帶有6X組氨酸標(biāo)簽的蛋白的純化柱，可以很方便的將表達(dá)出的IL-27重組蛋白收集純化，且不影響IL-27重組蛋白的生物學(xué)活性。本發(fā)明的表達(dá)載體可以通過(guò)轉(zhuǎn)化入DH5 α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，其中pcDNA3. 1 +所包含的Ampicillin抗性基因序列可用于對(duì)轉(zhuǎn)化成功的細(xì)菌進(jìn)行篩選，方便快捷。將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)入細(xì)菌后用含有氨芐抗生素的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌至所需濃度，提取質(zhì)粒即可得到大量擴(kuò)增的重組蛋白表達(dá)載體，用于后續(xù)試驗(yàn)。


圖I.鼠源IL-27重組蛋白真核表達(dá)載體pSZ12的關(guān)鍵序列pSZ12-insert示意圖。圖2. pSZ12的酶切鑒定。圖中，M表示DNA標(biāo)準(zhǔn)條帶，從上到下依次是8000bp、5000bp、3000bp、2000bp、IOOObp0 1-6表示用XhoI對(duì)pSZ12進(jìn)行單酶切，條帶大小為6743bp，7-12表示用XhoI和KpnI對(duì)pSZ12進(jìn)行雙酶切，條帶大小為5364bp和1379bp。圖3. pSZ12轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的蛋白表達(dá)水平鑒定。圖中，Control表示對(duì)照質(zhì)粒pcDNA3. I+,ND表示未檢測(cè)出。對(duì)照質(zhì)粒和pSZ12轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后24小時(shí)及48小時(shí)收細(xì)胞上清，用ELISA方法檢測(cè)其中的IL-27含量。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I (附圖I、附圖2 )鼠源IL-27重組蛋白真核表達(dá)載體的構(gòu)建方法I.引物設(shè)計(jì)與關(guān)鍵片段pSZ12_insert的擴(kuò)增弓丨物PRM-149如序列表SEQID No. I所示，包含了 KpnI酶切位點(diǎn)和EBI3的5’端編碼序列的一部分；弓丨物PMR-150如序列表SEQID No. 2所示，包含了(GGGS)4鏈編碼序列、EBI3的3’端編碼序列的一部分和P28的5’端編碼序列的一部分；弓丨物PMR-151如序列表SEQID No. 3所示，包含了 p28的5’端編碼序列的一部分；弓丨物PMR-152如序列表SEQID No. 4所示，包含了 p28的3’端編碼序列的一部分，6X組氨酸編碼序列，終止密碼子以及XhoI酶切位點(diǎn)；首先提取IFN- Y +CpG刺激的小鼠樹突狀細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)成cDNA，以此為模板，以引物PRM-149和PRM-150擴(kuò)增出片段pSZ12-L，如序列表SEQ ID No. 5所示，以弓丨物PRM-151和PRM-152擴(kuò)增出片段pSZ12_R，如序列表SEQ ID No. 6所示；然后以純化后的pSZ12-L和pSZ12-R為模板，以PRM-149和PRM-152為引物做S0EPCR，擴(kuò)增出關(guān)鍵片段pSZ12-insert，如序列表SEQ ID No. 7所示(附圖I)。擴(kuò)增的反應(yīng)條件為98°C預(yù)變性2min,以98°C變性10s，57。。退火15s，72。。延伸lmin，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)， 末次循環(huán)后再72°C延伸lOmin，之后4°C保溫。PCR產(chǎn)物均經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，將目的條帶切下后，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收純化。2.鼠源IL-27重組蛋白真核表達(dá)載體pSZ12的構(gòu)建與鑒定將pSZ12-insert和pcDNA3. 1+載體用KpnI+XhoI雙酶切，分別用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收純化酶切產(chǎn)物，在T4 DNA連接酶作用下定向連接pSZ12-insert至pcDNA3. 1+，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5a感受態(tài)細(xì)菌中，在LB (Amp+)培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)。挑取陽(yáng)性克隆，培養(yǎng)后小量提取質(zhì)粒，分別對(duì)PSZ12進(jìn)行XhoI單酶切與KpnI和XhoI雙酶切鑒定(附圖2)，選取陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與預(yù)期設(shè)計(jì)完全一致。實(shí)施例2 (附圖3)利用鼠源IL-27重組蛋白真核表達(dá)載體PSZ12體外表達(dá)IL-27重組蛋白I. 293T細(xì)胞培養(yǎng)在IOcm細(xì)胞培養(yǎng)盤中，加入IOml含10%小牛血清的DMEM新鮮培養(yǎng)基至80%左右生長(zhǎng)密度。2.將10 μ g的pSZ12質(zhì)粒和control對(duì)照質(zhì)粒分別加入500 μ LOpti-MEM培養(yǎng)基，混勻，再加入15 μ L FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑，混勻。室溫放置15分鐘。3.將轉(zhuǎn)染試劑混合物滴加入細(xì)胞培養(yǎng)盤，輕輕晃勻，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。4.轉(zhuǎn)染后24小時(shí)和48小時(shí)分別收集細(xì)胞上清，用IL-27的ELISA試劑盒檢測(cè)上清中表達(dá)的IL-27重組蛋白。在用control對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞上清中均檢測(cè)不到IL-27重組蛋白的表達(dá)；在用pSZ12質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞上清中則能夠檢測(cè)到IL-27重組蛋白的表達(dá)，且表達(dá)量較高。
權(quán)利要求
1.一種鼠源IL-27重組蛋白真核表達(dá)載體PSZ12，如序列表SEQ ID No. 8所示。
2.一種鼠源IL-27重組蛋白真核表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括下列步驟 第I、設(shè)計(jì)引物 引物PRM-149如序列表SEQ ID No. I所示，包含了 KpnI酶切位點(diǎn)和EBI3的5’端編碼序列的一部分； 引物PMR-150如序列表SEQ ID No. 2所示，包含了(GGGS)4鏈編碼序列、EBI3的3’端編碼序列的一部分和P28的5’端編碼序列的一部分； 引物PMR-151如序列表SEQ ID No. 3所示，包含了 p28的5’端編碼序列的一部分； 引物PMR-152如序列表SEQ ID No. 4所示，包含了 p28的3’端編碼序列的一部分，6X組氨酸編碼序列，終止密碼子以及XhoI酶切位點(diǎn)； 第2、擴(kuò)增關(guān)鍵片段pSZ12-insert 首先提取IFN- Y +CpG刺激的小鼠樹突狀細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)成cDNA，以此為模板，以引物PRM-149和PRM-150擴(kuò)增出片段pSZ12-L，如序列表SEQ ID No. 5所示，以引物PRM-151和PRM-152擴(kuò)增出片段pSZ12_R，如序列表SEQ ID No. 6所示； 然后以純化后的PSZ12-L和pSZ12-R為模板，以PRM-149和PRM-152為引物做S0EPCR，擴(kuò)增出關(guān)鍵片段pSZ12-insert，如序列表SEQ ID No. 7所示; 第3、將pSZ12-insert和pcDNA3. 1+載體用KpnI+XhoI雙酶切并純化后用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，涂布氨芐抗性LB培養(yǎng)基平板； 第4、鑒定質(zhì)粒pSZ12 挑取單克隆，氨芐抗性液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)并提質(zhì)粒，酶切鑒定并測(cè)序鑒定。
3.引物PRM-149 如序列表 SEQ ID No. 1，PRM-150 如序列表 SEQ ID No. 2，PRM-151 如序列表 SEQ ID No. 3，PRM-152 如序列表 SEQ ID No. 4。
4.一種鼠源IL-27重組蛋白真核表達(dá)載體pSZ12中的關(guān)鍵片段pSZ12-insert的序列，如序列表SEQ ID No. 7所示。
5.EBI3和p28的連接鏈(GGGS) 4的編碼DNA序列，如序列表SEQ ID No. 9所示。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鼠源IL-27重組蛋白真核表達(dá)載體及構(gòu)建方法。其構(gòu)建流程是設(shè)計(jì)引物分別將編碼小鼠EBI3氨基酸1-228的cDNA序列與編碼小鼠p28氨基酸29-234的cDNA序列擴(kuò)增，然后通過(guò)SOEPCR的方法獲得整合的DNA片段。將此片段與pcDNA3.1+載體連接后得到鼠源IL-27重組蛋白真核表達(dá)載體pSZ12。其中EBI3和p28通過(guò)預(yù)先設(shè)計(jì)的氨基酸編碼序列連接。本發(fā)明所構(gòu)建的載體，不僅能高效表達(dá)由EBI3和p28組成的異源二聚體IL-27，而且包含6×組氨酸編碼序列，極大方便了重組蛋白的純化。并且可將其關(guān)鍵片段克隆至其他載體上以方便不同情況下的蛋白表達(dá)應(yīng)用，為研究IL-27功能及基因治療方法的研究提供了一個(gè)有效工具。
文檔編號(hào)C12N15/66GK102816794SQ20121030203
公開日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2012年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月23日
發(fā)明者張松, 梁瑞芳, 劉暢, 尹芝南 申請(qǐng)人:南開大學(xué)